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COMPETIO ENTRE LEVEDURAS Saccharomyces cerevisiae (LEEUWENHOEK, 1680) (Saccharomycetales: Saccharomycetaceae) E BACTERIAS Bacillus sp. DO PROCESSO FERMENTATIVO DA AGROINDSTRIA SANTA MARIA DE MANDURI - SP COMPETITION AMONG YEAST Saccharomyces cerevisiae (LEEUWENHOEK, 1680) (Saccharomycetales: Saccharomycetaceae) and Bacillus sp. AND FERMENTATION PROCESS IN AGROINDUSTRIA OF SANTA MARIA DE MANDURI - SP
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GUIDIO, A. S.; 2FRANCISCO, O.

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Departamento de Cincias Biolgicas Faculdades Integradas de Ourinhos-FIO/FEMM

RESUMO
As contaminaes e o baixo rendimento quando caminham juntos na fermentao alcolica, tornamse um problema de difcil resoluo. Fundamentalmente preciso conhecer o processo fermentativo, que vem sendo constantemente aprimorado no intuito de estabelecer formas relevantes e com baixo custo, na tentativa de resolver os problemas de contaminao que consiste em mais de uma forma de custo para a empresa de produtos para controle. O objetivo deste trabalho foi observar a competio existente entre leveduras Saccharomyces cerevisiae e bactrias do gnero Bacillus sp, pelo mesmo substrato (mosto) e principalmente o impacto causado na produo e rendimento industrial. Foi constatado tambm que, devido a esta competio, as perdas so de dimenses irreparveis por causar queda significativa na produo do etanol e estas infeces, quando no controladas com os meios adequados podem ocasionar a perca total da fermentao. Este estudo mostra a partir de dados que corroboram com outros estudos j realizados e que chegam ao resultado de que a melhor forma de controle microbiolgico a preveno, no deixando a produo chegar a percas extremas. Palavras-chave: bactrias, competio, fermentao, leveduras, rendimento.

ABSTRACT
The contamination and low income when they walk together in the fermentation becomes a problem difficult to solve. Basically you need to know the fermentation process, which has been constantly improved in order to establish relevant forms and low cost in an attempt to solve the problems of contamination that turns out to be another form of cost to the company's control products. The objective of this study was to observe the competition between Saccharomyces cerevisiae and bacteria of the genus Bacillus, the substrate (must) and especially the impact on industrial production and income. It was also found that because of this competition, the losses are irreparable dimensions to cause a significant decrease in the production of ethanol and these infections, if not controlled with the means can cause the total loss of fermentation. This study shows from data corroborate other previous studies that reach the result that the best way to microbiological control is prevention, not leaving the production to reach extreme losses. Keywords: bacteria, competition, fermentation, yeast, yield.

INTRODUO Desde pesquisas realizadas por Alcard et al. (2003) a respeito da contaminao na fermentao alcolica, mostrou que bactrias do gnero Bacillus e Lactobacillus so microorganismos que normalmente contaminam o processo de fermentao realizada por leveduras, sendo que esta contaminao pode causar queda da viabilidade das leveduras e da eficincia da fermentao, provocando a diminuio do rendimento da produo de lcool, sendo que muitos so os tratamentos para seu controle, sendo usado tambm a irradiao que torna se tambm bastante eficaz. Enfatizam Cabrini e Gallo (1999), que a maioria das espcies de leveduras obtidas num processo de fermentao para a produo de lcool foi a do gnero Saccharomyces e a espcie foi S. cerevisiae. J em outros estudos, realizados por Meneghin et al. (2008), verificaram que a produo de etanol, tanto no processo de fermentao contnuo, quanto num processo de fermentao batelada, tem muitos problemas com contaminantes bacterianos, sendo que esses, competem com a levedura pelo mesmo substrato (acar), diminuindo a produo. Verifica-se tambm, que o assentamento de clulas de leveduras no fundo das dornas e perdas de clulas na centrifugao, podem tambm ser causados por bactrias floculantes. A floculao do fermento usado nas indstrias sucroalcooleiras faz com que esse assentamento dificulte a converso do acar em lcool, j que as leveduras devem ficar suspensas no meio fermentativo, levando a queda do rendimento, tal como, a produtividade do etanol, tendo a necessidade de repor essas clulas que se perdeu na centrifugao. (LUDWIG et al., 2001). Mas ainda, conforme Noris e Joseph (1977), para um melhor rendimento e um menor uso de subproduto, tm que haver o selecionamento de cepas de levedura que so mais resistentes e produtivas para levar o possvel custo da fermentao para o mnimo. Outros estudos mostram que a infeco causada por bactrias da fermentao alcolica do gnero Bacillus e Lactobacillus, bem como seus produtos metablicos, quando associados no mesmo processo fermentativo, podem causar danos ao processo, assim como podendo ocorrer significativa queda no rendimento. (NOBRE, 2007).

Conforme Marques e Serra (2004), nas usinas sucroalcooleiras o mtodo mais utilizado o processo de reciclagem das clulas de levedura por centrifugao, porm, juntamente com essas clulas acumulam tambm os compostos txicos fermentao produzidos no processo, o que ocasiona baixa eficincia e queda na viabilidade, afetando a produtividade. Pesquisas realizadas por Alquati e Antunes (1990), a contaminao por bactrias num processo de fermentao deve ser considerado, pois h uma bioconverso dos acares em outros subprodutos que no seja o etanol e pelo fato das transformaes da matria prima fermentvel em outros compostos, por influncia da competio das leveduras com outros contaminantes, o que provoca perdas irreparveis de grande dimenso no rendimento fermentativo. J estudos feitos por Yokoia (1991) e Stupiello (1981), mostram que parte dos microorganismos que atrapalham o processamento da cana de acar, j vem com a prpria planta, porm essa carga bacteriana aumenta ao longo do processo de fermentao, degradando a sacarose que resulta em subprodutos que causam perdas diretas na produo. Trabalhos realizados por Borzani (2006), tambm mostram que o rendimento fermentativo pode cair com o aumento da concentrao de biomassa, fato que influncia no processo de produo do lcool. O presente trabalho tem como objetivo observar e comprovar a competio entre leveduras e bactrias pelo mesmo substrato e o impacto causado no rendimento, devido competio, assim como verificar as espcies de cepas de leveduras utilizadas no processo, como tambm as bactrias que mais acometem a fermentao alcolica; constatando que por conta desta competio h uma queda na produo de lcool, sendo que estas infeces precisam ser controladas. MATERIAL E MTODOS As amostras foram feitas no ano de 2008 na Agroindstria Santa Maria, localizada na Estrada Municipal dos Nunes, Stio dos Nunes, em Manduri SP. As amostras foram coletadas em frascos limpos, sendo analisadas imediatamente aps as coletas. O material utilizado como vidrarias foram: Tubos de ensaio com tampa esmerilada, proveta de 50 ml, cmara de Newbauer espelhada, lamnula para microscopia (22.0 x 22.0 mm), lminas para microscopia (26 x 76 mm), Becker de

250 ml, pipetas de 0,1 ml e 1 ml. Os equipamentos utilizados foram: Microscpio; contador de clulas Phoenix, agitador de tubos Phoenix, usando como reagentes para contagem de Bactrias foram utilizados o corante Azul de Metileno + Sulfato Azul de Nilo e leo de imerso. Para contagem de leveduras foram utilizados o corante de Eritrosina e leo de imerso. Os Softwares utilizados para armazenar os dados foram as planilhas do Programa Excel e os grficos. A metodologia utilizada foi a da Fermentec de Piracicaba, onde: a) Para a contagem de bactrias Diluiu-se a amostra adequadamente, utilizando gua destilada. Transferiu-se para um tubo de ensaio, 1,0 ml da amostra diluda e adicionou-se 1,0 ml do corante azul de metileno + sulfato azul de Nilo, agitando o tubo de ensaio no agitador. Limpou-se a pipeta com papel higinico antes de transferir o volume para a lmina, transferiu-se 0,003 ml de amostra para uma lmina de vidro (26 x 76), colocando sobre a amostra uma lamnula de vidro (22 x 22), tendo o cuidado para a formao de bolhas, adicionando-se uma gota de leo de imerso e procedendo contagem dos bastonetes. Clculo: Bast/ml = FM x Onde: 1 xMxD Vol amostra

0,003 - o volume da amostra;

FM - o fator do microscpio; M - o total de bactrias vivas / n. campos contados; D - a diluio utilizada; Fator do microscpio = rea da lamnula / rea do campo do microscpio. rea do microscpio = x
4 D2

rea da lamnula = 22 x 22 = 484 b) Para viabilidade e brotamento celular das leveduras - As amostras foram homogeneizadas e analisadas imediatamente aps a coleta, seguindo a metodologia: Homogeneizou-se a amostra, colocando 50 ml de gua para tubo de ensaio (ou outro volume se fosse necessrio), adicionou 1 ml de amostra e homogeneizou, transferiu 1 ml desta mistura para um tubo de ensaio, adicionou 1 ml de corante Eritrosina ao tubo de ensaio e agitou, transferindo uma alquota desta mistura para cmara de Newbauer, retirando o excesso com o auxilio de um papel higinico. Colocou-se a lmina sobre os retculos da cmara de Newbauer,

adicionou uma gota de leo de imerso sobre a lamnula e procedeu-se imerso da objetiva de 100 vezes, foram feitas as contagens das clulas no coradas (vivas), das clulas coradas (mortas), dos brotos no corados (brotos vivos) e dos brotos corados (brotos mortos); Contou-se os quatros retculos centrais de cada quadrculo, que na soma d 100 retculos, considerando todas as clulas que esto no interior deles e as que esto at para dentro, considerando como brotamento as clulas que for menor ou metade do tamanho da clula-me, contou-se em mdia 500 clulas na amostra, caso fosse maior que isso, era mudada a diluio. Clculo: % viabilidade celular = n.clulas vivas x 100 _ n. clulas vivas + mortas % brotamento = n.brotam. vivos n. clulas vivas
x 100

% viabilidade de brotamento = n.brotos vivos x 100 n. total de brotos N clulas vivas / ml = Total clulas vivas x 4.000 x D x 103 Total retculo contado RESULTADOS E DISCUSSO Foi revelado pelos dados obtidos que, quando a viabilidade das clulas de leveduras est alta e a infeco do vinho est baixa, a produo e o rendimento da fermentao aumentam, levando em considerao outros aspectos do prprio processo, sendo que, quando ocorre a competio com as bactrias, a tendncia cair o rendimento e conseqentemente a produtividade, conforme visto por Meneghin et al. (2008).(Ver tabela 1). Foi observado tambm que a medida que a infeco de certas amostras foi aumentando, a floculao tambm acompanhou esses resultados, levando a formao de aglomerados de clulas de leveduras devido ao aumento do nmero de bactrias ,ocasionando concentrao de fermento no fundo da dorna, a morte de clulas de leveduras e assim como citaram Ludwig et al. (2001).

Tabela 1. Comparao entre as mdias altas e mdias baixas (mensal) de Rendimento Geral, eficincia da fermentao e infeco obtidas na Agroindstria de Manduri -SP. Meses Maio Junho Julho Agosto Setembro Outubro Novembro Dezembro Rendimento Geral % 84.26 72.59 83.32 56.83 83.17 68.45 57.72 82.31 80.69 64.44 81.42 66.30 84.59 65.49 80.37 74.14 Eficincia da Fermentao % 90.33 80.29 89.39 61.02 89.76 74.55 64.86 89.72 87.19 70.42 90.20 74.73 91.80 80.80 93.12 82.23 Infeces Bacterianas 6 7 x 10 / x 10 2.0 x 106 6 3.0 x 10 7 1.0 x 10 7 2.5 x 10 7 1.5 x 10 7 2.4 x 10 1.2 x 107 7 1.0 x 10 7 1.9 x 10 2.2 x 107 1.2 x 107 1.8 x 107 1.2 x 107 1.8 x 107 1.4 x 107 1.6 x 107

* significativamente sendo controlados com bactericidas e antibiticos.

Concordando com estudos j realizados, dos microorganismos observados no processo de fermentao da Agroindstria Santa Maria, foram encontradas bactrias do gnero Bacillus e Lactobacillus, conforme Alcard et al. (2003). As leveduras encontradas foram as do gnero Saccharomyces e espcie cerevisiae, tal como j observou Gallo (2003). Conforme pode ser visualizado na figura 2, a produo aumenta de acordo com a eficincia fermentativa.

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Figura 1. Caractersticas Morfolgicas e Bioqumicas de Leveduras Saccharomices cerevisiae e bactrias Bacillus sp. A) Imagem de clulas de Leveduras sp em competio com Bactrias sp, ao microscpio eletrnico de varredura. (Fermentec - Piracicaba, 2002). B) Leveduras Saccharomices cerevisiae, encontradas nas amostras coletadas na Agroindstria Santa Maria de Manduri SP. C) Formao de aglomerados de clulas de Leveduras dando origem s floculaes. D) Leveduras Saccharomices cerevisiae, encontradas no processo fermentativo da Agroindstria Santa Maria de Manduri SP. E) Formao da floculao causada por infeco de bactrias em amostras representando o impacto causado no fundo das dornas de Fermentao Alcolica.

% % % % % %

Figura 2 Comparao da medias mensais entre a eficincia da fermentao e o rendimento geral da Agroindstria Santa Maria de Manduri SP.

CONCLUSO Concluiu-se ento, com o presente trabalho que, ao controlar os nveis de infeco e conseqentemente a competio nas dornas de fermentao, a eficincia de fermentao aumenta e por seguinte a produtividade. REFERNCIAS ALCARDE, A. R.; WALDER, J. M. M.; HORII, J. Fermentation of irradated sugarcane must. Sci.Agric. v. 60, n. 4, p. 677-681, 2003. ALQUATI, P.H. Caracterizao e controle de microorganismos contaminantes em microdestilarias de lcool. Pelotas, 1990. Tese (Doutorado em Agronomia) Universidade Federal de Pelotas. BORZANI, W. Fermentao alcolica descontinua: a correlao entre o rendimento da fermentao e a concentrao inicial de biomassa depende do que se considere etanol produzido. Braz. J. Microbiol. v.37, n.1, p. 87-89, 2006. CABRINI, K. T.; GALLO, C. R. Identificao de leveduras no processo de fermentao alcolica em usina do Estado de So Paulo, Brasil. Sci.Agric. Depto de Agroindstria, Alimentos e Nutrio ESALQ / USP. Piracicaba v.56, n. 1, 2003 LUDWIG, K.M; OLIVA-NETO, P.;ANGELIS D.F. Quantificao da floculao de Saccharomyces cerevisiae por bactrias contaminantes da fermentao alcolica. Cinc. Tecnol. Aliment. , Campinas, v.21, n.1, p. 63-68, 2001. MARQUES, T.A; SERRA, G.E. Estudo da reciclagem de clulas na produo biolgica de etanol. Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, v.24, n.4, p. 532-535, 2004. MENEGHIN, S. P.; REIS, F. C.; ALMEIDA, P. G.;ANTONINI, S. R.C. Dixido de cloro contra bactrias e leveduras da fermentao alcolica. Braz. J. Microbiol. v.39, n.2, p.337-343, 2008. NOBRE, T. P.;HORII J.; ALCARDE, A. R. Viabilidade celular de Saccharomyces Cerevisiae cultivada em associao com bactrias contaminantes da fermentao alcolica. Cinc. Tecnol. Aliment. , Campinas, v. 27, n.1, p. 20-25, 2007. NORIS R.S.; JOSEPH A. B.J. Indstria de processo Qumico, 4 ed.,1977, 717p. STUPIELLO, J.P. Curso de qualidade da matria prima. Cd Room, 2006. YOKOIA, F. Problemas com contaminantes na fermentao alcolica. STAB, Piracicaba, v.1, n.1, p. 38-39, 1991.

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