SEDE BOGOT

VI CTEDRA INTERNACIONAL FACULTAD DE INGENIERA ETANOL LIGNOCELULSICO

GUIA PRCTICA GRUPO 1. PRODUCCION DE EXTRACTOS ENZIMATICOS CELULOLITICOS POR Trichoderma reesei A PARTIR DE SUSTRATOS LIGNOCELULOSICOS

En estas guas se presenta el esquema general de las prcticas programadas en el contexto de la ctedra de etanol lignocelulsico. Las prcticas sern desarrolladas en el laboratorio 218 de la planta piloto de ingeniera qumica (Edificio 412 del campus universitario). Uno de los sustratos a utilizar es pasto (p.e. Panicum mximum) proveniente de los llanos orientales de Colombia y el componente experimental incluye cuatro temticas fundamentales para los procesos investigativos de la obtencin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica como son: pretratamiento hidrotrmico, hidrlisis enzimtica, fermentacin y produccin de celulasas. En cada prctica se realizar la determinacin de productos por espectrofotometra y/o por cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC). Para cada prctica se describe el objetivo, los materiales, el procedimiento general y los referentes a seguir y aplicar en el laboratorio. Adicionalmente, en cada prctica encontrar un conjunto de preguntas cuyas respuestas permiten afianzar los conceptos fundamentales de la sesin y que permitirn en futuras experimentaciones analizar y discutir los resultados. En las sesiones propuestas, cada grupo realizar el montaje correspondiente y reconocer las variables y algunas de las tcnicas de cuantificacin que permiten hacer seguimiento a la experimentacin. Cada grupo debe contextualizar el tema y realizar una presentacin el da jueves 19 de julio/12 en la cual se har una socializacin de los resultados.

Listado de prcticas: Prctica Grupo 1. Produccin de celulasas con Trichoderma reesei. Prctica Grupo 2. Pretratamiento hidrotrmico de biomasa bajo dos condiciones Prctica Grupo 3. Hidrlisis enzimtica de diversos sustratos lignocelulsicos Prctica Grupo 4. Hidrlisis y fermentacin simultnea (SSF) de pasto pretratado hidrotrmicamente

INTRODUCCION Existe un creciente marco de inters por el desarrollo de procesos que permitan la utilizacin de materiales lignocelulsicos, para la obtencin de sustratos ricos en azcares como hexosas y pentosas que sirvan como materia prima para la produccin de otra serie de compuestos de inters industrial y de consumo masivo. Por tanto la biomasa (materiales lignocelulsicos) se presenta como una fuente de energa renovable y abundante dentro de la naturaleza, para lo cual es oportuna la investigacin de tecnologas que permitan el aprovechamiento de estos materiales.

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Uno de los procesos que mayores limitantes puede generar al pensar en la comercializacin de biocompuestos, es la hidrlisis enzimtica, bien sea por el costo de los complejos enzimticos de tipo comercial, o por bajos rendimientos, y la produccin de inhibidores. Por tal razn la investigacin de complejos enzimticos, su produccin y utilizacin in situ., son de suma importancia pues pueden brindar varias alternativas estratgicas para hacer rentable y consolidar el concepto de biorrefinera. OBJETIVO Evaluar la actividad celulolitica de un extracto enzimtico producido por Trichoderma reesei, a partir de Panicum maximum

TALLER Qu variables pueden afectar la produccin de extractos enzimticos a partir de sustratos lignocelulsicos? Cules son los retos tecnolgicos para aumentar el rendimiento de la hidrlisis enzimtica de un sustrato lignocelulsico con y sin pretratamiento? Cules son las ventajas de la produccin y utilizacin in situ de enzimas, en un proceso de conversin de biomasa?

MATERIALES Y METODOS Microorganismo Para esta prctica se utilizar el hongo filamentoso Trichoderma reesei Simmons NRRL 3652 ATCC 56763 ampliamente conocido por la produccin de enzimas celulolticos. La cepa se propagara en medio Papa Dextrosa Agar (15g/l glucosa),pH 5.6 por 7 das a 28C . Recuperacin de inoculo Teniendo cajas de Petri colonizadas en medio PDA (segundo repique), se realizara la obtencin del inoculo para la fermentacion sumergida. Se agreg 8 mL de una solucin de Tween 80 al 0.1% estril sobre el micelio esporulado para facilitar su recoleccin. Adicionalmente, se agregaron 3 perlas de cristal estriles en cada caja y se realizaron movimientos orbitales por un minuto. La suspensin de esporas fue recogida aspticamente y su concentracin fue determinada por medio de recuento en cmara de Neubauer. (Suesca, 2012)

Produccin enzimtica en fermentacin sumergida Para la realizacin de los ensayos de fermentacin se utilizaran matraces de 250 mL, con 50 mL de volumen de trabajo. Los ensayos se llevaran a cabo en un shaker de agitacin orbital con una velocidad de 150 rpm, ubicado en un cuarto cerrado, a temperado a 301 C y en oscuridad. 2

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Inoculado con una concentracin de 3*108esporas/ml, durante 4 dias, pH 5.6 La composicin del medio de cultivo ser.

Composicin Pastos*(g/100mL) (NH4)2SO4 [g/L] Urea [g/L] CaCl2*2H2O [g/L] MgSO4*7H2O [g/L] Peptona [g/L] Tween 80 [mL/L] Ext. levadura [g/L] FeSO4*7H2O [mg/L] MnSO4*H2O [mg/L] ZnSO4*7H2O [mg/L] KH2PO4[g/L]

Valor 5 0.05 0.02 0.12 0.04 1.31 1.99 0.27 9.63 1.50 2.17 0.24

Determinacin de las actividades celulolticas Con el fin de determinar la actividad celuloltica, se analizaran las muestras para identificar la actividad en trminos de unidades de papel filtro (NREL, 2008). El procedimiento se basa en la metodologa de la IUPAC. Preparacin de la solucin reactiva Reactivos Solucin 0.05 M de cido ctrico monohidratado (C6H8O7*H2O) , pH 4.8. Reactivo DNS Patrones de glucosa (2 10 mg/mL) Tiras de papel filtro (50mg) Buffer citrato-CMC (carboximetilcelulosa) Procedimiento Llevar a agitacin por un minuto, la muestra de fermentacin sumergida. Extraer 10 ml de muestra en un tubo falcon , centrifugar por 10 min a 4000 rpm Tomar el sobrenadante como extracto enzimtico. Cuantificacin por Unidades de Papel Filtro (FPU) Preparacin de los blancos y controles Blanco: adicionar 1.5ml de buffer citrato Control: 1ml de buffer citrato + 0.5ml de muestra Muestra: 1ml de buffer citrato + 0.5ml de muestra + tira de papel filtro Preparacin de los blancos 3

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Buffer: adicionar 1 mL de buffer citrato a un tubo Sustrato: adicionar 1 mL de buffer de citrato- CMC a un tubo Muestra: adicionar 0.5 mL de muestra y 0.5 mL de buffer de citrato Procedimiento Tomar la muestra y hacer la dilucin pertinente Agregar 0.5 mL de buffer citrato- tira papel filtro a un tubo y 0.5 mL de muestra Incubar a 50C por 60 min todos los tubos incluyendo los blancos. Detener la reaccin llevando a un bao de agua a 90C por 10 min Realizar el procedimiento de determinacin de azcares reductores por el mtodo DNS .

Cuantificacin por CMC Preparacin de la solucin reactiva Reactivos Solucin 0.1 M de cido ctrico monohidratado (C6H8O7*H2O) Solucin 0.2 M de Fosfato di bsico de potasio (K2HPO4) Procedimiento Mezclar las dos soluciones en proporciones iguales, hasta que se alcance el pH de 5.0 Reservar una proporcin de la solucin llamndola Buffer citrato-fosfato pH 5 Preparar con la solucin restante una solucin de CMC al 1% en el mismo buffer Procedimiento Tomar la muestra y hacer la dilucin pertinente Agregar 0.5 mL de buffer citrato- CMC a un tubo y 0.5 mL de muestra Incubar a 50C por 60 min todos los tubos incluyendo los blancos. Detener la reaccin llevando a un bao de agua a 90C por 10 min Realizar el procedimiento de determinacin de azcares reductores por el mtodo DNS .

Se define como 1 unidad de actividad celulasa (U) como 1 mol de azcares reductores equivalentes a glucosa obtenidos por minuto. REFERENTES NREL (2008). Measurement of Cellulase Activities, Laboratory Analytical Procedure (LAP) NREL/TP -510- 42628. Consultado en: Julio 2012. Disponible en: www.nrel.gov/biomass/pdfs/42628.pdf N Pieros N.Y. (2012). Hidrlisis de residuos lignocelulsicos derivados de la explotacin de la palma de aceite hasta azcares fermentables. Tesis de Doctorado en Ingeniera Qumica, Universidad Nacional de Colombia, Bogot.

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Suesca A. (2012). Produccin de enzimas celulolticas a partir de cultivos de Trichoderma sp, utilizando biomasa lignocelulsica. Tesis de Maestra en Ingeniera Qumica, Universidad Nacional de Colombia, Bogot.