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Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Departamento de Aqicultura

Cultivo in vitro, em tanques e no mar de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) em Santa Catarina

Gabriel Soares Mattar de Faria

Florianpolis / SC 2008

Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Departamento de Aqicultura

Cultivo in vitro, em tanques e no mar de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) em Santa Catarina

Relatrio de Estgio de Concluso do Curso de Engenharia de Aqicultura

Gabriel Soares Mattar de Faria Orientador: Profa. Dra. Zenilda L. Bouzon Supervisor: Dra. Leila Hayashi Laboratrio de Algas Marinhas, CCB, UFSC

Florianpolis / SC 2008

Agradecimentos BAKOF E PIBIC CNPQ

Sumrio 1. Resumo ........................................................................................................................................... 5 2. Introduo ....................................................................................................................................... 7 3. Objetivos ....................................................................................................................................... 10 4. Material e Mtodos ........................................................................................................................ 11 4.1 Infra-Estrutura da Cmara de Cultivo .......................................................................................... 11 4.2 Cultivo em laboratrio ................................................................................................................. 11 4.3 Efeitos de Diferentes Concentraes de Sulfato ......................................................................... 12 4.4 Crescimento em gua Proveniente da Praia do Sambaqui ........................................................ 13 4.5 Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais .............................................................. 14 4.5.1 Uria agrcola ........................................................................................................................... 14 4.5.2 Adubo NPK 15:15:20................................................................................................................ 14 5. Cultivo em Tanques ...................................................................................................................... 15 7. Cultivo Experimental no Mar ......................................................................................................... 16 8. Anlises Estatsticas ..................................................................................................................... 17 9. Resultados e Discusso ................................................................................................................ 18 9.1 Cultivo em Laboratrio ................................................................................................................ 18 9.1.1 Efeito de Diferentes Concentraes de Sulfato ........................................................................ 18 9.1.2 Crescimento em gua Proveniente da Praia do Sambaqui ..................................................... 20 9.2 Anlise dos Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais........................................... 23 9.2.1 Uria Agrcola .......................................................................................................................... 23 9.2.2 Adubo NPK 15:15:20................................................................................................................ 25 10. Cultivo em Tanques .................................................................................................................... 26 11. Cultivo Experimental no Mar ....................................................................................................... 26 12. Consideraes Finais .................................................................................................................. 28 13. Referncias ................................................................................................................................. 29

1. Resumo O presente relatrio refere-se s atividades desenvolvidas entre julho de 2007 a maio de 2008, incio da vigncia da Bolsa de Iniciao Cientfica (PIBIC/UFSC), vinculada ao Projeto Cultivo Experimental de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) no litoral de Santa Catarina, realizado pela UFSC (CCB/ BEG), em parceria com a EPAGRI, USP e Instituto de Pesca de So Paulo. Como a autorizao para o incio do cultivo experimental no mar foi concedida apenas em dezembro de 2007, a instalao do mdulo de cultivo foi realizada somente em fevereiro do presente ano. Enquanto isto, experimentos em laboratrio foram desenvolvidos para analisar o desempenho da espcie em condies controladas. Estudos relacionados sobrevivncia das algas em gua do mar coletada na Praia do Sambaqui, consideradas ligeiramente eutrofizadas pelo cultivo de moluscos e onde o mdulo de cultivo foi instalado, foram realizados. Plantas incubadas nessa gua por 14 dias apresentaram baixas taxas de crescimento e sinais de ice-ice, doena degenerativa do talo, tpica da espcie. Entretanto, uma vez colocada novamente nas condies gerais de cultivo, essas recuperaram as taxas de crescimento normais e o aspecto saudvel. Diferentes concentraes de sulfato em meios de cultura foram testadas para verificar a sobrevivncia da espcie, uma vez que as carragenanas so colides altamente sulfatados. Plantas cultivadas com ausncia de sulfato no sobreviveram e as que foram cultivadas com acrscimo de sulfato apresentaram taxas de crescimento similares ao do controle. Experimentos com diferentes fontes de nutrientes comerciais esto sendo realizados inicialmente em laboratrio para encontrar alternativas mais viveis soluo von Stosch utilizada tradicionalmente no cultivo in vitro da espcie. Os primeiros resultados indicam que a Uria comercial no eficiente para a manuteno das plantas. Entretanto, o NPK tem mostrado resultados otimistas, considerando que o objetivo principal no o crescimento das plantas, mas a manuteno de propgulos saudveis nos cultivos em tanques. Este tipo de cultivo est sendo desenvolvido como uma medida preventiva, uma vez que a espcie proveniente de regies tropicais e Santa Catarina possui baixas temperaturas no inverno, sendo uma alternativa, caso seja necessrio retirar as plantas do mar

at que as condies ambientais se tornem novamente favorveis. O mdulo de cultivo ainda apresenta problemas de adequao s condies da regio. Diferentes alternativas de cultivo esto sendo testadas de forma a solucionar estes problemas. At o momento, a disperso da espcie nos costes e praias adjacentes no foi observada. A segunda etapa do projeto envolver o acompanhamento do ciclo anual do cultivo no mar (plantio, colheita e processamento) e a anlise de carragenana.

Palavras-Chave Kappaphycus alvarezii, macroalgas marinhas, maricultura.

2. Introduo Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P. C. Silva (Rhodophyta, Solieriaceae) atualmente a principal fonte de carragenana kappa, colide utilizado amplamente pelas indstrias alimentcia, farmacutica e de cosmticos como agente espessante e estabilizante. A espcie, juntamente com Eucheuma denticulatum (N.L. Burman) F.S. Collins & Hervey, responde por aproximadamente 88% da matria-prima mundial processada para produo de carragenana (McHugh 2003). A maricultura dessas espcies no sul das Filipinas modificou em apenas 10 anos a fisionomia mundial da indstria de carragenana, iniciada em escala comercial na dcada de 1940 e a partir de ento, linhagens derivadas desses cultivos foram introduzidas em mais de 20 pases, com propsitos de maricultura (Areces 1995, Paula & Pereira 1998, Paula et al. 1998, Paula 2001). Atualmente, a produo mundial de carragenfitas provenientes dos cultivos das Filipinas, Indonsia e Tanznia atingem a cifra anual de 150.000 toneladas, sendo 80% proveniente de K. alvarezii e 20% de E. denticulatum. A indstria de carragenana possui mercado estimado de US$ 240 milhes (McHugh 2003). Os principais fatores limitantes para a produo das algas so: a luz, os nutrientes, o hidrodinamismo e as inter-relaes biticas. A maricultura de algas feita geralmente em um sistema extensivo, sem adio de nutrientes e tratamento com produtos qumicos. A taxa de crescimento e a produo tm sido amplamente utilizadas como os primeiros passos para avaliar o desempenho das algas para fins de maricultura, considerando que as taxas de crescimento so intrnsecas a uma dada espcie em resposta aos fatores ambientais. Do mesmo modo, a morfologia, as dimenses, a resistncia e a longevidade do talo, entre outras caractersticas fisiolgicas e reprodutivas, tm sido consideradas particularmente importantes em relao seleo de tcnicas e de locais de cultivo (Paula 2001). Os cultivos comerciais de Kappaphycus alvarezii so realizados em larga escala empregando o sistema conhecido como "tie-tie", onde pores do talo so amarradas em cabos de cultivo e esses so mantidos fixos ao fundo ou em sistemas flutuantes, como balsas ou "long-lines". A propagao de

K. alvarezii um processo de carter contnuo baseado na sua multiplicao vegetativa atravs de ciclos sucessivos de cultivo por 40 a 60 dias. Variaes desse sistema tm sido testadas ainda sem sucesso comercial, visando minimizar a mo-de-obra exigida (Areces 1995). No Brasil, a espcie foi introduzida experimentalmente em 1995, no Instituto de Pesca da Secretaria de Agricultura e Abastecimento (Ubatuba, So Paulo), com o objetivo de desenvolver estudos bsicos (marinomia) como suporte para a implantao de cultivos comerciais no litoral brasileiro, sendo aprovado pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (IBAMA) (Paula 2001). Os resultados obtidos durante mais de 10 anos de experimentos evidenciam caractersticas favorveis das linhagens para o cultivo comercial no Brasil. Destacam-se: a adaptao da espcie na regio, com altas taxas de crescimento (entre 4,5% e 8,0% dia-1), bom teor de carragenanas durante todo o ciclo anual (entre 20% e 40% de carragenana semi-refinada e entre 12% e 28% de carragenana refinada) e a regularidade das variaes sazonais desses dois parmetros, que pode ser utilizada para a previso e o controle da produo. A sazonalidade do crescimento foi relacionada principalmente temperatura, e a herbivoria foi o principal fator limitante da espcie na regio. No foram observados indcios de riscos ambientais (Hayashi 2001, Paula & Pereira 1998, 2003, Paula et al. 1999, Hayashi et al. 2007a). Desde a sua introduo, diversos estudos foram realizados: a) cultivo in vitro e taxas fotossintticas (Erbert 2001, Paula et al. 2001), b) introduo no mar e maricultura (Paula 2001, Paula & Pereira 1998, Paula et al. 2002, Paula & Pereira 2003, Hayashi 2007, Hayashi et al. 2007b), c) cultivo integrado com camares, moluscos e peixes (Lombardi et al. 2001a, 2001b, Hayashi 2007, Hayashi et al. 2008b), d) teor e propriedades de carragenanas (Hayashi 2001, 2007, Hayashi et al. 2007a, Hayashi et al. 2007b), e) cultura de tecidos e seleo de linhagens (Paula et al. 1999, Hayashi et al. 2008a), f) aspectos reprodutivos e biolgicos (Contador 2001, Bulboa & Paula 2005). As altas taxas de crescimento e o comportamento previsvel da produo de Kappaphycus alvarezii observados no cultivo experimental realizado na regio de Ubatuba, SP, sugerem a

possibilidade de cultivo da espcie em grande parte do litoral brasileiro. O Estado de Santa Catarina foi escolhido como um local promissor para desenvolver este projeto pela disponibilidade de espaos para implantao de fazendas marinhas e por ser o Estado onde existe maior desenvolvimento da maricultura e estrutura social voltada para produo de organismos marinhos, com uma infra-estrutura de pesquisa e extenso (Universidade Federal de Santa Catarina/UFSC, Empresa de Pesquisa Agropecuria e de Extenso Rural/ EPAGRI) que no encontra paralelo no pas. Uma vez que a autorizao demorou a ser liberada, foram realizados alguns experimentos de cultivo em laboratrio para analisar o desempenho da espcie em condies controladas. Estudos sobre a sobrevivncia das algas em gua do mar coletada na Praia do Sambaqui, consideradas ligeiramente eutrofizadas pelo cultivo de moluscos, onde o mdulo de cultivo foi instalado, foram realizados. Alm disso, diferentes concentraes de sulfato em meios de cultura foram testadas para verificar a sobrevivncia da espcie, uma vez que as carragenanas so colides altamente sulfatados. Foi iniciado o cultivo em tanques como uma medida preventiva, uma vez que a espcie proveniente de regies tropicais e Santa Catarina possui baixas temperaturas no inverno. Esse tipo de cultivo uma alternativa, caso seja necessrio retirar as plantas do mar at que as condies ambientais se tornem novamente favorveis. Por ser realizado em uma escala maior que o cultivo in vitro, ocorre um alto consumo de nutrientes para manter as plantas saudveis, o que torna essa fase intermediria dispendiosa. Experimentos com diferentes fontes de nutrientes comerciais esto sendo realizados inicialmente em laboratrio para encontrar alternativas mais viveis soluo von Stosch utilizada tradicionalmente no cultivo in vitro da espcie. Uma vez encontrada a fonte mais adequada, essa ser testada nos tanques.

3. Objetivos Esse trabalho teve como objetivos: Montar uma infra-estrutura no Laboratrio de Algas Marinhas (LAMAR), do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Gentica, do Centro de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Santa Catarina, que suporte toda a biomassa produzida atravs das linhagens trazidas do Laboratrio de Algas Marinhas Edison de Paula da Universidade de So Paulo Produzir biomassa suficiente para os cultivos no mar Avaliar o crescimento das linhagens cultivadas em diferentes concentraes de sulfato Avaliar o crescimento das linhagens cultivadas em gua do mar proveniente da Praia do Sambaqui Avaliar o crescimento das linhagens cultivadas sob efeito de diferentes nutrientes comerciais Criar uma fase intermediria de cultivo em tanques Instalao do mdulo de cultivo no mar

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4. Material e Mtodos 4.1 Infra-Estrutura da Cmara de Cultivo Uma das finalidades dos cultivos in vitro foi aumentar a biomassa das linhagens provenientes de So Paulo at que a autorizao para instalao do cultivo fosse concedida. Sendo assim, toda a infra-estrutura da cmara de cultivo foi otimizada e adaptada para se criar as melhores condies de crescimento da espcie. Para tanto, a irradincia foi aumentada com a instalao de mais lmpadas, o sistema de aerao foi aprimorado com a instalao de filtros intermedirios para evitar a passagem de leo proveniente do compressor de ar, e as vlvulas de aerao foram substitudas e adicionadas nas prateleiras. Com a instalao de novas lmpadas, houve um superaquecimento das prateleiras, problema resolvido com isolamento trmico atravs de placas de isopor. Foi colocado ainda um ar condicionado com controle termosttico de temperatura, para garantir uma temperatura constante de 25C no interior da cmara. Mangueiras de silicone foram instaladas para garantir a passagem da aerao por todas as prateleiras. Foi colocado ainda mais um conjunto de 4 prateleiras, para aumentar a capacidade da cmara de cultivo, disponibilizando assim mais espao para novos experimentos.

4.2 Cultivo em laboratrio Ramos de 5 linhagens diferentes (tetrasporfitos marrom, MR, verde, VD, vermelho, VM, e gametfito feminino, FM, e linhagem Edison de Paula, EP) de Kappaphycus alvarezii foram transferidas dos cultivos unialgceos e livres de contaminantes realizados no Laboratrio de Algas Marinhas Edison Jos de Paula do Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo, para o Laboratrio de Algas Marinhas (LAMAR) do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Gentica (BEG/CCB) da Universidade Federal de Santa Catarina. Esses ramos esto sendo cultivados em gua do mar esterilizada (34 1 ups) enriquecida com soluo von Stosch 50% (VS 50, segundo McLachlan 1973), em fotoperodo de 12 h, temperatura de 25C (1C), fluxo fotnico de 100 (10) mol ftons.

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m-2. s-1 e aerao constante. Os cultivos so realizados para produo de mudas de 10 a 20 g de biomassa mida e, uma vez atingida a biomassa, as mudas so mantidas em tanques at serem transferidas para o cultivo no mar, localizado na Praia do Sambaqui (Florianpolis, Santa Catarina).

4.3 Efeitos de Diferentes Concentraes de Sulfato Estudos prvios foram realizados para escolher o meio de cultura mais adequado para os experimentos. Ramos da linhagem VD com biomassa inicial de 0,5 g foram cultivados em 200 mL dos seguintes meios de cultura: gua do mar sem sulfato enriquecida com soluo VS 50 sem sulfato, gua do mar esterilizada e enriquecida com soluo VS 50 e gua do mar artificial (Pueschel & West 2007) enriquecida com soluo VS 50, segundo as condies gerais de cultivo em laboratrio descritas acima (item 4.1). O sulfato foi removido da gua do mar segundo metodologia modificada descrita por Grasshoff et al. (1983). Para cada tratamento, foram feitas 4 repeties e os cultivos foram mantidos por 15 dias. Aps os experimentos prvios, ramos das linhagens MR e VD foram cultivados em meios de cultura com diferentes concentraes de sulfato. pices com biomassa fresca total de 0,5 g foram cultivados em 200 mL de meio de cultura, perfazendo um total de quatro repeties para cada linhagem, por um perodo de 28 dias. Foram testados: gua do mar esterilizada sem sulfato enriquecida com soluo VS 50 sem sulfato e gua do mar esterilizada enriquecida com soluo VS 50 e 80 mM de sulfato de sdio. Como controle, foi utilizada gua do mar esterilizada enriquecida com soluo VS 50. Semanalmente, os meios de cultura foram renovados, as algas foram pesadas e as TCs foram calculadas. No final do experimento, foi observado aumento da salinidade (38 ups) nos meios de cultura com acrscimo de sulfato de sdio. Sendo assim, o experimento foi repetido, controlando a salinidade desse tratamento

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4.4 Crescimento em gua Proveniente da Praia do Sambaqui Ramos das linhagens de MR, VD, VM e FM foram cultivados nas condies gerais de cultivo em laboratrio descritas acima (item 4.1) em gua do mar coletada na Praia do Sambaqui. Plantas com biomassa fresca total aproximada de 15 g foram cultivadas em 3 L de gua por 14 dias, perfazendo um total de trs repeties para cada linhagem. Como controle, foi utilizado gua do mar sem algas. No final do experimento, as algas foram pesadas e as TCs foram calculadas. Aps o perodo experimental, aproximadamente 5 g de biomassa de cada linhagem foi isolada e cultivada em gua do mar esterilizada com regime alternado de nutrientes: uma semana com o acrscimo de soluo de VS 50 e outra semana sem. Para cada linhagem, foram feitas 3 repeties.

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4.5 Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais As concentraes estabelecidas para os fertilizantes comerciais foram baseadas na concentrao de nitrognio utilizada na soluo von Stosch.

4.5.1 Uria agrcola Ramos com biomassa inicial de 0,5 g da linhagem marrom foram cultivados com gua do mar esterilizada enriquecida com diferentes concentraes de Uria Agrcola (com 45% de nitrognio Ultraverde): a) 50% (4 mg L-1) b) 100% (8 mg L-1) e c) 200% (16 mg L-1). Como controle, foi utilizado gua do mar esterilizada enriquecida com soluo VS 50. Dois regimes nutricionais foram testados: pulso de nutrientes de 3 dias e acrscimo de nutrientes em semanas alternadas (uma semana de cultivo com nutrientes e outra semana apenas com gua do mar esterilizada). Para cada tratamento, foram feitas 3 repeties. Os experimentos foram realizados por um perodo de 35 dias. Semanalmente, os meios de cultura foram renovados, as algas foram pesadas e as TCs foram calculadas. 4.5.2 Adubo NPK 15:15:20 Experimentos prvios foram realizados para analisar o desempenho da espcie quando cultivada com esse fertilizante. Ramos da linhagem VD com biomassa inicial de 1g foram cultivados em 500 mL de gua do mar esterilizada enriquecida com soluo NPK (Sempre Verde). Foi utilizada uma soluo padro de NPK na concentrao de 5,83g L-1; entretanto, a quantidade utilizada no diluiu completamente em gua destilada, sendo necessrio filtrar os resduos. A soluo final foi acrescentada na gua do mar esterilizada utilizada nos cultivos, na mesma proporo da soluo VS 50 (4 mL L-1). O experimento teve durao de 35 dias, e foram feitas 3 repeties. Os meios de cultura foram renovados semanalmente, momento em que as algas foram pesadas e as TCs foram calculadas. Atualmente, esto sendo realizados experimentos com diferentes concentraes e regimes nutricionais, como descrito no experimento da Uria (dados no apresentados).

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5. Cultivo em Tanques Foram instalados 4 tanques circulares de polietileno de 500 L (BAKOF TEC), interligados entre si atravs de canos de PVC. Foram colocadas telas plsticas circulares com malha de 1,0 cm a uma distncia de 30 cm do fundo do tanque de forma a permitir que as algas permaneam no meio da coluna de gua. A circulao da gua feita entre os tanques com bomba submersa de 23 watts e capacidade de vazo de 1200 L h-1. A temperatura da gua nos tanques mantida com termostato em aproximadamente 25 1 C, salinidade em 35 ups e aerao constante. Os tanques so mantidos dentro de uma casa de vegetao e protegidos da chuva. O sistema de cultivo fechado, sem adio de nutrientes e com renovao de gua aps perodos superiores a 30 dias (Figura 1).

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Figura 1 Estrutura do cultivo em tanques de Kappaphycus alvarezii

Havendo a necessidade de corrigir a salinidade, gua de torneira com anticloro instantneo fabricado pela Empresa Mania de Peixes Ornamentais Ltda. adicionada nos tanques para manter a salinidade em 35 ups. 7. Cultivo Experimental no Mar Os cultivos esto sendo realizados na Praia do Sambaqui, localizada na Baa Norte da Ilha de Santa Catarina, em uma rea experimental de cultivo de moluscos do Departamento de Aqicultura da UFSC. O mdulo de cultivo composto por 13 quadras de 4 x 3 m, compostas por canos de PVC e cabos multifilamento. Em cada quadra esto presos oito cabos monofilamento de cultivo. Em cada cabo, 17 mudas de biomassa mdia de 20 g foram amarradas com espaamento entre elas de 20 cm. Abaixo da estrutura foi colocada uma rede de nylon com o objetivo de proteger as algas contra eventuais herbvoros e evitar a disperso e perda no ambiente (Figura 2).

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Figura 2 Mdulo de cultivo de Kappaphycus alvarezii instalado na Praia do Sambaqui. A. Viso geral B. Viso de uma quadra. Em cada extremidade da balsa foram colocadas poitas de 800 kg, confeccionadas de concreto e ferro, alm de bias de sinalizao. Esto sendo testados diferentes tipos de amarraes das plantas e dos cabos de cultivo.

8. Anlises Estatsticas As TCs das diferentes linhagens foram analisadas segundo Anlise de Varincia (ANOVA) uni ou multifatorial, e teste a posteriori de Duncan (multifatorial) ou Tukey (unifatorial) ou Unequal N (n diferentes). TCs dos cultivos em tanques foram correlacionadas com temperatura e salinidade segundo correlao de Spearman R. Todas as anlises foram realizadas no Programa Statisitica (verso 6.0) , considerando p< 0,05.

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9. Resultados e Discusso

9.1 Cultivo em Laboratrio

9.1.1 Efeito de Diferentes Concentraes de Sulfato Experimentos prvios demonstraram que algas cultivadas em gua do mar sem sulfato enriquecida com soluo VS 50 sem sulfato no conseguiram sobreviver aps 7 dias de cultivo, e as TCs mdia em gua do mar artificial enriquecida com VS 50 (0,23 - 1,24% dia-1) foram significativamente menores do que as do controle (gua do mar esterilizada enriquecida com VS 50 7,91 - 10,37 % dia-1). Plantas do controle apresentaram ainda TCs significativamente maiores em 14 dias de cultivo que em 7 dias (Figura 3). Figura 3 Taxas de crescimento (TC % dia-1) da linhagem verde cultivada por 14 dias em gua do mar esterilizada enriquecida com soluo von Stosch 50% (controle), gua do mar artificial enriquecida com soluo von Stosch 50% (artificial) e gua do mar sem sulfato enriquecida com soluo von Stosch 50% sem sulfato (sem SO4). Valores apresentados em mdias (n=4); as barras verticais representam o intervalo de confiana e as letras as diferenas significativas entre o perodo de cultivo (minsculas) e entre tratamento e controle (maiscula), segundo teste a posteriori de Newman-Keuls.

12 10 TC (% dia-1) 8 6 4 2 0 7 B aA

bA

Controle Artificial Sem SO4 SO4

B 14 perodo de cultivo (dias)

Aps os experimentos prvios, ramos das linhagens MR e VD foram cultivados em meios de cultura com diferentes concentraes de sulfato. Ramos de ambas as linhagens no sobreviveram quando cultivados em gua do mar sem sulfato enriquecida com soluo VS 50 sem sulfato (Figura 4). No foram observadas diferenas significativas entre as TCs de plantas cultivadas no tratamento

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controle (gua do mar enriquecida com soluo VS 50) e com acrscimo de sulfato em ambas linhagens, aps 28 dias de cultivo. O sulfato no considerado um fator limitante para o crescimento das algas em condies normais devido a sua abundncia no mar, e pouca ateno tem sido dada a sua influncia nos cultivos de algas marinhas. Essa abundncia provavelmente explique as TCs similares entre controle e tratamento com 80 mM de sulfato de sdio, quantidade 3 vezes maior que a normalmente encontrada na gua do mar (25 mM) (DeBoer 1981). Entretanto, a ausncia de sulfato no meio de cultura foi limitante na sobrevivncia da espcie.

Figura 4 Ramos de linhagens de Kappaphycus alvarezii cultivados em gua do mar sem sulfato enriquecida com soluo VS 50 sem sulfato. A. Linhagem marrom e B. Linhagem verde. Escala = 1 cm

Nos primeiros 7 dias de cultivo a linhagem VD do controle apresentou TC mdia (8,71 2 % dia-1) significativamente maior do que a linhagem MR do controle (5,90 1,43 % dia-1) ; no perodo restante, no foram observadas diferenas significativas entre as linhagens (Figura 5). A alta salinidade no interferiu nas taxas de crescimento uma vez que os mesmos resultados foram obtidos aps repetir o experimento, regulando a salinidade para 33 ups. A carragenana um dos principais componentes da parede celular de K. alvarezii e sua funcionalidade diretamente relacionada ao seu grau de sulfatao (Goulard & Diouris 2005). Apesar da adio de sulfato no ter interferido na TC da espcie, existe a possibilidade de alterao na

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qualidade da carragenana e na estrutura da parede celular. Por esse motivo, aps o encerramento dos experimentos, amostras foram separadas para posterior anlise de Microscopia ptica e Eletrnica, e qualidade de gel.

Figura 5 Taxas de crescimento (TC % dia-1) das linhagens marrom (MR) e verde (VD) cultivadas por 28 dias em gua do mar esterilizada enriquecida com soluo von Stosch 50% (controle) e gua do mar esterilizada enriquecida com soluo von Stosch 50% acrescida de 80 mM de sulfato de sdio (Sulfato). Valores apresentados em mdias (n=4); as barras verticais representam o intervalo de confiana e as letras as diferenas significativas entre as linhagens, segundo teste a posteriori de Newman-Keuls.

12 b 10 Controle MR Sulfato MR Controle VD Sulfato VD 8 TC (% dia-1) a

6 ' 4

0 7 14 21 28 perodo de cultivo (dias)

9.1.2 Crescimento em gua Proveniente da Praia do Sambaqui As TCs mdia das linhagens incubadas em gua do mar proveniente da Praia do Sambaqui foram mais baixas (1,20 - 2,64 % dia-1) que as observadas normalmente em cultivo in vitro (Paula et al. 2001; Bulboa & Paula 2005). As TCs foram significativamente menores em 14 dias de cultivo somente para as linhagens MR e VD. No foram observadas diferenas significativas entre as linhagens (Figura 6). Aps o perodo de incubao, foi observado despigmentao das plantas de todas as linhagens e sinais de ice-ice, doena degenerativa do talo associada ao estresse (Figura 7). Provavelmente, essa diminuio das TCs e despigmentao seja devido a limitao de nutrientes, uma vez que a gua do

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mar onde as algas foram incubadas no foi renovada durante todo o perodo experimental. De acordo com DeBoer (1981), a diminuio do contedo de pigmentos fotossintetizantes uma das respostas das algas a deficincia de nutrientes. Esta deficincia pode ter sido provocada ainda por competio com outros microorganismos, uma vez que a gua utilizada na incubao no foi filtrada nem esterilizada. Figura 6 - Taxas de crescimento das linhagens tetrasporofticas marrom (MR), verde (VD) e vermelha (VM) e gametfito feminino (FM), incubadas por 14 dias em gua do mar coletada da Praia do Sambaqui. Valores apresentados em mdia (n=3); as barras verticais apresentam os intervalos de confiana, e as letras as diferenas significativas entre os perodos de incubao de acordo com o teste a posteriori de Newman-Keuls.

4 A TC (% dia-1) 3 2 1 0 7 14 perodo de incubao (dias) a b

MR VD VM FM

Figura 7 Linhagens de Kappaphycus alvarezii incubadas por 14 dias em gua do mar proveniente da Praia do Sambaqui. A. Linhagem marrom, B. Linhagem verde, C. Linhagem vermelha e D. Linhagem feminina. Escala = 1 cm.

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Aps o perodo de incubao, as plantas foram cultivadas em gua do mar esterilizada enriquecida com soluo VS 50, por 28 dias. Aps 1 semana de aclimatao, todas as linhagens recuperaram as TCs mdias normalmente descritas para a espcie cultivadas in vitro (Paula et al. 2001; Bulboa & Paula 2005), com TCs mximas em 21 dias. Entretanto, em 28 dias de cultivo, as TCs diminuram significativamente para todas as linhagens, indicando provvel limitao de espao dentro do frasco onde foram cultivadas (Figura 8. Segundo Paula et al. (2001), as maiores TCs so observadas quando a biomassa de alga total inferior a 10 g L-1 de meio de cultura. Figura 8 - Taxas de crescimento das linhagens tetrasporofticas marrom (MR), verde (VD) e vermelha (VM) e gametfito feminino (FM), cultivadas por 28 dias em gua do mar esterilizada enriquecida com soluo von Stosch 50%, aps incubao por 14 dias em gua do mar coletada da Praia do Sambaqui. Valores apresentados em mdia (n=3); as barras verticais apresentam os intervalos de confiana, e as letras as diferenas significativas entre os perodos de incubao de acordo com o teste a posteriori de Newman-Keuls.

8 7 TC (% dia-1) 6 5 4 3 2 1 0 7 14 a bc A

bd A a ac B b B

MR VD VM FM

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perodo de cultivo (dias)

No foram observadas diferenas significativas entre as linhagens durante todo o perodo experimental (Figura 6 e 9).

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Figura 9 - Taxas de crescimento das linhagens tetrasporofticas marrom (MR), verde (VD) e vermelha (VM) e gametfitos feminino (FM), cultivadas por 28 dias em gua do mar esterilizada enriquecida com soluo von Stosch 50%, aps incubao por 14 dias em gua do mar coletada da Praia do Sambaqui. Valores apresentados em mdia (n=3) e as barras verticais apresentam os intervalos de confiana.
5 4 TC (% dia-1) 3 2 1 0 MR VD linhagem VM FM

9.2 Anlise dos Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais 9.2.1 Uria Agrcola Tanto no regime de pulso de nutrientes por 3 dias quanto no regime de semanas alternadas, as TCs foram significativamente maiores na primeira semana para todos os tratamentos (Tabela 1). Plantas cultivadas em uria a 100% e 200% em regime de semanas alternadas apresentaram diferenas significativas em relao ao controle em 7 e 35 dias de cultivo. Para plantas cultivadas em regime de pulso, no foram observadas diferenas significativas em relao ao controle. Aps 35 dias de cultivo, praticamente todas as plantas dos tratamentos com uria morreram. Entretanto, maior incidncia de ice-ice foi observada durante todo o perodo experimental em plantas cultivadas no regime de semanas alternadas. Provavelmente, as plantas cultivadas nesse regime ficaram mais susceptveis ao desbalano nutricional de fsforo/nitrognio, uma vez que a uria utilizada nos tratamentos era composta apenas por 45% de nitrognio, sem nenhum outro elemento mineral. Plantas cultivadas em pulso de 3 dias, possuam maior tempo hbil para recuperarem o balano, embora parcialmente, uma vez que possuam apenas os nutrientes disponveis naturalmente na gua do mar. Foi observado que a utilizao de uria como nica fonte de nutrientes prejudicial ao

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desenvolvimento da espcie, sendo necessrio o acrscimo de outros elementos minerais. De fato, Navarro-ngulo & Robledo (1999), em estudos sobre efeitos de fontes de nitrognio, proporo N:P e concentrao de pulso de nitrognio no crescimento de Gracilaria cornea, relatam maiores taxas de crescimento quando a relao de N:P era de 10:1 do que 10:0 em soluo Provasoli (PES). Segundo estes autores, plantas cultivadas com meio de cultura PES com relao N:P 10:0 conseguiram sobreviver, porm apresentaram colorao plida a partir de duas semanas de cultivo. No presente experimento, como apenas uria foi fornecida, sem outra soluo de nutrientes, as plantas no sobreviveram. Tabela 1 Taxas de crescimento da linhagem marrom cultivada por 35 dias em regime de pulso de nutrientes por 3 dias (P) ou em semanas alternadas (A), em diferentes concentraes de uria comercial: a) 50% (U50P e U50A), b) 100% (U100P e U100A) e c) 200% (U200P e U200A). Como controle, foi utilizado gua do mar esterilizada enriquecida com soluo von Stosch 50% (CP e CA). Valores apresentados em mdias (n=3) intervalo de confiana. Os asteriscos indicam as diferenas significativas entre os perodos de cultivo e as letras, as diferenas entre controles e tratamentos, segundo teste a posteriori de Newman-Keuls. Perodo de cultivo (dias) 14 21 28 0,68% 1,25% 1,17% 0,30 0,98 1,77 2,98% 1,16 0,76% 0,26 1,17% 0,11 0,59% 0,06 0,59% 0,53 1,03% 0,32 0,44% 0,29 2,79% 1,01 0,00% 0,00 0,00% 0,00 0,21% 0,19 0,15% 0,26 0,21% 0,36 0,17% 0,29 2,93% 0,20 1,49% 1,27 0,37% 0,09 0,53% 0,51 0,22% 0,38 0,18% 0,31 0,38% 0,65

Tratamento CP

7 3,34% 0,31 7,15% a 1,03 3,73% 0,64 3,50% 0,27 3,28% 0,74 3,70% b 0,64 3,19% 0,40 4,74% b 0,68

35 1,03% 0,57 3,31% a 0,45 0,00% 0,00 0,00% b 0,00 0,10% 0,17 0,00% b 0,00 0,00% 0,00 0,12% b 0,21

CA

U50P

U50A

U100P

U100A

U200P

U200A

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9.2.2 Adubo NPK 15:15:20 Experimentos prvios indicam que ramos da linhagem VD cultivados em NPK na concentrao de 50% apresentaram TC mdia entre 0,82 2,41% dia-1. As TCs em 7 e 14 dias foram significativamente maiores que no perodo restante (Figura 10). Em todo o perodo experimental, nenhuma planta apresentou sinais de ice-ice e ao trmino do experimento, foi observada alterao na tonalidade das plantas de verde escuro para verde amarronzado. Essa mudana de tonalidade est de acordo com o observado por Navarro-ngulo & Robledo (1999) em Gracilaria cornea cultivada em meio de cultura com relao N:P 10:10, similar ao utilizado no presente experimento. As TCs observadas esto dentro do esperado para o propsito inicial de manter as plantas saudveis com fertilizantes comerciais de baixo custo. Experimentos testando concentraes mais altas de NPK e diferentes regimes de nutrientes (contnuo ou em pulso) esto em andamento.

Figura 10 Taxas de crescimento da linhagem verde cultivada por 35 dias em gua do mar esterilizada enriquecida com soluo NPK 50% (5,83g L-1). Valores apresentados em mdias (n=3). As barras verticais representam o intervalo de confiana e as letras, as diferenas significativas de acordo com teste a posteriori de Newman-Keuls.

3 TC (% dia-1)

ac

a b b

bd

0 7 14 21 perodo de cultivo (dias) 28 35

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10. Cultivo em Tanques Desde o incio do cultivo nos tanques, algumas alteraes tiveram que ser realizadas de forma a aprimorar o sistema de cultivo. Foi instalado um filtro de partculas slidas de forma a melhorar a qualidade da gua. As algas apresentaram uma colorao plida com as pontas despigmentadas aps um perodo de 30 dias de cultivo sem renovao de gua. Possivelmente, esse aspecto possa estar relacionado baixa disponibilidade de nutrientes e a alta incidncia de luz. Segundo Werlinger & Alveal (1995) se a incidncia de luz ultrapassa os limites mximos, ocorre a despigmentao e debilitao dos talos das algas, e reduo nas TCs. A irradincia excessiva causa foto-oxidao dos pigmentos e posterior destruio dos cloroplastos e protenas internas da planta. Como uma tentativa melhorar o desempenho da espcie nesse sistema, foi colocada tela sombrite (25% de passagem de luz) em cima dos tanques para diminuir a incidncia de radiao solar e soluo VS 50 foi adicionada diretamente nos tanques. Entretanto, como a gua do mar utilizada no esterilizada, houve uma proliferao excessiva de outros microorganismos, como colnias de cianobactrias, ocasionando alta turbidez da gua e prejudicando a incidncia de luz. Sendo assim, pulsos de nutrientes em recipientes plsticos de 50 L foram realizados com gua do mar enriquecida com soluo VS 50 por 7 dias em aerao constante. Aps esse perodo, as linhagens foram transferidas novamente para os tanques. Atualmente, o regime de pulsos de nutrientes associado a menor incidncia de luz tem apresentado resultados satisfatrios. As plantas esto se mantendo saudveis por perodos superiores a 30 dias sem renovao de gua. Materiais precipitados no fundo dos tanques so sifonados quando observados em excesso.

11. Cultivo Experimental no Mar Embora existam procedimentos padres para o cultivo de K. alvarezii, deve-se considerar que a maioria dos protocolos de cultivo, como espaamento dos propgulos no cabo de cultivo, perodo de

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crescimento, tamanho do propgulo, profundidade e distncia entre cabos de cultivo so especficos de cada regio e poca do ano. Assim, diversos experimentos devem ser realizados para se determinar as metodologias mais adequadas que garantam uma alta produtividade ao longo do ano (Ask & Azanza 2002). A regio da Praia do Sambaqui possui caractersticas bem diferentes da Baa de Itagu, em Ubatuba, So Paulo. Essas caractersticas incluem maior fora de gua e maior influncia s variaes de correntes. Esses fatores contriburam para a dificuldade em estabelecer o cultivo na regio, uma vez que amarraes das plantas iguais s utilizadas em Ubatuba no foram eficientes em Florianpolis. Foram testados diversos tipos de amarraes, com diferentes materiais, porm todos provocaram a ruptura das plantas devido fora da gua (Figura 11).

Figura 11 Principais amarraes testadas no cultivo experimental de Kappaphycus alvarezii realizado na Praia do Sambaqui. Atualmente, a amarrao que parece estar funcionando para manter as algas nos cabos de cultivo de monofilamento realizada atravs de cabos multifilamento. Esse cabo, por ser mais macio, evita a ruptura da alga, mesmo quando a fora da gua intensa, o que no foi observado quando se utilizava fitilhos de plstico (tradicional tie-tie). Por outro lado, amarraes com ganchos feitos com cabo monofilamento, como os utilizados em Ubatuba, mantinham as plantas muito expostas superfcie, causando ice-ice. Esse tipo de amarrao bem eficiente para plantas do tamanho de propgulos comerciais, entre 150 a 200g. No presente estudo, as plantas foram transferidas para o mar em tamanhos que variavam de 10 a 20 g.

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Incrustaes tambm foram freqentes, e na rede colocada abaixo do mdulo de cultivo, foi observada uma grande quantidade de Hypnea musciformis. At o momento, no foi notada a ao de herbvoros e a disperso da espcie nos costes e praias adjacentes no foi observada. Devido a todos os problemas expostos, no foi possvel iniciar os experimentos de crescimento no mar, que est previsto para iniciar aps o perodo de inverno, mais crtico para os cultivos.

12. Consideraes Finais O cultivo estabelecido na Praia do Sambaqui ainda apresenta problemas de adequao do mdulo de cultivo s condies da regio. Por esse motivo, experimentos de crescimento e produtividade das diferentes linhagens ainda no foram realizados. Alm disso, com a proximidade do inverno, poca crtica para o crescimento das algas em Santa Catarina devido s baixas temperaturas, considera-se prudente observar o desempenho da espcie nessas condies para ento iniciar tais experimentos, previstos para agosto do presente ano. Em relao ao cultivo em tanques, a proposta inicial de estabelecer condies de cultivo que mantivesse as plantas saudveis foi cumprida. O propsito de se manter as plantas e no cresc-las se deve principalmente a inviabilidade financeira de manter grande biomassa estocada por perodos de condies desfavorveis no mar. Entretanto, alguns ajustes ainda devem ser realizados, principalmente em relao utilizao de fertilizantes comerciais de baixo custo e freqncia de pulso de nutrientes. Os resultados parciais dos experimentos de cultivo em tanques e de incubao com gua proveniente na Praia do Sambaqui sero apresentados no VIII Congresso de Ficologia da Amrica Latina e do Caribe, que ser realizado nos dias 21 a 29 de agosto, em Lima, Peru.

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