Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Instabilidade Gentica e Cancerizao Prof. Jos Carlos Machado 5 Maro 2007

Hoje vamos falar sobre instabilidade gentica e cancerizao. H uma lgica de acumulao de erros genticos associada ao fenmeno de iniciao e progresso neoplsica. Na 1 metade da aula, vamos recapitular alguns conceitos simples discutidos nas ltimas semanas, nomeadamente nas aulas tericas de Iniciao e progresso neoplsica, Oncogenes e cancro e Genes supressores tumorais. Depois vamos discutir os dois mecanismos principais de instabilidade gentica, segundo uma lgica de pergunta-resposta. 1 - O que distingue uma clula normal duma clula tumoral? Aplicando o esquema do hexgono: 1) Auto-suficincia ou independncia relativamente a sinais de crescimento 2) Insensibilidade a sinais que param o crescimento 3) Capacidade de invadir e metastizar 4) Potencial replicativo ilimitado, ou seja, proliferao 5) Capacidade de gerar angiognese 6) Capacidade de escapar apoptose

2 - Como que estas capacidades tumorais so adquiridas? Atravs de alteraes genticas, por isso o cancro uma doena genmica (gentica). A palavra gentica tem uma conotao demasiado forte com hereditariedade e isto no verdade, s vezes o cancro hereditrio mas a maior parte das vezes no . Mesmo quando espordico no deixa de ser uma doena dos genes, mas somtica e no hereditria, por isso a palavra genmica faz mais sentido. 3 - Quais so os genes-alvo das mutaes? Genes supressores tumorais (traves) - mutaes levam a perda de funo; Oncogenes (aceleradores) - mutaes implicam ganho de funo. 4 - Quantos genes tm que ser mutados para se ter um cancro? Depende do tumor: - one-hit tumour - tumores geneticamente simples como os tumores hematolgicos. P.e.: leucemia mielide crnica (LMC) que aparentemente parece ter origem numa nica alterao gentica, neste caso numa translocao cromossmica BCR/ABL, o famoso cromossoma de Filadlfia; 9 p/22 uma s transformao gentica suficiente para conduzir transformao neoplsica!

- two-hit tumour como o retinoblastoma, um tumor especfico que depende da inactivao de um gene supressor tumoral (RB), ou seja, duas alteraes genticas; - 6 a 8-hits tumour tumores muito mais complexos como a maior parte dos carcinomas P.e.: carcinoma colo-rectal (CCR), modelo muito bem estudado, que sabemos que necessita de 6 a 8 hits. NOTA: Em relao ao mecanismo de activao, no caso de um oncogene, necessitamos de 1 mutao, enquanto que num gene supressor tumoral necessitamos de 2 mutaes. 5 - Qual a principal diferena epidemiolgica entre estes ltimos tumores? A idade mdia de diagnstico a principal diferena. O facto dos tumores serem em termos genticos mais simples ou mais complexos vai depender da acumulao de mais ou menos alteraes genticas, que tm uma consequncia directa muito evidente: a idade mdia de diagnstico. - a LMC apresenta uma curva de incidncia, em termos de faixa etria, antecipada relativamente curva de CCR. O tumor precisa de menos alteraes genticas portanto manifesta-se mais rapidamente. Dito por outras palavras: LMC a partir da populao de clulas normais, um s evento gentico d imediatamente aquela populao de clulas vermelhas que representa o nosso produto final: o cancro.

CCR temos uma srie de acontecimentos numa lgica que denominamos de expanso clonal, ou seja, numa populao de clulas normais, h uma clula que acumula uma alterao gentica e forma uma subpopulao. Dentro desta subpopulao, h uma 2 alterao gentica que gera um novo conjunto de clulas e por a fora at que finalmente, temos a nossa populao de clulas tumorais.

Normal

Plipo Adenomatoso

Displasia Baixo Grau

Displasia Alto Grau

Carcinoma

Legenda: Azul normal; Verde plipo adenomatoso; Amarelo displasia de baixo grau; Laranja displasia de alto grau; Vermelho tumor/carcinoma.

Agora um esquema com genes: - duas alteraes do APC que colocam mucosa em risco (discutidas no seminrio de CCR no mbito da PAF polipose adenomatosa familiar - e do HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer); - mutao do oncogene RAS, que explica o aparecimento de um plipo displsico; - p53 - aberraes/alteraes cromossmicas, ou seja, instabilidade gentica. Neste modelo, h uma discusso: tendo em conta apenas a taxa de mutao tpica das nossas clulas, no fcil de explicar como que, num perodo de 40-50 anos, uma linhagem celular acumula todas estas alteraes genticas. Assim, h algo que faz com que as alteraes genticas, medida que se acumulam, tornem mais provvel a ocorrncia das alteraes genticas seguintes. 6 - O que pode ser necessrio para algumas linhagens celulares acumularem mutaes suficientes para originar um cancro em tempo til? (Tempo til significa tempo de vida dos humanos) A instabilidade gentica (ou taxa de mutao aumentada), um factor fundamental para explicar a rapidez com que algumas linhagens celulares acumulam 6 ou 7 alteraes genticas, em tempo til. *** Temos fundamentalmente 2 tipos de instabilidade: cromossmica e de microssatlites. Instabilidade cromossmica (imagem aulas prticas carcinoma hepatocelular com aberraes mitticas mto evidentes) Temos clulas em mitose com cromossomas desorganizados, no alinhados numa placa metafsica nem a migrar para um dos plos de forma muito evidente. Aqui temos uma aneuploidia. Isto uma situao de instabilidade cromossmica com mitose aneuplide.

A instabilidade cromossmica pode ser algo muito simples como no cromossoma de Filadlfia translocao cromossmica 9-22 - que d origem quele gene fulcral BCR/ABL. considerada simples pois esta alterao gentica por si s d origem a um tumor especfico - LMC.

Voltamos s situaes complicadas, o professor mostrou duas imagens da tcnica Cromossome-painting onde possvel marcar cada um dos cromossomas com uma cor diferente e distinguir aneuploidias numricas.: - imagem da esquerda: alterao relativamente tpica de clulas tumorais que a formao de fusos mitticos aberrantes com amplificao centrossmica: a vermelho os cinetocoros, a verde o DNA e a amarelo os centrossomas. O fuso mittico tetrapolar, tendo 4 centrossomas (normalmente deveria ter 2). Daqui vo resultar clulas altamente anormais; - imagem da direita: aqui temos outra aberrao: na mesma clula encontramos 6 centrossomas (a amarelo), o que origina mitoses e divises celulares onde os cromossomas se dividem de forma assimtrica que resultam em aneuploidias. 7 Qual a origem destas aneuploidias? O que est por trs destas mitoses e divises celulares aberrantes? No h uma resposta final para esta questo, o mais provvel estar relacionado com deficincias nos check-points mitticos. O p53 um gene fundamental nestes checkpoints, mais especificamente no check-point de passagem entre G1 e S, permitindo a progresso no ciclo celular caso esteja tudo bem em termos de integridade de DNA. Havendo erros no DNA, a protena p53 pra o ciclo celular, podendo, inclusivamente, forar a clula a activar a apoptose quando esta incapaz de os reparar. Existe tambm o check-point do fuso mittico, que regula a passagem ou sada das clulas da fase M, ou seja, este s permite clula progredir no ciclo celular se todos os cromossomas estiverem devidamente alinhados na placa metafsica e ligados correctamente ao fuso mittico. Enquanto isto no acontecer, a clula no entra em anafase. H um complexo de genes denominado APC - Anaphase Promoting Complex (e no o gene APC do clon!), que regula a progresso das clulas para a anafase. Enquanto os cromossomas no esto correctamente alinhados, este complexo est inactivo e no permite a progresso das clulas. Assim que estes se alinham e ligam ao fuso mittico, o complexo activado e as clulas progridem no ciclo celular, havendo separao e migrao das cromtides pelo fuso. Se algum destes genes comear a funcionar mal, observam-se mitoses anormais.

Resumindo: - normal alinhar dos cromossomas na metfase, activao do complexo APC e posterior separao das cromtides; - mutaes em protenas reguladoras: 1. um dos alelos de uma protena reguladora do APC est mutado levando produo de quantidade anormal da protena. Numa linha celular em que isto se verifique, perdida a capacidade de regulao e as clulas entram em anafase antes do tempo podendo haver perda de cromossomas; 2. perda de uma protena que era suposto facilitar a entrada da clula em anafase. Ainda que esteja tudo correcto, a clula no entra em anafase e temos uma mitose mais prolongada que pode levar ruptura de cromossomas. De seguida, o professor mostrou 3 filmes para demonstrar o efeito do mau funcionamento de genes deste complexo APC: 1 Mitose normal 2 Clula tumoral em que foi inactivado o gene de uma das protenas que regula a entrada na anafase clula tripolar com formao de 3 centrossomas que sofre uma diviso totalmente aberrante, herdando um componente cromossmico anormal. 3 Anafase precoce cromossomas no esto alinhados no fuso mittico por isso a clula no se consegue separar; h cromossomas soltos no citoplasma que impedem que a citocinese se complete correctamente. A clula une-se novamente o que tem uma consequncia tetraploidia que, nas divises celulares subsequentes, vai acabar por gerar mais erros quando os cromossomas se separam de formas aberrantes. Portanto, isto s para vos mostrar que quando alguns daqueles genes que funcionam como check-points da mitose no funcionam bem, as coisas correm mal em termos de diviso celular e relativamente simples explicar como surgem todas aquelas situaes de aneuploidia que depois vemos nos tumores primrios. Instabilidade de microssatlites ou STR (short tandem repeats) 8 O que so microssatlites? Sequncias de DNA repetitivas. 9 O que os caracteriza? So muito polimrficos. Noutros polimorfismos, como nos SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), que so substituies de um nucleotdeo, ns temos apenas 2 alelos e 3 gentipos possveis: homozigtico para cada um dos alelos ou heterozigtico. No caso dos microssatlites, temos muitos alelos e muitas combinaes genotpicas possveis. A variedade genotpica associada a estes polimorfismos pode ser muito grande, logo a probabilidade de encontrarmos 2 indivduos aqui na sala com o mesmo gentipo muito menor do que se fossemos procurar indivduos com o mesmo gentipo para um SNP. Outra caracterstica a repetio de unidades bsicas.

10 Qual a relao entre instabilidade de microssatlites e cancro? Muitos cancros tm instabilidade de microssatlites. Usando o CCR como exemplo, est presente em cerca de 10 a 15% dos casos espordicos e 95% dos casos de HNPCC, ou seja, ambos so MSI (microsatellite instability) positivos.

Quando olhamos para esta imagem electrofortica (do seminrio sobre cancro colorectal espordico e familiar) deste tipo de instabilidade, observam-se pares de DNA tumoral (T) e DNA normal (N). Do normal para o tumoral, aparecem sempre alteraes, muitas vezes com aparecimento de bandas novas correspondentes multiplicao dos alelos. 11 De onde surge este fenmeno de instabilidade? No caso do HNPCC, a funo comprometida a reparao do DNA. A clula tem vrios mecanismos de reparao de DNA, um deles lida especificamente com erros de emparelhamento. Quando um nucleotdeo mutado (p.e. uma guanina transformada em timina), um dos alelos no emparelha correctamente com o outro. Numa clula normal, isto ser reparado e o DNA volta a emparelhar correctamente. Se houver um erro na reparao ou se a clula for incapaz de reparar o DNA, no h reparao e as clulasfilha herdam a mutao. Esta a origem de uma mutao. A populao celular resultante daquela clula original vai partilhar esta mutao. A instabilidade de microssatlites, no fundo, um fentipo de instabilidade molecular, ou seja, existe uma deficincia na clula de reparar ADN. Como ela no o consegue reparar, acumula erros ou variabilidade nos microssatlites e as clulas apresentam mais ou menos unidades de repetio do que o normal, manifestado em electroforese pela variao do tamanho das bandas de microssatlites. NOTA: Algum sugeriu mutao do gene APC como resposta, surgindo alguma confuso nesta pergunta. Assim, o professor esclareceu a dvida, explicando que na PAF, h uma mutao do APC que interrompe a diferenciao das clulas, mas mantendo a sua proliferao, sem que haja instabilidade de microssatlites. Por outro lado, no HNPCC, temos deficincias em genes de reparao do DNA e, consequentemente, instabilidade de microssatlites. Em 1994 foi publicado o 1 artigo onde foi demonstrado que o fentipo de instabilidade de microssatlites, muitas vezes encontrado em tumores, era devido a mutaes de genes envolvidos na reparao de DNA. Na altura, encontraram mutaes num gene que hoje tem o nome de MLH1, que estava mutado numa certa proporo de famlias com HNPCC. Assim, muitos dos casos de HNPCC e o fentipo de instabilidade de microssatlites, que aparece em 95% destes casos, so explicados por mutaes germinais, ou seja, hereditrias, num gene de reparao de DNA.

Hoje sabe-se muito mais sobre as alteraes genticas associadas ao HNPCC. Aqui tm um esquema onde vem o espectro de mutaes de genes de reparao de DNA associadas ao HNPCC. O MLH1 um dos mais importantes, 30% das famlias tm mutao no MLH1, mas reparem h mutaes noutros genes: o MSH2, o PMS1 e por a fora. Todos estes genes, se repararem bem, so genes que aparecem neste esquema e fazem parte deste complexo de reparao do DNA. Portanto nos HNPCC a maior parte deles herdam mutaes nestes genes. Nos CCR espordicos no bem assim... 12 O que faz a metilao e qual a sua importncia? A metilao um mecanismo de regulao da transcrio. Se um promotor-gene estiver hipermetilado, no transcreve porque este mecanismo impede os factores de transcrio de acederem correctamente regio promotora. Quando temos uma situao de hipometilao, o promotor est acessvel e portanto h transcrio activa. Isto o que acontece nos CCR espordicos com fentipo de instabilidade. Nestes casos no h mutaes dos genes como acontece nas formas hereditrias, em alternativa h hipermetilao do gene MLH1, um dos genes envolvido nas formas hereditrias. Concluindo, dentro do CCR, temos uma verso hereditria (mutaes inactivantes do gene) e uma verso espordica (hipermetilao dos promotores). O resultado ou consequncia prtica exactamente a mesma: a incapacidade da clula de reparar o DNA.
Mutaes (formas hereditrias) Metilao (formas espordicas)

Gerao de deficincia na reparao

Aumento da taxa de mutao

Gerao de instabilidade de microssatlites

13 Qual a consequncia deste fenmeno de metilao? Mais uma vez, uma deficiente reparao do DNA, causa acumulao de erros em sequncias especficas e repetitivas. Uma falha neste sistema de reparao do DNA faz com que haja acumulao de erros de emparelhamento, que isso que ele suposto reparar. 14 Onde esto os microssatlites? Geralmente em regies no codificantes do genoma, o que parece no ter nenhuma consequncia. Mas tambm existem genes que tm sequncias deste tipo na sua regio codificante e neste caso vamos ter um envolvimento funcional, com provvel inactivao destes genes. 15 Que tipo de mutaes isto origina? H vrios tipos de mutao: - missense origina-se um diferente a.a. por troca de codo, com substituio de um nucleotdeo; - nonsense h substituio de um nucleotdeo com formao de um codo stop, ou seja, a protena resultante vai ser mais curta que a normal; - frame-shift inseres ou deleces que alteram o padro de leitura do DNA; os a.a. mudam a partir do local da insero/deleco at ao codo stop, portanto o resultado prtico uma mutao nonsense, com a formao de uma protena mais pequena que o normal. As mutaes dos microssatlites caem na categoria frame-shift, com ganho ou perda de unidades de repetio. Sendo mutaes frame-shift, h inactivao de genes com formao de protenas pequenas no funcionantes. Nos tumores positivos para a instabilidade de microssatlites, os genes de reparao do DNA so uma espcie de facilitadores da ocorrncia de mutaes nos genes-alvo que so de facto os fundamentais para a transformao neoplsica. Como exemplos de genes-alvo (genes supressores tumorais) temos: TCF4 factor de transcrio fundamental na modulao da penetrao em clulas do clon; IGF IIR receptor de um factor de crescimento, portanto tambm tem a ver com a penetrao; Bax gene regulador da apoptose; TGF--RII receptor para o factor de crescimento e inibidor do crescimento na mucosa normal do clon; esta uma forma das clulas do clon se libertarem do efeito inibidor do TGF-, ao mutar o receptor, este deixa de responder ao sinal de inibio por si mesmo.

FIM
Antes de mais, pedimos desculpa pelo atraso. Optamos pela desgravao integral da aula. No entanto, o professor repetiu-se bastante e limitmo-nos ao essencial, cortando as partes redundantes. Bom estudo! Ana Sofia Oliveira Marta Andrade Turma 2

Glossrio:
MECANISMOS/LESES/MEDIADORES INFLAMATRIOS E NEOPLSICOS DOS PROCESSOS DEGENERATIVOS,

Carcinognese Deleco Metilao do promotor gnico Microssatlites Mutao(es) Mutao somtica Mutao germinativa Oncognese Reparao do ADN (exciso de nucleotdeos) Single Nucleotide Polymorphisms(s) (SNP) Tandem repeats (VNTR) Translocao Tetraploidia
GENES /PRODUTOS DE GENES/ BLOQUEADORES DE GENES/MARCADORES CELULARES E EXTRACELULARES

BCR-ABL Bax Genes de susceptibilidade ao cancro Genes dos checkpoints mitticos Gene(s) supressor(es) tumoral(ais) Genes que reparam o ADN IGFII-R (Insulin-like growth factor II- Receptor) MLH1 MSH2 Oncogene(s) TGF-RII (Transforming growth factor Receptor II)
NEOPLASIAS/LESES NEOPLASIFORMES/LESES PRECURSORAS/LESES PRMALIGNAS

Displasia Leucemia mielide crnica Plipo

DOENAS/SINDROMES

HNPCC (Hereditary non polyposis colon cancer)