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Atualizao em Fisiologia e Fisiopatologia Renal: Canais inicos nas clulas do epitlio tubular renal
Antonio C Cassola

Departamento de Fisiologia e Biofsica, Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo Endereo para correspondncia: Antnio C. Cassola Av. Lineu Prestes, 1524 05508-900 So Paulo, SP E-mail: cassola@fisio.icb.usp.br.

Canais inicos: fundamentos

A matriz das membranas celulares, plasmtica ou de organelas, a bicamada lipdica. Os lipdios de membrana fosfolipdios, glicolipdios, esfingolipdios e colesterol so molculas que no seu eixo maior tm carter anfiptico, com uma extremidade hidroflica e a outra hidrofbica. Estruturas moleculares hidroflicas so aquelas que interagem com a gua. O ngulo entre as ligaes covalentes dos hidrognios com o oxignio faz da molcula de gua um dipolo, capaz de interaes eletrostticas e vido por formao de pontes de H com grupamentos -OH, inclusive de outras molculas de gua, e -NH. Portanto, domnios moleculares hidroflicos so aqueles que tm carga eltrica resultante ou a capacidade de formar pontes de H. Em meio aquoso a estrutura supramolecular mais estvel para os lipdios de membrana a bicamada lipdica, com os domnios hidroflicos voltados para a fase aquosa, interagindo com a gua, e os domnios hidrofbicos constituindo o cerne da membrana, sem interao mais forte que as fracas foras de Van der Waals. O cerne hidrofbico da bicamada lipdica constitui, portanto, barreira para o fluxo das espcies qumicas hidroflicas. A travessia da membrana por essas substncias d-se por estruturas especializadas, canais ou carregadores, que so protenas de membrana, codificadas geneticamente. Os canais so poros. As protenas formam uma via razoavelmente hidroflica que transpassa a bicamada lipdica. Com algumas excees, os canais so vias para a passagem de ons inorgnicos. As dimenses restritas dos canais foram a interao do on com resduos de aminocidos da protena e, por essas interaes, os canais so seletivos.

O fluxo de ons pelos canais passivo, movido pela concentrao, pelo movimento trmico e pela diferena de potencial eltrico na membrana celular. Assim, o fluxo resultante de um on pelos canais, que lhe so seletivos, depender da diferena de concentrao entre os compartimentos intra e extracelulares e da diferena de potencial eltrico na membrana celular. As oscilaes trmicas dos tomos na molcula de protena induzem incessantes modificaes na sua conformao. Probabilisticamente, a protena assume conformaes que correspondem a estado condutivo (aberto) do canal ou no condutivo (fechado). Variveis diversas como a diferena de potencial eltrico na membrana, ligao de compostos protena do canal, fosforilao e ligao protena de ons outros que no os que passam pelo canal mas tm afinidade por stios da protena podem modificar a probabilidade das conformaes, favorecendo ou o estado fechado ou o aberto do canal. Os canais, ento, so dependentes ou de voltagem, ou de mediadores, ou de ATP ou de Ca2+.
Canais inicos e o transporte de ons pelas clulas tubulares

Os tbulos renais so formados por clulas epiteliais. A caracterstica que distingue o fentipo celular epitelial a diferenciao de dois domnios de membrana celular, o apical e o basolateral, definidos pelas junes intercelulares de tipo tight junctions. Os dois domnios contm diferentes tipos de protenas com funes de transporte como carregadores ou como canais. Essa diferenciao dos domnios, a que alguns autores costumam chamar de polarizao da clula, permite o transporte vetorial das espcies qumicas, que a funo dos epitlios, no sentido da absoro ou da secreo. Os tbulos proximais fazem a reabsoro macia do ultrafiltrado glomerular, liberando para a poro descendente da ala de Henle 40% do volume que

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penetrou na cpsula de Bowman. Solutos orgnicos de baixo peso molecular que passaram pela membrana glomerular, como glicose e aminocidos, so totalmente reabsorvidos nesse segmento. Contudo, a reabsoro praticamente isotnica, pois a permeabilidade elevada do epitlio gua no lhe permite estabelecer diferenas de presso osmtica. subtrao de solutos luminais segue-se invariavelmente a reabsoro de gua. Na Figura (A) tem-se um esquema da clula tubular proximal com os tipos fundamentais de transportadores. Na membrana basolateral, e s nela, esto as bombas de Na+ -K+. O transporte por essas ATPases demanda ATP e um dos poucos processos, na reabsoro, em que a energia metablica diretamente utilizada. Essas bombas transportam 3 Na+, da clula para o espao intersticial, mantendo a concentrao citoslica desse on em torno de 10 mM, abaixo, portanto, da concentrao do on na luz e no plasma. O Na+, transportado pela bomba, vem do espao luminal e , assim, reabsorvido. As vias de transporte, na membrana apical, so carregadores que fazem co-transporte, como os carregadores para glicose e aminocidos, ou contratransporte, como o trocador Na+ -H+. Nesses transportadores, a energia livre da diferena de concentrao do Na+ entre o citosol e o lmen , em parte, transferida para a diferena de concentrao da espcie qumica de transporte acoplado. Em segmentos S1 e S2 de tbulos proximais no se observaram canais para Na+, que teriam efeito dissipativo da diferena de concentrao do on. Em segmentos S3, em que o fludo luminal escasso de solutos orgnicos e o pH relativamente cido, h algumas evidncias, no categricas, de que as clulas expressariam canais para Na+ de tipo sensvel a amiloride. A bomba de Na+ -K+ transporta, em um ciclo, 2 K+ e 3 Na+. Os canais para K+ da membrana basolateral so necessrios para a recirculao desse on. No fossem eles, a concentrao intracelular do K+ cresceria a valores limitantes da atividade da bomba. Esses canais ainda asseguram a condutncia eltrica da membrana, mais elevada a K+, que determina a diferena de potencial eltrico na membrana lateral, em torno de -70 mV (compartimento intracelular eletricamente negativo em relao ao extracelular). A fenomenologia desses canais foi j bastante estudada, tanto por tcnicas de avaliao indireta da expresso eletrofisiolgica deles, como por registros de canais unitrios, por patch clamping. Esses canais so do tipo retificador para dentro. A probabilidade do estado aberto do canal se reduz com

a queda do pH intracelular e com a elevao da relao ATP/ADP no citosol. H evidncias convincentes de que, pela sensibilidade do canal aos nucleotdeos, a atividade desse seja modulada em nvel adequado atividade da bomba de Na+ -K+.1 A estrutura molecular do canal ainda no foi determinada. Todavia, as propriedades do canal sustentam a conjectura de que pertena classe estrutural dos canais com dois segmentos intramembrnicos.

Figura Esquemas dos processos de transporte nas membranas celulares, nos vrios segmentos do nefro. A: tbulo proximal, B: ramo ascendente espesso da ala de Henle, C: tbulo distal, D: duto coletor. Os crculos negros representam bombas que hidrolisam o ATP para efetuar a transferncia dos ons indicados, na direo das setas. Os crculos brancos indicam transportadores com acoplamento, que no utilizam diretamente energia metablica. Os cilindros representam canais. As setas, vazando os cilindros, indicam a direo do fluxo resultante do on, nas condies fisiolgicas.

O ramo ascendente espesso da ala de Henle se situa em parte na medula e em parte no crtex. Na proposta de reviso da nomenclatura, esse segmento passaria a ser considerado a poro reta do tbulo distal, estendendo-se da poro fina ascendente da ala de Henle at a mcula densa, no glomrulo. O ramo ascendente espesso reabsorve sais, diluindo o fludo luminal pois o epitlio impermevel gua. A poro medular do segmento produz o efeito unitrio do sistema contracorrente multiplicador que gera a hipertonicidade medular. Os transportadores fundamentais para a reabsor-

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o de NaCl so mostrados no esquema da Figura (B). Como em todas as clulas do epitlio do nefro, na membrana basolateral esto as bombas de Na+ -K+, que utilizam energia metablica e mantm baixa a concentrao citoslica de Na+ e elevada a de K+. Na membrana basolateral, canais seletivos possibilitam o efluxo de K+, transportado para o citosol pela bomba. Esses canais conferem membrana a permeabilidade predominante ao on K+ e formam a via condutiva pela qual o fluxo desses ons prepondera na determinao da diferena de potencial eltrico na membrana celular. O co-transporte Na+-2Cl--K+, que opera na membrana apical, fundamental para a reabsoro de NaCl. As clulas do ramo ascendente espesso parecem ser as nicas a expressar essa protena. O transportador eleva as concentraes intracelulares do Cl- acima do valor de equilbrio e cria, portanto, a fora que transfere o nion atravs da membrana basolateral, por canais ou por co-transporte. O transportador no est implicado na reabsoro do K+, pois o on retorna ao lmen por canais para K+ e a sua ligao ao transportador assegura que, em um ciclo de transporte, no ocorra transferncia resultante de carga eltrica. Como so transportadas duas cargas negativas e duas positivas a cada ciclo, o campo eltrico da membrana apical no interfere nas foras que determinam o transporte. Esse determinado apenas pelas diferenas de concentrao das espcies qumicas transportadas. Dessa forma, os canais para K+, ao permitir a recirculaao do on, determinam o ritmo de transporte de NaCl pelo segmento. Os canais para K + da membrana apical foram exaustivamente estudados pela tcnica de patch clamp. So canais do tipo retificador para dentro, com condutncia mxima de 30-35pS. A probabilidade de estarem no estado aberto reduzida por pH baixo e pela razo ATP/ADP. Quando a relao se eleva o canal inibido. O cDNA para a protena do canal foi clonado, e a seqncia de aminocidos determinada.2 Desde ento o canal, a protena e o gene correspondente foram denominados ROMK (Renal outer medulla K channel). As informaes disponveis indicam que o canal pertence classe estrutural dos canais para K+ com dois segmentos intramembrnicos. O canal se forma por tetramerizao da protena. Ainda no se sabe de subunidades reguladoras para o canal, semelhana do SUR (receptores para sulfonilurias), associados a canais para K+ de propriedades semelhantes, expressos por clulas pancreticas .

Tbulo distal

O tbulo distal, ou, na nova nomenclatura, poro convoluta do tbulo distal, localiza-se no crtex renal e estende-se da mcula densa ao segmento de conexo, que um segmento de transio entre tbulo distal e duto coletor cortical. O tbulo distal convoluto, curto e frgil na disseco, no bem conhecido. Na Figura (C) tem-se os mecanismos de transporte para os quais h boas evidncias experimentais. Como nos demais segmentos, na membrana basolateral h bombas de Na+-K+ e canais para K+. No domnio apical h co-transportadores Na+-Cl-, alvos dos diurticos da classe dos tiazdicos. H boas evidncias de que, na membrana apical, haja canais para Ca2+. O on entraria nas clulas, em fluxo resultante movido pela diferena de concentrao e de potencial eltrico na membrana apical, e seria transportado de volta ao plasma pelo trocador Na+xCa2+ e pela bomba de Ca2+, ambos na membrana basolateral. O transporte de Ca2+ pelas clulas tubulares inibido pelo verapamil e por dihidropiridinas, como a nifedipina. Esses inibidores afetam os canais para Ca2+ sensveis a voltagem, de tipo L. Todavia, a clonagem por homologia revelou a expresso, em tecido renal, de subunidades 1A, que so produtos do gene CaCh4.3 Essas subunidades formam canais classificados como P, caractersticos de neurnios, e que no so sensveis aos bloqueadores discutidos acima. Portanto, a caracterizao funcional e molecular dos canais para Ca2+ do epitlio tubular renal ainda bastante incompleta.
Duto Coletor

As caractersticas funcionais e os fentipos celulares desse segmento variam axialmente, a ponto de, funcionalmente, subdividir-se o duto coletor em cortical e medular. O duto coletor cortical um segmento com dois tipos de clulas, as intercalares e as principais. As clulas intercalares, conforme o subtipo, ou , secretam H+ ou bicarbonato e conferem ao rim competncia para intervir no equilbrio cido-base. As clulas principais reabsorvem Na+ e secretam K+ sob o controle dos hormnios aldosterona e arginina vasopressina, que o hormnio antidiurtico. Como as clulas de qualquer outro segmento, as principais tm, na membrana basolateral, bombas de Na+-K+ e canais para K+, pelos quais a difuso do on compensa o influxo pela bomba e contribui preponderantemente para o estabelecimento da diferena de potencial eltrico na membrana basolateral. Na membrana apical h canais para Na+ e para

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K+. Os canais para K+ so do tipo ROMK, protenas iguais s dos canais do ramo ascendente espesso da ala de Henle. Os canais para Na+ so identificados farmacologicamente pela sensibilidade ao amiloride e, mais recentemente, foram denominados ENaC (epithelial Na channels). Esses canais so formados por trs protenas homlogas, , e . Admite-se, pelas caractersticas dos aminocidos, que cada uma dessas subunidades assuma conformao que inclui dois segmentos na membrana, com os terminais C e N no citoplasma e um longo segmento extracelular. possvel que a estequiometria das subunidades varie em diferentes clulas epiteliais As evidncias acumuladas indicam que a subunidade forma o poro. A aldosterona estimula a reabsoro de Na+ nesse segmento. Um dos mecanismos do efeito o aumento da sntese de protenas do ENaC e, portanto, aumento da atividade dos canais. A insulina age em clulas epiteliais aumentando a atividade dos ENaC por mecanismos diferentes daqueles da aldosterona, pois as aes dos dois hormnios se somam. Quanto funo renal, o significado da ao da insulina sobre canais para Na+ est por esclarecer. Um segundo tipo de canal para Na+ inibido por amiloride, expresso em clulas tubulares, o canal sensvel a guanosina 3'-5' monofosfato cclico (cGMP). Nveis elevados do cGMP inibem o canal. Embora mRNA para a protena desse canal tenha sido detectado por RTPCR em praticamente todos os segmentos do nefro, a expresso de canais funcionais foi demonstrada inequivocamente em duto coletor da medula interna. Nessa regio os canais para Na+ sensveis a cGMP so a via principal para a entrada do on na clula, pela membrana apical. O fator natriurtico atrial, ao induzir o aumento de cGMP, inibe esse canal, reduzindo a reabsoro do Na+. A expresso de canais desse tipo em outros segmentos do nefro no foi demonstrada.
Alteraes patolgicas da funo renal associadas a mutaes em canais inicos

minante, descrita em 1963. Os portadores da sndrome desenvolvem hipertenso severa e precoce e, freqentemente, hipokalemia, associadas a supresso da atividade da renina plasmtica e baixos nveis de aldosterona. Tanto a hipertenso quanto a hipokalemia respondem bem ao tratamento com triamtereno, um diurtico antikaliurtico. Em 1994 demonstrou-se a completa ligao da sndrome com o gene que codifica a subunidade do canal para Na+.4 A anlise do gene revelou mutao, criando um cdon de parada (stop codon) prematuro, que trunca a terminao carboxila da protena. O truncamento aumenta a expresso dos canais ENaC no nefro distal, com aumento na reabsoro de Na+ e comprometimento da homeostase do volume extracelular, que predispe hipertenso. H trs formas de nefrolitase com hipercalciria doena de Dent, nefrolitase recessiva ligada ao cromossoma X e raquitismo hipofosfatmico recessivo, ligado ao cromossoma X que foram associadas ao locus Xp11.22 do cromossoma. Em todas essas formas de nefrolitase o gene do canal para cloreto CLCN5, que se localiza no locus, est modificado por mutaes de diferentes tipos.5 Algumas das mutaes foram expressas em sistemas heterlogos sem produzir canais funcionantes. Esse tipo de canal para cloreto expresso por clulas tubulares renais. A relao entre a mutao que produz genes cujos produtos no formam canais funcionantes e o aumento na excreo urinria do Ca2+ ainda no est esclarecida. O produto do gene da CFTR forma canais para cloreto e opera como regulador de outros canais para cloreto ou para Na+. Muito embora o gene CFTR se expresse em tecido renal,6 os portadores das mutaes que provocam a fibrose cstica no demonstram comprometimento da funo renal. provvel que a coexpresso de outros tipos de canais para cloreto garanta a funo das clulas portadoras da mutao.
Fibrose cstica (CFTR) Nefrolitase

Com as tcnicas de biologia molecular desenvolvidas nas ltimas dcadas demonstrou-se que algumas doenas renais ou associadas a modificaes da funo renal tm como causa mutaes em genes cujos produtos so canais inicos, expressos em clulas tubulares. Essas mutaes resultam em alteraes nas propriedades dos canais, com alteraes nas funes tubulares. A sndrome de Liddle, ou pseudoaldosteronismo, uma forma de hipertenso humana, autossmica e do-

Referncias
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Sndrome de Liddle

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5.

Fonte de financiamento: Fapesp (Processo no 95/04628-4). Conflito de interesses inexistente.

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