Aplicaciones de la Epidemiologa Molecular en la Salud Animal.

Caso Estudio: Brucelosis

Ing. Duglas Ernesto Len Nez Abril 2012

Repblica Bolivariana de Venezuela Ministerio del Poder Popular para la Agricultura y Tierras Instituto nacional de investigaciones agrcolas Escuela Socialista de Agricultura Tropical Doctorado en Biotecnologa Agrcola Mencin Animal

Aplicaciones de la Epidemiologa Molecular en Salud Animal

Caso Estudio: Brucelosis

Autor: Ing. Duglas Ernesto Len N Ctedra: Epidemiologa Molecular Facilitadora: Dra. Rita Tamasaukas.

Maracay, Abril de 2012

TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIN ............................................................................................................. 3 EPIDEMIOLOGIA DE LA BRUCELOSIS ............................................................................. 5 UTILIDAD DE LA BIOLOGA MOLECULAR EN EL ESTUDIO DE LAS ZOONOSIS ............... 6 TIPIFICACIN MOLECULAR DE BRUCELLA ..................................................................... 7 PCR MLTIPLE (BRUCE-LADDER)................................................................................... 8 PCR TIEMPO REAL (REAL TIME) EN BRUCELOSIS ..................................................... 10 APLICACIONES DE MLVA (Deteccin De Polimorfismos En Las Secuencias Repetidas En Tandem) EN BRUCELOSIS ...................................................................................... 11 ANLISIS DE BRUCELAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE)13 REFERENCIA BIBLIOGRFICAS ..................................................................................... 14

INTRODUCCIN
La brucelosis es una infeccin bacteriana producida por una bacteria del gnero Brucella Gram negativa, pequea, inmvil y aerobia estricta, de crecimiento lento que no poseen cpsulas ni forman esporas. La brucelosis tambin conocida como aborto de Bang o Fiebre de Malta, descrita en los marinos de la guerra de Crimea. (Ariza, 2002)

La Brucelosis en animales, es una enfermedad infecciosa limitante del desarrollo productivo. Se encuentra ubicada en la lista B de la OIE donde se enumeran enfermedades transmisibles que se consideran importantes desde el punto de vista socioeconmico y/o sanitario a nivel nacional y cuyas repercusiones en el comercio internacional de animales y productos de origen animal son considerables (MEDEROS et al. 1981 y OIE, 2003, citado por RODRGUEZ, et al, 2005).

Segn ACHA y SZYFRES (2001), La brucelosis es una enfermedad de alta contagiosidad que afecta diversas especies animales, se transmite al hombre y constituye una zoonosis que es an motivo de preocupacin a nivel mundial. En tal sentido GODFROID et al, (2005), establecen que Si bien la enfermedad humana ha estado asociada a un reservorio animal, la complejidad de la interaccin entre humanos y animales se ha incrementado en los ltimos aos ante la aparicin de nuevas especies.

SAMARTINO (2003), seala que la Brucelosis es una enfermedad de curso crnico, afecta de forma severa la salud del animal al ocasionar abortos en varias especies de importancia zootcnica, lo que genera un impacto econmico negativo
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en la industria por las importantes prdidas originadas en la produccin de carne y leche.

En el caso particular de Venezuela, la brucelosis es una enfermedad que causa importantes prdidas econmicas, especialmente en la ganadera bovina, la misma constituye un problema de salud pblica. La enfermedad se conoce en el pas desde el ao 1930 pero no fue sino hasta el ao 1968 cuando el Ministerio de Agricultura y Cra (MAC), publica la resolucin para la campaa nacional de control de la brucelosis que aun contina en vigencia (MAC, 1987). En la actualidad, el organismo que regula la materia sanitaria animal es el Instituto Nacional de Salud Agrcola Integral INSAI, el cual est encargado de velar por el cumplimiento de las normas establecidas para el control y erradicacin de la enfermedad.

VARGAS (2003) seala que en

Venezuela la brucelosis constituye un

verdadero problema de salud pblica al cual se le viene dando mayor importancia en los ltimos aos. La enfermedad es principalmente de tipo ocupacional, afectando al personal que trabaja en ganaderas, mataderos, granjas porcinas y laboratorios que pueden entrar en contacto con placentas, secreciones y fetos abortados de animales infectados, siendo observadas alteraciones osteoarticulares y cardiacas de tipo crnico en muchos pacientes afectados.

EPIDEMIOLOGIA DE LA BRUCELOSIS La epidemiologa de la brucelosis es compleja y ha tenido variaciones con el tiempo. Se estima que anualmente existen en el mundo ms de 500.000 casos nuevos, representando una de las zoonosis ms frecuentes. La enfermedad es endmica en pases del Mediterrneo como Portugal, Espaa, el sur de Francia, Italia, Grecia, Turqua y frica del Norte, as como en Centro y Sudamrica, algunas partes de Mxico, Asia y el medio Oriente (PAPPAS, et al 2006).

Las formas de transmisin al ser humano son principalmente la ingestin de productos de origen animal no pasteurizados, contacto directo con un animal infectado o por la inhalacin de partculas. La ruta ms comn de transmisin es a travs del consumo de productos no pasteurizados, principalmente leche, quesos, mantequilla y helados. As mismo los trabajadores de mataderos, veterinarios, ganaderos y trabajadores de laboratorios tienen alto riesgo de adquirir la infeccin. (SBRIGLIO, et al 2007)

El Centers for Disease Control and Prevention (2000), establece que la Brucella, ha sido considerada como un arma biolgica, pues se piensa que la liberacin al medio ambiente de partculas que contengan esta bacteria producira 82.500 casos nuevos de brucelosis.

DORIS (2006), seala que en el caso particular de los animales, la forma principal de contagio es la va digestiva, esta se produce cuando los animales lamen fetos abortados, terneros recin nacidos y/o los genitales de otros animales, y si estos estn brucelosos se produce una ingestin masiva de bacterias. Tambin es

importante la ingestin de pastos, forrajes y aguas contaminados con secreciones vaginales y leche de hembras enfermas.

Algunos autores consideran que el contagio por va cutnea tiene por lo menos, la misma importancia, por ejemplo: se pueden producir infecciones mediante las camas infectadas, cuando haya lesiones en las tetillas o en los extremos de los miembros o en el espacio interdigital que faciliten la penetracin del agente patgeno en capas profundas de la piel, al ordear, quizs puedan introducir Brucella en la piel de los pezones las manos humedecidas con leche infectada (Rodrguez et al., 2005). La va genital puede ser importante solo si se realiza inseminacin artificial con semen infectado, de lo contrario, la brucelosis bovina no es una enfermedad venrea. El semen de un toro infectado puede contener grandes cantidades pero sin embargo no contagia a la vaca. La razn es que la acidez de la vagina contribuye a destruir a las brucelas.

La vigilancia epidemiolgica, entendida como informacin para la accin, constituye un instrumento de vital importancia para identificar, medir y analizar los problemas y condicionantes de la salud que afectan a la poblacin y sobre esa base, tomar decisiones orientadas a promocionar la salud. (GARCA, 2004).

UTILIDAD DE LA BIOLOGA MOLECULAR EN EL ESTUDIO DE LAS ZOONOSIS

Las tcnicas de biologa molecular para la deteccin rpida y directa de cidos nucleicos de los diferentes microrganismos son muy tiles en el estudio epidemiolgico de las enfermedades infecciosas. Un gran nmero de estas tcnicas

de identificacin rpida se han desarrollado con base en la amplificacin enzimtica de secuencias especficas de cidos nucleicos; estas tcnicas incluyen: la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), el RFLP (Restriction Fragment lenght Polymorphism), ribotyping (ribotipificacin), PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) Ampliacin al azar del ADN y el Spoligotyping, MLVA (deteccin de polimorfismos en las secuencias repetidas en tandem)

Estos nuevos mtodos de anlisis a nivel gentico han aumentado la posibilidad de diferenciar las cepas bacterianas y han permitido llevar a cabo estudios epidemiolgicos moleculares. La comparacin de cepas para establecer su identidad se basa en el hecho de que las cepas relacionadas epidemiolgicamente provienen de la expansin clonal de un precursor nico. (MTTAR, 2000)

En el caso de la Brucelosis, como de otras enfermedades, muchas de ests tcnicas han venido desarrollndose y protocolizndose, de manera tal que hoy en da constituyen herramientas de caracterizacin molecular que permiten hacer estudios epidemiolgicos comparativos entre los diversos biovares existentes.

TIPIFICACIN MOLECULAR DE BRUCELLA

En la tipificacin de Brucelas, se utilizan tcnicas de PCR convencional, mltiple y a tiempo real, as como PCR-RFLP y MLVA (deteccin de polimorfismos en las secuencias repetidas en tandem). En tal sentido GARCIA (2009), en sus estudios doctorales, analiz los polimorfismos entre las especies y biovariedades de Brucella y se han seleccionado un panel de marcadores moleculares basados en inserciones,

deleciones, mutaciones puntuales y secuencias repetidas en tandem para la discriminacin de Brucella.

PCR MLTIPLE (BRUCE-LADDER) GARCIA (2009), desarroll una tcnica de PCR mltiplex (Bruce-ladder) capaz de discriminar en un solo ensayo entre todas las especies de Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis y B. neotomae), incluidas los aislamientos de mamferos marinos, y las cepas vacunales B. abortus RB51, B19 y B. melitensis Rev1 (Figura 1).

FIGURA 1. RESULTADO DE LA PCR BRUCE-LADDER: (m), Brucella de aislamientos marinos; (M), B.

melitensis; (Rev1), B. melitensis Rev1; (O), B. ovis; (A), B. abortus; (RB51), B. abortus RB51; (B19), B. abortus B19; (S), B. suis; (C), B. canis; (Neo), B. neotomae. Los nmeros indican el peso molecular de los fragmentos amplificados. Con flechas blancas se indican las diferencias entre especies. Cada especie o cepa vacunal presenta un perfil caracterstico que permite su diferenciacin mediante una PCR convencional. (GARCIA 2009)

De forma similar, GARCIA (2009) mediante otros ensayos de PCR mltiplex ha sido posible discriminar entre las cinco biovariedades de B. suis. Estos mismos ensayos se han desarrollado tambin en formato para PCR a tiempo real basados en sondas TaqMan MGB. Por otra parte, mediante el anlisis por MLVA se ha demostrado la estabilidad gentica de la cepa vacunal Rev1, independientemente del origen geogrfico, comercial o tipo de aislamiento.

En ese mismo Orden de ideas GARCIA (2009) seala que mediante esta misma tcnica se ha demostrado la existencia de brotes epidemiolgicos por B. suis y se ha confirmado la infeccin cruzada de B. suis entre animales salvajes y domsticos.

GARCIA (2009) concluye que ste ensayo, que se realiza en un solo paso, permite saber qu tipo de brucela causa la infeccin. La tcnica ha sido evaluada en siete laboratorios europeos con ms de 600 cepas de Brucella de origen animal y humano y de distinta procedencia geogrfica. Se puede realizar en menos de 24 horas, en cualquier laboratorio de diagnstico bsico, sustituye a las tcnicas biolgicas y bioqumicas clsicas y evita la excesiva manipulacin de este importante patgeno.

Esta tcnica ha sido reconocida y recomendada por la OIE (Organizacin Mundial de Sanidad Animal) en su ltimo Manual de brucelosis bovina para la tipificacin molecular de Brucella, sustituyendo a otras como la PCR-AMOS.

PCR TIEMPO REAL (REAL TIME) EN BRUCELOSIS

La PCR en tiempo real (o PCR cuantitativa) surgi para resolver el problema de la cuantificacin de la tcnica de la PCR. En la PCR en tiempo real se emplean sondas marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrlisis, frecuentemente empleadas en esta tcnica, son oligonucletidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere amplificar (FIBAO, 2007)

Los estudios de GARCA (2009), permitieron protocolizar un ensayo de PCR a tiempo real que permite la deteccin especfica de todas las especies y biovariedades del gnero Brucella con una sensibilidad de 100 fg de ADN y una especificidad del 100% (Figura 2).

FIGURA 2. DETECCIN DE ADN DE B. ABORTUS MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL. En colaboracin con la empresa espaola de biotecnologa veterinaria Ingenasa se han desarrollado varios kits

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comerciales de PCR a tiempo real para la deteccin de Brucella y la diferenciacin especfica en una sola reaccin de B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. ovis. GARCA (2009)

APLICACIONES DE MLVA (Deteccin De Polimorfismos En Las Secuencias Repetidas En Tandem) EN BRUCELOSIS

En 1980 A. R. Wyman y R. White descubrieron, por azar, la primera regin hipervariable del ADN humano, y subsecuentemente se fueron hallando otras regiones de ese tipo cerca de los genes de la globina, la insulina, la mioglobina y otros. Estas secuencias no codificantes e hipervariables del ADN (de una longitud aproximada de entre 6 y 25 pb) repetidos en tndem un nmero variable de veces en sus siglas en ingles (VNTR), estn ubicados en regiones Centroamrica y telomricas de los cromosomas y forman secuencias de entre 5 y 50 kb de longitud. (FERNANDO, J. JEAN-LOUIS G, 2003).

Esta tcnica molecular es empleada para el anlisis gentico de los microrganismos particulares, tales como bacterias patgenas, que se aprovecha del polimorfismo de secuencias de ADN repetidas en tndem, por lo que su uso en brucellas ha tenido aplicaciones en filogenia y en caracterizaciones especficas para el anlisis de las vacunas.

El diagnstico y la tipificacin correctas son esenciales para llevar a cabo estudios epidemiolgicos que permitan el control y la erradicacin de la infeccin por brucelosis.

Las aplicacin de tcnicas moleculares que permiten discriminar a nivel gentico entre cepas de la misma bacteria, lo que se conoce como MLVA (de forma coloquial

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podramos definir estas tcnicas como pruebas de paternidad pero aplicadas a los microorganismos).

Para el control sanitario de la brucelosis, se emplean vacunas vivas y es esencial que estas sean estables e idnticas independientemente del origen geogrfico, comercial o tipo de aislamiento. GARCA (2009) demostr que mediante el uso de MLVA se puede emplear para garantizar la calidad y estabilidad de las vacunas de brucelosis.

En los estudios de GARCA (2009), se realizaron aislamientos de B. suis los ciales demuestran una perfecta correlacin entre las pruebas moleculares y otras tcnicas, siendo capaces de demostrar la existencia de brotes epidemiolgicos y confirmar la infeccin cruzada de B. suis entre animales salvajes (jabales) y domsticos (cerdos) (FIGURA 3)

FIGURA 3. Ejemplo de anlisis molecular por MLVA de aislamientos de B. suis. Los recuadros en rojo sealan una posible infeccin cruzada de B. suis entre jabales y cerdos domsticos en un caso (a), y la existencia de brotes epidemiolgicos en el otro (b). GARCA (2009)

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ANLISIS DE BRUCELAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE) Las tcnicas moleculares para el anlisis de ADN cromosomal como el PFGE han demostrado ser un mtodo eficiente para resolver divergencias entre las diferentes cepas de brucelas y ha sido bastante utilizado en el estudio epidemiolgico de las mismas. La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es una de las tcnicas ms modernas utilizadas en estudios epidemiolgicos, ya que es capaz de separar fragmentos de 10 kpb hasta 10.000 kpb y por esta razn ha demostrado ser altamente discriminatoria para estudios epidemiolgicos por su habilidad para diferenciar intre especies de aislados bacterianos en estudios epidemiolgicos de zoonosis.

Los estudios sugieren que PFGE es una tcnica til en la diferenciacin de cepas provenientes de animales y del hombre y que puede complementar otras tcnicas moleculares para propsitos epidemiolgicos, para prevencin y control de importantes infecciones bacterianas. Este mtodo es adems, fcilmente reproducible, relativamente estable y rpido en comparacin con mtodos que requieren hibridizaciones de ADN (MTTAR, 2000).

La Brucella ovis es reconocida mundialmente como un importante patgeno de ovejas, y tambin ha sido identificado en los ciervos de cra en Nueva Zelanda. Anteriormente, slo un tipo de cepa de B. ovis ha sido identificado. Utilizando la tcnica de ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE) en aislamientos de campo de B. ovis, se para determin si las ovejas y los ciervos se ven afectados por las mismas cepas (Ridler, et.al. 2005)

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