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LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR, Polimerase Chain Reaction) APLICADA EN PROGRAMAS DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES P. Dovc Introduccin En los programas de transferencia de embriones es deseable contar, antes de la transferencia, con informacin confiable sobre el genotipo del embrin. Sobre todo sera importante diagnosticar su sexo. De la misma forma sera interesante obtener informacin sobre la eventual presencia de predisposiciones a enfermedades hereditarias y la constitucin gnica en algunos loci, importantes para las caractersticas de valor productivo. La reaccin en cadena de polimerasa brinda la oportunidad de amplificar especficamente un reducido nmero de copias de ADN genmico para fines analticos. La ejecucin de estos tests, aunque sensible a perturbaciones, es relativamente simple y puede brindar la informacin deseada al cabo de pocas horas. Por ello el diagnstico gnico mediante la reaccin PCR es un mtodo de eleccin para los programas de TE. La historia de la biologa molecular muestra que a menudo el desarrollo y la puesta a punto de nuevas tcnicas tienen una marcada influencia sobre el modus procedere para resolver problemas bsicos y aplicativos. De esta forma la reaccin de PCR marc un importante cambio en la estrategia para resolver problemas en un amplio campo de la biologa molecular. La reaccin PCR en la forma actual fue establecida por MULLIS y FALOONA en 1987 y fue intensamente automatizada mediante la aplicacin de modernos instrumentos. Por un lado la reaccin PCR puede reemplazar parcialmente algunos mtodos antiguos y complicados (determinacin del genotipo de loci individuales). Por otro lado permite el desarrollo de nuevas estrategias (p.e. "gen linkage", anlisis a nivel molecular, caracterizacin del genotipo de determinadas clulas en forma individual). La reaccin PCR representa una eficiente tcnica para la replicacin de segmentos especficos de ADN in vitro e impulsa el desarrollo del rea de anlisis de ADN y ARN. La idntica duplicacin del material hereditario y su transmisin a la prxima generacin es una caracterstica de todo ser vivo. La reproduccin de la masa hereditaria (replicacin del ADN) sucede en forma semi conservadora: en la doble hlice de ADN una es la cadena original, mientras que la otra es su homlogo sintetizado posteriormente. In vivo la replicacin de ADN es un proceso complejo que requiere la accin coordinada de una gran cantidad de enzimas. En primer lugar las largas molculas de ADN genmico deben ser desespiralizadas, estabilizadas en ese estado, replicadas y luego la nueva cadena doble, recin sintetizada, debe ser transformada nuevamente en la cadena de doble hlice original. Estos procesos ocurren a una velocidad de unas miles de bases por minuto con una frecuencia de error de 1x10-9. Las polimerasas de ADN juegan un rol preponderante en la replicacin in vivo de ADN como matriz (template), un final 3'OH de un fragmento corto de una cadena doble de ADN libre como oligonucletido iniciador (primer) y nucletidos trifosfato desoxigenados (dNTPD, N corresponde a adenosina, citosina, guanidina o timidina) como bases para la cadena complementaria. Normalmente las polimerasas de ADN necesitan para su actividad, la presencia de iones metlicos como cofactores. Estos componentes -matriz, oligonucletido iniciador con final 3'OH libre, dNTPs y polimerasasrepresentan tambin los elementos para la replicacin de ADN in vitro. En la concepcin de la reaccin PCR se unieron varios pasos de la sntesis, logrando una amplificacin especfica de una regin limitada por oligonucletidos iniciadores (MULLIS y col., 1987).

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Principios de la reaccin PCR La idea de la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) se basa en la repetida sntesis de una regin de ADN que es limitada por dos molculas iniciadoras. Para la seleccin y la sntesis del iniciador es necesario tener por lo menos la informacin sobre la secuencia en los extremos del ADN que se desean amplificar. Esto posibilita la ubicacin de dos oligoelementos iniciadores complementarios a la cadena matriz, de tal manera que demarcan la secuencia blanco. La matriz de ADN es desnaturalizada en primer lugar mediante calentamiento de 94 a 96o C, la reasociacin se impide luego por medio de un enfriamiento rpido. En presencia de iniciadores adecuados, dNTPs y polimerasas de ADN, se logra un acoplamiento de las molculas iniciadoras a la parte homloga de la matriz (primer annealing), posteriormente la polimerasa puede sintetizar la segunda cadena. De esta manera se obtienen dos cadenas dobles a partir de una. Estas pueden ser a continuacin utilizadas nuevamente como matriz. Una repetida desnaturalizacin por medio de calor conduce a la liberacin esta vez de cuatro matrices que pueden ser complementadas a continuacin formando cuatro cadenas dobles de ADN. De esta forma se puede duplicar el nmero de copias de cada ciclo y despus de n ciclos concentrar una regin especfica a un valor 2n. Es necesario destacar que durante la amplificacin se forman dos distintas amplificaciones: cortas, limitadas en ambos extremos por la del iniciador y copias largas que sobrepasan la secuencia homloga al iniciador en el final 3'OH. La amplificacin de los fragmentos cortos sucede en forma exponencial, mientras que el incremento de las copias largas se manifiesta en forma lineal. Despus de n ciclos el nmero de fragmentos cortos aument a 2n (n + 1). Una sola molcula puede ser modificada de esta manera en 20 ciclos por el millonsimo factor (220). La idea ya fue descripta en los aos '70 (KLEPPE y col., 1971). En un comienzo se utiliz una polimerasa de ADN termolbil (fragmento Klenow de la polimerasa I de E. Coli). Luego de cada desnaturalizacin fue necesario agregar la polimerasa nuevamente, lo que complicaba y encareca el procedimiento. La aplicacin de la polimerasa de ADN termoestable de thermus aquaticus, cuya actividad se mantiene durante un alto nmero de ciclos, permite incorporar la polimerasa una sola vez al comienzo de la reaccin. Diferentes pasos de la reaccin PCR (desnaturalizacin, alineamiento del iniciador-primer annealing- y extensin del iniciador) requieren cambios de temperatura relativamente rpidos. Una solucin sencilla es la instalacin de 3 baos Mara. Uno con temperatura de desnaturalizacin (94-96o C), el segundo con la temperatura adecuada para el alineamiento del iniciador a la matriz (primer annealing, 50-70oC) y el tercero con la temperatura apta para la sntesis (72o C). Dado que es muy trabajoso cambiar manualmente los tubos de ensayo se recurri rpidamente a la ayuda de brazos robots. El siguiente paso fue el desarrollo de los hoy muy comunes termocicladores, capaces de repetir cclicamente los cambios de temperatura deseados gracias a microprocesadores. Los programas de estos aparatos permiten variar sus funciones. Esto significa que es posible prolongar el tiempo de desnaturalizacin en el primer ciclo, extender la duracin de la fase de sntesis en el ciclo final y enfriar el tubo de ensayo a 4o y hasta 8o C al concluir la reaccin. La mayora de las mquinas pueden ser programadas libremente siendo posible le eleccin de temperaturas dentro del margen de 50-96o C. El cambio de temperatura al calentar o enfriar sucede a una velocidad de 1 a 2oC/min-1. Segn el equipamiento tcnico se distinguen termocicladores con un bloque metlico termorregulado para los tubos y otros con bao fluyente.

Componentes de la reaccin Los componentes de la reaccin PCR pueden ser comprados en forma de set completo ("gen-Amp.Kit", Perkn-Elmer/Cetus). Diversas firmas ofrecen tambin los componentes en forma separada. El empleo de un set es recomendable para el principiante y para los laboratorios que tienen dificultades en conseguir los reactivos de alta calidad. La combinacin individual de los componentes para la reaccin

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PCR requiere la adquisicin de polimerasa ADN, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris, detergente no inico, gelatina o albmina de suero de vaca, iniciadores y matriz de ADN. En la mayora de los casos se utiliza la polimerasa de ADN termoestable, aislada de la bacteria termfila thermus aquaticus (polimerasa ADN-Taq). La termoestabilidad y la alta temperatura ptima hacen que esta enzima sea de eleccin para mltiples aplicaciones. La misma es ofrecida ya por varias firmas. Aparte de la polimerasa ADN-Taq hay otras polimerasas termoestables en el mercado (polimerasa ADN-Tth de thermus thermophilus, polimerasa ADN-Bst de Bacillus stereo-thermophilus, polimerasa ADN-Vent der thermococcus litoralis). La mayora de las polimerasas de ADN termoestables tienen una actividad ptima a temperaturas entre 70-78o C y sintetizan la cadena homloga a una velocidad de ms de 1000 bases por minuto. Para esa actividad ptima se requiere un pH de 8,2 a 9,5 en 10mM de solucin tampn Tris. Los nucletidos trifosfticos desoxigenados (dNTP) son ofrecidos liofilizados o en soluciones acuosas de 100 mM. Es conveniente preparar soluciones de 2mM de cada dNTP y congelarlas en pequeas porciones (100 a 200 l). Bajo estas condiciones son estables durante varias semanas. Las soluciones tampn son usualmente producidas y almacenadas en forma dcupla concentrada. La composicin comn es de 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatina, 0,01% NPO4 y 0,01 Tween 20 (SAIKI y col., 1988). Detergentes no inicos pueden ser reemplazados por Tritn x-100 aunque la presencia de un detergente es decisiva para el procesamiento de la enzima. Se debe recordar que altas concentraciones de dNTPs forman complejos MgCl2, lo que reduce la disponibilidad del mismo. Por ello es necesario aumentar la concentracin de MgCl2 en dicho caso. Los oligonucletidos iniciadores sintticos con 18 a 30 nucletidos mostraron ser adecuados para la amplia gama de aplicaciones. Iniciadores cortos de 18 nucletidos son suficientes para la ampificaciones de matriz-ADN poco complejas (p.e. plasmidios). Los iniciadores universales con lectura hacia adelante y atrs (Forward y Reverse-Primer) son adecuados para la amplificacin de sectores clonados. A menudo la calidad y pureza de los iniciadores sintticos es satisfactoria y pueden ser utilizados sin purificacin accesoria. En caso contrario se ofrece la purificacin HPLC en una columna cromatogrfica o la limpieza a travs de poliacrilamida. Al disear un iniciador se debe tener en cuenta que los iniciadores tengan semejante cantidad de guanidina y citosina, que no formen estructuras secundarias estables y que tengan poca homologa entre s. Sobre todo es importante que no exista homologa en la regin 3'- entre los iniciadores. Ya se ofrecen a la venta programas de computacin que facilitan decisivamente la seleccin de los iniciadores. Como matriz (template) puede ser utilizado ADN del ms variado origen. Para una amplificacin exitosa es de decisiva importancia que la preparacin del ADN no contenga impurezas que puedan interferir la misma negativamente. Sobre todo la presencia de fenol, detergentes y EDTA tiene un efecto perturbador. Dado que el largo de las amplificaciones excede en raros casos 1-2 Kb, el ADN-matriz no requiere tener alto peso molecular. Sectores cortos pueden ser amplificados exitosa-mente an a partir de matrices ADN degradadas como por ejemplo en material arqueolgico (PBO y col., 1988). Para la amplificacin es importante una buena desnaturalizacin de la matriz-ADN. Se recomienda una desnaturalizacin de por lo menos 5 min antes de la aplicacin de la enzima. Las condiciones de reaccin dependen sobre todo de la temperatura de fusin del iniciador (temperatura de alineamiento, "annealing temperature") y del largo de la amplificacin (tiempo de sntesis). Es necesario establecer experimentalmente el tiempo de reaccin ptima para cada par de iniciadores. El volumen de reaccin vara de 25 a 100l dependiendo de la cantidad de amplificaciones que se requiere para los estudios posteriores. Por razones econmicas es propicio reducir al mnimo el volumen de reaccin en anlisis de rutina. La concentracin del iniciador oscila entre 25 y 100 pmol. Para la mayora de las amplificaciones son suficientes 25 a 30 ciclos de amplificacin. Se requieren ms ciclos si la matriz-ADN que se quiere copiar se presenta en un reducido nmero de muestras (p. e. ADN de clulas aisladas).

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Anlisis de los productos de la reaccin PCR La concentracin especfica de la secuencia entre los iniciadores permite amplificar una cantidad suficiente de ADN para un anlisis electrofortico a partir de un grupo pequeo de copias de la matrizADN. En la mayora de los casos es posible separar las amplificaciones en gel de agarosa de 0,8 a 2,0% y observarlas bajo luz ultravioleta despus de una coloracin con etidio bromado (Ethidium Bromid). Si se trabaja con fragmentos muy cortos, que deben ser divididos con enzimas de restriccin despus de la amplificacin (fragmentos ms cortos que 50 pB), algunas veces es necesario utilizar geles de poliacrilamida (PAA) para alcanzar una separacin suficiente. Para los geles PAA se puede utilizar la coloracin con etidio bromado o la coloracin con plata. Esta ltima, a pesar de ser ms complicada, es ms apropiada para fragmentos muy cortos y cantidades pequeas de ADN debido a su sensibilidad. Particularmente exigente es la separacin electrofortica de las amplificaciones de las llamadas regiones "microsatlites". Microsatlites son regiones repetidas en el genoma que se componen de muchas copias de una secuencia corta (por lo general son dinucletidos). Estas regiones se diferencian a menudo en el largo solamente por dos nucletidos. Para el anlisis de dichas amplificaciones es importante un sistema electrofortico de alto poder resolutivo. En estos casos se utilizan productos de la reaccin PCR marcados radioactivamante o de otra manera. Estos son separados sobre geles finos PAA (estos geles se utilizan tambin para determinar la secuencia del ADN). Para detectar mutaciones puntuales se aprovecha la distinta forma de fusin de las amplificaciones que surgen a partir de las mutaciones. Para ese fin se preparan geles con gradientes lineares del desnaturalizante ("Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE, MYERS y col., 1987). En la migracin a travs del gradiente las molculas de ADN se desnaturalizan en forma paulatina en funcin del nmero de dominios de fusin (regin topogrfica de la hlice de ADN). Esto determina el diferente modo de fluir. En este sistema no es necesario buscar lugares de restriccin polimorfos para la separacin especfica del alelo. Una sola mutacin puntual altera la temperatura de fusin de un dominio determinado (25 a varios cientos de nucletidos) hasta 1,5o C. La migracin de los fragmentos parcialmente desnaturalizados en el DGGE es ms lenta que el flujo de los fragmentos correspondientes no desnaturalizados. La separacin electrofortica de los fragmentos de cadenas simples en geles-PAA nativos brinda un mtodo alternativo para la deteccin de mutaciones puntuales en amplificaciones obtenidas mediante la reaccin PCR. Las amplificaciones desnaturalizadas con anticipacin forman estructuras secundarias en el gel PAA nativo dependientes de la secuencia. Las diferentes mutaciones puntuales influyen de manera difcilmente pronosticable sobre las estructuras secundarias de los fragmentos. No obstante lo hacen de forma tan marcada que es posible identificar mutantes que difieren por una mutacin puntual debido a la diferente movilidad entre dos amplificaciones.

Reaccin PCR mltiple (PCR Multiplex) Junto con la amplificacin especfica de una regin flanqueada por un par de iniciadores que pertenecen a una matriz compleja, la eleccin de otros pares de iniciadores posibilita la amplificacin de varios fragmentos especficos de ADN en una sola reaccin PCR. Para ello se deben cumplir algunas condiciones: cada par de iniciadores debe responder a la exigencia general para los iniciadores descripta en el punto "componentes para la reaccin", no debe existir alta homologa entre los iniciadores de una reaccin y finalmente todos deben tener similar temperatura de fusin (Tm). Reacciones PCR mltiples son reacciones concebidas con el fin de estudiar simultneamente varias localizaciones (loci) del genotipo (p.e. diagnstico gnico de enfermedades hereditarias con un amplio espectro de diferentes mutaciones, exmenes de identidad, etc.). A veces se utiliza la reaccin PCR

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mltiple como reaccin interna de control para comprobar la regin haploide existente en el genoma (regin especfica para el cromosoma Y, PEURA y col., 1991). La importancia de la reaccin PCR mltiple como reaccin de control es cuestionable sobre todo en los casos en los cuales se amplifican muy pocas matrices y especialmente se supone que las amplificaciones en las diferentes localizaciones son sucesos independientes.

Tipificacin del genotipo de espermatozoides (Single Sperm Typing) La construccin de mapas gnicos exigi hasta el momento el apareamiento selectivo, el estudio de la descendencia o la determinacin de las combinaciones gnicas en base a los datos obtenidos por el estudio del pedigree. La primera posibilidad fue aprovechada a menudo para animales. Para el estudio del genotipo humano slo es considerada la segunda estrategia. La introduccin de los marcadores RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) posibilit dividir el genoma humano en sectores mas o menos regulares de 10 cM. El anlisis del pedigree permite determinar las distancias gnicas en sectores de 1 cM (en el hombre cerca de 100 kb) en forma estadsticamente asegurada. Para la estimacin de distancias ms cortas el nmero de datos requeridos sera demasiado grande por lo que este mtodo parece ser inadecuado para estos objetivos. A partir de la introduccin de la reaccin PCR es posible amplificar el ADN de una clula en lugares especficos en forma tan abundante que las ampliaciones obtenidas son suficientes para fines analticos. Durante la meiosis el ADN de las gametas puede ser afectado por crossing-over lo que genera nuevas recombinaciones adems de las de origen materno y paterno. La frecuencia de stas es un ndice para la posibilidad de un crossing-over y la distancia entre loci investigados. Para estos estudios se adecuan individuos que son heterocigotas en ambas localizaciones examinadas. La amplificacin simultnea de ambas regiones obtenidas de espermatozoides individuales y la posterior determinacin del alelo para ambos loci permite identificar la variante de los padres como as tambin la recombinante (LI y col., 1988). En los ciclos iniciales se lleva a cabo una amplificacin simultnea de ambos loci con dos pares de iniciadores (reaccin PCR mltiple), luego se dividen los componentes para amplificar cada regin separadamente. La deteccin de las variantes del alelo se lleva a cabo mediante la hibridacin de las amplificaciones con aligonucletidos especficos para el alelo marcado radiactivamente (OEA) o no. Los resultados de la tipificacin de espermatozoides individuales demuestran que en 20% de los mismos no se produce amplificacin. Para obtener resultados confiables estadsticamente se requiere evaluar una cantidad abundante de espermatozoides. A pesar que el trabajo con las clulas espermticas individuales es relativamente complicado, este mtodo es de gran valor para la obtencin de cartas gnicas, porque brinda resultados rpidos independientes del intervalo generacional.

Determinacin del sexo El sexado confiable de los embriones en estadios preimplantatorios es un problema actual en programas de TE. Existieron diferentes intentos para determinar el sexo: mtodos inmunolgicos o citogenticos y otros mediante tcnicas de ADN. Cabe destacar que se prob intensamente como alternativa de clasificar los espermatozoides antes de la fertilizacin. Los mtodos que se fundaban en el diferente peso especfico de los cromosomas X e Y demostraron no ser adecuados por la alta variabilidad del contenido citoplasmtico. Igualmente el intento de seleccionar los espermatozoides X e Y segn su motilidad en funcin del pH produjo resultados insatisfactorios. La deteccin inmunolgica depende del reconocimiento especfico del antigen HY propio del sexo masculino (BOOMAN, 1989). Este mtodo dio resultados no confiables y mostr ser inadecuado para la aplicacin prctica. La representacin citognica de los cromosomas sexuales es relativamente exigente y requiere para la determinacin confiable del sexo un nmero alto de blastmeros. El problema principal de la determinacin del sexo mediante sondas especficas para el ADN del cromosoma Y es el largo procesamiento y la baja sensibilidad de los sistemas de hibridacin.

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Tambin en este campo de diagnstico del sexo la aplicacin de la reaccin PCR promovi una nueva estrategia en la bsqueda de una solucin. En principio una sola copia del ADN-matriz es suficiente para amplificar una regin. Como fue mencionado al tratar la amplificacin del ADN de los espermatozoides, en algunos casos, el ADN de una clula no es suficiente para una amplificacin exitosa. Por ello, para diagnosticar el sexo es conveniente disponer de 2 a 3 blastmeros para amplificar el ADN. Luego de aislar los blastmeros por medio de microciruga, las clulas deben ser lisadas con el propsito de liberar el ADN genmico para su posterior amplificacin. Para la amplificacin de las secuencias del sexo se dispone de diferentes pares de iniciadores (p.e. BRY4a, REED y col., 1989). A menudo se eligen secuencias repetidas de los cromosomas sexuales para la amplificacin. De esta forma se dispone desde un principio de un nmero mayor de copias, facilitando notablemente la obtencin de la cantidad necesaria de amplificaciones para el anlisis. En consecuencia se necesitan menos ciclos de amplificacin (20 a 25), obtenindose resultados ms rpidos. Al amplificar secuencias especficas del cromosoma Y se obtienen amplificaciones slo en embriones masculinos (HERR y col., 1990a, b). Para excluir errores durante la reaccin es conveniente amplificar una regin autosomal (GROBET y col., 1992). Esto hace necesario una reaccin PCR mltiple con 2 pares de iniciadores por lo menos. La cuestionable relevancia del control de la reaccin fue mencionada anteriormente. Una posibilidad alternativa para la amplificacin de las secuencias especficas del sexo es la amplificacin de las secuencias presentes tanto en el cromosoma X como en el Y. Estas secuencias, sin embargo, se diferencian por medio de mutaciones propias del tipo de cromosoma. Un ejemplo para dichas secuencias son los genes ZFX y ZFY (Zinc, MARDON y PAGE, 1989). Se trata de genes con una sola copia (Single Copy Gene) que existen tanto en el cromosoma Y como en el X. Ambos se diferencian, sin embargo, en un corto fragmento de la secuencia. Uno tiene un lugar de corte para la endonucleasa, el otro no. Esto conduce a un polimorfismo del largo de los fragmentos despus de la restriccin de las amplificaciones (REEP) con dicha enzima. Los iniciadores para las amplificaciones especficas de los genes ZFX y ZFY son aptos para un amplio espectro de especies. Ambos iniciadores son 25-meros, el iniciador 5-'P1-5EZ tiene la secuencia: 5'ATAATCACATGGAGAGCCACAACT-3. El iniciador 3'- tiene la secuencia: 5'GCATTTCTTTTGGTTATCTGACAAAGT-3' Los RFLPs de las ampliaciones fueron observados en las especies humana, bovina, ovina y caprina (AASEN y MEDRANO, 1990). La tabla 1 presenta los RFLPs observados en las esas especies. Tabla 1: Largo de los fragmentos y enzimas de restriccin para la demostracin del RFLP de los genes ZFX (445pb) y ZFY (447 pb) Largo de fragmento (pb) ZFX ZFY 400+45 445 272+173 272+173 317+84+46 344+103 447 447

Especie Humana Bovina Ovina Caprina

Enzima HaeIII PstI SacI SacI

Las amplificaciones tratadas con la correspondiente enzima de restriccin o las amplificaciones especficas del cromosoma Y con sus correspondientes pruebas de control son separadas en gel de agarosa y coloreadas con bromuro de etidio.

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Foto 1: Amplificacin de la secuencia especfica repetida del cromosoma Y y RFLP de las amplificaciones especficas de los cromosomas X e Y. Las columnas 1 y 8: 100 pb marcador, columna 2: amplificacin del ADN femenino con un iniciador especfico del cromosoma Y. Columna 4 y 5: amplificacin de los ADN masculino y femenino con iniciador P1-5EZ/P2-3EZ. Columna 6 y 7: divisin enzimtica de los amplificadores de los ADN masculinos y femeninos con los iniciadores P1-5EZ/P2-3EZ Caracterizacin del genotipo Las caractersticas cuantitativas son de importancia para la zootecnia prctica. Estas son determinadas en forma polignica y hasta el momento poco accesibles a los anlisis de gentica molecular. Pero hay algunos ejemplos que ilustran la importancia de algunos genes individuales para la produccin animal. Las protenas de la leche representan una familia de genes sumamente polimorfa. Las distintas variantes se distinguen en mutaciones puntuales y pequeas prdidas en el genoma. Existe especial inters en caracterizar la caseina y la lactoglobulina . Ambas enzimas tienen influencia sobre las cualidades de la leche (GRAML y col., 1987). Con la eleccin de iniciadores adecuados se pueden amplificar regiones polimorfas e identificar mutaciones puntuales mediante el RFLP. La principal ventaja de este mtodo es la independencia de la expresin gnica (el sistema es aplicable tambin en animales machos) y su rapidez (LIN y col., 1992).

Control de la descendencia Para el control de la descendencia se aplican comnmente secuencias altamente polimorfas y repetidas las cuales forman, en combinacin con diferentes sondas, un sistema de alto poder de resolucin. Con ste se pueden hacer afirmaciones estadsticamente seguras sobre la descendencia. Frecuentemente se utilizan regiones microsatlites (denominadas tambin VNTR, variable number of tandem repeat). Algunos alelos se distinguen en el largo de las repeticiones tndem (tandem repeat). Despus de la amplificacin con iniciadores que flanquean estas regiones se puede, luego de separar las amplificaciones en gel secuencial, identificar los polimorfismos. Con la combinacin de varios loci aumenta el poder resolutivo de este mtodo (GEORGES y col., 1991). Con fines forenses se emplean regiones con repeticiones de Tri- o Tetranucletidos junto con los VNTRs. Para la aclaracin de la descendencia materna se dispone del anlisis de la secuencia de la regin hipervariable (D-loop). En las especies mamferas el ADNmt es de herencia materna y est presente en numerosas copias por clula.

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Diagnstico de enfermedades hereditarias Las enfermedades hereditarias dependientes de un solo gen, con mutaciones bien definidas y que causan el desarrollo de los sntomas clnicos, son apropiadas para el diagnstico por medio de la reaccin PCR. El mtodo se basa en la ampliacin de la regin que puede estar afectada por la mutacin. En principio puede tratarse de mutaciones puntuales o prdidas (deletions) en el genoma. Para el diagnstico se disponen bsicamente de 3 alternativas: hibridacin de las amplificaciones con oligonucletidos especficos para el alelo (OEA), anlisis de restriccin de las amplificaciones y determinacin directa de la secuencia de la regin amplificada. Con el surtido de endonucleasas disponibles actualmente en el mercado, es posible encontrar para casi todas las secuencias una enzima apropiada. Para la determinacin directa de la secuencia de los productos de la reaccin PCR se ofrecen varias alternativas. Una posibilidad es la concepcin de una reaccin PCR en la cual solo en los primeros ciclos ambas cadenas son sintetizadas. A continuacin predomina la sntesis de una cadena. El incremento del producto de la reaccin PCR es lineal en lugar de exponencial). Finalmente el producto es una cadena simple de ADN, la cual puede ser utilizada directamente como matriz para la secuencia a determinar. Otra posibilidad es la determinacin directa de la secuencia del producto de cadena doble de la reaccin PCR. Esto, sin embargo, parece ser difcil sobre todo con amplificaciones cortas. Una ltima posibilidad la presenta, por supuesto, el clonado de las amplificaciones y el posterior anlisis de los clones recombinantes. Un ejemplo para el anlisis de restriccin de las amplificaciones es la deteccin de la anemia falciforme del hombre (SAIKI y col., 1985). Para ese fin se amplifica una regin con un largo de 725 pb del gen de la -globulina y luego se divide la amplificacin mediante la enzima CvnI. Con ello se obtienen dos fragmentos constantes (256 y 88 pb) y un fragmento de 381 pb de largo. Este puede ser dividido en dos subfragmentos (201 y 180 pb) si proviene de un individuo sano. En cambio en individuos con anemia falciforme una mutacin puntual causa la prdida del lugar de reconocimiento para la enzima (KAZAZZIAN, 1989). La identificacin directa de la mutacin es posible despus del anlisis electrofortico de las ampliaciones tratadas enzimaticamente. La citrulinemia es una enfermedad hereditaria del bovino provocada por una mutacin puntual en el gen de la enzima argininasuccinato sintetasa. En los animales que padecen esta enfermedad, el codn 86, que normalmente codifica para arginina, se transforma en un codn stop. La consecuencia es un producto gnico corto en el locus que impide el normal desenvolvimiento del ciclo metablico de la urea provocando un aumento de la concentracin de citrulina con alteraciones patolgicas. La mutacin modifica tambin el lugar de reconocimiento de la endonucleasa AvaII, presente en animales sanos, de forma tal que en los animales con esa deficiencia gentica el lugar con AvaII no se puede separar. Con la eleccin de una iniciador adecuado es posible amplificar una fragmento de 176 pb de largo, que produce dos fragmentos (98 bp + 78 pb) cuando los animales sanos son tratados con AvaII. En los animales enfermos falta el lugar de reconocimiento para AvaII (FRSTER, 1991). Diagnsticos de rutina para la talasemia- se basan en la hibridacin especfica del ADN amplificado con oligonucletidos especficos para el alelo en combinacin con el anlisis de restriccin. Aproximadamente la mitad de los ms de 60 mutantes de la talasemia son identificables mediante el anlisis de restriccin. Las mutantes restantes son diagnosticables mediante el anlisis de restriccin. El resto de las mutantes es diagnosticable por medio de la hibridacin Dot-blot con oligonucletidos especficos para el alelo. La precisin del lavado debe ser establecida de tal manera que la diferencia entre las fuerzas de la seal de hibridacin entre homocigotas y heterocigotas sea detectable con claridad. La secuenciacin de las regiones amplificadas cobra particular importancia en la identificacin de nuevas mutantes (WONG y col., 1987). Defectos ocasionados por prdidas pequeas pueden ser diagnosticados mediante la seleccin de iniciadores apropiados para ambos lados del lugar presumible de la prdida. Un ejemplo de ello es el

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diagnstico de la distrofia muscular Duchenne. En una reaccin PCR se emplean 18 iniciadores, que limitan 9 regiones ms comnmente afectadas por prdidas del gen distrofin. La falta de las amplificaciones de la regin determinada indica la mutacin. En general este mtodo es limitado por el largo de la amplificacin en individuos sin prdidas, dado que la amplificacin de regiones que superan 2 kB es problemtica y poco adecuada para el diagnstico de rutina.

Comprobacin del transgen Como ocurri en otras reas de la gentica molecular, la reaccin PCR encontr rpidamente su aplicacin en el diagnstico de transgnesis. En la concepcin del sistema de comprobacin se hace uso, sobre todo, de las particularidades de la secuencia transferida. Se intenta amplificar los fragmentos del transgen no presentes en el ADN genmico endgeno o aquellos diferentes de la secuencia endgena (p.e. mutaciones puntuales que modifican las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas, prdidas, inserciones, etc.). En algunos casos el transgen se diferencia de la secuencia endgena por la falta de secuencias vectores o por las regiones promotoras. En ambos casos la presencia de elementos heterlogos puede ser utilizada para el diseo de iniciadores. Mediante la evaluacin cuantitativa de la reaccin PCR se puede deducir el nmero de copias del transgen. Con ese fin se lleva a cabo a menudo una co-amplificacin en un locus endgeno para estimar la cantidad de la amplificacin del transgen en funcin de la produccin estandarizada de amplificaciones del locus de referencia. De singular importancia es la evaluacin de la reaccin PCR en la fase logartmica dado que las diferencias causadas por la distinta cantidad original de ADN matriz son evidentes sobre todo en ese momento. El mejoramiento de la cuantificacin significa una marcacin estandarizada, covalente de las amplificaciones (iniciadores marcados en forma fluorescente).

Diagnstico de enfermedades infecciosas La reaccin de PCR se ofrece como mtodo diagnstico para detectar infecciones, sobre todo las subclnicas porque su sensibilidad permite la deteccin de cantidades mnimas de ADN (tericamente una sola copia de la molcula matriz es suficiente). Es posible comprobar secuencias integradas en el genoma (p.e. infecciones retrovirales) como tambin la presencia de secuencias episomales y extracelulares propias de las infecciones. La reaccin de PCR facilit un progreso importante en la investigacin HIV. Se posibilit el diagnstico de secuencias provirales HIV-I de las clulas mononucleares de la sangre perifrica, obtenida de pacientes sero-positivos; a pesar que no fue posible confirmar la infeccin a travs del cultivo del virus (OU y col., 1988). De especial importancia es la aplicacin de la PCR en el diagnstico de infecciones subclnicas provocadas por agentes difcilmente cultivables in vitro. La eleccin del iniciador especfico de especie garantiza la identificacin del agente infeccioso. El polimorfismo en las regiones especficas de especie permite la identificacin de las distintos tipos (DOVC y col., 1992). De esta forma se dispone, en el estudio etiolgico de las infecciones, de un mtodo eficaz que puede aclarar tambin los interrogantes forenses.

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Apndice Protocolo de laboratorio para la amplificacin de la regin ZFX y ZFY de blastmeros. 1. Los blastmeros obtenidos por medio de microciruga son suspendidos en 5l de medio y transferidos a un tubo de ensayo Eppendorf. Se aaden 20 l de agua bidestilada a fin de alcanzar un volumen final de 25l. Posteriormente los blastmeros (3-5) son congelados cclicamente 10 veces en hielo seco y descongelados a 96o C en un termociclador. En el ltimo ciclo el tratamiento trmico es prolongado a 10 minutos. Luego las pruebas son mantenidas en hielo. Para la reaccin PCR se prepara la siguiente solucin "Master-mix" (expresada en l): H2O 8,5 10 x buffer 5,0 dNTPs 5,0 Iniciador 3,0 + 3,0 Polimerasa Taq 0,5 25l de Master-mix son incorporados a la solucin con los blastmeros lisados. Todo se cubre con 60l de parafina. La reaccin de PCR se lleva a cabo en el termociclador: 1 min: 94o C 1 min: 60o C 1 min: 72o C 25 ciclos En el primer ciclo se prolonga el primer paso a 5 min y en el ltimo ciclo el ltimo paso a 4 min. 6. 7. Despus de 25 ciclos se aade 0,5 ml de polimerasa Taq, posteriormente se sigue con otros 25 ciclos. Despus de 50 ciclos se produce la divisin enzimtica de las amplificaciones. Luego la electroforesis en gel.

2.

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