Los liposomas: usos y perspectivas

Manuel Gonzlez Prez Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente

Resumen
En este trabajo se abordan los aspectos generales sobre los liposomas. Tambin, se indican los resultados obtenidos en nuestro laboratorio. Los datos que caracterizan a estos liposomas aparecen en varias tablas, mientras que la accin de la peroxidacin sobre los lpidos de la membrana liposomal se muestra en las grficas. En el experimento se utilizaron liposomas MLVs y la inmovilizacin de las vitaminas A, E y C en ellos. Adems, los liposomas sern ampliamente utilizados en muchas formas y mtodos en el futuro. Al final de este reporte, se indican diferentes aplicaciones alternativas. Palabras clave: liposoma, la tecnologa liposomal, MLV.

Abstract
This work outlines a study performed making MLVs liposomes to entrap vitamins A, E and C in order to reduce the chance of oxidation to a minimum. The general concepts of the liposomes are offered. The data which characterize this liposomes are found in some tables whilst the action of the peroxidation process on the liposomal membranous lipids is show in the graphs. The liposomes will be widely used in more modes and methods in the future. Different alternative use are indicated in this report at the end. Key words: liposomes, MLVs, inmovilization, vitamins.

Introduccin
Los liposomas son vesculas, cuya constitucin qumica bsica es un tipo de fosfolpido o varios, y colesterol, integrados en una o ms bicapas, encerrando un espacio acuoso central y, ocasionalmente, otros espacios interlaminares. Sobre esta estructura bsica se pueden insertar otros lpidos, protenas, anticuerpos, biomolculas diversas marcadas con istopos radiactivos, sustancias fluorescentes, etctera. Esta versatilidad estructural le permite al

investigador disear los liposomas de acuerdo con los objetivos para los que sern utilizados, como por ejemplo, transportar sustancias quimioteraputicas anticancergenas hacia rganos especficos, sin que afecten a otros rganos o tejidos corporales. Los sustratos por encapsular se ubicarn en los espacios acuosos, en la fase lipdica, o adoptarn una participacin estructural comprometida en ambas fases, segn sea su naturaleza lipoflica, hidroflica o anfiflica.

Vol. XVI, N 1, 2004

En la actualidad la tecnologa liposomal se desarrolla fundamentalmente a nivel de laboratorio, aunque ya existen en el mercado varios productos basados en su aplicacin, fundamentalmente, en las reas de la medicina y cosmetologa.

Consideraciones tericas
La palabra liposoma se ha formado a partir de dos races griegas; la primera se refiere a los cuerpos grasos (lipo) y la segunda a una estructura (soma). Esta etimologa traduce exactamente qu son los liposomas, unas vesculas cuya membrana est formada por una doble capa o bicapa de molculas lipdicas que incluyen un pequeo volumen de disolvente en el que han sido preparadas. La inclusin de un soluto en estas estructuras recibe el nombre de encapsulacin La eleccin de un protocolo de encapsulacin est determinada por factores tales como la relacin frmaco/lpido, eficacia de encapsulacin, capacidad de retencin del frmaco, facilidad de preparacin, esterilidad y estabilidad del liposoma y del medicamento. La mayor parte de las tcnicas son de encapsulacin pasiva, basadas en la capacidad del liposoma de englobar un determinado volumen acuoso y los solutos en l contenidos durante el proceso de formacin. Las molculas se clasifican en dos categoras: las que son solubles en disolventes polares, ejemplo cloruro de sodio en agua, y las que son solubles en disolventes orgnicos apolares, como las grasas en ter de petrleo. Sin embargo, existen molculas solubles en ambos tipos de disolventes, nombradas anfiflicas, ejemplo los fosfolpidos y los esfingolpidos; estas molculas tienen partes lipoflicas, insolubles en agua (hidrfobas), y otras partes hidroflicas, ms compatibles con el agua que con disolventes orgnicos. Los jabones o los detergentes son buenos ejemplos, pero como veremos, estos compuestos existen, naturalmente, en los lpidos de las membranas biolgicas. Estas molculas, llamadas tambin agentes tensoioactivos, estn formadas por una cabeza polar (un grupo hidroxilo OH, carboxilo o sulfato), y una larga cadena apolar formada por una cadena hidrocarbonada.

La cabeza y la cola garantizan, respectivamente, la solubilidad en el agua o en el disolvente orgnico. En solucin, estas molculas forman unas estructuras ordenadas llamadas miscelas; las cabezas polares de las molculas constituyen una capa protectora entre la solucin acuosa y las colas apolares de las molculas. Estas molculas se agrupan hacia el centro de la estructura con el fin de aislarse del contacto del agua. En las membranas biolgicas, las molculas anfiflicas son fosfolpidos; su cabeza polar posee un grupo fosfato. No obstante, los fosfolpidos no pueden adoptar fcilmente la estructura micelar clsica de las molculas anffilicas, un problema considerable es que cada cabeza polar incluye dos cadenas de hidrocarburos muy voluminosas. Por tanto, los fosfolpidos se agrupan en capas biomoleculares. Las cadenas hidrocarbonadas, apuntando unas hacia otras, forman una doble capa aislada del medio acuoso por las cabezas polares. Este tipo de estructura plana no es estable, y se repliega sobre s mismo para formar estructuras cerradas ms estables, esfricas u ovales; estas estructuras son, precisamente, los liposomas. En dichos sistemas, los componentes mayoritarios son siempre lpidos polares como la fosfatidilcolinas o lecitinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, etctera. Esta estructura de bicapa lipdica no es exclusiva de los liposomas, puede encontrarse tambin en todas las membranas biolgicas, y fue descrita por primera vez por Danielly y Dawson en l935. Aunque muchos investigadores produjeron involuntariamente liposomas, no es hasta principio de los aos sesenta, que se llega a descubrir que los liposomas incluan una parte del disolvente, y fue entonces cuando Baghman y sus discpulos estudiaron los liposomas, demostrando que la dispersin de fosfolpidos en un medio acuoso originaba vesculas cuyas molculas de fosfolpidos se acomodan de tal manera que sus cadenas hidrofbicas de cidos grasos evitan el contacto con el agua, formando bicapas lipdicas, donde la cabeza polar se orienta hacia la parte externa de cada bicapa, mientras que las cadenas de cidos grasos se orientan hacia el interior, y directamente opuestas entre s. En la actualidad, ya se han desarrollado muchas tcnicas de obtencin de liposomas, las que estn perfectamente establecidas.

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Con ellas, se pueden obtener muchos liposomas diferentes en cuanto a tamao, forma, nmero de bicapas lipdicas, volumen interno, etiquetados en las superficies, durabilidad de los mismos, permeabilidad, etctera. As, diseando protocolos de trabajo en los que se emplean estas metodologas, se obtienen diversos tipos de liposomas denominados segn sus nombres en idioma ingls. Los ms frecuentemente utilizados en los trabajos de investigacin son los MLVs (vesculas multilaminares), los SUVs ( vesculas unilaminares pequeas) y los LUVs (vesculas unilaminares grandes). Las tcnicas de preparacin de liposomas son muy variadas, e incluyen no slo diferentes mtodos de obtencin, sino la correspondiente seleccin por tamaos, clasificndose de la siguiente forma: hidratacin del fosfolpido y dispersin simple, sonicacin, extrusin, mtodos que modifican el proceso de hidratacin, congelacin-descongelacin, prensa de French, fase reversa y ciclos de deshidratacin controlada. El mtodo de eleccin depende, en cada caso, del tipo de liposoma que se desea obtener y su tamao. Influye tambin el tipo de fosfolpidos que se utilice y la aplicacin que se pretende. El mtodo de hidratacin y dispersin simple es un procedimiento originalmente descrito por Baghman, y consta de las siguientes etapas: disolucin del lpido en un disolvente orgnico, evaporacin a presin reducida del solvente con movimiento rotatorio simultneo, hasta obtener una pelcula delgada y perfectamente seca en las paredes del matraz y adicin de la fase acuosa y formacin del MLV mediante agitacin. Para la obtencin de liposomas unilaminares a partir de MLV se pueden emplear los procedimientos de sonicacin, de la prensa de French y de la extrusin secuencial. El mtodo de sonicacin puede realizarse con sondas o baos ultrasnicos. Este mtodo aporta altos niveles de energa a la suspensin de lpidos, y es necesario lograr la exposicin de MLV a la irradiacin ultrasnica, siendo el mtodo ms frecuentemente usado para obtener pequeas vesculas. La extrusin de membranas liposomales, permite reducir el tamao de los liposomas, pasando stos a travs de un filtro de membrana de poros de

tamao definido. stos pueden ser ejecutados con presiones mucho ms bajas (100 psi), que se requieren para la presin celular, y pueden dar poblaciones en la cual es posible escoger sobre el tamao lmite, dependiendo del poro exacto del filtro particular, usado para inmovilizar solutos lbiles y protenas. Existen mtodos que modifican el proceso de hidratacin para mejorar el por ciento de encapsulacin; uno de ellos es la congelacin-descongelacin. La tcnica de congelacin-descongelacin consiste en someter una preparacin de MLV a sucesivos ciclos de congelacin en N2 lquido, y descongelacin en un bao termostatado, formndose los FATMLV (Frozen and Thawed MLV). En este caso se logra una mayor eficiencia de encapsulacin y una menor heterogeneidad de tamaos de partculas, de manera que el dimetro promedio se desplaza hacia valores inferiores. Permite, adems, incrementar el volumen interno de los MLV desde 0,5 L/mol fosfolpido, hasta aproximadamente 10 L/mol fosfolpido, si se utiliza la lecitina de huevo, y hasta 15 L/mol si incluye un 10 % de fosfatidilserina en la composicin lipdica. El mecanismo, a travs del cual el ciclo de congelacin modifica el estado de hidratacin del lpido, es desconocido. Existen evidencias que apuntan hacia un efecto de rotura mecnica de la estructura laminar causada por los cristales de hielo, que dara lugar a la formacin de vesculas entre lminas durante la fase de calentamiento. Prensa de French. El mtodo de French consiste en la inyeccin de cierto volumen de suspensin de MLV en el cilindro de una celda de presin de French y la recuperacin de la muestra despus de sucesivos ciclos de extrusin bajo alta presin (20 000 psi). La velocidad de flujo oscila entre 20 y 40 min, y se pueden procesar volmenes entre 30 y 40 mL, obtenindose un rendimiento de 70 % en la produccin de MLVs. Fase reversa. Los liposomas unilaminares se pueden obtener de sistemas bifsicos agua-solvente orgnico mediante los mtodos de inyeccin y de inversin de fase (REV). El mtodo de inyeccin se basa en la formacin espontnea de LUV, mediante la inyeccin de una solucin orgnica (ter o etanol) del lpido en un medio acuoso tamponado. En la inyeccin con etanol ocurre la dispersin de las

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molculas de fosfolpidos instantneamente al entrar en contacto con el agua. Este procedimiento tiene las ventajas de su extrema simplicidad y su bajo riesgo de degradacin lipdica. Su mayor limitacin est en la solubilidad de los lpidos en etanol y el volumen de etanol que puede introducirse en el medio acuoso, lo cual limita la cantidad de lpidos que se pueden dispersar. Otra desventaja es la dificultad de extraer completamente las trazas de etanol de las membranas liposomales. Cuando los lpidos se encuentran disueltos en ter, se inyectan lentamente en una fase acuosa a una temperatura en la cual el solvente orgnico se evapora durante el proceso. Con este mtodo, se corre un poco el riesgo de causar degradaciones oxidativas de los lpidos, y se puede introducir cantidades mayores de estas molculas. La desventaja es el tiempo necesario para hacer la preparacin liposomal y el cuidadoso control para introducir la solucin lipdica, requirindose un sistema mecnico para bombear la solucin etrea. El mtodo de la fase reversa ha sido el ms ampliamente aceptado para la preparacin de LUV. Este procedimiento consta bsicamente de dos etapas: en la primera se forma la emulsin fase orgnica-fase acuosa (FO/FA) por sonicacin de la mezcla aguater, en la que se encuentran disueltos soluto y lpido,

respectivamente. En segundo lugar, se procede a la eliminacin del ter con formacin de un gel estable, ruptura del gel e inversin de la fase mediante vaco y agitacin simultnea. La encapsulacin en MLV tiene como ventaja fundamental la capacidad de retencin de solutos, debido a su estructura multilaminar. En contrapartida, el pequeo volumen interno de estas preparaciones conduce a rendimientos bajos. Con los MLV se pueden obtener rendimientos de hasta un 38 %; por deshidratacin-rehidratacin se alcanza hasta un 50 %, y los ms recientes rinden valores de hasta un 88 % (congelacin-descongelacin).

Inmovilizacin de las vitaminas antioxidantes mediante las tcnicas liposomales

Tamao de los liposomas
Se utiliz la tcnica de gel exclusin con Sephadex G-75, la que permite dar un tamao homogneo a los liposomas. Al observar las cifras que aparecen en la tabla 1, vemos que los liposomas mantienen aproximadamente el mismo tamao con independencia del soluto atrapado.

TABLA 1. MEDIDAS DEL DIMETRO DE LOS LIPOSOMAS

CONTENIDO ATRAPADO

DIMETRO (micras )

Vitamina A

2,02

Vitamina E

2,1

Vitamina C

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En la literatura, el rango de los liposomas oscila entre 25 nm, y aquellos que pueden ser visibles bajo la luz del microscopio con un dimetro de 1 000 nm o ms igual a las dimensiones de una clula viviente. Varios autores proponen determinadas dimensiones; por ejemplo, Chvez plantea la siguiente distribucin: SUV dimetro 20-50 nm, MLV dimetro 400-3 500 nm y LUV dimetro 70-200 nm, mientras que Saviz y Chantres plantean que los liposomas oscilan los tres (SUV, LUV y MLUV) entre 0,02 micrmetro y 3,5 micrmetro. Cada autor propone un tamao de acuerdo con las condiciones de trabajo, pero todos coinciden con que el tamao de los liposomas, en sentido general, oscila entre pocos micrmetros hasta 10 micrmetros.

Los esteroles son componentes importantes de las membranas, y entre ellos el predominante es el colesterol, el cual se encuentra en una relacin molar con la fosfatidilcolina de 1:1 1:2, dependiendo de la anatoma y la localizacin celular. De acuerdo con el objetivo en este trabajo, y por experiencias previas, la composicin qumica de las membranas liposomales preparadas fueron de lecitina y colesterol en el rango de relacion molar 1:1, partiendo de soluciones madres de 10 mg/mL para la lecitina y el colesterol, respectivamente, preparadas en una mezcla de cloroformo:metanol (2:1, v:v).

Composicin qumica
Los constituyentes qumicos determinan algunas propiedades en los liposomas como fluidez de la membrana, densidad de carga y permeabilidad. Los lpidos componentes de la membrana celular son de diferentes clases de molculas, con un amplio rango de funciones. Permiten un mejor entendimiento de la barrera de permeabilidad entre compartimientos subcelulares y la clula y su medio ambiente. Los lpidos desempean un papel importante en la regulacin de la actividad de membranas asociadas a enzimas, adems de ser almacn de reservas de energas celulares, como forma de transporte de combustible metablico y como agente de proteccin de las paredes celulares, y representan el 40 % de la masa seca total, siendo los ms comunes las molculas de fosfatidilcolinas, conocidas como lecitinas.

ndices evaluativos de la inmovilizacin de las vitaminas A, E y C en los liposomas MLVs

Fueron utilizados los tres ndices bsicos que se emplean en los estudios de inmovilizacin de biomolculas. A continuacin se abordan cada uno de ellos.

Rendimiento de encapsulacin
La fraccin de vitamina incorporada al liposoma con relacin al total aadido y multiplicada por 100, representa el por ciento de encapsulacin. Las vitaminas se utilizaron en las relaciones molares de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1, respectivamente respecto a la cantidad de fosfatidilcolina. Se realiz la determinacin espectrofotomtrica antes y despus de su purificacin en Sephadex G-75 de las vitaminas A y E, y la valoracin en la vitamina C, midiendo la presencia de vitamina en el sobrenadante y en el precipitado. El clculo de los valores se realiz mediante la expresin:

Re n dim iento de encapsulacin en %( RE ) =

Moles encapsuldos o inmovilizados ( ME ) 100 Moles aplicados o total ( MT )

encuentra entre 52 y 65,4 %, valores que concuerdan con los datos de la literatura consultada.

Los resultados son mostrados en la tabla 2. En todos los casos, el por ciento de encapsulacin se

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TABLA 2. VALORES PROMEDIOS DE LOS POR CIENTOS DE RENDIMIENTO DE ENCAPSULACIN DE LAS VITAMINAS A, E Y C, RESPECTIVAMENTE, EN LIPOSOMAS MLVS, EN DIFERENTES RELACIONES MOLARES; SE COMPARA CON LOS LIPOSOMAS SIN VITAMINAS (S)

Condicin

Relaciones molares

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

58,31

54,10

55,32

57,10

65,40

56,20

50,20

52,29

53,29

64,60

54,84

56,22

52,00

60,00

61,90

0,01

Para liposomas del tipo MLV, considerados liposomas madres, a raz de los cuales se parte para realizar otras preparaciones liposomales, se tiene previsto un por ciento de encapsulacin desde un 30 a un 60 %, que pueden ser mejorados por las tcnicas antes mencionadas (congelacin-descongelacin, hidratacin-rehidratacin, etctera). En este trabajo, los por cientos de encapsulacin sobrepasan la cifra de 30, y las vitaminas A y E se colocan en la bicapa lipdica, y la vitamina C en la capa acuosa. El anlisis estadstico demostr, que existen diferencias significativas entre las cantidades de sustancias encapsuladas en los diferentes tratamientos, por lo que se decidi realizar el test de Duncan, el cual arroj que la media muestral de la relacin molar 1, es significativamente diferente del resto, mientras que las restantes medias muestrales son iguales.

En cuanto a la naturaleza hidrosoluble o liposoluble de la vitamina, tampoco se encontr en nuestro experimento diferencias del por ciento de rendimiento de encapsulacin, motivado esto, posiblemente, a que todos los liposomas fueron MLVs, y diseados mediante la misma tecnologa experimental y, adems, con tamaos algo similares, segn las medidas realizadas luego de pasarlos a travs de columna de Sephadex G-75, lo que uniformiza sus tallas.

Eficiencia de encapsulacin liposomas

Otro de los aspectos para tener en cuenta en las investigaciones relacionadas con liposomas, es la eficiencia de atrapamiento. Este parmetro puede ser modificado atendiendo a la tecnologa empleada, concentracin y composicin lipdica, utilizada en la obtencin de esas vesculas. El clculo de este ndice se realza mediante la siguiente expresin:
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Por ciento de eficiencia de encapsulacin =

Moles de sustratos encapsulados 100 Moles de lpidos ( de fosfolpidos)

el liposoma, desempean un papel importante. Estos enlaces se consideran dbiles cuando cada uno acta por separado, pero que unidos son los que estabilizan el liposoma, requiriendo determinadas fuerzas para su ruptura. De la tabla 3 se hace evidente, que con el incremento de la relacin molar existe un incremento en el por ciento de eficiencia, similar en todos los casos, y que en la relacin molar 1 alcanza los valores mayores, siendo estos resultados buenos, no as en las relaciones molares menores. Se escoge la relacin molar 1 como la de mayor eficiencia de encapsulacin.

La tabla 3 relaciona los valores de eficiencias con las relaciones molares, observndose que la eficiencia crece a medidas que aumenta la concentracin de vitamina aadida, logrando un valor mximo de 79,01 % y un mnimo de 11,62 %. Este parmetro es similar al reportado por Schimiddetk, el cual plantea, que los valores de eficiencia estn entre 30 y 70 %, por lo que debe existir un compromiso entre lo encapsulado y la eficiencia de atrapamiento. El liposoma creado debe permitir un intercambio de la sustancia objeto de estudio con el exterior. En esto, los enlaces que se hayan establecidos al formar

TABLA 3. VALORES EN % DE LA EFICIENCIA DE ENCAPSULACIN DE LOS LIPOSOMAS MLVs EN CINCO RELACIONES MOLARES DE FOSFATIDILCOLINA/COLESTEROL, Y CON LA ENCAPSULACIN DE LAS VITAMINAS A, E Y C. SI INDICA, ADEMS, EN AUSENCIA DE VITAMINAS

Relaciones molares Condiciones A E C S 0,2 13,01 11,62 11,84 0,00 0,4 16,0 17,93 16,90 0,00 0,6 33,96 33,07 35,12 0,00 0,8 43,21 44,70 47,00 0,00 1,0 70,20 69,92 79,01 0,00

El por ciento de eficiencia de encapsulacin de la vitamina hidrosoluble C, atrapado en los liposomas MLVs, result significativamente diferente (p = 0,95) de los por cientos de encapsulacin de las vitaminas liposolubles A y E , pero no entre las dos ltimas, lo cual se supone que est condicionado por las diferencias de fases, de mayor empaquetamiento en la fase de membrana, que en la fase acuosa liposomal, y no a las solubilidades en s de las vitaminas empleadas.

Otro posible factor es el de los volmenes fsicos diferentes que ocupan estas fases, tericamente esperados, la fase acuosa y la fase lipdica. Por ltimo es necesario resaltar que las vitaminas A y E poseen caractersticas estructurales a escala molecular diferentes. Sin embargo, al no ser la eficiencia de encapsulacin estadsticamente diferente, la conformacin molecular per se, parece no estar influyendo en este porcentaje.

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Las medias de las vitaminas A, E y C son realmente diferentes entre ellas en la relacin molar 1 y la de esta relacin molar respecto a las dems relaciones molares. Que la relacin molar 1 result de un mejor comportamiento respecto a las dems relaciones molares, lo que es evidente cuando observamos grficamente los resultados:
EFICIENCIA DE ENCAPSULACION
90 80 70 60 % D E EF I C I EN C I A D E 50 EN C A P S U L A C I ON 40 30 20 10 0 0,2 0,4 0,6 R EL A C I ON M O LA R 0,8 1 Vit amina A Vit amina E Vit amina C

Grfica 1. Por cientos de eficiencia de encapsulacin de las vitaminas A, E y C.

El eje X representa las relaciones molares de la PC/colesterol en orden creciente.

Estabilidad funcional y anlisis de la permeabilidad de los liposomas diseados

En la caracterizacin liposomal no basta slo el por ciento de encapsulacin y la eficiencia de encapsulacin, sino que es necesario evaluar, al menos, algn parmetro que caracterice la estabilidad de la preparacin. Esto tiene an mayor importancia cuando se trata de preparar liposomas de diferentes relaciones molares. En el estudio de estabilidad pueden utilizarse diferentes procedimientos, y uno de ellos es medir la liberacin de una molcula indicadora encapsulada en la vescula por almacenamiento en determinadas condiciones. La sustancia escogida en este caso es el citocromo C, de peso molecular 12 500, y se lee espectrofotomtricamente a 410 nm. La liberacin fue cuantificada durante un perodo de 21 das, mantenidos a 4 C . De las muestras se tom 1 mL a los 7, 14 y 21 d, y se analiz la presencia de citocromo C. Se observ, que al aumentar el perodo en das existe un mayor por ciento de liberacin en cada una de las relaciones molares, teniendo el mayor valor de liberacin la relacin molar 1.

El citocromo C, se encapsula en la parte hidroflica. Para poder ser llevado al exterior y detectarse, tiene que atravesar las membranas lipdicas, indicando rompimiento de lminas para liberar su contenido al exterior. La estabilidad est estrechamente relacionada con las caractersticas de los liposomas, mientras ms estables son sus bicapas, menor es la cantidad de sustancia que se libera al exterior, excepto por difusin, y est ligada de manera lineal con la temperatura de transicin del fosfolpido (lecitina), que en este caso est entre menos 15 C y menos 5 oC. Esta temperatura es la de transicin entre la fase gel ordenada y la lquido-cristal ms desordenada, Analizamos que en este caso tienen todos las mismas posibilidades, pues la temperatura de almacenaje es de 4 oC, la cual est por encima de la temperatura de transicin (Tc). En la tabla 4 se indican las cifras correspondientes al ensayo realizado con citocromo C en liposomas con cinco relaciones molares de lecitina/colesterol. El contenido relativo del colesterol influye en la rigidez de la membrana y en su permeabilidad. En el caso especfico de los liposomas, dado su destino, es necesario llegar a un equilibrio en el que libere su contenido, pero que lo haga con una
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dosificacin deseada en el rgano o tejido diana. Variando la cantidad y tipos de lpidos constituyentes en su membrana, se logran resultados satisfactorios en cuanto a estos dos propsitos.

El experimentador incide en los siguientes ndices de los liposomas: tamao, nmero de lminas, volumen interno, cantidad de captura, permeabilidad y direccionabilidad de los mismos.

TABLA 4. LIBERACIN DE CITOCROMO C EN POR CIENTO DESDE LOS LIPOSOMAS MLVs DURANTE 21 DAS. LAS SEIS PRIMERAS COLUMNAS INDICAN LOS VALORES PROMEDIOS ACUMULADOS, RESPECTIVAMENTE, Y EN LA LTIMA LOS INCREMENTOS PARTICULARES EN CADA SEMANA

Tiempo ( Das )

Relaciones molares Incremento 0,2 0,4 0 0,6 0 0,8 0 1,0 0 Promedio semanal 0 0

12

21,69

18,86

13,19

18,98

16,94

2,42

14

15,9

30,6

26,35

20,50

31,79

26,23

1,33

21

21,79

43,05

37,07

37,07

44,66

36,73

1,50

Las grficas 2 y 3 resaltan aspectos cualitativos de la permeabilidad de los MLVs obtenidos. As, miden la funcionabilidad de los MLVs, y tambin es un criterio sobre la magnitud de la permeabilidad de la membrana liposomal al citocromo C en el tiempo, independiente de las relaciones molares. Para fin de los liposomas que se requieren en este trabajo, hay que lograr que liberen el soluto atrapado. En este caso, por tratarse de vitaminas antioxidantes, cuyos efectos sern sobre los tejidos, especialmente sobre la dermis, es necesario una liberacin del contenido atrapado de forma controlada. Al finalizar las tres semanas de almacenaje de los MLVs, se haba liberado el 36,73 % de su contenido, lo que representa algo ms de la tercera parte. Esto permitira su comercializacin al mantener su

potencialidad an a las tres semanas de creados, con 2/3 de su contenido inicial, con las posibles variaciones esperadas cuando se trate de vitaminas en lugar del citocromo C. Un factor importante en el propsito anteriormente indicado, y que influye directamente en las caractersticas y en la permeabilidad, en especial, de las membranas lipdicas y lipoprotecas, lo constituyen las cantidades relativas de los fosfolpidos y el colesterol. Un incremento relativo en el colesterol se traduce en una membrana ms fluida y ms porosa, mientras que una disminucin de este ndice resulta lo contrario. Cuando el biotecnlogo disea un liposoma para que cumpla su propsito deseado, tiene en sus manos la herramienta de poder variar las relaciones molares

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de los constituyentes de las membranas y su naturaleza. Con las relaciones molares ensayadas se encontr un comportamiento que oscila entre un 30 % y un 45 % de citocromo C liberado, pero con un comportamiento
50 45 40 35 % de liberacin 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 Dias

ms estable en la relacin molar 1 (es una lnea recta). Otro aspecto analizable es el comportamiento de la liberacin del soluto atrapado en los perodos de tiempo.

Rel. Mol. 0,2 Rel. Mol. 0,4 Rel. Mol 0,6 Rel. Mol. 0,8 Rel. Mol. 1

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20

25

Grfica 2. Comparacin de la liberacin de citocromo C desde 0 a 21 das, a partir de los liposomas MLVs de cinco relaciones molares de la PC/colesterol.

En la grfica 3 aparece, que en la primera semana se libera un por ciento de citocromo C superior al de las respectivas semanas siguientes. En las semanas 1, 2 y 3 se liberaron 2,42 %, 1,33 % y 1,50 %, respectivamente. Con esta salida del soluto atrapado, se va equiparando la concentracin del mismo dentro y fuera del liposoma. Por los resultados que se indican en esta grfica, se evalan las relaciones molares de PC/colesterol de adecuadas, aunque existe una salida mayor del soluto en la primera semana. Estadsticamente se diferencian del resultado de la relacin molar en 0,8 el de los 7, 14 das, y en la relacin molar 1. El de la relacin molar 0,2 es diferente del de 0,4 y 0,6. El de la relacin molar 0 respecto a 0,2 y 0,8.

Oxidacin de los fosfolpidos liposomales

Todos los cidos grasos sufren degradacin oxidativa a causa del oxgeno atmosfrico y la accin cataltica de varios agentes comunes en los sistemas biolgicos (Hb, Fe, Zn, radicales libres, etctera.). Los cidos grasos son partes constitutivas de los fosfolpidos, molculas imprescindibles en las biomembranas. Los cidos grasos insaturados y conjugados son los ms proclives a la oxidacin, aunque realmente todos se oxidan, incluyendo los insaturados. Estos eventos de oxidacin de los fosfolpidos mediante la formacin de hidroperxidos y endoperxidos, son eventos dainos, ya que afectan a la actividad de las membranas.
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PROMEDIO SEMANAL DE CITOCROMO C LIBERADO

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 SEMANAS 3

Grfica 3. Comparacin del promedio de citocromo C liberado en cada semana, independiente una de otra, desde los liposomas MLVs de relacin molar 1 de PC/colesterol.

Los agentes antioxidantes como las vitaminas A, E y C es proteger a las clulas de estos efectos dainos. A continuacin podemos observar el efecto protector de estas vitaminas.

% DE LIBERACION

En la tabla 5 y el grfica 4, se muestran los resultados de un experimento de 120 das de duracin con las vitaminas A, E , C, y sin vitaminas en liposomas PC/colesterol y relacin molar 1.

TABLA 5. RESULTADOS DE LA PEROXIDACIN DE LOS FOSFOLPIDOS DE LOS LIPOSOMAS (PC) HASTA LOS 120 DAS DE ALMACENAJE EN REFRIGERACIN A 4 C, EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE VITAMINAS A, E Y C, RESPECTIVAMENTE

Tiempo (Das) Condicin 0 A 1,99 E 2,03 2,04 2,17 2,48 2,40 2,49 2,52 3,24 3,20 3,94 3,80 3 12 21 72 120

2,02

2,31

2,78

2,93

3,66

4,05

Sinvitaminas Con vitaminas

1,99 2,02

2,61 2,17

2,86 2,55

3,09 2,65

4,23 3,36

4,96 3,93

En las dos ltimas filas aparecen los valores promedios sin y con vitaminas en general. El experimento slo responde a la relacin molar 1.

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Cuando se comparan las muestras sin vitaminas respecto con las que poseen vitaminas, partiendo de una igualdad de condiciones, se nota una tendencia general, en todos los casos, de un incremento en la peroxidacin, pero es mayor sin las vitaminas. Se observa una mayor proteccin por parte de las vitaminas A y E, aunque ligera, en relacin con la vitamina C. Si se tiene en cuenta que, cerca del tiempo cero ya exista, aproximadamente un 2 % de peroxidacin, al cabo de 120 das lleg a un 4 %, es decir, que en ese perodo la oxidacin fue aproximadamente de un 2 % si no estaban presentes las vitaminas antioxidantes, y

de slo 1 % 1 % y decimales, si contenan las vitaminas mencionadas. Hay que tener presente, que por la ubicacin de estas vitaminas en los liposomas, no hay una proteccin de la peroxidacin en la capa externa de los liposomas. Los lpidos superficiales estn ms expuestos a la oxidacin a pesar de los procesos difusionales de las vitaminas y el oxgeno. A medida que aumenta la temperatura, es ms rpida la peroxidacin, notndose esto bien entre las temperaturas de 37 y 60 grados. A 37 grados, la peroxidacin aumenta, pero a 60 es ms rpida.

5 % DE PEROXIDACION

4 Vitamina E 3 Vitamina A Vitamina C Sin vitaminas 2

0 0 3 12 21 72 120 TIEMPOS (DIAS )

Grfica 4. Se representa comparativamente el % de peroxidacin de la fosfatidilcolina de los liposomas MLVs en presencia y ausencia de las vitaminas.

Sustancias antioxidantes tales como vitamina E y A, son capaces de reducir el nmero de radicales libres que se forman normalmente durante un proceso de oxidacin, y por tanto, bajan las velocidades de oxidacin, y prolongan el perodo conocido como induccin. Se observ un efecto protector de las vitaminas A, E y C, lo que se indica por la disminucin de la peroxidacin de la fosfatidilcolina (PC), siendo mucho ms efectivas las vitaminas A y E, lo que concuerda

con la literatura revisada y los resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio. Es probable la conversin de buena parte del cido ascrbico en cido dihidroascrbico por la accin del oxgeno atmosfrico y la luz, as tambin como el incremento de la temperatura. Existe una profusa literatura sobre los efectos en ese sentido de los agentes sealados anteriormente, todo lo cual se corrobora en nuestro trabajo.

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El alcance presente y futuro de las tecnologas liposomales

Hoy se preparan muchas aplicaciones prometedoras. En un futuro, los liposomas superarn, posiblemente, la fase de curiosidad del laboratorio para entrar en nuestras vidas, porque es cierto que an no han acabado de descubrirnos todos sus secretos, por tanto, cualquier esperanza es permisible. Actualmente, se contina realizando estudios, extendindose el campo de aplicacin de los liposomas a diferentes reas de investigaciones, tales como: Modelo de membranas para el estudio de la influencia en la composicin lipdica y el funcionamiento de estas estructuras. Adyuvantes para aumentar la respuesta inmune no especfica. Vehiculizador de sustancias para su liberacin a macrfagos. Reduccin de toxicidad de algunas drogas. Proteccin del contenido encapsulado, por tanto, reduccin de la lisis, metabolismo y eliminacin de las drogas encapsuladas. Direccionalidad: administracin local y especfica de drogas. Transferencia de genes a clulas especficas. En un breve resumen de lo que se hace en este campo a nivel mundial, tenemos: Surfactantes Reconocimiento del dominio carbohidrato de la protena A surfactante es crtica para la secrecin a partir de clulas tipo II y calcio en liposomas. Se investig la creacin de surfactantes artificiales para ser aplicados en pacientes portadores del Sndrome Distrfico Respiratorio (RDS). stos requieren de un sistema de lpidos que permitan la aplicacin en forma de finas gotas en el aire, lo cual lograron mediante el empleo de liposomas.

Virus Otros estudios con liposomas portadores del virus de la influenza, y en estudios de fusin mediados por streptavidina, se han realizado con resultados prometedores. En la actualidad, an continan los ensayos con liposomas, tratando de encontrar una solucin a la pandemia del SIDA. Se ha reportado informacin sobre la utilizacin de liposomas catinicos transportadores de oligonucletidos antisense, ribozimas y genes teraputicos en pacientes HIV-1. Se demostr, que las clulas infestadas-HIV-1 son ms susceptibles que las clulas no infestadas a morir por la accin de los liposomas catinicos. Todava se desconoce la causa molecular de estas diferencias. Nuevos estudios sobre el efecto depresor de la permeabilidad de las membranas, aportan Guillod et al. El intercambio de protenas entre el virus de la influenza y liposomas con dicetilfosfato o cido esterico. Estudios sobre HIV realizaron Pereira et al., valindose de liposomas. Drogas Los liposomas son tiles para transportar drogas al cerebro. La toxicidad y los efectos colaterales de la 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina (THA), de accin en el Sistema Nervioso Central, se redujeron al ser encapsulados en DRV. La transfeccin de resistencia a drogas, constituye otro de los campos donde los liposomas estn siendo aplicados en las respectivas investigaciones. Los liposomas son un vehculo importante en la transportacin de drogas. En los tipos de liposomas y consideraciones farmacocinticas, dos tipos de liposomas son habitualmente usados: vesculas multilamelares (VML; 1 a 5 mm) y vesculas unilamelares (VUL; 0,05-0,2 mm). Las VML estn formadas por capas concntricas de fosfolpidos, en las que el compartimiento acuoso est reducido, por lo que son muy tiles para encapsular drogas lipoflicas.

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Cuando estos liposomas son sometidos a sonicacin o extrusin a travs de filtros, se forman VUL. Existen dos tipos de VUL: pequeos (menos de 0,1 mm) y grandes (entre 0,1 y 0,25 mm). En general, las VUL son mejores para transportar drogas hidroflicas. La utilidad mdica de estos liposomas convencionales se ve limitada por la rpida fagocitosis por las clulas del sistema reticuloendotelial (SRE), fundamentalmente en hgado y bazo. Aunque esta caracterstica es til cuando los liposomas se utilizan para transportar drogas en el tratamiento de ciertos procesos infecciosos en los que el SRE es el rgano diana, no lo es tanto cuando se utilizan para el tratamiento de tumores. El uso de VUL pequeas que puedan penetrar en las clulas tumorales por mecanismos de endocitosis y pinocitosis, soslaya, en parte, este problema. Por otro lado, en la actualidad se estn desarrollando nuevos liposomas en los que se les incorporan pequeas cantidades de glicolpidos con carga negativa, que los vuelve ms hidrfilos y reduce la opsonizacin y fagocitosis por el SRE. Estos liposomas permanecen en sangre cien veces ms que los liposomas convencionales, y pueden as aumentar la eficacia farmacolgica de las drogas encapsuladas. La mayora de agentes quimioterpicos usados para el tratamiento del cncer, poseen un ndice teraputico estrecho que da lugar a efectos adversos severos, e impiden usar la droga en la dosis necesaria para que la misma sea ms eficaz. Los liposomas pueden ser utilizados para modificar la biodistribucin de la droga citotxica, aumentando la selectividad por el tumor, y reduciendo el dao en otros tejidos. El objetivo final sera poder aumentar el ndice teraputico de la droga, para as poder explorar el potencial de curabilidad de los agentes quimioterpicos de los que se dispone en la actualidad. Estudios clnicos con antraciclinas atrapadas en lpidos. Las antraciclinas, y en especial la doxorrubicina, poseen un amplio espectro de actividades biolgicas que incluyen tratamiento de linfomas, mieloma, sarcoma, carcinoma de ovario, cncer de mama y otros tumores slidos.

El principal problema asociado a su uso es la cardiotoxicidad, por lo que no se recomiendan dosis acumulativas que excedan los 500 mg/m2. El desarrollo de un transportador que disminuya la liberacin de la droga en el msculo cardaco sin disminuir su actividad antitumoral, aumentar su ndice teraputico. Los liposomas atrapan eficientemente la doxorrubicina y pueden cumplir este objetivo teraputico.

Liposomas como transportadores de agentes modificadores de la respuesta biolgica

Desde dcadas pasadas, las drogas encapsuladas en liposomas, han sido objeto de estudio como una posible alternativa a las preparaciones existentes. El primer estudio experimental usado con sustancia encapsulada fue la triancinolona en 1979, donde se observaba una mejor distribucin selectiva de la droga, as como un incremento del tiempo de vida de la droga en la piel del individuo. Inmunologa En la Ciencia de la Inmunologa, se ha hecho amplio uso de los liposomas. Por ejemplo, utilizando antgenos para la influenza, encapsulados en liposomas con y sin adyuvantes, induce respuesta de anticuerpos en ratones transformados. Estos resultados ilustran la utilidad de este modelo para el uso de estudios en la vacunacin humana, y demuestran que el antgeno de la influenza, aplicado en vesculas liposomales selectivamente, promueve slo respuesta Th1, mientras que los antgenos libres promueven, adems, respuesta Th2 in vivo. La participacin de los macrfagos en los mecanismos de defensa, tanto inmunes como no inmunes, la abordaron Buiting et al., valindose de liposomas. En los estudios biotecnolgicos, en ocasiones, se requieren caractersticas especficas del material de ensayo. As, se han creado liposomas unilaminares gigantes para el anlisis de la interaccin entre la membrana del retculo endoplasmtico y membranas con protenas unidas, como podrn ser anticuerpos, por ejemplo.

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En 1994 ya se tienen inmunoliposomas tiles en aplicaciones terapetica y diagnstica; estudios inmunolgicos relacionados con el VIH, efecto adyuvante y otros aspectos. En los ltimos aos, se han realizado estudios inmunolgicos haciendo uso de los liposomas. Una interesante e ingeniosa va de investigacin se comenz en el Departamento de Bioqumica e Inmunologa de la Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil, al utilizar las tcnicas liposomales para obtener anticuerpos contra fuertes venenos mortales de escorpiones sudamericanos, como el Tityus serrulatus. Para ello, el veneno de este arcnido se encierra en liposomas, se trata con tripsina para disminuir su toxicidad, y se aplica en ratas para la obtencin de anticuerpos. Sin el empleo de los liposomas, la aplicacin de los mtodos inmunolgicos no era posible por la alta toxicidad de estos venenos. En 1997, se estudi la interaccin de liposomas catinicos y las protenas, mecanismos qumico-fsicos de su accin inmunoadyuvante. Liposomas cargados positivamente funcionan como inmunoadyuvantes efectivos. Se ha demostrado que, cuando en los liposomas existen protenas incorporadas en la superficie, estos liposomas son inmunognicos. Administracin de dosis reiteradas de ellos desarrollan la aparicin de anticuerpos contra estos liposomas, lo cual es un problema, ya que afecta su utlizacin farmacolgica. En estudios de inmuno-ensayos se emplean liposomas. Se prepararon inmunoliposomas para estudios inmunolgicos con la bacteria oral Streptococcus oralis. Otro campo de investigacin interesante es el uso de liposomas como transportadores de sustancias inmunomoduladoras. En este caso, los liposomas son atrapados con facilidad por monocitos y otras clulas del SRE, ejerciendo en ella su accin. ste es el caso de los muramil-dipptidos, que son sustancias estructuralmente relacionadas con ciertos constituyentes de las membranas de las paredes bacterianas, y que han demostrado tener una actividad antitumoral en estudios in vitro mediante la activacin del sistema monoctico /15/.

Otros inmunomoduladores que se estn probando son la interleucina-2 y el interfern-g. Numerosos ensayos clnicos se estn realizando en el momento actual para demostrar esta hiptesis; interaccin de liposomas catinicos y las protenas, mecanismos qumico-fsicos de su accin inmuno-adyuvante. Vacunas En la preparacin de una vacuna contra el SIDA, se estudi la inmunogenicidad de la regin del lazo V3 de la protena gp 120 de HIV-1. En estos estudios, los liposomas han sido utilizados con resultados para aumentar la respuesta inmune. El estudio in vivo del candidato vacunal DNA HIV-1-especfico (pCMV160/REV) en liposomas catinicos, puede ser positivo. La posibilidad del empleo de los liposomas en vacunas orales, est siendo investigada. Se han diseado liposomas con mensajeros caractersticos; se prepararon liposomas con vacunas recombinantes contra Plasmodium falciparum Energa Groth y Walker (1996) lograron liposomas conteniendo las enzimas mitocondriales para la sntesis de ATP, la cual ocurri. En el campo de la energtica, tambin los liposomas han sido tiles, en especfico, en el clculo de la entalpia, utilizando el mtodo de la polarizacin fluorescente. Se requieren unos diez moles, por lo que comparado con los procedimientos clsicos de la calorimetra estndar, resulta ventajosa la tcnica liposomal. El monitoreo de la temperatura mediante la medida de la fluorescencia dada por la liberacin de tintes desde liposomas, inducida por lser. La gran utilidad que posee este proceder es que permite predecir el posible dao trmico en los tejidos.

Estudios de la transferencia de energa por resonancia fluorescente con el uso de lisofosfatidil colina fluorescente
Estudios de las reacciones fotosintticas indicaron mejores resultados con liposomas positivos que con neutros o negativos, liposomas que remedan a las

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mitocondrias, integrados por los lpidos de la membrana interna de las mitocondrias. Coello demostr, en el ao 1997, que la permeabilidad protnica en las mitocondrias, necesaria para la vital sntesis de ATP, no est correlacionada con la composicin de fosfolpidos y sus cidos grasos.

catinicos en la transferencia de genes en clulas in vitro. cido nucleico atrapado en liposomas result eficiente. Uso de los lioposomas en la transferencia de DNA. Investigadores indican la posibilidad de la terapia gnica renal en ciertas enfermedades de este rgano, mediada por liposomas. La utilidad de los liposomas catinicos en la transferencia de material gentico. Un nuevo sistema de transmitir genes evita la utilizacin de vectores virales o el uso de mtodos invasivos. Con genes contenidos en liposomas se logra vencer la barrera cerebral. La utilizacin de liposomas en terapia gnica puede evitar la necesidad del uso de vectores virales y mtodos invasivos para la administracin de los genes manipulados mediante la Ingeniera Gentica. Un equipo de la Universidad de California, en Los ngeles, Estados Unidos, desarroll un sistema no invasivo para la administracin de genes teraputicos en el interior del cerebro y, de esta forma, evitar el obstculo que supone la barrera hematoenceflica, una pared capilar que protege al cerebro de la introduccin de la mayora de los compuestos presentes en la corriente sangunea. Los investigadores que publican hoy sus resultados en Proceedings of the National Academy of Sciences, sealan que esta aproximacin en terapia gnica podra ser posible en humanos con el empleo de anticuerpos que seleccionarn los receptores diana en el cerebro humano, como el receptor de insulina. Para resolver este obstculo, los expertos han recubierto los genes con liposomas o clulas grasas con miles de filamentos cerleos, que desempean dos funciones: aumentar la estabilidad y la duracin de los liposomas en sangre, y ligar las clulas grasas a los anticuerpos diana del cerebro. Cuando se inyectaron intravenosamente en ratas, se vio que dos genes diferentes han sido capaces de cruzar la barrera hematoenceflica y las membranas neuronales, explican. En el ao de 1994 investigadores reportaron la creacin de liposomas catinicos tiles en la transfeccin de genes.

Sobrevivencia
Arbutin es una hidroquinina glicosilada que est en alta concentracin en ciertas plantas capaces de sobrevivir a una deshidratacin extrema y sostenida. Dada esta caracterstica, arbutin posee un posible rol como anhidrobiosis. As, por ejemplo, podra preservar a los liposomas durante la fase de deshidratacin. En este sentido, se realizan estudios.

DNA y genes
La transferencia exitosa de genes con el uso de los liposomas, es otro de los logros biotecnolgicos recientes. A ratones parcialmente hepatotectmicos se les transfiri el gen de origen humano alfa 1-antitripsina (AAT), y tambin a animales no hepatotectmicos parciales. El gen est localizado en el plsmido pTG7101, el cual fue incorporado a pequeos liposomas de fosfatidilserina (negativos) o de lpidos cargados positivamente (DOTAP). Por ms de cinco meses, se observ, mediante ELISA en el plasma del ratn, la presencia de la protena humana. Novedoso resulta el procedimiento que permite, de forma rpida y por identificacin visual, especificar la secuencia del DNA por medio de liposomas tarjetados con secuencias conocidas de DNA. El procedimiento utiliza tinte rojo y marcado radiactivamente, logrndose el resultado en menos de 10 min un DNA-tagged liposomes. Hay liposomas catinicos capaces de transferir DNA no viral. Se han realizado considerables esfuerzos en el desarrollo de estrategias de transferencias de genes eficientes. Se han desarrollado mtodos virales y no virales, pero estos mecanismos genticos son an pobremente entendidos. Estudios relacionados con estos mecanismos se realizan con la utilizacin de los liposomas. Optimizacin de los parmetros de liposomas

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Permeabilidad Existen pptidos capaces de incrementar la permeabilidad de los vasos sanguneos hacia tejidos especficos, permitiendo la salida de los liposomas hacia esos tejidos. Los pptidos P (SP) en ratas, facilitan, as, la salida de los liposomas desde los capilares hacia los tejidos especficos, donde se encuentran receptores dianas, como son trqueas, esfagos, vejiga urinaria. Tales liposomas pueden portar una variedad de agentes farmacolgicos que pueden ser liberados localmente en los tejidos dianas seleccionados para los propsitos teraputicos. La aplicacin de vanadato en msculo mediante liposomas, y su relacin con el incremento del transporte de glucosa, ha sido objeto de investigacin por Kristiansen et al. La alfa 1-cido glicoprotena influye en la permeabilidad de las membranas celulares mediante la utilizacin de liposomas que indagan sobre el mecanismo de este efecto. Varios cientficos realizaron estudios sobre el comportamiento difusional de los liposomas y, en general, sobre las vesculas. Se realizaron estudios sobre la permeabilidad de la barrera sangunea cerebral a analgsicos como la encefalina y la bifalina. La difusin del zinc en las bicapas lipdicas fue analizada. La permeabilidad de dichas bicapasy los estudios de bioluminiscencia tambin se han apoyado en los liposomas. Se analiz la difusin del zinc en las bicapas lipdicas. La permeabilidad de las biomembranas es fundamental para la vida, por ello, en 1997, se realizaron estudios de permeabilidad con liposomas. Etanol La metodologa avanzada en la optimizacin del proceso de produccin de etanol en cultivos con alta densidad de clulas, procura incrementar la utilizacin del sustrato y tratar de eliminar la fase de crecimiento celular y de productos secundarios, as como el aumento de la productividad volumtrica, con lo cual se reducen los costos. Para lograr esto, las investigaciones estn dirigidas a obtener clulas genticamente adaptadas a concentraciones de etanol superiores a 11 %, para

obtener diseos experimentales que impliquen el reciclaje de las clulas en el proceso productivo, y finalmente, otra vertiente de trabajo es la de lograr tecnologas con clulas inmovilizadas. Otro aspecto al que se le presta atencin es lograr sistemas continuos, que permitan mejorar el control del proceso, aunque resulta costoso al tener que evitar la contaminacin. El incremento de la extraccin del etanol tambin es importante. En la actualidad, se ensaya a escala industrial con la bacteria Zymomonas mobnilis, en un proceso anaerbico, continuo e inmovilizado, utilizando el sustrato glucosa, y tambin con la levadura Saccharomices cerevisiae. A diferencia de estos ensayos, nuestra industria de alcohol utiliza diversas cepas de levaduras y bacterias, y a la melaza de nuestra industria azucarera como sustrato, donde existe una mezcla de azcares, siendo el principal la sacarosa, y se acompaan de otros metabolitos diversos. El procedimiento para la produccin de etanol a partir de la caa de azcar, procura la fermentacin de la melaza con una fuente energtica externa; la fermentacin de la melaza en una destilera en la planta de la caa, utilizando la bagaza como fuel; las destileras autnomas, utilizando la bagaza como fuel, as como otras formas ms. Vesculas Un nuevo mtodo para obtener vesculas unilaminares gigantes de 10 a 60 micras de dimetros fue reportado. En ocasiones, en Biotecnologa se requieren mtodos que cumplan con determinados requisitos. La tecnologa de atrapamiento por encapsulacin liposomal a veces se precisa ajustarla a determinadas temperaturas, pH, momentos de clivajes de los liposomas para que liberen su contenido, etctera. Uno de los campos ms prometedores de la tecnologa liposomal es su empleo en la Ingeniera Gentica. Con tales propsitos, se han empleado liposomas catinicos. Los resultados obtenidos sugieren que los liposomas son potentes en la transduccin retroviral.

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Un importante paso en la biodireccionabilidad de los liposomas se est por obtener sobre la creacin de los liposomas bioadhesivos, mediante la modificacin del cido hialurnico. Otra utilidad de los liposomas, y que se utiliza en la actualidad, es sobre las investigaciones de la relacin entre la estructura y las propiedades funcionales de lipoprotenas. Las lysozymas modificadas qumicamente son capaces de provocar agregacin, fusin y destruccin de liposomas. Cncer Los liposomas se han utilizado en las investigaciones sobre el cncer, tanto como vehculos para el transporte de drogas, hasta las clulas cancerosas con independencia, donde se encuentre la creacin de nuevas estrategias para combatir esta enfermedad. Se ha reportado, que liposomas preparados con hexadecilfosfocolina y polietilenglicol, y sus combinaciones, resultan una preparacin prometedora para el tratamiento del cncer mamario, segn ensayos realizados in vitro y en ratas. La posibilidad real del uso de los liposomas en la terapia anticncer, queda claramente expuesta con el reporte. La tolerancia a doxorubicin en el tratamiento del cncer, aumenta al administrarse en liposomas como se ha demostrado. Se encontr, que en cnceres de pecho y ovario, para los cuales es urgente el desarrollo de nuevos regmenes quimioterpicos ms activos, la utilizacin de doxorubicin encapsulado en liposomas (PLD) result ser ms efectivo con una alta velocidad de respuesta (26 %). Con el uso de polietilenglicol, se logr un liposoma portador de doxorubicin ms duradero en sangre y que ejerce el efecto de la droga sobre el tumor slido. Se prepar un liposoma radiactivo que permite localizar el cncer e incrementar su imagen. Fue reportado el efecto inhibitorio sobre el crecimiento de tumores (HL-60) por liposomas hbridos. Peroxidacin Investigadores demostraron la posibilidad de que la peroxidacin de los lpidos de la sangre se inicie mediante hipoclorito generado por la activacin de neutrofilos y monocitos/macrfagos. Llegaron a este

resultado en experimentos de incubacin de liposomas PC con hipoclorito y con tricloruro de hierro, respectivamente. Estudios de peroxidacin por tipos de radiaciones y los radicales formados, se estudiaron con los liposomas, las interacciones de los efectos del hierro, el zinc y la peroxidacin de los lpidos de las membranas. En estudios de la inhibicin de la peroxidacin de lpidos de la yema de huevo (lecitina), empleando liposomas y como inhibidores el beta-caroteno y el alfa-tocoferol, se encontr que el beta caroteno fue ms efectivo. Esta accin demostr el efecto facilitador del aluminio sobre la peroxidacin fosfolipdica mediada por hierro en las membranas del sistema nervioso. Fases Los liposomas y clulas interaccionan en cuatro formas. A diferentes temperaturas, las membranas de lecitinas pueden existir en diferentes fases, y la transicin de una fase a otra puede ser detectada por mtodos fsicos como el incremento de temperatura. A altas temperaturas, se observa en la fase de transicin, que la membrana pasa de una forma o fase gel/slido a lquido cristal, donde la libertad de movimiento de una molcula individual es mayor. En el caso de la PC, la temperatura de transicin es de 15 a 7 oC; comparada con lecitinas de fuentes mamarias que estn en el rango de 0 40 oC. Esto es importante para la manufactura y explotacin del liposoma, ya que esta propiedad influye sobre aspectos como la permeabilidad, fusin, agregacin y enlace con protenas.

Interaccin celular
Los liposomas y clulas interaccionan en cuatro formas. Un liposoma puede primero absorber a la clula de la membrana, donde ste puede liberar su contenido dentro del fluido extracelular; alguno de los contenidos pueden pasar a travs de la membrana dentro de la clula. Otros liposomas son ingeridos por el proceso de endocitosis, y son degradados en orgnulos llamados lisosomas, los cuales liberan el contenido del liposoma dentro del citoplasma. El contenido del liposoma puede entrar directamente al citoplasma si el liposoma se fusiona
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con la membrana de la clula. Un liposoma puede tambin intercambiar sus lpidos con los lpidos de la membrana. Los liposomas son utilizados en los estudios de Biomembranologa para dilucidar los mecanismos y factores que intervienen en las interacciones membrana-membrana; as por ejemplo, se prepar liposomas catinicos mediante el empleo de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol (Chol) y estearilamina (SA). Estas vesculas fosfolipdicas fueron expuestas a un biofilm de bacterias Staphylococcus epidermidis, frente al cual estos liposomas mostraron una gran afinidad de adsorcin, demostrando que la fuerza de adsorcin depende de la fuerza inica del medio, concluyendo que la adsorcin est mediada por efectos electrostticos. Estudios con poblaciones de clulas de diferente hidrofobicidad mostraron que el carcter hidrofbico de las clulas bacterianas tiene efecto sobre la adsorcin de los liposomas. Las estrategias de diseos liposomales, en ocasiones, precisan evitar el fenmeno de la fusin, mientras que en otros es necesaria. Se mostraron, que la exposicin a la luz ultravioleta de dos series de liposomas unilaminares (LUV) compuestos de relaciones molares 3:1 de dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) y 1,2bis[10-(2'-hexadienoyloxy)decanoyl]-sn-glycero-3phosphatidyl-choline (bis-SorbPC), facilita la fusin de los liposomas. La extensin y velocidad de la fusin de los liposomas depende de la extensin de la fotopolimerizacin, la temperatura y el pH. En la Biotecnologa actual se realizan importantes estudios en este campo. Un grupo de investigadores chinos tratan de solucionar uno de los problemas que tiene la tecnologa liposomal, la agregacin. Otro uso de los liposomas es en el tratamiento de la queratinocites humana. La transferencia de protenas a los liposomas permiten la posibilidad real del uso de estos proteoliposomas como modelos para el estudio a nivel molecular de la interaccin de estas protenas con sus ligandos (Dalencon et al., 1996). La presencia de pptidos embebidos en la membrana liposomal parece causar disturbios en ella, lo que facilita los eventos de fusin; as se demostr

mediante el empleo de pptidos anfiflicos en liposomas SUVs. Las interacciones con las membranas, las uniones con stas, son partes importantes del uso de la tecnologa de encapsulacin de sustratos en liposomas para ser aplicados in vivo. Uno de los rganos ms delicados en los seres vivos es el cerebro. Se ha investigado sobre la posibilidad de utilizar los liposomas para transportar drogas al cerebro. Se trata de liposomas termosensibles y de hipertermia. Las ventajas de este tipo de orgnulos es que permiten incrementar la concentracin de las drogas en los tumores y, adems, posibilitan matar a las clulas cancerosas por hipertermia local. La interaccin entre los liposomas y las clulas y los macrfagos, es el objeto de estudio del equipo formado. La compartimentacin de las reacciones bioqumicas fue uno de los grandes logros evolutivos de las clulas. Mediante los liposomas, se puede lograr estas separaciones entre las reacciones. Un ejemplo elocuente es la obtencin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) dentro de un liposoma termorresistente, constituido por 1-palmitol-2-olelsn-glicerol-3-fosfocolina (POPC). Sangre Una de las limitaciones de las tecnologas liposomales radica en la rapidez de aclaramiento en sangre. Ensayos tendientes a prolongar esto, se han realizado. La protrombina es uno de los factores relacionados con la coagulacin sangunea, y se han realizado trabajos con este factor y los liposomas. Se realiz tambin el estudio de material lipdico entre las plaquetas sanguneas y membranas lipdicas, aqu liposomas PC; la hemoglobina fue encapsulada en liposomas. Los pptidos angiotensingenos, angiotensina I y angiotensina II, estn vinculados con la presin sangunea. Varios investigadores descubrieron (empleando la tcnica liposomal), ques estos pptidos alteran la fluidez de las membranas fosfolipdicas, por lo que podra estar esto relacionado con la presin. El ter lpido 1-O-octadecyl-2-O-metil-sn-glicero-3fosfocolina tiene una accin anticncer probada, pero posee efectos colaterales como es una fuerte actividad hemoltica. Se ensaya la posibilidad de aplicarlo mediante liposomas.

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Piel La preparacin de ungentos y su aplicacin en la superficie de la piel, ha sido parte de la rutina por siglos. La medicina contempornea ha continuado la prctica con la incorporacin de drogas y otros ingredientes dentro de lociones, pastas y cremas. En general, esas preparaciones sirven como llevadores de drogas, y tambin como agentes transportadores de humedad, que incrementan la adsorcin de la droga. En algunos casos, la sustancia por transportar puede pasar al sistema circulatorio a travs de la piel, y ser diseminada al cuerpo. Independientemente de las aplicaciones mdicas, un sector mucho ms al alcance del pblico es la utilizacin de los liposomas aplicados a tratamientos locales, la que ha conquistado el mercado de la cosmetologa. Debido a la posibilidad de los liposomas para liberar su contenido dentro de capas superficiales y profundas de la piel, aun sin un ingrediente activo, los liposomas pueden liberar humedad y suplir molculas de lpidos hacia las capas callosas. Molculas de agua pueden liberarse de las capas profundas unas u otras por lpidos hidratados. En adicin a mezclas de liposomas, pueden llevar otras sustancias, tales como vitaminas, protenas, antibiticos, etctera. Algunas manufacturas son an nacientes para encapsular perfumes, lo cual incrementa la duracin de la fragancia. Las sociedades Loreal L. Lancome y Christian Dior, fueron las primeras en poner a punto y comercializar algunas preparaciones liposmicas de sustancias regenerantes para la piel, tales como: cremas hidratantes, extracto de timo y otro colgeno. Todas estas sustancias se presentan encapsuladas en liposomas mantenidos en suspensin en un medio acuoso, lo que evita el uso de otras sustancias como glicerol, alcohol, aceites menos favorables para la piel, etctera, adems de que los liposomas permanecan en las inmediaciones del lugar de accin, fusionndose con las membranas de las clulas de la piel, y aumentando as su contenido lipdico e hidratante. Sin embargo, este ltimo fenmeno ha sido poco demostrado en ensayos de laboratorio. Se analiz la administracin tpica de los

medicamentos encapsulados en los liposomas para numerosas enfermedades de la piel. Los resultados obtenidos permitieron pronosticar una utilizacin de los sistemas liposmicos en dermatologa, por las numerosas ventajas que ofrecen los sistemas de administracin avanzados, como son: incremento del efecto local con la siguiente disminucin de la toxicidad sistmica, versatilidad para lograr un sistema drmico o transdrmico, en dependencia de la formulacin, mayor aceptabilidad cosmtica entre otros. Estudios sobre la toma de liposomas por clulas epiteliales pigmentadas de la retina humana en cultivo de tejido. Vesculas liposomales desarrolladas, portadoras de insulina, son capaces de penetrar la piel intacta en un por ciento alto, con una bioeficiencia hasta de 50 %. La anfotericina B es una droga antifngica de uso indispensable en los infantes con cncer. Sin embargo, su administracin por va intravenosa suele provocar estados cianticos y de poca tolerancia: es el fenmeno ciantico Raynaud. La tromboxana A2 podra ser la causa de este peligroso efecto. Agentes terapeticos para tejidos endotelial mediante el uso de liposomas. Los primeros investigadores en explotar las posibilidades de la accin cutnea de los liposomas f. En este primer estudio, se seleccion el acetnido de triamcinolona (0,1 %) como frmaco modelo para la encapsulacin en liposomas. Se obtuvieron vesculas de tipo MLV (Multillamellar Vesicles), las cuales se formularon posteriormente como locin, gel y crema, cuya efectividad biolgica se evalu en conejos. Los resultados indicaron que la preparacin liposmica liber entre 4-5 veces ms agente activo en la epidermis, comparado con el grupo control. Adems, se comprob que los niveles de triamcinolona en la regin talmica fueron entre 2-3 veces menores para la forma liposmica. El tratamiento de diferentes infecciones fngicas de la piel ha sido formulado en forma liposmica; se encuentran: miconazol, ketoconazol, rilopilox y econazol, entre otros. Detergentes Los sistemas de enzimas inmovilizadas no han podido penetrar todava al mercado domstico. Sin embargo, la inmovilizacin puede probar su utilidad en

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esta rea, por ejemplo, en la estabilizacin de detergentes. Igualmente, algunas lipasas pueden ser inmovilizadas para lograr un poder ms efectivo y para la obtencin de grasas. Por ltimo, algunas enzimas para la obtencin de cremas o para el tratamiento de alimentos pueden dejar a un lado su vida arrinconada y realzarse a travs de la inmovilizacin. Se prepar liposomas con los detergentes n-octyl beta D-glucsido y Triton X-100. Industria El uso analtico de sistemas de enzimas inmovilizadas es muy amplio e importante. Debido a la gran especificidad de las enzimas, estos sistemas se han empleado en la determinacin de una gran variedad de compuestos en el diagnstico clnico, a travs de sondas enzimticas, como por ejemplo una sonda oxgeno-glucosa oxidasa para la determinacin de glucosa en un rango de hasta 10-3 mol/L, y otra de amonioureasa para la determinacin de urea. Existen numerosos ejemplos de las aplicaciones que, en varias industrias, han encontrado los sistemas de enzimas o clulas inmovilizadas. Algunos de los ms importantes son: produccin de etanol por levaduras inmovilizadas, produccin de leche libre de lactosa, mediante un proceso continuo que hace uso de la lactasa de la levadura inmovilizada en geles de poliacrilamida, produccin de varios aminocidos (cido asprtico, triptfano, L-tirosina), produccin de antibiticos (penicilina), produccin de nucletidos, produccin de jugos y vinos, clasificacin de cervezas, hidrlisis de polisacridos, isomerizacin de glucosa, etctera. La tendencia actual en la tecnologa farmacutica, se basa sobre el desarrollo de sistemas de liberacin controlada de medicamentos cada vez ms perfeccionados, en los cuales, el vehculo favorece la penetracin, la liberacin e incluso, el destino farmacocintico del principio activo. Los liposomas constituyen en la actualidad uno de los sistemas de administracin de medicamentos y de productos biolgicos, en general, ms atractivos por su funcionalidad, versatilidad de empleo y sus perspectivas futuras. Es por esas razones, que la va de administracin tpica recibi una mayor atencin

a partir de 1980, y se introduce el trmino "localizadores" para definir la accin de los liposomas como transportadores de medicamentos en los sitios de mayor accesibilidad como la piel y las membranas mucosas ocular, nasal y pulmonar. Medicina Desde que en 1965 Bangham describiera, por primera vez, los liposomas, se conocen cada vez ms aplicaciones en el uso de estas vesculas como transportadoras de drogas. Los liposomas son vesculas compuestas por simples o mltiples membranas de fosfolpidos que rodean un compartimento acuoso. Tienen un tamao variable entre 0,025 y 20 m, y debido a sus propiedades hidroflicas e hidrofbicas, pueden ser usados para incorporar compuestos acuosos y lipoflicos. Tambin pueden atrapar anticuerpos especficos entre sus cadenas de cidos grasos, pudiendo as liberar la droga en aquellas clulas que posean el receptor o antgeno especfico a ese anticuerpo /2/. En la actualidad, se estn desarrollando numerosos ensayos clnicos que utilizan liposomas como transportadores de agentes quimioterpicos, principalmente derivados de las antraciclinas y el cisplatino, as como de sustancias moduladoras de la respuestas biolgica. Su uso como transportadores de cidos nucleicos, incluyendo ADN y oligonucletidos antisentido, como terapia gnica de algunos tumores, es otro campo de intensa investigacin. En la lucha en contra de la tuberculosis, tambin se han utilizado las tcnicas liposomales. Se realiz estudios para conocer cmo es la interaccin de los antibiticos con las membranas de las bacterias. Utilizacin de compuestos fosforilados en liposomas en contra de la artritis. Insulina en liposomas es aplicada por va oral en el tratamiento de diabticos como una va de administracin efectiva. Calcitonina fue encapsulada en liposomas por Arien y Dupuy. Liposomas integrados por fosfatidilcolina parecen descender el nivel de colesterol en sangre, e incluso removerlo de los depsitos en arterias. Estos ensayos se realizaron en conejos con resultados positivos.

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Un estudio realizado en humanos con triamcinolona liposmica en forma de ungento, fue publicado por Krowczynski y Stozek. Ellos encontraron, que la formulacin liposmica presentaba mayor absorcin en la piel (cerca de 3 veces mayor) que el ungento empleado como control. Estos resultados les permitieron sugerir, que las formulaciones liposmicas de este frmaco pueden convertirse en un sistema de liberacin perfeccionado para la terapia transdrmica. Resultados similares fueron reportados por Wohlrab y Lasch en un estudio de penetracin de hidrocortisona en liposomas. En el caso del econazol, se prepararon varias formulaciones con el producto en forma de base y de nitrato, las cuales se evaluaron mediante estudios de biodisposicin in vivo, comparadas con los productos comerciales existentes en forma de crema, gel y locin, y en frmulas liposmicas con el frmaco libre. Los resultados indicaron, que la mayora de los productos liposmicos produjeron mayores concentraciones de econazol en las diferentes capas de la piel, y menores concentraciones en los rganos internos, si se comparan con las formas comerciales, segn este estudio. Los retinoides han demostrado ser eficaces en el tratamiento de diversos tipos de acn y otras dermatosis. Cuando se administran por va sistmica, producen teratogenicidad, por lo cual no deben ser empleados por pacientes del sexo femenino. Estos resultados difieren de los reportados por Foldvari et al., quienes investigaron el tratamiento de las infecciones genitales producidas por papilomavirus con interfern alfa encapsulado en liposomas, comprobndose la desaparicin de las lesiones cutneas en una poblacin femenina al trmino de 12 semanas de tratamiento. En la mayora de los casos, la encapsulacin en liposomas rinde mayores concentraciones del agente activo en los diferentes estratos de la piel, principalmente en la epidermis que en la circulacin sistmica y rganos como cerebro, rin e hgado, etctera, comparada con las formas farmacuticas convencionales, minimizando la toxicidad sistmica. Los pptidos sintetizados se utilizan para direccionar liposomas conteniendo citostticos a clulas proliferantes.

Los campos de aplicacin son el tratamiento de vitreoretinopatas en oftalmologa y la inhibicin del crecimiento de clulas tumorales e inhibicin de diseminacin de metstasis en el tratamiento del cncer. Se ha ensayado con xito, en el suministro de la anfotericina B atrapada en liposomas. Las dosis liposomales fueron bien toleradas por los nios. El equipo de investigadores del Department of Biochemistry, Universiteit Gent, Belgium. integrado, viene realizando investigaciones importantes sobre la glicoprotena prion (PrPC), de funcin desconocida, pero que se encuentra presente en la superficie de neuronas y de las clulas glial. Como tal, esta glicoprotena, est implicada en enfermedades como la encefalopata espongiforme bovina (mal de las vacas locas), la enfermedad humana de CreutzfeldtJakob (sospechosa de ser la forma humana de la anterior bovina). Tambin la glicoprotena PrPC est vinculada con el desarrollo del mal de Alzheimer (locura senil en humano). Entre las tcnicas utilizadas por este grupo estn las tcnicas liposomales. Anestsicos Los autores concluyeron, que la lecitina liposmica penetra rpidamente dentro de la piel humana, por lo que plantean la relevancia de estos sistemas como promotores de la penetracin. A partir de esta fecha comienzan a surgir con ms frecuencia en la literatura reportes acerca de la administracin de corticoides por va tpica. Los principales estudios incluyen varios steres de hidrocortisona y 5-alfatestosterona, entre otros. Los anestsicos locales constituyen una familia de agentes activos que se caracterizan por tener un corto tiempo de vida media en el organismo; la mayora poseen escasa penetracin en la piel, y en general, se consideran poco efectivos por va tpica. Se han preparado en forma liposmica, los siguientes agentes: tetracana, dibucana, lidocana, entre otros. Los anestsicos locales constituyen una familia de agentes activos que se caracterizan por tener un corto tiempo de vida media en el organismo; la mayora poseen escasa penetracin en la piel y, en general, se consideran poco efectivos por va tpica.

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Se han preparado, en forma liposmica, los siguientes agentes: tetracana, dibucana, lidocana, entre otros. Se realizaron tambin investigaciones con lidocana liposmica para uso tpico. Toxinas Tambin, utilizaron liposomas en el estudio de toxinas desde Bacillus thuringiensisvar. israelensis. Uso de los liposomas en estudios de desnaturalizacin trmica de venenos de serpientes a 48-50 grados centgrados en Bungarus fasciatus. Imgenes Otra aplicacin novedosa de los liposomas es su utilizacin, como agente de contraste, en el empleo del ultrasonido en la obtencin de imgenes con fines mdicos en los estudios de posibles patologas. En este sentido, se prepararon liposomas (liposomas ecognicos), en especfico, con fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG) y colesterol (CH), utilizando el mtodo de dehidratacin/ rehidratacin. Entre los agentes de contraste ultrasnicos desarrollados en la actualidad, ocurre que en ocasiones no son tiles para tejidos especficos o no poseen suficiente reflectividad acstica. Los estudios realizados con liposomas in vitro e in vivo dejaron resultados positivos. En la actualidad, se desarrollan familias de liposomas ecognicos apropiados para tejidos especficos

la adicin de colesterol provoca el empaquetamiento de los lpidos catinicos.

Fsico-qumica
La creacin de membranas artificiales liposomales y membranas liposomales semejantes a las membranas bacterianas, est permitiendo indagar sobre las propiedades fisicoqumicas reales en las de estos microorganismos, las cuales son fundamentales en el tratamiento medicamentoso de las enfermedades. Por su parte, se ha estudiado el efecto de los cationes monovalentes sobre la curvatura de los liposomas. En otro aspecto, una nueva posibilidad de las tcnicas liposomales es la creacin de vesculas con mltiples compartimentaciones. Los autores de este ensayo atraparon vitamina B 12, Beta-caroteno, drogas, etctera, en una misma vescula de forma compartimentada. Derivados de D-mio-inositol afectan la fluidez de las membranas en liposomas, y podran ejercer efectos en las membranas celulares naturales. Biosensores Tambin han sido elaborados biosensores para la determinacin de algunos iones como H+, (pH), etctera. Una posibilidad distinta sera la aplicacin de enzimas inmovilizadas para la deteccin de pesticidas y otros trazos de materiales txicos. Actualmente, al acoplar la especificidad de una enzima con algunos sistemas fluoromtricos, se han podido llevar a cabo anlisis muy sensibles de niveles de concentraciones tan bajos como es de 10-12 M. Cosmticos La vitamina A y la isotretiona tienen el inconveniente adicional de que son irritantes, y que durante las primeras semanas provocan la exacerbacin de los sntomas de acn, por lo cual, muchos pacientes se muestran insatisfechos con el tratamiento. Estas limitaciones motivaron a varios investigadores para llevar a cabo la encapsulacin de estos agentes en liposomas, y los resultados preliminares han demostrado las ventajas de estas formulaciones, como por ejemplo, menor tiempo de tratamiento, la no recurrencia de los sntomas al terminar el perodo de tratamiento, y la mayor aceptabilidad cosmtica.

Bomba de sodio-potasio
Estudios sobre la bomba de sodio se llevan a cabo con las tcnicas liposomales. Cmo funcionan las defensinas humanas y los procesos de formacin de poros tambin es objeto de estudio mediante esta tecnologa. Estabilidad Estudios realizados con pequeas vesculas unilaminares constituidas por cuatro lpidos catinicos, y variando el contenido de colesterol, sealan la importancia de esta molcula en la estabilidad y las caractersticas de estas membranas. Como tcnicas de medidas, se emplearon la polarizacin fluorescente y la resonancia magntica nuclear. Se comprob, que

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