2.

Validao e ferramentas estatsticas

Muitos aspectos relacionados sociedade so suportados, de alguma forma, por algum tipo de medio analtica. Milhes de medies analticas so realizadas todos os dias, em milhares de laboratrios pelo mundo. O custo da realizao destas medies muitas vezes elevado e custos adicionais podem advir de decises sobre falsos resultados. Definitivamente, importante alcanar resultados analticos corretos e, ao mesmo tempo, ser capaz de demonstrar que eles o so. A utilizao de procedimentos analticos validados permite a obteno de resultados confiveis. Validar confirmar, atravs da obteno e exame de evidncias objetivas, que os requisitos particulares para uma determinada utilizao de um mtodo foram atingidos. Em outras palavras, a validao de um mtodo

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analtico consiste em definir os requisitos analticos necessrios para determinada aplicao, gerar resultados atravs da utilizao do mtodo analtico que objeto de validao e, finalmente, confirmar se o desempenho obtido para os parmetros definidos consistente. No processo de validao est implcita a avaliao dos critrios estabelecidos, garantindo que o mtodo apropriado para a aplicao pretendida. Essa garantia de extrema importncia, sendo a mesma obtida justamente pela definio destes critrios. Um fator importante durante a etapa de gerao de resultados analticos a utilizao de equipamentos adequadamente calibrados e que estejam operando dentro das especificaes. Da mesma maneira, nesta etapa, o analista deve ter a competncia necessria, e suficiente conhecimento e capacidade para tomar as decises apropriadas, de acordo com as observaes realizadas durante o processo de anlise e avaliao de resultados. J que o desenvolvimento e a validao de mtodos analticos so atividades fortemente relacionadas, difcil definir exatamente seus limites e, por isso, muitos dos parmetros associados validao so avaliados, pelo menos aproximadamente, como parte do desenvolvimento do mtodo [18]. A validao de um mtodo analtico deve ser realizada sempre que for necessrio verificar se o desempenho de seus parmetros adequado para utilizao em uma determinada aplicao. A extenso requerida da validao

19 ou da revalidao vai depender da natureza das alteraes envolvidas. Mtodos publicados, mesmo por instituies internacionalmente reconhecidas, quando realizados pela primeira vez em um laboratrio, precisam ser validados para verificar se os parmetros estabelecidos pelo mtodo so alcanados pelo laboratrio [18]. A utilizao de materiais de referncia parte crtica do processo de validao. Um certificado de anlise que caracterize completamente a substncia de referncia deve acompanhar todo padro analtico, seja ele material de referncia certificado (MRC) ou um padro de trabalho, sendo este ltimo usualmente um padro produzido no prprio laboratrio, que quantificado contra um material de referncia certificado [19].
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A maneira como a validao realizada deve ser definida pelo laboratrio que conduz a anlise, visto que ele o responsvel por assegurar que o mtodo utilizado est adequadamente validado. Existem muitas publicaes que abordam a validao de mtodos analticos atravs de estudos colaborativos; entretanto, nem sempre esta uma soluo acessvel e vivel. Sendo assim, o laboratrio deve decidir que parmetros de desempenho precisam ser caracterizados para a validao do mtodo. Um bom comeo para o planejamento do processo de validao a considerao cuidadosa das especificaes do produto a ser analisado. De uma maneira geral, o laboratrio precisa fazer o melhor esforo possvel dentro dos limites impostos, levando em considerao os requerimentos do cliente, a experincia no mtodo e os custos envolvidos [18]. Os requisitos para validao de mtodos analticos so, geralmente, definidos por publicaes orientativas, especficas para cada setor relevante. Como requisito, entenda-se a definio dos parmetros de importncia e o grau em que cada um deve ser aplicado. recomendada a completa satisfao dos requisitos definidos sempre que estes estejam disponveis para um setor especfico [18]. Para o setor de defensivos agrcolas, os requisitos de validao de mtodos analticos aplicveis determinao de teor de ingrediente ativo em produtos formulados e tcnicos foram claramente definidos no documento

20 intitulado Guidelines on method validation to be performed in support of analytical methods for agrochemical formulations emitido pela CIPAC (Collaborative International Analytical Pesticide Council) [20]. No mbito nacional existe a norma ABNT NBR 14029 (Agrotxicos e afins Validao de mtodos analticos) [14]. A nova verso desta norma oferece uma viso completa e atual, no se restringindo exclusivamente a anlise de produtos tcnicos e formulados. Essa nova verso abrange tambm mtodos para anlise de traos e de resduos e inclui como requisito a estimativa da incerteza de medio, sinalizando o interesse na confiabilidade dos resultados analticos. A validao dos procedimentos analticos envolvidos neste trabalho foi obtida inicialmente a partir das seguintes etapas: definio da curva analtica, estudo de interferncias, estudo de preciso e exatido, e estimativa da
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incerteza de medio. Cada uma destas etapas descrita a seguir: Definio da curva de calibrao (ou curva analtica): Nesta etapa investigou-se a provvel faixa de resposta linear, definiu-se a melhor curva, alm de estimar os limites superior e inferior da faixa linear de trabalho. No presente trabalho, quando necessrio, o limite quantificao foi estimado e sua adequao ao uso pretendido foi verificada. Estudo de interferncias: Verificou-se a existncia de interferncias espectrais, pela simples aplicao do procedimento a amostras do branco de reagente, branco da amostra (matriz) e ao material de referncia. A verificao de ocorrncia de efeito matriz foi realiza pela utilizao dos resultados experimentais obtidos no estudo de exatido e preciso, descrito a seguir. Os dados obtidos nos ensaios de fortificao foram utilizados para a construo da curva de fortificao e esta foi, ento, comparada com a curva de calibrao. Estudo de exatido e preciso: Seleciou-se trs pontos (concentraes) de forma a cobrir toda a faixa de utilizao da curva de calibrao e correspondentemente de concentrao das possveis amostras: nominal, superior e inferior. Preparou-se e analisou-se, atravs da adio do analito ao branco da amostra, sete replicatas para cada ponto. Todo o processo de preparao e anlise foi realizado sob condies de repetitividade. Aps a obteno dos resultados experimentais a existncia de valores dispersos foi

21 verificada pela utilizao do teste de Grubbs. As concentraes de cada amostra fortificada, a concentrao mdia, o desvio padro e o respectivo coeficiente de variao foram calculados. Verificou-se a adequao dos coeficientes de variao aos limites estabelecidos em norma de acordo com o nvel de concentrao. As recuperaes foram calculadas. Verificou-se a adequao das recuperaes aos limites estabelecidos. A recuperao global do procedimento analtico tambm foi calculada. O desvio padro obtido para o ponto de menor concentrao foi comparado ao do limite de quantificao estimado, a partir da curva de calibrao, para verificao de sua adequao como limite de quantificao efetivo. Dentro desta etapa foram realizados tambm ensaios para determinao da robustez do procedimento analtico. Para esta finalidade foram eleitas variveis que poderiam ter efeito significativo no
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desempenho analtico, ensaios foram realizados para avaliar o efeito destas variveis. Estimativa da incerteza de medio: A incerteza de medio foi estimada de acordo com o Guia EURACHEM/CITAC [15] e consiste basicamente da seqncia de aes descrita a seguir: i) ii) iii) iv) v) vi) Especificar claramente o mensurando e as grandezas de entrada das quais ele depende. Identificar as provveis fontes de incerteza. Listar as provveis fontes significativas atravs de um grfico de causa e efeito. Estimar a contribuio de cada componente e converter todas as contribuies para incerteza padro. Considerar contribuies menores que 1/3 da contribuio do maior componente como no significativas. Calcular a incerteza padro combinada. abrangncia e a incerteza expandida. viii) Concluir comparando a incerteza de medio estimada com a tolerncia estabelecida. No item 2.5, so apresentados os principais conceitos envolvidos nesta estimativa. A estimativa da incerteza de medio de cada um dos vii) Calcular os graus de liberdade efetivos, o respectivo fator de

22 procedimentos analticos envolvidos neste trabalho foi realizada com o objetivo principal demonstrar e expressar as variveis envolvidas durante o processo de anlise de teor de ingrediente ativo. A contribuio da amostragem no foi considerada. discutidas. Alm dos parmetros descritos nas etapas de validao foi avaliada tambm a estabilidade do sistema analtico utilizado para as determinaes espectrofotomtricas. Essa etapa foi iniciada pela seleo de uma amostra conhecidamente estvel e pela avaliao desta pela aplicao do procedimento analtico em intervalos previamente definidos ao longo do perodo de utilizao do equipamento. Esta avaliao foi realizada atravs da construo
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No capitulo 4, as incertezas estimadas

para cada um dos so apresentadas e

procedimentos analticos envolvidos neste trabalho

de grficos de controle. Nos subitens a seguir, uma introduo conceitual para cada uma das principais tcnicas estatsticas utilizadas na realizao deste trabalho, apresentada.

2.1 Grficos de controle Um processo estatisticamente estvel, ou est sob controle estatstico, se apresentar apenas uma variao natural, sem quaisquer padres, ou ciclos, ou pontos estranhos. Quando o processo est sob controle possvel predizer o seu comportamento com certo grau de confiana. Entretanto, quando ocorrem interferncias no sistema o processo responde a estas causas gerando resultados fora de controle e que so facilmente visualizados nos grficos de controle. Os grficos de controle so ferramentas fundamentais, largamente utilizadas na garantia do controle estatstico de processos. Eles permitem comparar informaes de amostras que representam o atual estado de controle do processo contra os limites estabelecidos pela considerao da variabilidade inerente ao processo. A construo e utilizao de grficos de controle so detalhadamente descritas pela International Organization for Standardization ISO [21, 22].

23 Neste trabalho, foram utilizados grficos de valores individuais (X) e de amplitudes variantes (R) para avaliar a estabilidade do sistema espectrofotomtrico. Como j mencionado, uma amostra conhecidamente estvel foi selecionada, a absorvncia da amostra em 280 nm foi medida em intervalos previamente definidos. Quando o nmero de dados disponveis igualou-se a 15, os intervalos de controle foram calculados e os grficos de controle construdos. O clculo dos limites de controle para cada um dos grficos foi obtido pelas expresses dadas a seguir: i) Grfico de valores individuais (X): IC = X E 2 R ii)
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(equao 2.1)

Grfico de amplitudes variantes (R):

IC = D4 R , D 3 R Onde: R Amplitude mdia Absorvncia mdia

(equao 2.2)

E2, D3 e D4

so fatores para os clculos dos intervalos de controle [22].

Aps a construo dos grficos, deu-se continuidade na determinao da absorvncia da amostra, acompanhando simultaneamente o estado de controle do sistema. Os resultados obtidos so apresentados no capitulo 4.

2.2 Testes de significncia

Os testes de significncia, tambm conhecidos como testes de hipteses, so ferramentas que possibilitam a realizao de inferncia estatstica a uma populao tomando como base dados experimentais obtidos a partir de amostras desta populao. Este assunto detalhadamente discutido na literatura [23, 24]. Aqui, nesse texto, a apresentao se restringe em um breve resumo. Um teste de significncia consiste basicamente de: i) Estabelecer ambas as hipteses: Nula (H0) e Alternativa (H1), definindo se o teste do tipo bilateral (H1: contempla sinal de desigualdade ) ou unilateral (H1: contempla < ou >). ii) Identificar a funo estatstica apropriada ao teste.

24

iii)

Calcular o valor da estatstica de teste com base nos valores experimentais obtidos.

iv)

Obter o valor crtico tabelado para a estatstica de teste a partir do nvel de significncia () desejado e dos graus de liberdade relativos ao experimento.

v)

Comparar os valores, calculado e crtico, para a estatstica de teste. Na comparao a hiptese nula (H0) deve ser rejeitada se o valor calculado para a estatstica de teste for maior que o valor crtico tabelado. Entretanto, a hiptese nula (H0) deve ser aceita se o valor calculado para a estatstica de teste for menor que o valor crtico tabelado.

Nos subitens a seguir, os testes de significncia utilizados neste trabalho so

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apresentados:
2.2.1Comparao de mdia populacional () e mdia amostral Teste de t-Students:
X = s n , onde:

(X )

t cal

(equao 2.3)

s n

desvio padro amostral, nmero de repeties.

2.2.2Comparao do desvio padro() entre duas populaes - Teste F:

Fcal = s2 2 s 12

, onde s2 > s1.

(equao 2.4)

2.2.3 Verificao da existncia de valores dispersos - Teste de Grubbs [14]:

X X1 G1 = s e X X Gn = n s ,onde:

(equao 2.5)

(equao 2.6)

25

X1 Xn

primeiro termo da srie, ltimo termo da srie.

2.2.4 Verificao da homogeneidade de varincias (2) - Teste de Cochrans [24]:

H cal =
sx

2 sx , onde: si2

(equao 2.7)

maior desvio padro do conjunto de dados avaliado,

2 i

somatrio das varincias do conjunto avaliado.

Os valores crticos desta estatstica (Hcrit) so apresentados no Anexo I [24]. O valor crtico, a ser utilizado em teste, obtido em funo do nmero de
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graus de liberdade, do nvel de significncia desejado, e do nmero de determinaes realizadas para obteno dos valores mdios e respectivos desvios padres.

2.2.5 Deteco de curvatura [24]:

Este teste utilizado para determinar o ponto mximo onde ocorre descontinuidade de linearidade na curva analtica. um teste do tipo unilateral no qual a hiptese alternativa : H1: (A B) > 0.

t cal =

rH n +1 ( RSD ) n

, onde:

(equao 2.8)

rH RSD n
A

resduo para a amostra de concentrao mais elevada, Desvio padro residual da curva, mdia dos resduos para todas as amostras acima do limite de nmero de pontos na curva.

linearidade
B mdia dos resduos para todas as amostras abaixo do limite de

linearidade

26 2.2.6 Comparao entre duas relaes lineares:

Quando duas relaes lineares so comparadas indiretamente esto sendo comparados os respectivos coeficientes linear e angular. Idealmente cada coeficiente deve coincidir para que as relaes sejam consideradas idnticas, mas de uma perspectiva estatstica, um grau definido de similaridade tambm pode fornecer a significncia necessria para a considerao de igualdade. O processo de comparao baseado em anlise de regresso linear simples, para cada conjunto original de dados separadamente, e na anlise de regresso no linear mltipla com a incluso de variveis de indicao para a avaliao do conjunto unificado de dados. Cada etapa do processo explicada em detalhes por William Gardiner [25]. A seguir, um resumo do processo apresentado.
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O procedimento de teste iniciado por avaliar separadamente a significncia das retas a serem comparadas. preciso considerar os valores obtidos para o coeficiente de correlao e p-valor respectivo ao coeficiente angular. Considera-se que relaes lineares so estatisticamente significativas quando estas apresentam R > 0,99 e p-valor < 0,05. Caso os pr-requisitos definidos sejam atendidos ento a unificao dos dois conjuntos deve ser realizada pela criao de um nico conjunto que atenda ao seguinte modelo: Y = + 1 X 1 + 2 X 2 + 3 X 1 X 2 Onde:Y X1 X2 X1X2 Todos os valores da varivel resposta para os dois conjuntos, Todos os valores da varivel de entrada para os dois conjuntos, Um (1) quando os dados forem originrios do primeiro conjunto e O produto da coluna X1 pela coluna X2

Zero (0) quando os dados forem originrios do segundo,

A informao estatstica relacionada ao ajuste dos dados a este modelo a base para a comparao que composta dos dois testes, descritos a seguir: O Teste 1 avalia se o melhor ajuste obtido para um nico conjunto ou para dois conjuntos distintos: Um conjunto composto por todos os dados dos dois conjuntos originais para formar uma nica curva ou dois conjuntos distintos formando retas distintas.

27

Hipteses: H0: No h diferena entre curva nica ou duas retas distintas (2 = 3 = 0) H1: Curva nica pior que duas retas distintas (pelo menos um dos parmetros (2, 3) diferente de zero) Teste estatstico:
Fcal = SEQSS ( X 2 , X 1 X 2 | X 1 ) / 2 , que equivale a: QM Re s

Teste bilateral.

(equao 2.9) (equao 2.10)

Fcal =

(SQ

Re gn

( X 1 , X 2, X 1 X 2 ) SQRe gn ( X 1 ) ) / 2 QM Re s

, onde:

QMRES mltipla.
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o quadrado mdio do resduo da regresso no linear

SEQSS(X2,X1X2|X1) = SQRegn(X1, X2, X1X2) - SQRegn(X1) SQRegn(X1, X2, X1X2) SQRegn(X1) Soma dos quadrados dos resduos da regresso mltipla para o modelo no linear contemplando X1, X2, X1X2. Soma dos quadrados da regresso para o modelo linear simples contemplando apenas X1. Valor Crtico: Obtido da tabela de distribuio F para 1= 2 e 2 = (nA+ nB 4) F(/2; 1; 2) nA nB Teste bilateral se NC = 95%
= 0,05 e /2= 0,025; onde:

n de pontos do primeiro conjunto original. n de pontos no segundo conjunto original

Sempre que no Teste 1 a hiptese nula for aceita, no necessrio realizar o Teste 2. O Teste 2 consiste em avaliar se as retas distintas so paralelas, ou seja, se os coeficientes angulares no so significativamente diferentes. Hipteses: H0: As retas so paralelas (3 = 0) H1: As retas no so paralelas (3 0) Teste bilateral.

28

Teste estatstico:

Fcal =
Fcal =

SEQSS( X 1 X 2 | X 1 , X 2 ) , que equivale a: QM Re s

(equao 2.11) , onde: (equao 2.12)

(SQ

Re ng

( X 1 , X 2 , X 1 X 2 ) SQRe ng ( X 1 , X 2 ) ) QM Re s

QMRES mltipla.

o quadrado mdio do resduo da regresso no linear

SEQSS(X1X2|X1, X2) = SQRegn(X1, X2, X1X2) - SQRegn(X1, X2). SQRegn(X1, X2, X1X2) SQRegn(X1, X2)
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Soma dos quadrados dos resduos da regresso

mltipla para o modelo no linear contemplando X1, X2, X1X2. Soma dos quadrados dos resduos da regresso mltipla para o modelo no linear contemplando X1 e X2. Valor Crtico: Obtido da tabela de distribuio F pra 1= 1 e 2= (nA+ nB 4). F( /2; 1; 2) nA nB Teste bilateral se NC = 95%
= 0,05 e /2= 0,025; onde:

n de pontos do primeiro conjunto original, n de pontos no segundo conjunto original.

2.3 Anlise de varincia

A anlise de varincia, tambm conhecida como ANOVA, um teste de significncia, que utiliza a distribuio F para detectar diferenas entre mdias de mais de duas populaes, comparando varincias. Esta tcnica abordada em detalhes por Montgomery [26]. A aplicao da anlise de varincia envolve as seguintes consideraes relacionadas com as populaes em estudo: homogeneidade de varincias, distribuio normal e que as amostras so mutuamente independentes e obtidas de forma aleatrias. Na realizao do presente trabalho, os recursos da planilha eletrnica do Excel foram utilizados de acordo com o descrito por Juan C. Laponni [27]. Visando resumir como os resultados dos clculos obtidos a partir da planilha de clculos do Excel foram interpretados, esto citados a seguir os principais itens considerados para a interpretao:

29

Hipteses Hiptese nula (H0): Todas as populaes tm a mesma mdia (1 = 2 =...= n.) Hiptese alternativa (H1): Pelo menos uma das populaes apresenta mdia diferente. Teste estatstico: Fcal = QMF QMRes resduos.
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2 sF QM F , onde: = 2 s Re s QM Re s

(equao 2.13)

o quadrado mdio do fator que equivalente sua varincia, o quadrado mdio dos resduos, equivalente a varincia dos

Valor crtico: O valor crtico da estatstica pode ser obtido de tabela de distribuio F unilateral, considerando = 5% e os respectivos graus de liberdade para o fator e para os resduos. A deciso, como em qualquer outro teste de significncia, de rejeitar H0 se o valor calculado para a estatstica de teste for maior que o valor crtico tabelado, ou aceitar H0 caso contrrio. A anlise de varincia foi utilizada para avaliar o impacto de fatores como comprimento de onda e pH sobre os valores obtidos para absorvncia. Amostras foram selecionadas e submetidas a condies variadas destes fatores, a fim de estimar o intervalo no qual o procedimento analtico pode ser considerado robusto. Os resultados obtidos so apresentados no prximo captulo.

2.4 Anlise de regresso

A anlise de regresso a ferramenta estatstica que permite a avaliao de sries emparelhadas de dados com o objetivo de determinar a existncia de uma relao significativa entre as variveis de entrada e de resposta. Alm de definir a forma especifica da curva, atravs de um modelo, esta anlise possibilita a estimativa das incertezas associadas ao uso subseqente do

30

mesmo. Considerou-se em detalhe o modelo linear de regresso: y = mx + b, que assume como varivel de aleatria (x), que conhecida, e a varivel resposta, ou dependente (y), que desconhecida. O mtodo dos mnimos quadrados utilizado para estimar o coeficiente linear (b) e o coeficiente angular (m) do modelo. Nos processos de medio qumica medimos o valor de y para estimar o valor de x utilizando a regresso inversa. Considerou-se que todos os desvios de pontos individuais da linha reta so decorrentes de erros de medida, ou seja, no h erros no eixo do x. Para utilizar um modelo como curva de calibrao, alm das consideraes j mencionadas, necessrio que os seguintes requisitos sejam satisfatoriamente atendidos: (i) linearidade do modelo, (ii) aleatoriedade dos erros, (iii) homogeneidade das varincias, (iv) forma de
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distribuio dos erros. Quando detectada a heterocedasticidade do conjunto, utilizao da regresso linear ponderada recomendada. A regresso linear simples pode ser utilizada para estabelecer a relao entre concentrao(x) e desvio padro(s). Utiliza-se ento esta relao para estimar os desvios padro referentes a cada ponto da curva. Os coeficientes de ponderao (wi), dados pela expresso a seguir, so utilizados para a construo da curva de calibrao. O mtodo dos mnimos quadrados ponderados utilizado neste caso [24].
1 wi = si 1
i 2

*n

(equao 2.14)

Pela utilizao da regresso ponderada atribui-se menor importncia aos pontos que apresentam maior desvio padro, minimizando o somatrio dos quadrados dos resduos ponderados. Isto resulta no deslocamento do ponto centride da curva com estreitamento dos intervalos de confiana em baixas concentraes e conseqente alargamento dos intervalos de confiana nas concentraes mais elevadas. Ainda como parte do estabelecimento da curva de calibrao preciso definir a faixa de trabalho. O limite mnimo pode ser estabelecido pela

31

estimativa do limite de deteco ou de quantificao. O limite mximo estabelecido pelo ponto de descontinuidade de linearidade da curva analtica atravs do teste de significncia apresentado no item 2.2.5. O limite de deteco de um analito pode ser descrito como a concentrao na qual o instrumento apresenta um sinal significativamente diferente do sinal da amostra de branco ou do rudo de fundo. Foi estabelecido que esta significncia alcanada quando o sinal obtido equivale ao sinal da amostra do branco (Yb) mais trs vezes o desvio padro da amostra do branco (sb), que pode ser representada pela expresso a seguir: YD = Yb + 3S b (equao 2.15)

O sinal do branco da amostra (Yb) corresponde ao coeficiente linear da

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curva de calibrao. Para obter o valor da concentrao no limite de deteco (LD) preciso substituir estes valores na equao de calibrao e assim pode-se expressar o limite de deteco em termos de desvio padro de uma amostra de branco (Sb) e do coeficiente angular (m) da curva analtica [28]:
LD = 3S b m

(equao 2.16)

O limite de quantificao, que pode ser definido como a mais baixa concentrao do analito determinvel com exatido e repetitividade aceitveis, dado por:
LQ = 10 S b m

(equao 2.17)

Quando a homogeneidade das varincias observada o desvio padro residual da curva analtica (RSD) uma boa estimativa para o desvio padro de todos os pontos da curva, inclusive para o ponto com concentrao igual concentrao do branco da amostra. Desta forma possvel estimar diretamente ambos os limites pela utilizao desta estatstica.
LD = 3RSD e m 10 RSD m (equao 2.18)

LQ =

(equao 2.19)

32

A formula para o clculo do desvio padro residual na regresso linear simples (RSD) apresentada a seguir:

(y
RSD =
i

yi )

(n 2)

(equao 2.20)

Nos casos onde a heterocedasticidade significativa, o desvio padro do ponto de menor concentrao da curva deve ser menor que o desvio padro residual ponderado (RSDW) dado pela expresso a seguir:

w (y
i

yi )

RSDW =

(n 2)

(equao 2.21)

A estimativa do desvio padro para amostras de concentrao

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desconhecida, que tiveram sua concentrao determinada a partir de uma curva de calibrao especfica, obtida a partir de uma das expresses a seguir: Quando observada homogeneidade de varincias: RSD 1 1 (X i X ) = + + , onde: m p n S xx
2

S ( xi ) p n

(equao 2.22)

o nmero de replicatas na determinao de Xi, o nmero de determinaes (pontos) na curva de calibrao,

Xi a concentrao de analito determinada para a amostra,

X

a concentrao mdia da curva de calibrao,

2

S xx = (X i X ) .
Quando observada heterocedasticidade:

(equao 2.23)

S ( xi ) =

RSDW 1 1 1 (X i X ) + + + , sendo: m p n wi S wxx

2

(equao 2.24)

S wxx = wi (X i X )

(equao 2.25)

33

Alm da construo da curva de calibrao utilizou-se a tcnica de regresso linear tambm como ferramenta para a comparao de procedimentos analticos distintos. A comparao foi realizada pela anlise de regresso linear dos resultados obtidos atravs de procedimento cromatogrfico (x), considerado como referncia, com os resultados obtidos pela aplicao do procedimento espectrofotomtrico (y), procedimento proposto para anlise de amostras para ensaios toxicolgicas. A significncia do modelo, propriamente dito, e dos respectivos coeficientes linear e angular, o ponto de partida para esta avaliao. Como os valores obtidos para os coeficientes linear e angular, que correspondem respectivamente s tendncias fixa e relativa observadas, fcil concluir comparando estes valores a 0,00 e 1,00 respectivamente [24].

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2.5 Incerteza de medio

Toda medio, ao realizada atravs de uma seqncia lgica de ensaios, ajustes e observao de um instrumento, tem como objetivo determinar a grandeza de um mensurando especifico. O resultado de uma medio verdadeiramente uma aproximao ou estimativa do valor do mensurando e, assim, para ser considerado completo preciso que seja composto tambm por uma declarao da incerteza. A incerteza de medio um parmetro associado ao resultado de uma medio, que caracteriza a disperso dos valores que poderiam ser razoavelmente atribudos ao mensurando [29]. Este parmetro pode ser dado por um desvio padro, ou mltiplos deste ou ainda pela metade do intervalo correspondente ao nvel de confiana declarado [30]. Estimando a incerteza padro: Muitas vezes o valor de uma grandeza, aqui designado por Y, obtido de maneira indireta, atravs de uma relao funcional f e de grandezas de entrada

X1 ,X2..Xn: Y = f ( X 1 , X 2 ,..., X n )
(equao 2.26)

34

As incertezas das grandezas de entrada devem ser expressas na forma de um desvio padro e podem ser estimadas a partir de informaes disponveis ou de observaes repetidas atravs de dois mtodos distintos e definidos a seguir:

Incerteza tipo A: Uma srie valores obtida, atravs de medies

independentes, sob condies aparentemente idnticas. O desvio padro experimental da mdia determinado e utilizado como a estimativa da incerteza padro (up).
up = s n

, onde:

(equao 2.27)

s n
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desvio padro de uma serie de dados, nmero de termos nesta srie de dados.

Incerteza tipo B: Um valor obtido diretamente de um documento ou

lido de um instrumento. O mtodo de avaliao de tipo B baseado em informaes disponveis sobre a variabilidade da grandeza e pode incluir: i) ii) Dados de medies prvias. Experincia ou conhecimento e propriedades da matria e instrumentos relevantes. iii) iv) v) Especificaes do fabricante. Dados fornecidos em certificados. Incertezas atribudas a dados extrados de manuais. No caso da avaliao pelo mtodo tipo B a estimativa da incerteza padro (up) obtida dividindo-se a metade do intervalo (a) atribudo grandeza pelo fator referente ao tipo de distribuio de probabilidade conhecido para esta grandeza. A Figura 2.1 ilustra o intervalo a para as distribuies, normal, retangular e triangular. Apresentamos na Tabela 2.1, a seguir, o fator divisor para os casos de distribuio mais freqentemente utilizados:

35

Figura 2.1 Representao grfica da metade dos intervalos de confiana, a, para as distribuies normal, retangular e triangular, respectivamente.

Tabela 2.1 - Valores do fator divisor para as funes de distribuio de probabilidade mais utilizadas. Tipo de Distribuio de probabilidade Fator divisor Observao

Retangular

A varincia da distribuio retangular igual a (a/3)2. Esta distribuio utilizada quando no se tem informao sobre o tipo de distribuio da grandeza. A varincia da distribuio triangular igual a (a/6)2. Para a distribuio normal o intervalo com 95 % de confiana corresponde a (2), onde o desvio padro e a o valor mdio.

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Triangular Normal

6
2

Combinando incertezas: A incerteza da grandeza de sada Y composta por todas as incertezas geradas no processo de medio, inclusive as incertezas de cada uma das grandezas de entrada. Ela estimada na forma de incerteza padro combinada (uc(y)) pela expresso a seguir:
u
2 c ( y)

f = i =1 x i
N

N 1 N 2 f f u xi + 2 u ( xi , x j ) i =1 j = i +1xi x j

(equao 2.28)

Que equivalente a:
u
2 c ( y)

f = i =1 xi
N

N 1 N 2 f f u x i + 2 u ( xi ) u ( x j ) r( xi , x j ) i =1 j =i +1x i x j

(equao 2.29)

36

Nos casos onde as grandezas de entrada so independentes, isto , as grandezas de entrada no so correlacionadas, o segundo termo da expresso eliminado ficando:
u
2 c( y)

f = i =1 xi
N

2 u xi

(equao 2.30)

Se fizermos: ci =

f f = x1 , x 2 ,..., x N , onde: xi X i

(equao 2.31)

ci

o coeficiente de sensibilidade e descreve quanto da grandeza de

sada y varia com alteraes nos valores da grandeza de entrada x1, x2...xn. Ento poderemos expressar a incerteza combinada na forma:
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uc ( y) =

c
i =1

2 i

u (2xi ) =

u
i =1

2 i

( y ) , onde:

(equao 2.32)

u
i =1

2 i

( y)

Somatrio das incertezas padro das grandezas de entrada.

Porm, em muitos casos a expresso para combinao de incertezas reduz-se a expresses bem mais simples, duas regras bsicas so apresentadas a seguir:

Regra 1: Para modelos que incluem apenas operaes de soma e subtrao,

como por exemplo:
Y = ( p + q + r...)

(equao 2.33)

A incerteza padro combinada obtida por:

u c ( y ) = u (2p ) + u (2q ) + u (2r ) + ....

(equao 2.34)

Regra 2: Para modelos que incluem apenas operaes de multiplicao e

diviso, como no exemplo:

Y=

pq r

(equao 2.35)

37

A incerteza padro combinada obtida por:

u ( p ) u (q ) u ( r ) =y p + q + r , onde:
2 2 2

uc( y)

(equao 2.36)

u ( xi ) xi

incertezas das grandezas de entrada expressas na forma de

desvio padro relativo. Na prtica, como modelos que envolvem ambos os tipos de operaes so muito comuns, nestes casos os componentes da incerteza so agrupados em parcelas que envolvem operaes unicamente de soma e subtrao e combinados, posteriormente ento combinados os grupos que envolvem operaes referentes segunda regra. Este agrupamento de componentes de
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incerteza facilmente conduzido quando levamos em considerao as unidades referentes a cada grandeza envolvida. Estimando a incerteza expandida: Basicamente a incerteza expandida (U) um intervalo de confiana, e como tal, precisa necessariamente ter seu nvel de confiana estabelecido. obtida pela multiplicao da incerteza padro combinada pelo fator de abrangncia (k):
U = k uc( y)

(equao 2.37)

A seleo do valor do fator de abrangncia deve ser realizada com base no conhecimento sobre o tipo de distribuio, o nvel de confiana exigido e o nmero de graus de liberdade envolvidos. Se uma varivel aleatria normalmente distribuda com esperana z, desvio padro populacional , mdia aritmtica z , de n observaes independentes, e desvio padro amostral

s( z ), ento a distribuio de Students, ou distribuio-t, da varivel ser dada

pela expresso a seguir para ( = n-1) graus de liberdade.
t=

(z z )
s( z )

(equao 2.38)

38

De uma maneira geral, o nmero de graus de liberdade igual ao nmero de termos em soma menos o nmero de restries aos termos da soma [30]. Por exemplo, para uma grandeza nica estimada pela mdia aritmtica de n observao o nmero de graus de liberdade, , igual a n-1. Se n observaes independentes so utilizadas para determinar os coeficientes linear e angular de uma linha reta pelo mtodo dos mnimos quadrados, ento os graus de liberdade de suas respectivas incertezas padro dado por n-2. Em geral a distribuio-t no descreve bem a distribuio da varivel

( y Y ) / u c( y ) se u2c(y) a soma de dois ou mais componentes de varincia estimada, mesmo quando cada uma das grandezas de entrada estimada
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normalmente distribuda. Considera-se, entretanto, que a distribuio desta varivel seja aproximada distribuio-t com graus de liberdade efetivos ef obtidos a partir da equao de Welch-Satterthaite [30]:

ef =

u c4( y )

i =1

u i4( y )

(equao 2.39)

A Tabela 2.2 apresenta os valores para o fator de abrangncia considerando-se distribuio-t e o nvel de confiana mais comumente utilizado, 95,45%, em funo do nmero de graus de liberdade envolvidos no clculo do intervalo. Depois de calcular a incerteza expandida possvel expressar o resultado da medio por meio de um intervalo de confiana no qual se espera abranger a frao especificada da distribuio dos valores que podem ser atribudos razoavelmente a Y. O resultado de medio deve ser reportado na forma da expresso a seguir, definindo claramente o nvel de confiana selecionado: Y = y U. (equao 2.40)

39
Tabela 2.2 Valores do fator de abrangncia para nvel de confiana de 95,45% [30]. Fator de abrangncia (k) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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Graus de liberdade () 13,97 4,53 3,31 2,87 2,65 2,52 2,43 2,37 2,28 2,25 2,23 2,21 2,20 2,18

Fator de abrangncia (k) 16 17 18 19 20 25 30 35 40 45 50 100 -

Graus de liberdade () 2,17 2,16 2,15 2,14 2,13 2,11 2,09 2,07 2,06 2,06 2,05 2,025 2,000 -

12 13 14 15