LABORATORIO DE BIOQUIMICA 502504 GUIA No 6.1- Enzimas mitocondriales : citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa I. EL PROBLEMA.

Identificar la actividad de algunas enzimas especficas presentes en el tejido animal como la citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa, mediante el uso de aceptores electrnicos coloreados e identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias sobre este sistema enzimtico. II. BSQUEDA DE INFORMACIN. Exprese en forma de ecuacin qumica las reacciones que catalizan las enzimas que se estudiaran en esta prctica. Realice la ficha tcnica de los reactivos a utilizar en esta prctica, los cuales se especifican en el numeral 4.

III. FUNDAMENTO TEORICO. Cadena de transporte de electrones: La cadena de transporte de electrones o fosforilacin oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y est constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroprotenas. El complejo citocromo oxidasa es el componente final de la cadena y est constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu (II). Aproximadamente el 90% del consumo celular de oxgeno se debe a la accin de este complejo. Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores electrnicos ms fuertes como el cianuro, azida y monxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente este complejo enzimtico y se interrumpe el transporte de electrones producindose una cianosis celular. La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidacin de sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos. Esta sustancia es muy reactiva as que se condensa y polimeriza fcilmente originando mezclas de pigmentos oscuros. El ciclo de Krebs y la succnico deshidrogenasa (SDH) La succnico deshidriogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocndria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de otros cidos dicarboxlicos como el malonato, malato, oxalactico y oxlico, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulacin de succinato.

El proceso se puede evidenciar in vitro mediante el uso e un aceptor electrnico artificial como el azul de metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se reoxida la coenzima FAD. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxgeno del aire, se reoaxida tomando la coloracin azul y formando perxido de hidrgeno, por esta razn el sistema se asla mediante una capa de aceite mineral. IV. MATERIALES Y REACTIVOS. Material por grupo de laboratorio. 10 tubos de ensayo dos erlenemeyer de 150ml un vaso de precipitados de 500ml Un mortero con mano Cuatro pipetas de 5ml Cinco pipetas de 2ml Dos tubos de centrfuga Una gradilla Un pipeteador

Materiales y reactivos generales. (volmenes calculados para 10 grupos de laboratorio) Arena lavada Buffer fosfato 0,1M y pH 7.4 (300ml) Solucin malonato de sodio 1% (100ml) Solucin cianuro de potasio 0,05M (50ml) PELIGROSO Solucin de p-fenilendiamina al 1% (100ml) Solucin de succinato de sodio al 1% (100ml) Solucin de azul de metileno 0,01% (100ml) Aceite mineral (200ml) Agua destilada Bao de mara termostatado a 37C Tejido heptico fresco Tejido cardiaco fresco Tejido muscular fresco

V. PROCEDIMIENTO. 1. Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas. Tomar una muestra de aproximadamente 5g de tejido libres de sangre y colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una masa suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfatos hasta completar un volumen aproximado de 15ml. Transfiera la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y mantngalo en un bao con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pase la muestra a tubos de centrfuga y centrifugue a 1500 rpm por 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150ml y mrquelo como extracto enzimtico y mantngalo en bao de hielo hasta su posterior uso. 2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa: Prepare una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la Tabla No 1.

TABLA No 1. REACTIVO (ml) Buffer fosfato pH 7.4 Malonato de sodio 1% Cianuro de potasio 0,05M Agua destilada Extracto enzimtico p-fenilendiamina 1% B 1,0 0,0 0,0 2,0 1,0 0,0 1 1,0 0,0 0.0 1.0 1.0 1.0 2 1,0 0,0 1.0 0.0 1.0 1.0 3 1,0 1,0 0.0 0.0 1.0 1.0

Mezcle bien el contenido de cada tubo e incube a 37C hasta cuando aparezca el complejo coloreado. Observe y anote los resultados obtenidos en cada tubo. 3. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succinico deshidrogenasa: Prepare una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la tabla No 2. TABLA No 2. Reactivo (ml) Buffer fosfato pH 7.4 Succinato de sodio 1% Azul de metileno Malonato de sodio 1% Extracto enzimtico Aceite mineral B 3.0 0.0 0.5 0.0 1.0 1.0 1 2.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 2 2.0 1.0 0.5 0.0 1.0 1.0 3 1.5 1.0 0.5 0.0 1.5 1.0 4 1.0 1.0 0.5 1.0 1.0 1.0

Antes de agregar el extracto enzimtico, deje los tubos incubando a 37C durante 10 minutos, y sin retirarlos del bao agregue el extracto enzimtico, inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el momento en que coloc el extracto enzimtico y anote el tiempo requerido para la decoloracin de cada tubo. Anote los resultados de cada tubo. VI. PARA EL ANLISIS DE LA PRACTICA. Datos y observaciones debidamente tabulados Anlisis de las observaciones de la prctica Revise de nuevo los objetivos de la prctica y evale si se cumplieron total o parcialmente, y redacte unas conclusiones en donde exprese en forma clara lo aprendido.

VII. BIBLIOGRAFA. Plummer, D. Bioqumica prctica,1981. Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, Mxico. Bohinski, R.C. Bioqumica.1998. Quinta Edicin, Pearson Educacin. Mxico.