La hibridacion consiste en una mezcla de orbitales puros en un estado excitado para formar orbitales puros en un estado excitado para

formar orbitales hibridos equivalentes con orientaciones determinadas en el espacio Tipos de hibridaciones Hibridacin sp3 Para los compuestos en los cuales el carbono presenta enlaces simples Se le conoce como hibridacin tetradrica Hibridacin sp2 En la hibridacin trigonal se hibridan los orbitales 2s, 2px y 2py, resultando tres orbitales idnticos sp2 y un electron en un orbital puro 2pz El carbono hibridado sp2 da lugar a la serie de los alquenos Un enlace de tipo o por solapamiento de loss orbitales hibridos sp2 Un enlace de tipo pi por solapamietno del orbital 2pz El enlace pi es mas dbil que el enlace o lo cual explica la mayor reactividad de los alquenos , debido al grado de insaturacion que presentan los dobles enlaces El doble enlace impide la libre rotacin de la molecula Hibridacin sp Los atomos que se hibridan poseen un juego un orbital s y uno p, para dar los orbitales hiridos sp, colineales formando un angulo de 180 Los otros dos orbitales p no experimentan ningn tipo de perturbacin en su configuracin

Hibridacin
La hibridacin es un fenmeno importante y muy utilizado en todas las reas de la biologa molecular. Una vez que ya hemos conocido los fundamentos que mantienen unidas las dos hebras del DNA y aquellos que las separan, vamos a estudiar cmo se pueden emplear en el laboratorio. Recordemos que la temperatura (y algunos agentes qumicos) pueden desnaturalizar el DNA de forma reversible siempre que la temperatura (o el agente) disminuya lentamente. Si se hace descender bruscamente, cada hebra de DNA tiende a reasociarse consigo misma y formar un ovillo que se estabiliza por fuerzas intramoleculares. Como consecuencia, se obtiene un DNA sin utilidad para ningn manejo biolgico y cuya absorbencia es menor que el desnaturalizado, pero mayor que como dsDNA.

Principios bsicos
La hibridacin entre se cuencias se basa en la especificidad de la interaccin entre las bases nitrogenadas de distintas cadenas, de manera que se favorezca su asociacin y se disminuya la posibilidad de reasociaciones intracatenarias as como las hibridaciones inespecficas. Para empezar, hay que contar con una secuencia dediana dentro de un fragmento de DNA y con una sonda, que no es ms que un fragmento pequeo de DNA de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana.

Cuando la sonda y la diana se encuentran, el dplex se identifica con radiactividad, fluorescencia o colorante, segn de la manera en que la sonda se hayamarcado. El DNA a hibridar debe digerirse previamente con una o varias enzimas de restriccin para dar lugar a una serie de fragmentos discretos y repetitivos que se pueden resolver en una electroforesis en un gel de agarosa. Este gel de agarosa se replica sobre un filtro de nitrocelulosa o niln mediante la transferencia (en ingls blot) del DNA desde el gel hasta el filtro. Para que el DNA se transfiera es necesario sumergir el gel en una solucin alcalina, de manera que ste de desnaturaliza al romperse los puentes de hidrgeno. La desnaturalizacin del DNA es esencial para que, posteriormente, la sonda pueda encontrar su secuencia complementaria. Si el DNA a transferir es de gran tamao, entonces conviene dar antes un tratamiento con rayos UV o una solucin cida para introducir mellas que permitan que los fragmentos difundan a travs de la agarosa. A continuacin, el gel se neutraliza para permitir que el DNA desnaturalizado se transfiera como cadenas sencillas a la membrana. sta transferencia se produce por capilaridad desde el gel hasta el filtro. Tambin se han desarrollado mtodos rpidos por transferencia al vaco. Una vez inmovilizado el DNA sobre el filtro, se rastrea el fragmento con la sonda especfica. Se forman as una serie de DNA hbridos bicatenarios cuya estabilidad va a depender de la cantidad de bases apareadas: cuanto ms larga es la sonda y ms bases se aparean y ms estable es el hbrido. En general, a mayor grado de hibridacin, mayor conexin evolutiva entre especies, y viceversa.

ontrol de la hibridacin
La especificidad de la hibridacin se puede modificar mediante:

El nmero de copias de la secuencia de diana es clave, puesto que un nmero demasiado bajo hace que la tcnica no tenga suficiente sensibilidad como para que, despus de haberse hibridado la sonda con la diana, podamos detectar tales hbridos. La concentracin de la sonda es tambin clave por la misma razn que la anterior. El tamao de la sonda va a permitir que se hibriden suficientes pares de bases de manera que el hbrido sea suficientemente estable como para que se pueda detectar y no se deshaga durante las manipulaciones. Con unos cientos de pb basta. El rigor (stringency) de la hibridacin. Con este concepto se agrupan varios factores experimentales como la temperatura, el tiempo y la fuerza inica entre otras. Se trata del grado de especificidad del apareamiento conseguido en los hbridos. De l va a depender que slo se apareen las secuencias exactamente complementarias, o simplemente muy parecidas, segn sean los objetivos del experimento. Hay que procurar que no sea tan alto que impida el apareamiento de la sonda homloga, ni tan bajo que permita una hibridacin inespecfica con secuencias poco relacionadas. En este ltimo caso, se dira que hay mucho ruido de fondo en el ensayo. Para conseguir unas condiciones muy rigurosas, hay que subir la temperatura, disminuir la fuerza inica, aadir formamida o urea. Lo opuesto es tambin verdad. Tambin influye la composicin de bases de la sonda, ya que a mayor %GC, ms fuerte resulta la hibridacin.

Tipos de hibridaciones
Las caractersticas principales de la hibridacin que hemos venido comentando corresponden a la transferencia Southern desarrollada en 1975 por Edward. M. Southern y cuya principal ventaja es que el DNA diana se encuentra fijado sobre un soporte slido. Inicialmente se utiliz nitrocelulosa a la que se una covalentemente el DNA al vaco. Hoy se usan membranas de niln, que son menos delicadas y basta con exponerlas al UV unos minutos para que el DNA se fije a ella. Requiere una separacin electrofortica, desnaturalizacin, transferencia, hibridacin y deteccin del DNA de la diana.