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FACULTAD DE INGENIERA PROGRAMA DE INGENIERA AMBIENTAL Asignatura: Microbiologa Ambiental FISIOLOGIA Y METABOLISMO MICROBIANO Los microorganismos son los

organismos ms pequeos que tienen la maquinaria requerida para el crecimiento y la replicacin. Se encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios procesos biolgicos. Estn compuestos por protenas, polisacridos, lpidos, cidos nucleicos, entre otros. Estas molculas a su vez forman parte de estructuras celulares ms complejas, como por ejemplo la pared celular y la membrana citoplasmtica. Una caracterstica de los seres vivos es la capacidad para sintetizar sus propios constituyentes a partir de nutrientes que toman del medio externo. El crecimiento microbiano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la clula. Se trata de un proceso complejo, que supone la replicacin de todas las estructuras y componentes celulares a partir de los nutrientes exgenos. El conocimiento de la fisiologa y del metabolismo microbiano tiene algunas aplicaciones prcticas:

Permite conocer el modo de vida y el hbitat de diferentes especies bacterianas. El ser humano actuando como hospedero por ejemplo, ofrece una variedad de nichos ecolgicos que se diferencian entre s por aspectos fsicos y qumicos (temperatura, concentracin de O2, pH, presin osmtica, etc.) en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas especies bacterianas, de acuerdo a sus requerimientos nutricionales. el aislamiento e

Permite formular medios de cultivo para identificacin de los patgenos participantes.

Desde el punto de vista teraputico nos permite conocer y entender el modo de accin de algunos antimicrobianos que bloquean una va metablica o la sntesis de alguna macromolcula esencial para la bacteria. El crecimiento microbiano requiere la formacin de estructuras complejas como protenas, cidos nucledos, polisacridos y lpidos a partir de elementos preformados en el medio de crecimiento o ser sintetizados por la propia clula, a su vez, este crecimiento necesita de una fuente de

energa para ser llevado a efecto, todo este proceso se designa con el nombre de metabolismo, que se define como todas las transformaciones qumicas que ocurren en la clula, y tiene 3 funciones especficas a saber: Obtener energa qumica del entorno, almacenarla, para utilizar luego en diferentes funciones celulares, Convertir los nutrientes exgenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la clula bacteriana, Formar y degradar molculas necesarias para funciones celulares especficas, como por ejemplo, movilidad y captacin de nutrientes. Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran nmero de reacciones qumicas destinadas a transformar las molculas nutritivas en elementos que posteriormente sern utilizados para la sntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las protenas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energa que est contenida en una reaccin qumica en algn proceso que requiera de energa, como puede ser el trabajo o el movimiento. La transformacin de los nutrientes en compuestos tiles para la subsistencia de un organismo se lleva a cabo por medio de las reacciones qumicas que realizan unas protenas conocidas como enzimas. El metabolismo tiene lugar a travs de secuencias de reacciones catalizadas enzimticamente, y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la clula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo, y como resulta en la produccin de nuevo material celular, tambin se denomina biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energa o para convertirlos en unidades precursoras de la biosntesis, se conoce como catabolismo.

Vimos de este modo los 2 tipos de transformaciones qumicas que ocurren simultneamente en la bacteria, y as el metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones. De esta manera la energa liberada como resultado de las reacciones de xido-reduccin del catabolismo debe ser almacenada y transportada de algn modo. Una forma es como compuestos con uniones fosfato de alta energa, y son estos los que luego sirven como intermediarios en la conversin de la energa conservada en trabajo til. El compuesto fosfato de alta energa ms importante en los seres vivos es el adenosintrifosfato (ATP). Este se genera en la clula bacteriana por 2 procesos diferentes, llamados: fosforilacin a nivel del substrato y fosforilacin oxidativa. La energa liberada en las reacciones catablicas se usa para fosforilar ADP, generando ATP. La energa almacenada en el ATP se utiliza en la mayora de los trabajos celulares. Por lo tanto, el ATP acopla los procesos productores de energa de la clula a los consumidores de energa. Todos los procesos que ocurren en la clula o bacteria requieren de energa. Esta energa est almacenada como molculas de ATP, que se forma a partir de ADP y fosfato inorgnico.

El anabolismo y el catabolismo Tipos de metabolismo microbiano El crecimiento equilibrado de un microorganismo requiere de la integracin de un gran nmero de rutas metablicas (alrededor de 2000 procesos bioqumicos diferentes), interconectados, que participan en un correcto flujo de energa y carbn hacia la formacin de ms materia celular, los cuales deben operar coordinadamente y permitirle, al menor costo energtico una adaptacin a condiciones ambientales cambiantes (tanto qumicas como fsicas). En general la regulacin y fisiologa funcionan a travs de controles ejercidos sobre las enzimas claves de vas metablicas y sobre los genes que codifican para enzimas o protenas importantes en el comportamiento microbiano. Los distintos tipos de metabolismo microbiano se pueden clasificar segn tres criterios distintos: I. Segn la fuente de carbono que utilizan El carbono es el mayor constituyente de la clula bacteriana, por lo tanto no llama la atencin que requieran ms carbono que cualquier otro nutriente. Las bacterias se pueden dividir de acuerdo a la forma en la que el organismo obtiene o utiliza el carbono para la construccin de la masa celular:

Auttrofo. crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgnicas sencillas. El carbono se obtiene del dixido de carbono (CO2). Hetertrofo. Su fuente de carbono es orgnica. El carbono se obtiene de compuestos orgnicos. En este ltimo grupo se encuentran todas las bacterias de inters mdico. Mixtrofo. Son aquellas bacterias con metabolismo energtico litotrofo (obtienen energa de compuestos inorgnicos), pero requieren sustancias orgnicas como nutrientes para su metabolismo biosinttico. El carbono se obtiene tanto de compuestos orgnicos como fijando el dixido de carbono.

II. Segn el punto de vista biosinttico La forma en la que el organismo obtiene los equivalentes reductores para la conservacin de energa o en las reacciones biosintticas:

Litotrofo. Son aquellas que solo requieren sustancias inorgnicas sencillas. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos inorgnicos. (SH2 SO, NH3, NO2-, Fe, etc.). Organotrofo. Requieren compuestos orgnicos. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos orgnicos. (Hidratos de carbono, hidrocarburos, lpidos, protenas, alcoholes).

III. Segn la fuente de energa

Segn la forma en la que el organismo obtiene la energa para vivir y crecer:

Quimiotrofo. La energa se obtiene de compuestos qumicos externos. Fototrofo. La energa se obtiene de la luz.

Los ejemplos tpicos son como sigue: Los quimiolitoauttrofos obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos y el carbono de la fijacin del dixido de carbono. Ejemplos: bacterias nitrificantes, bacterias oxidantes del azufre, bacterias oxidantes del hierro, bacterias oxidantes del hidrgeno.

Los fotolitoauttrofos obtienen energa de la luz y el carbono de la fijacin del dixido de carbono, usando compuestos inorgnicos

como equivalentes reductores. Ejemplos: Cianobacterias (agua como equivalente reductor), Chlorobiaceae, Chromaticaceae (sulfuro de hidrogeno), Chloroflexus (hidrgeno).

Los quimiolitohetertrofos obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos, pero no pueden fijar el dixido de carbono. Ejemplos: algunos Nitrobacter spp., Wolinella (con hidrgeno como equivalente reductor), algunas bacterias oxidantes del hidrgeno. Los quimioorganohetertrofos obtienen energa, carbono y equivalentes reductores para las reacciones biosintticas de compuestos orgnicos. Ejemplos: la mayora de las bacterias, como Escherichia coli, Bacillus spp., Actinobacteria. Las bacterias patgenas que viven a expensas de la materia orgnica son quimioorganotrofas. Los fotoorganotrofos obtienen energa de la luz y el carbono y los equivalentes reductores para las reacciones biosintticas de compuestos orgnicos. Algunas especies son terminantemente heterotrofas, pero muchas otras pueden tambin fijar el dixido de carbono y son mixotrofas. Ejemplos: Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Rhodocyclus, Heliobacterium, Chloroflexus (alterna con fotolitoautotrofia con hidrgeno).

Metabolismo productor de energa En los seres vivos, la utilizacin de la energa potencial contenida en los nutrientes se produce por reacciones de oxidacin reduccin. Qumicamente la oxidacin est definida por la prdida de electrones y, la reduccin por la ganancia de los mismos. En bioqumica, estas reacciones frecuentemente incluyen tambin la transferencia de tomos enteros de hidrgeno, por lo tanto se conocen con el nombre de reacciones de deshidrogenacin. En las reacciones de este tipo hay sustancias que ceden electrones (dadoras) y otras que los aceptan (aceptoras). En las bacterias de inters mdico los sistemas de oxidacin reduccin transforman la energa qumica de los nutrientes en una forma biolgicamente til; dichos procesos incluyen la fermentacin y la respiracin. En la primera, tanto la molcula dadora como la aceptora de electrones, son compuestos orgnicos. En cambio, en la respiracin hay un aceptor final exgeno, que cuando es el oxgeno se denomina respiracin aerobia y cuando es un compuesto inorgnico, respiracin anaerobia.

Fermentacin En sta los electrones pasan del dador, un intermediario formado durante la degradacin del substrato, hacia un aceptor constituido por algn otro intermediario orgnico tambin generado durante el catabolismo del substrato inicial. Por lo tanto, este proceso de oxidacin reduccin no requiere el aporte exgeno de un aceptor final de electrones. Aunque hay distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidacin parcial de los tomos de carbono del substrato inicial y liberan, por lo tanto una pequea parte de la energa potencial contenida (Ver figura). El rendimiento energtico de este proceso es menor que el de la respiracin.

1. Bacterias acidolcticas (Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus),

Bacillus
2. Levaduras, Zymomonas 3. Bacterias acidopropinicas (Propinibacterium)

4. Enterobacter, Serratia, Bacillus 5. Enterobacterias (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus) 6. Clostridium En las bacterias se encuentran las tres vas centrales del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono: la glucoltica o de Embden Meyerhof Parnas, la de pentosa fosfato o shunt de las pentosas y la de Entner-Doudoroff. La va glucoltica que degrada la glucosa se divide en tres etapas principales. La primera es preparativa, con reacciones que no son de oxidacin reduccin, sin liberacin de energa y con formacin de dos intermediarios de tres tomos de carbono cada uno. En la segunda etapa, s ocurren reacciones de oxidacin reduccin con liberacin de energa, formacin de ATP por fosforilacin a nivel del substrato (el ATP se genera en un paso enzimtico especfico) y produccin de dos molculas de piruvato. En la tercera etapa, nuevamente ocurren reacciones de oxidacin reduccin y se generan los productos finales de la fermentacin, que varan segn la bacteria en cuestin. Solo una pequea parte de la energa libre que potencialmente puede derivar de la degradacin de una molcula de glucosa queda disponible por esta va, dado que los productos finales son compuestos en los que el carbono se encuentra todava en estado reducido. Por cada molcula de glucosa que entra a esta va, se forman cuatro molculas de ATP y como se consumen dos en la primera etapa, el balance neto es de dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa fermentada. El destino final del metabolito clave, el piruvato, depende de los procesos empleados para la regeneracin del dinucletido de nicotinamida adenina (NAD) a partir del dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH) y as mantener el equilibrio de oxidacin reduccin. Aunque la va glucoltica es la ms importante en las clulas eucariotas y procariotas, no es la nica. La va de las pentosas es una ruta multifuncional para la degradacin de hexosas, pentosas y otros hidratos de carbono. Para los fermentadores heterolcticos es la principal fuente productora de energa, aunque la mayora de las bacterias usan esta va como fuente de dinucletido de nicotinamida adenina fosfato reducido (NADPH) y de pentosas para la sntesis de nucletidos. La va de Entner-Doudoroff es la ruta principal para la degradacin de la glucosa en las bacterias aerobias estrictas como Neisseria y Pseudomonas. Como sucede en la va de las pentosas, aqu solo se produce una molcula de ATP por molcula de glucosa degradada.

El cido pirvico derivado de la glucosa, es un compuesto clave en el metabolismo fermentador de los hidratos de carbono. En su formacin, el NAD es reducido a NADH y ste debe oxidarse nuevamente a NAD para alcanzar el equilibrio final de oxidacin reduccin. Las bacterias se diferencian de las clulas eucariotas por la forma en que eliminan el piruvato; en las bacterias la oxidacin incompleta es la regla y se acumula gran cantidad de metabolitos finales de la fermentacin. El estudio y el conocimiento de las fermentaciones bacterianas tienen importancia prctica, porque proporciona productos industriales que son tiles en el laboratorio para identificar las diferentes especies. Entonces, segn los productos finales, tenemos diferentes tipos de fermentacin: alcohlica, homolctica, heterolctica, del cido propinico, cido mixta, de butanodiol y del cido butrico.

Fermentacin alcohlica Es el tipo de fermentacin ms antigua que se conoce. Produce etanol a partir de glucosa. Aunque ciertas bacterias producen alcohol, ste es elaborado por otras vas. Fermentacin homolctica Todos los miembros del gnero Streptococcus, Pediococcus y muchas especies de Lactobacillus fermentan la glucosa fundamentalmente a cido lctico con poca acumulacin de otros productos finales. En esta reaccin el piruvato se reduce a cido lctico por accin de la enzima lctica deshidrogenasa, actuando el NADH como dador de electrones. Esto ocurre en la tercer etapa de la va glucoltica. Fermentacin heterolctica En este tipo de fermentacin solo la mitad de la glucosa se convierte en cido lctico, el resto se transforma en una mezcla de anhdrido carbnico (CO2), cido frmico, cido actico, etc. En esta fermentacin se emplea fundamentalmente la va de las pentosas y se produce en las bacterias del gnero Leuconostoc y Lactobacillus. Fermentacin del cido propinico Es caracterstica de algunas bacterias anaerobias como el Propionibacterium (bacilo grampositivo, no esporulado). Este tipo de fermentacin tiene la ventaja de que genera una molcula ms de ATP. Fermentacin cido mixta Es caracterstica de la mayora de las enterobacterias. Bacterias como Shigella, Salmonella y E.coli fermentan las hexosas a travs del piruvato a cido lctico, cido actico, cido succnico y cido frmico. Fermentacin de butanodiol Varias bacterias como Enterobacter, Serratia y Bacillus producen 2,3butanodiol durante la fermentacin de la glucosa. Este deriva de la condensacin de dos molculas de piruvato en una molcula neutra de acetona que luego es reducida a 2,3-butanodiol. Fermentacin del cido butrico Se ve en bacterias del gnero Clostridium (bacilo grampositivo, anaerobio y esporulado).

Si bien hasta ahora nos hemos referido solo a la fermentacin de hidratos de carbono como procedimiento para obtener energa, debemos destacar que otros compuestos orgnicos pueden ser fermentados, por ejemplo: aminocidos (alanina, glicina). En Clostridium proteolticos, la fermentacin de aminocidos ms caracterstica es la reaccin de Stickland. Anteriormente hemos discutido el metabolismo de los hidratos de carbono en ausencia de un aceptor externo de electrones y hemos visto que solo una pequea parte de la energa potencial contenida en el substrato es liberada. Esto se debe a que la diferencia entre los potenciales de oxidacin reduccin entre la molcula dadora inicial y la aceptora final es muy pequea. Otras bacterias tienen la capacidad de oxidar completamente el substrato inicial a CO2 por el proceso conocido como respiracin. Respiracin Es el proceso por el cual un substrato es oxidado completamente a CO2 y agua, con participacin de una cadena de electrones ubicada en la membrana plasmtica, en la cual el aceptor final es el oxgeno molecular u otro compuesto inorgnico (nitratos, sulfatos, anhdrido carbnico, etc.) anaerobia. Los primeros pasos en la respiracin de la glucosa son idnticos a los de la gluclisis, pero mientras en esta ltima el piruvato es convertido en productos finales de la fermentacin (cido lctico, cido propinico, etc.), en la respiracin es oxidado completamente a CO2 mediante el ciclo de Krebs. Por cada molcula de piruvato oxidada en este ciclo, se generan tres molculas de CO2. Al igual que en la fermentacin, los electrones generados en el ciclo de Krebs, pasan a coenzimas que tienen NAD. Sin embargo, en la respiracin aerobia, los electrones del NADH son transferidos al oxgeno para regenerar NAD a travs de un sistema transportador, en lugar de cederlos al piruvato. Regulacin del metabolismo Cada reaccin metablica est regulada no solo con respecto a otras reacciones, sino tambin con respecto a la concentracin de nutrientes en el medio. La regulacin se realiza a diferentes niveles: en la actividad enzimtica y en la sntesis de las enzimas. En la primera, regulacin de la actividad enzimtica, se produce: activacin de enzimas alostricas, inhibicin por retroalimentacin, activacin alostrica y cooperatividad. La induccin enzimtica y la represin por productos finales, son mecanismos de regulacin de la sntesis de enzimas.

En las bacterias anaerobias facultativas la fermentacin (como nica va de produccin de energa) es bloqueada en presencia de oxgeno, asegurando que el suministro de energa se produzca por respiracin, que consume menos glucosa y acumula menos lactato. En este fenmeno denominado efecto Pasteur, la enzima fosfofructoquinasa es activada o inhibida segn la relacin entre el ATP y el ADP, regulando as el consumo de glucosa. Este es un ejemplo de regulacin de la actividad enzimtica por una enzima alostrica. El ejemplo clsico de regulacin de la sntesis de enzimas lo constituye el opern lactosa. Hay tres enzimas que participan en la utilizacin de la lactosa (-galactosidasa, galactsido permeasa y galactsido transacetilasa), las cuales tienen un promotor nico. En ausencia de lactosa, la transcripcin para estas enzimas est bloqueada por un represor que se une al promotor inhibiendo la accin de la ARN polimerasa. Cuando se agrega lactosa al medio, sta se une al represor, bloqueando de este modo su unin al promotor y permitiendo la accin de la ARN polimerasa y la sntesis de las tres enzimas anteriormente mencionadas. Ciclo de Krebs Cul es la secuencia de acontecimientos? El ciclo puede subdividirse en tres estadios: Estadio I. 1. Condensacin: 2 Carbonos + 4 carbonos = 6 Carbonos Estadio II. 2. Isomerizacin: dos pasos: deshidratacin y luego rehidratacin. 3. Descarboxilacin oxidativa 6 carbonos a 5 carbonos. 4. Descarboxilacin oxidativa 5 carbonos a 4 carbonos. 5. Fosforilacin a nivel de sustrato. Estadio III. 6. Oxidacin. 7. Hidratacin. 8. Oxidacin. Nota: Las reacciones 1,3 y 4 son irreversibles Las reacciones bioqumicas son las siguientes: Modelo de procesamiento: Formacin de enlaces carbono-carbono (Condensacin).

Modelo de procesamiento: Isomerizacin (deshidratacin, hidratacin).

Modelo de oxidativa).

procesamiento:

Oxidacin

biolgica

(descarboxilacin

Modelo de oxidativa).

procesamiento:

Oxidacin

biolgica

(descarboxilacin

Modelo de procesamiento: Oxidacin biolgica (deshidrogenacin).

Modelo de procesamiento: Oxidacin biolgica (hidratacin).

Modelo de procesamiento: Oxidacin biolgica (deshidrogenacin)

Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la clula. Las condiciones fsicas y qumicas del medio donde el microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La comprensin de cmo influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y hace posible disear estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo. Las bacterias como grupo, son extremadamente verstiles y tienen gran capacidad para utilizar una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos inorgnicos simples, a compuestos orgnicos ms complejos. Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los cuales la clula no puede crecer y no esenciales, se usan cuando estn presentes pero no son indispensables. Algunos nutrientes son usados solo como precursores de macromolculas celulares, otros solo como fuente de energa sin ser incorporados directamente al material celular y otros cumplen las dos funciones al mismo tiempo. Tambin se pueden clasificar como macro y micronutrientes segn la cantidad requerida. Macronutrientes El carbono es el mayor constituyente de la clula bacteriana, por lo tanto no llama la atencin que requiera ms carbono que cualquier otro nutriente. Segn la forma en que lo usa, existen fundamentalmente dos tipos de bacterias: auttrofas y hetertrofas. Las primeras son capaces de sintetizar todos sus componentes orgnicos a partir de compuestos

inorgnicos como el CO2. Como ejemplo de este grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de inters mdico. En cambio, las hetertrofas usan sustancias orgnicas como fuente de carbono. En este grupo se encuentran todas las bacterias de inters mdico. La glucosa, por ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energa. Tambin existen bacterias que pueden usar otras sustancias orgnicas como fuente parcial o exclusiva de carbono. Entre las bacterias ms verstiles se encuentran las del gnero Pseudomonas, muchas de las cuales pueden usar ms de cien compuestos orgnicos. Despus del carbono, el elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno que representa entre el 12 y el 15% del peso seco. Es el constituyente principal de las protenas y los cidos nucleicos. La mayora de las bacterias son capaces de usar el amonio como fuente de nitrgeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reduccin de nitratos, se puede lograr por dos mecanismos diferentes: reduccin asimiladora, en la cual se reduce por la va del nitrito y reduccin desasimiladora, donde el nitrato sirve como aceptor final de electrones. La primera est bastante extendida entre las bacterias, mientras que la segunda solo es comn en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas. El fsforo es usado para la sntesis de cidos nucleicos y de fosfolpidos. La mayora de las bacterias lo usan en forma inorgnica como fosfato (PO4=). Los fosfatos orgnicos si bien estn distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados deben ser atacados primero por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos liberando el fsforo inorgnico. Micronutrientes Aunque requeridos en cantidades muy pequeas, los micronutrientes son importantes para la nutricin de la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el cobre y el manganeso. Factores de crecimiento Son sustancias que deben ser aportadas y preformadas, porque la bacteria que los requiere no puede sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o ausencia de una va metablica determinada. Estas sustancias incluyen vitaminas del complejo B, aminocidos, purinas y pirimidinas.

Las bacterias que no necesitan factores de crecimiento, se denominan prototrficas y, las que s los requieren, auxotrficas para ese factor. Requerimientos atmosfricos y ambientales Oxgeno Las exigencias de oxgeno de una bacteria en particular, reflejan el tipo de metabolismo productor de energa. Segn su relacin con el oxgeno, existen bacterias: anaerobias obligadas, anaerobias facultativas, aerobias obligadas y microaerfilas. De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las aerotolerantes. Las bacterias anaerobias obligadas estrictas, crecen en ausencia de oxgeno, el cual es muy txico e incluso letal cuando la exposicin es breve. Las segundas (aerotolerantes) tambin crecen solo en ausencia de oxgeno, pero toleran su presencia un poco ms que las anteriores; por ejemplo: Clostridium sp. Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxgeno. Ejemplo de stas son las bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Las aerobias obligadas, requieren oxgeno para su desarrollo. Dentro de este grupo se encuentran la Pseudomonas. Por ltimo, las microaerfilas crecen mejor con presiones de oxgeno bajas (3 a 5%); las concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento. En las bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima superoxidodismutasa impide la acumulacin del radical superxido; esta enzima est ausente en los anaerobios estrictos. El perxido de hidrgeno formado por la accin de la superoxidodismutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa o peroxidasa. En el laboratorio de microbiologa los requerimientos atmosfricos de oxgeno, pueden determinarse cultivando la cepa en caldo tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes, siendo un caldo de enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias de inters mdico. El cido tiogliclico acta como agente reductor que disminuye el potencial redox del medio, generando un gradiente de concentracin de oxgeno a lo largo del tubo. En la superficie del medio, la concentracin es similar a la atmosfrica y va disminuyendo gradualmente hasta que en el fondo del tubo no existe oxgeno disuelto. Las bacterias aerobias estrictas podrn crecer en la superficie del caldo, las microaerfilas crecern en la franja inmediata que est debajo de la superficie. Las anaerobias

facultativas crecern en todo el tubo, mientras que las anaerobias lo harn en el fondo del mismo. Anhdrido carbnico Algunas bacterias como Neisseria y Brucella, tienen muchas enzimas con baja afinidad por el CO2 y requieren una concentracin ms elevada (10%) de la que habitualmente est presente en la atmsfera (0.03%). Estos requerimientos atmosfricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de estas bacterias. Potencial de oxidacin reduccin Es un requerimiento fsico del medio de cultivo. ste es un factor crtico para determinar si se desarrollar o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la mayora de los medios de cultivo en contacto con el aire, el potencial de oxidacin reduccin es de +0,2 a +0,4V, a pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son incapaces de crecer a menos que el potencial sea tan bajo como -0,2V. Para establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede eliminar el oxgeno, recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo el tioglicolato de sodio. Temperatura Es uno de los factores ambientales ms importantes que influyen en la proliferacin y mantenimiento de la vitalidad de los microorganismos. Cada bacteria tiene su propia temperatura mnima por debajo de la cual no puede proliferar, temperatura ptima en la cual el crecimiento es ms rpido y temperatura mxima por encima de la cual no puede multiplicarse. As, es posible distinguir tres grupos de microorganismos segn el rango de temperatura en el que es posible su multiplicacin: psicrfilas, crecen entre -5 y 30C, temperatura ptimo de 15C; mesfilas, crece entre 10 y 45C, con el ptimo a los 30C y termfilas, que crecen entre 25 y 80C, con el ptimo en 55C. En el laboratorio se puede determinar la temperatura ptima de crecimiento, sembrando el microorganismo en estudio en un medio de cultivo adecuado e incubndolo a diferentes temperaturas, para despus evaluar los rendimientos obtenidos en las distintas condiciones.

Si bien la mayora de los microorganismos de inters mdico son mesfilos, pueden existir diferencias entre las temperaturas de crecimiento ptimas de los mismos, siendo para la mayora de 35 a 37C. Concentraciones de hidrgeno Cada microorganismo tiene un rango de pH en el cual puede crecer y un pH ptimo bien definido. Segn el pH que obtenga mayor rendimiento, encontramos microorganismos acidfilos, neutrfilos (la mayora de inters mdico) y alcalfilos, que crecen bien en pH cidos, neutros y alcalinos respectivamente. Para la mayora de las bacterias de inters mdico, el pH ptimo es de 7,2 a 7,6. Sin embargo, hay microorganismos humanos como M. tuberculosis que resisten valores muy bajos de pH. Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus funciones metablicas, suelen modificar el pH del medio, ste puede prepararse con amortiguadores de pH (buffer), los cuales mantienen el pH relativamente constante. Condiciones osmticas y disponibilidad de agua El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de sta es un factor importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales. Esta disponibilidad no depende solamente del contenido de agua que haya en el ambiente, porque algunas sustancias y superficies pueden absorber molculas de agua y por consiguiente reducir la disponibilidad en el ambiente. Las sales y los azcares disueltos en agua, condicionan la disponibilidad de la misma porque las molculas de agua se asocian y no quedan disponibles para ser usadas por los microorganismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente como actividad acuosa o potencial de agua. Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor cantidad de solutos que en el interior celular, por lo tanto el agua tiende a entrar a la clula por osmosis. Por el contrario, si se encuentran en medios de baja actividad acuosa, el agua tender a salir de la clula, por lo tanto perder agua. As, encontramos microorganismos que pueden crecer en altas concentraciones salinas (halfilos) como las que estn en el agua de mar, en altas concentraciones de azcar (osmfilos) como las que hay en una jalea o en ambientes muy secos (xerfilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las altas concentraciones de solutos en su interior. La concentracin de solutos con actividad osmtica dentro de la clula bacteriana es superior a la concentracin del exterior celular. Con excepcin de las bacterias del gnero Mycoplasma y de las formas lister (L) que no tienen pared celular,

la mayora de las bacterias tienen tolerancia osmtica que les permite soportar grandes cambios de osmolaridad. Captacin de nutrientes La concentracin de solutos en el interior de una clula bacteriana es mayor que en el medio extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la mayora de los medios de cultivo usados en el laboratorio. La principal barrera para el paso de solutos entre la clula y el medio externo es la membrana celular. Las bacterias estn rodeadas de membranas semipermeables, compuestas por una mezcla compleja de protenas, lpidos y glucoprotenas, que restringen el ingreso de la mayora de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten el transporte de sustancias pequeas a travs de dichas membranas. Las molculas de mayor tamao primero deben ser degradadas a molculas ms pequeas por enzimas (exoenzimas) producidas por la propia bacteria y secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnegativas estas exoenzimas se encuentran fundamentalmente en el espacio periplsmico (espacio virtual ubicado entre la membrana externa y la membrana plasmtica), mientras que en las bacterias grampositivas estn ancladas en la membrana plasmtica. Dichas enzimas son activas sobre: protenas, polisacridos, lpidos y cidos nucleicos, entre otros. Bacterias como S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens, elaboran algunas de estas enzimas que contribuyen a la virulencia, destruyendo los componentes vitales de los tejidos del husped infectado. Pueden ser constitutivas (se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando est presente su substrato). Con excepcin del agua y el amonio que ingresan a la clula por difusin pasiva en respuesta a un gradiente de concentracin a ambos lados de la membrana, el resto de los metabolitos lo hacen por sistemas de transporte ms especficos. Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren consumo de energa. Los primeros son sistemas inespecficos que permiten el ingreso de molculas pequeas (peso molecular menor o igual a seis mil dalton). Las porinas son protenas ubicadas en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de las molculas pequeas e hidroflicas. En la difusin facilitada, una protena asociada a la membrana celular facilita el equilibrio a ambos lados de la misma, actuando en conjunto con una quinasa citoplasmtica dependiente de ATP. Estas protenas de membrana se denominan permeasas y muchas son inducidas por el substrato a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa citoplasmtica, queda atrapada dentro de la clula. La difusin

facilitada se parece a la difusin simple, porque el substrato se mueve por un gradiente de concentracin (de mayor a menor), por lo tanto el propio proceso de transporte no requiere energa. La diferencia que tiene con la difusin pasiva, es que est mediada por una protena transportadora, es ms rpida y tiene mayor especificidad de substrato. El transporte activo permite que los solutos ingresen a la clula en contra de un gradiente de concentracin, consumiendo energa metablica. Como ejemplo citaremos al sistema de la -galactsido permeasa, mediante el cual la lactosa (disacrido) es concentrado dentro de una bacteria como E. coli. El transporte de la lactosa se produce por una permeasa especfica (protena M); dicha reaccin implica gasto de energa. La energa se usa para disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte interna de la membrana celular, favoreciendo su rpida liberacin dentro del citoplasma. Si la generacin de energa es bloqueada por el agregado de azida de sodio al sistema, la permeasa cataliza la difusin facilitada de la lactosa, cesando el transporte cuando la concentracin del disacrido sea la misma a ambos lados de la membrana. En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentracin de hierro no permite alcanzar un desarrollo ptimo. Las bacterias han desarrollado varios sistemas para obtener cantidades adecuadas de dicho elemento. Los siderforos son ligandos de bajo peso molecular cuya funcin es suministrar hierro a la clula. Aunque existe una variacin importante en la estructura de los distintos tipos de siderforos conocidos, la mayora son de dos tipos: catecoles: la enterobactina es la ms estudiada; e hidroximatos: producidos por algunos hongos. La enterobactina es un poderoso quelante que E. coli produce rpidamente cuando existe dficit de hierro y la secreta al medio externo. Crecimiento de las poblaciones bacterianas El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este paso es importante para proveer de una poblacin de bacterias que puedan ser analizadas mediante pruebas bioqumicas, serolgicas, genticas y de susceptibilidad a los antibiticos. El cultivo es el proceso de propagacin de los microorganismos en el laboratorio, que se obtiene aportando las condiciones ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes. Es necesario conocer cules son los requisitos bsicos de la bacteria en cuestin para su cultivo en el laboratorio (nutrientes, requerimientos

atmosfricos y ambientales), as como los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar. La siembra de un material que contiene bacterias en un medio slido adecuado con la tcnica de aislamiento permite, luego de un perodo adecuado de incubacin, la recuperacin de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. stas pueden ser aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro. El crecimiento se define como el aumento del nmero de bacterias en una poblacin determinada (ver figura). Es importante diferenciar entre el crecimiento de una clula individual y el de una poblacin. Dicho crecimiento celular es el resultado del aumento del tamao de la clula, seguido de su divisin. El crecimiento de una poblacin, en cambio, es el resultado del aumento del nmero total de clulas, que puede ser cuantificado directamente (contando el nmero de clulas) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular). El recuento de clulas totales puede determinarse por recuento microscpico en una cmara con reas de volumen conocido, contando las clulas por unidades. Este recuento, considera la totalidad de las clulas presentes en la muestra (viables y no viables). Para realizar un recuento de las clulas viables, es necesario hacer un cultivo en medio slido para contar el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un volumen conocido de la muestra.

Curva de crecimiento Dicha tcnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio apropiado o por siembra incorporada en agar. El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada ni salida de los componentes del sistema), est limitado por el agotamiento de los nutrientes o bien por la acumulacin de productos txicos del metabolismo. Cuando las bacterias se siembran en el laboratorio en un medio lquido (por ejemplo en un tubo de ensayo), se trata de un sistema cerrado de cultivo. Si se toman muestras a intervalos

regulares en diferentes tiempos de incubacin y se realiza un recuento del nmero de clulas viables por mililitro de cultivo, la representacin grfica de los datos (conteo de clulas viables en funcin del tiempo) dar la curva de crecimiento caracterstica que consta de cuatro fases: latencia, exponencial, estacionaria y muerte. Fase de latencia Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco, sufren un cambio en su composicin qumica antes de ser capaces de iniciar la multiplicacin. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de la actividad metablica, casi sin divisin celular, asociado a un incremento de la susceptibilidad a los agentes fsicos y qumicos. Por lo tanto, la mal llamada fase de latencia implica intensa actividad metablica. Fase exponencial Las clulas se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza intrnseca de la bacteria y por las condiciones del medio. Existe gran aumento del nmero total de clulas viables, que puede ser expresado en forma exponencial. Prximo al final de esta fase, se produce la liberacin de exotoxinas por las bacterias que las producen. Fase estacionaria Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulacin de productos txicos determina el cese del crecimiento. Hay prdida de clulas por muerte, la cual es balanceada por la formacin de nuevas clulas. Cuando esto ocurre, el conteo total de clulas aumenta levemente aunque el de las bacterias viables permanece constante. Hacia el final de esta etapa, puede ocurrir la esporulacin en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de resistencia. Fase de muerte Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el nmero de bacterias viables disminuye rpidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento declina. Las caractersticas de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo de las caractersticas propias del microorganismo, del estado metablico del inoculo, del medio de cultivo y de las condiciones de incubacin. Las condiciones fsicas y qumicas del medio donde el microorganismo crece afectan las actividades de stos. La comprensin de cmo influye el ambiente en el crecimiento, nos ayuda a explicar la distribucin de los

microorganismos en la naturaleza y hace posible disear mtodos que permitan estudiar y controlar el crecimiento bacteriano. Adems, existen sistemas de cultivo abiertos que son poco usados en el laboratorio de microbiologa clnica. El cultivo continuo (con aporte y salida de nutrientes y requerimientos a una tasa constante), permite mantener a las bacterias en una misma fase de crecimiento durante un largo perodo de tiempo (por ejemplo en la fase estacionaria o en la exponencial). Dicha tcnica es interesante por ejemplo para los procesos productivos.

Medios de cultivo Son una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que permiten el crecimiento de los microorganismos. Deben contener todos los nutrientes necesarios en cantidades apropiadas a los requerimientos de los microorganismos y en condiciones de pH, presin osmtica, oxgeno disuelto, etc., adecuados para el crecimiento. Aunque los diferentes microorganismos tienen distintas propiedades fisiolgicas y requerimientos nutricionales, la composicin qumica de las clulas es constante en todo el mundo vivo. Los medios ms simples estn compuestos por una base mineral se puede suplementar con una fuente de carbono, de energa, de nitrgeno y con algn factor de crecimiento requerido. Los medios deben esterilizarse antes de ser usados. Esta esterilizacin generalmente se realiza con calor hmedo, pero algunos medios con componentes sensibles al calor pueden filtrarse. Existen muchos medios con diferentes utilidades que pueden ser clasificados de la siguiente manera. Segn su consistencia en: lquidos, semislidos y slidos. Los medios slidos son usados para el aislamiento bacteriano, mientras que los lquidos son tiles para el enriquecimiento de una poblacin bacteriana de inters. Segn su composicin: definidos (de composicin qumica conocida, medios simples) y complejos (con agregados de sustancias no definidas, por ejemplo extracto de levadura). Segn la cantidad de nutrientes: pobres (por ejemplo el agar simple) y ricos (por ejemplo el agar sangre). Tambin pueden clasificarse en medios: diferenciales, que permiten diferenciar algunas propiedades distintivas del grupo bacteriano (por ejemplo el uso de lactosa en agar CLED); y selectivos, que permiten el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros (por ejemplo el Mac Conckey para la seleccin de bacterias gramnegativas). Tambin existen los medios especiales para el transporte de muestras o cepas, o aquellos especficos para identificar alguna va metablica determinada.

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