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Estrutura dos cidos Nuclicos

Molculas com informaes para a sntese de protenas DNA armazm ou biblioteca celular Contm informaes para a construo das clulas e tecidos Duplicao dos genes garante a perpetuao das espcies Transcrio sntese de RNA RNA mensageiro (mRNA) RNA transportador (tRNA) RNA ribossmico (rRNA) Traduo sntese de protenas a partir das informaes dos RNAs Descoberta da estrutura do DNA em 1953

DNA e RNA Replicao Transcrio Traduo Introduo Biologia Molecular

Alexandre Havt

Watson e Crick

Estrutura dos cidos Nuclicos DNA e RNA

Estrutura dos cidos Nuclicos DNA e RNA

Estrutura dos cidos Nuclicos DNA e RNA

Estrutura dos cidos Nuclicos - DNA

Estrutura dos cidos Nuclicos - RNA

RNA mensageiro - mRNA

RNA ribossmico - rRNA


Ribossomos Procariotos Citoplasma Mitocndrias Eucariotos Procariotos 3 tipos de molculas de rRNA
16S + 21 protenas 30S 23S +34 protenas 50S 5S
70S

RNA transportador - tRNA


Funo
Transportar aminocidos para a sntese protica Assegurar a incorporao dos mesmos na posio correta
anticdon

Citoplasma de eucariotos 4 tipos de molculas de rRNA


18S + 33 protenas 40S 5S 28S +50 protenas 60S 5,8S Mitocondriais
80S

Clulas com pelo menos 20 tRNA Pequenas molculas 80 nucleotdeos 4S

55S
Propriedades similares ao das bactrias

Regras da Sntese dos cidos Nuclicos e Protenas


Formados por blocos monomricos
RNA e DNA
5 Nucleotdeos

Regras da Sntese dos cidos Nuclicos e Protenas

Protenas
20 aminocidos

Monmeros adicionados 1 por vez Cadeia de formao tem ponto de partida especfico com crescimento unidirecional para um terminal fixo
Direo 5 - 3

Produto primrio frequentemente modificado

Replicao do DNA
Duplicao do material gentico para a diviso celular Replicao semiconservativa
Uma fita parental e uma nova fita sintetizada

Replicao do DNA

Forquilha de replicao Helicases - Separao das duplas fitas Protenas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximao Primase sntese de iniciador Topoisomerase
Desenrolam supertoro

Ligases unio dos fragmentos de Okasaki DNA polimerases


- associao com primase para formao do iniciador - polimerizao das fitas lder e lenta - polimerizao DNA mitocondrial - polimerases de reparo

Replicao do DNA Eucaritico

Sntese de RNA Transcrio

Sntese de RNA

Transcrio Sntese de RNA


RNA polimerases devem reconhecer
O ponto de incio da transcrio Qual das fitas deve ser usada como molde transcrita

Regio promotora do DNA


Controla a ligao da RNA polimerase Identifica o ponto de incio da transcrio Controla a frequncia da transcrio
Sequncias regulatrias no promotor Sequncias perto do promotor Reforadores
Interagem com protenas que estabilizam a ligao RNA-polimerase ao promotor

Transcrio

Processamento do mRNA Eucaritico

Sntese dos rRNAs Eucariticos

Sntese dos tRNAs Eucariticos

Sntese Protica - Traduo


Ocorre nos ribossomos rRNA

Sntese de protenas Traduo

Direcionado pela sequncia dos cdons de mRNA Cada tRNA traz um aminocido especfico ao seu anticdon Aminoacil-tRNA

Cdigo Gentico
Primeira base (5) U U Phe Phe Leu Leu C Leu Leu Leu Leu A Ile Ile Ile Met G Val Val Val Val C Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Segunda base A Tyr Try Parada Parada His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu G Cys Cys Parada Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Terceira base (3) U C A G U C A G U C A G U C A G

Formao do aminoacil-tRNA
Aminoacil-tRNA tRNA ligado covalentemente a um aminocido na terminao 3 Cada aminocido com seu tRNA
Alanil-tRNAala Metionil-tRNAi met

20 Aminoacil-tRNA-sintetases Processo dependente de ATP Ocorre em 2 passos


Formao do complexo:
enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato

Transferncia do aminocido ativo


Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose Nucleotdeo de adenina (CCA)

Processo da Traduo
Envolvimento de 3 passos Iniciao Alongamento Terminao

Iniciao

Alongamento Ligao Peptdica Translocao


Cdons de parada

Terminao
Inexistncia de tRNA com anticdons que possam parear com
UAA UGA UAG

Fatores de liberao unem-se ao ribossomo Hidrlise da ligao peptidiltransferase


Cadeia peptdica tRNA

Peptdeo sintetizado liberado Dissociao das subunidades do ribossomo


Liberao do mRNA

Polissomos
Ligao de vrios ribossomos ao mRNA Cada ribossomo cobre 80 nucleotdeos de mRNA Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotdeos

Tcnicas de Biologia Molecular


Reao de Polimerase em Cadeia PCR
Funo - Multiplicao de trecho especfico de DNA
Problema anlise de cidos nucleicos
Baixa quantidade de cidos nuclicos nos tecidos
Karis Mulis

Primers Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus)


Enzima termoestvel em temperatura at 117 C Temperatura tima 72 C

Incio vrios banhos maria com diferentes temperaturas 1987 publicao do artigo de Mulis na Methods in Enzymology 1989 primeiro termociclador 1994 Nobel em qumica para Karis Mulis

Tcnicas de Biologia Molecular


Fundamentos do PCR
Desnaturao das cadeias de DNA 94 C Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer) Extenso incorporao dos nucleotdeos pela enzima Taq 72 C

Tcnicas de Biologia Molecular


Vdeo da reao de PCR

Reagentes essenciais
Taq em soluo de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 50% glicerol Tampo 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl Cloreto de magnsio cofator para ao da enzima Desoxinucleotdios (ATP, TTP, CTP, GTP) mistura de [ ]s iguais Primers especficos sequncia que se deseja amplificar

Tcnicas de Biologia Molecular


Fundamentos da Transcriptase Reversa
Vrus de RNA tipo VI
Enzima transcriptase reversa Genoma de RNA orienta a formao de uma molcula de DNA
AMV - Vrus da Mieloblastose aviria M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus)

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT

mRNA cDNA mRNA cDNA mRNA cDNA

RNAse I

Importante ferramenta para o estudo da expresso gnica a partir do mRNA Sntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA) Sequncias de cDNA especfico podem ser amplificados por PCR

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT

mRNA cDNA

PCR

Tcnicas de Biologia Molecular


Isolamento de RNA
Imprescindvel uso de luvas e amostras no gelo quando possvel evitar RNAse Qualquer amostra tecidual, cultura de clulas - (100mg) Mtodo muito utilizado Reagente TRIZOL

Isolamento de RNA por TRIZOL


Fenol + Isotiocianato de guanidine
Membranas celulares e nucleares destrudas Manuteno da integridade do RNA Macerao da amostra com TRIZOL

Clorofrmio separao em 3 fases


RNA sobrenadante DNA camada intermediria Protinas camada inferior

Precipitao com Isopropanol Lavagem com Etanol 75% Leitura em espectrofotmetro


260nm quantidade ( A260 x fator de diluio x 0,04 = [ ug/uL]) Razo 260nm/280nm qualidade do RNA ( 2,00)

Anlise por Eletroforese


Amostra 100 mg + 1 mL de TRIZOL Homogeneizar Centrifugar 12.000 g 10 min. 2- 8 C

Principio bsico
O DNA tem carga negativa Aplicando uma voltagem as molculas de DNA migrariam para o catodo Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separandoo por tamanho
Molculas menores migram mais rpido Molculas maiores migram mais lento

Vrtex por 15 sec. Remover sobrenadante transparente para novo tubo Acrescentar 500 uL de isopropanol Incubar RT C 10 min Incubar RT C p/ 2-3 min Centrifugar 12.000 g p/ 15 min

Remover sobrenadante p/ novo tubo Acrescentar 200 uL de clorofrmio

Descartar 3 sobrenadante Centrifugar 12.000 g p/ 15 min 2 8 C Descartar sobrenadante Acrescentar 3x 1mL de etanol 75% Centrifugar 3x a 7.500 g por 5 minutos 2 8 C Evaporar etanol Solubilizar pellet ddH2O autoclavada com

A distncia percorrida comparada distncia de uma molcula de tamanho conhecido

Leitura espectrofotmetro

Anlise por Eletroforese


Principio bsico
Agarose polissacardeo aquecido para dissolver em tampo eletroltico
Tris-Acetato-EDTA TAE Tris- Borato-EDTA Solubilizao do gel por esfriamento

Aumento da viscosidade da amostra com glicerol Visualizaoda corrida da amostra com corante bromofenol blue Visualizao do DNA no gel por brometo de etdeo
Cuba de Eletroforese Horizontal