NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista del captulo 1.2.3 del Cdigo de animales acuticos.

Este captulo no ha sido actualizado desde 2003.

CAPTULO 2.1.13

PISCIRICKETTSIOSIS (Piscirickettsia salmonis)

RESUMEN
La piscirickettsiosis es una enfermedad de los salmnidos causada por Piscirickettsia salmonis que se descubri por primera vez en el salmn plateado de piscifactora (Oncorhynchus kisutch) en 1989 en Chile. Piscirickettsia salmonis es una bacteria patgena intracelular de los peces, Gram-negativa y muy difcil de cultivar. Se relaciona remotamente con el gnero Coxiella y Francisella y se agrupa con la subdivisin gamma de las proteobacterias. La identificacin de P. salmonis se basa en el aislamiento del agente causal con la subsiguiente prueba para buscar las caractersticas del patgeno intracelular. Piscirickettsia salmonis aparece en las vacuolas citoplsmicas de las clulas hospedadoras. El organismo se puede distinguir de Chlamydiophila ya que no posee el ciclo de desarrollo clamidial caracterstico y no contiene el antgeno clamidial lipopolisacrido especfico de grupo. La identidad se confirma por medio de pruebas serolgicas o por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Para obtener un resultado rpido, la identidad de P. salmonis aislado en cultivo celular u observado en frotis procedentes de tejido enfermo, puede confirmarse por medio de la prueba de inmunofluorescencia, por mtodos inmunohistoqumicos con anticuerpos monoclonales o policlonales o por medio de la PCR con cebadores especficos para P. salmonis. La implementacin de medidas higinicas y la poltica de gestin son los nicos mtodos de control utilizados actualmente. Se usan antibiticos, pero su valor es cuestionable. Varios grupos estn realizando intensos esfuerzos para elaborar una vacuna efectiva.

INTRODUCCIN
La piscirickettsiosis es una infeccin septicmica de los salmnidos. El agente causal de esta enfermedad es piscirickettsia salmonis (ATCC VR-1361), y el tipo de cepa es el LF-89 (13, 15). Hasta ahora la enfermedad se haba descrito en Chile (5, 129, Irlanda (22, 23), Noruega (21) y tanto en la Costa Oeste como Este de Canad (16) de Canad. Piscirickettsia salmonis se ha detectado en el salmn plateado (Oncorhynchus kisutch), en el salmn real (O. tshawytscha), en el salmn japons (O. masou), en la trucha arco iris (O. mykiss), en el salmn rosado (O. gorbuscha) y en el salmn del Atlntico (Salmo salar). Se cree que el salmn plateado es el ms susceptible (13). Se describi una mortalidad en las jaulas de malla de las aguas marinas de entre un 30% y un 90% entre los salmones plateados criados en Chile (5). Piscirickettsia-salmonis, como otros organismos, se ha aislado recientemente de los peces no salmnidos (7-9). No se ha dilucidado por completo la relacin de la mayora de estos organismos con P. salmonis, pero el organismo aislado de la corvinata blanca (Atractoscion nobilis) (7) es genticamente indistinguible de P. salmonis. Se estn investigando an los mecanismos de transmisin. La enfermedad se describi primeramente en las piscifactoras marinas y tambin en las instalaciones de agua dulce (4, 14). La transmisin horizontal ocurre en agua salada y en agua dulce (2, 10). La transmisin por vectores no pasa de ser una hiptesis y el papel de la transmisin vertical no est muy claro.

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Aunque el tratamiento antibacteriano proporciona algn beneficio, ste no es completamente efectivo como medio de controlar la enfermedad. Actualmente el cido oxolnico parece ser el frmaco a emplear. Pueden desinfectarse los huevos como parte de una buena prctica de crianza. La enfermedad es una infeccin sistmica y crnica que afecta generalmente a los salmnidos criados en agua marina. Todas las edades son susceptibles, desde los esguines hasta los adultos. Estn bien documentados los signos de la enfermedad tanto externos como internos (10, 12, 21, 23). La enfermedad empieza aproximadamente un mes despus de la introduccin de los peces en las jaulas de malla de las aguas marinas y se cree que el organismo es una bacteria marina. Una gran variedad de sntomas generales de la infeccin estn presentes en los salmnidos infectados con P. salmonis. Los peces gravemente afectados tienen color oscuro y muestran anorexia y letargo. Generalmente, nadan cerca de la superficie o de los bordes de las jaulas. Los peces con infecciones ms leves generalmente no muestran signos externos anormales. Las infecciones en el cerebro pueden causar un comportamiento irregular al nadar (25). Tambin pueden aparecer lesiones en la piel de algunos peces, como pequeos parches blancos que pueden convertirse en lceras superficiales. Posiblemente los signos externos observados ms evidentes durante la infeccin por P. salmonis sean las branquias plidas como resultado de una anemia significativa, pero esto no es patognomnico para esta enfermedad. Compatibles con muchas enfermedades inflamatorias crnicas y sistmicas de los salmnidos, los signos internos son: rin inflamado y descolorido y bazo agrandado. Pueden estar presentes ascitis en el peritoneo y tambin pueden ocurrir hemorragias en la grasa visceral, el estmago, la vejiga natatoria y la musculatura del cuerpo (10, 24). Aparecen marcas distintivas de lesiones internas por la enfermedad en el hgado, que puede presentar ndulos piogranulomatosos agrupados, multifocales, de color blanquecino o amarillento. Dichas lesiones, a menudo agrietadas, dan como resultado cavidades crateriformes superficiales en el hgado. Aunque estas lesiones hepticas son en cierta medida nicas en la piscirickettsiosis, muchos peces que la padecen no muestran dichas lesiones. Los cambios histolgicos ms destacados se encuentran en el hgado, el rin, el bazo y el intestino, pero tambin se pueden observar cambios patolgicos en el cerebro, el corazn, los ovarios y las branquias (3, 7, 10, 22, 24). En el hgado se observa una necrosis multifocal de hepatocitos, acompaada de un infiltrado inflamatorio crnico de clulas mononucleares. Las necrosis perivascular y vascular son evidentes en el hgado, y es un hallazgo comn la coagulacin intravascular que causa trombos de fibrina en los vasos ms importantes. Las reas focales de la necrosis son la base de las lesiones circulares y plidas observadas macroscpicamente en los peces crnicamente ms afectados. En las infecciones ms agudas, la fusin de las reas de la necrosis origina una apariencia muy moteada del rgano en lugar de ndulos moderados. La inflamacin granulomatosa tambin ocurre en el intersticio y en el parnquima del hgado y del bazo. Se puede observar meningitis, endocarditis, peritonitis, pancreatitis y branquitis acompaadas de inflamacin crnica y de cambios vasculares similares a los del hgado y los rganos hematopoyticos. Se ha involucrado a los ovarios en ciertas infecciones del salmn plateado (10). Un examen realizado con aumento elevado revela agregados del microrganismo en el citoplasma de los hepatocitos degenerados y en los macrfagos. Los macrfagos infectados estn generalmente hipertrofiados y llenos de detritus celulares. En los cortes de tejido teidos con hematoxilina y eosina (H&E), el organismo aparece como una esfera anffila o basfila de aproximadamente 1 m de dimetro.

PROCEDIMIENTOS DE DIAGNSTICO
Los cambios globales y microscpicos derivados de la piscirickettsiosis no son lo bastante importantes para permitir un diagnstico definitivo de la enfermedad. Por tanto, el anlisis para el diagnstico de la piscirickettsiosis se basa en la deteccin del agente causal. Se puede obtener un diagnstico presuntivo mediante la visualizacin del agente causal dentro de los macrfagos o hepatocitos en los cortes histolgicos o en las improntas de los tejidos. Se obtiene un diagnstico confirmativo mediante el aislamiento de Piscirickettsia salmonis en cultivo celular, pero ste no crece en ningn medio bacteriolgico artificial conocido. La confirmacin de P. salmonis en cultivo celular puede hacerse mediante la prueba de

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inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) o por la prueba de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Los ensayos de la PCR pueden realizarse directamente en tejidos (19, 20), y de este modo los ensayos de la PCR en tejidos junto con la observacin de organismos sospechosos dentro de los macrfagos o de los hepatocitos son tambin mtodos apropiados para un diagnstico confirmativo. Alternativamente, P. salmonis puede detectarse en frotis de tejidos teidos con Giemsa, seguidos de la prueba IFI para identificacin positiva. Est disponible en el mercado un enzimoinmunoensayo para detectar P. salmonis, aunque no se ha publicado informacin sobre el uso de este mtodo. Los tejidos de peces infectados por Piscirickettsia-salmonis- apropiados para el examen en cultivos celulares, la PCR, las improntas de los tejidos y la histologa son: el rin, el hgado y la sangre, recogidos de los peces enfermos durante las infecciones bien sea visibles o encubiertas (18). Debido a la sensibilidad de P. salmonis a los antibiticos in vitro, no debera usarse ningn antibitico en el medio durante la recogida de tejido o del cultivo celular. Procedimiento de muestreo: vase el captulo I.1, seccin B.

1. MTODOS ESTNDAR DE CONTROL DE LA PISCIRICKETTSIOSIS

1.1. Aislamiento de Piscirickettsia salmonis en cultivo celular (18) Lnea celular a usar: CHSE-214 o EPC (sin antibiticos aadidos) a) Preparacin del tejido i) Se debe extraer el rin aspticamente y depositarlo en un contenedor esterilizado. No se deben utilizar antibiticos en ninguna etapa del procedimiento de aislamiento. Los tejidos deben conservarse a 4C o en hielo mientras se procesan y no deben congelarse. El tejido de rin debe homogeneizarse a 1/20 en solucin salina equilibrada (BSS) y libre de antibitico, y luego, sin centrifugarlo, se diluye en 1/5 y 1/50 BSS libre de antibitico para inoculacin en cultivos celulares. Las diluciones finales a usar son 102 y 103. Una dilucin 102 y una 103 del rgano homogeneizado debe inocularse en monocapas celulares y mantenerse en medio libre de antibiticos. El homogeneizado diluido puede inocularse directamente (0,1 ml/cultivo) en el medio de cultivo libre de antibitico recubriendo las clulas.

ii)

b) Inoculacin de las monocapas celulares i) ii)

iii) Los cultivos celulares deben incubarse a 1518C durante 28 das y observarse para la aparicin del efecto citoptico (ECP). El ECP de P. salmonis consiste en una formacin como de placas o de clulas redondeadas. Con el tiempo, el ECP avanza hasta destruir por completo las clulas. iv) Si el ECP no ocurre (excepto en controles positivos), los cultivos deben incubarse a 15 18C durante un perodo adicional de 14 das. 1.2. Prueba de anticuerpos fluorescentes y de tincin de Giemsa del sobrenadante de cultivo celular El sobrenadante de los cultivos celulares que muestran un ECP muy extenso puede depositarse directamente en los portas del microscopio y teirse con Giemsa o probarse mediante IFI (17) como se describe en la siguiente seccin.

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2. MTODOS DE DIAGNSTICO DE LA PISCIRICKETTSIOSIS

2.1. Tincin de Giemsa i) Las preparaciones del sobrenadante de cultivo de tejido, de los frotis o improntas del rin, del hgado y del bazo deben realizarse secndolas al aire y fijndolas durante 5 minutos en metanol absoluto. Los portas se sumergen en una solucin de trabajo de tincin de Giemsa durante 30 minutos. Solucin stock: solucin de metanol tamponado pH 6,9 (disponible comercialmente) en 0,4 (w/v). Solucin de trabajo: se diluye 1/10 en tampn fosfatado pH 6,0 (0,074 M de NaH2PO4, 0,009 M de Na2HPO4). iii) Se destie con agua corriente. iv) Se observan los portas bajo inmersin en aceite. Los frotis de tejido de rganos infectados muestran organismos pleomrficos teidos de color oscuro que se presentan en forma cocoide o de anillo, frecuentemente en pares y con un dimetro de 0.51.5 m. 2.2. Prueba de anticuerpo fluorescente de frotis de tejido (17) i) ii) La identidad positiva de P. salmonis aislado en cultivo celular u observado en frotis teidos de Giemsa, puede determinarse por mtodos serolgicos, por ejemplo la prueba IFI. Los frotis o improntas de rin, hgado y bazo deben prepararse secndolas al aire y fijndolas durante 5 minutos en metanol absoluto.

ii)

iii) Los frotis de tejido que se van a examinar por IFI deben estar recin preparados o almacenados a 20C. iv) La muestra se incuba primero con un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-P. salmonis, luego se lava y se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluorescena. v) Despus del lavado, se aplica medio montado en glicerol como base y un cubreobjetos, luego se examina con un microscopio de fluorescencia.

2.3. Histologa i) ii) Se fijan los rganos en formalina y se procesan para histologa rutinaria. Se tien los portas histolgicos con H&E o Giemsa.

iii) Se examinan los macrfagos dentro del intersticio del rin, del bazo o la sangre o los hepatocitos en las lesiones del hgado, para la presencia de cuerpos antfilos, basfilos, esfricos o mltiples (con H&E) o azul oscuro (con Giemsa), aproximadamente de 1 m de dimetro, en el citoplasma. 2.4. Immunohistoqumica de seccin de tejido (1) i) ii) Los cortes (5 m) de tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina y tratados para eliminar la actividad de la peroxidasa endgena. El tejido se incuba primero con un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-P. salmonis, a continuacin se lava y se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rbano.

iii) Despus del lavado, el tejido se expone a un cromgeno, se contrasta con hematoxilina se deshidrata y se prepara para examen en un microscopio de luz.

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2.5. Amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa (20) Se ha desarrollado la PCR anidada para detectar el ADN genmico de P. salmonis utilizando cebadores generales de rADN 16S bacteriano en la primera amplificacin y cebadores especficos para P.-salmonis- en la segunda reaccin. Las dos secuencias de cebadores generales para eubacterias son EubA (1518R) 5-AAG-GAG-GTG-ATC-CAN-CCR-CA-3 y EubB (27F) 5AGA-GTT-TGA-TCM-TGG-CTC-AG-3. Los dos cebadores especficos para P. salmonis PS2S (223F) y PS2AS (690R) tienen las siguientes secuencias: 5-CTA-GGA-GAT-GAG-CCC-GCGTTG-3 y 5-GCT-ACA-CCT-GAA-ATT-CCA-CTT-3, respectivamente. Estos cebadores aportan un producto especfico de 467 pares de bases. La secuencia del cebador PS2AS se ha actualizado para que corresponda a las correcciones de la secuencia de ADN diana (Nmero de acceso U36941 en GenBank). a) Preparacin del sobrenadante o del tejido de cultivo celular infectado Se recomienda el uso de una columna de centrifugacin, disponible en el mercado, para purificar el ADN del sobrenadante de cultivo celular o de tejido para la preparacin de la muestra de PCR. Adems de seguir las instrucciones del fabricante para el uso de la columna, se sugiere la digestin inicial de la muestra durante 30 minutos a 37C en tampn de lisis (20 mM Tris/HC, pH 8,0, 2 mM EDTA (cido etilendiaminotetractico), 1,2% de Tritn X100, 4 mg/ml de lisozima). b) Reaccin en cadena de la polimerasa anidada i) Se aade 5 l de la preparacin de ADN a los 45 l de la mezcla de reaccin que consta de tampn para la PCR (10 mM de Tris/HCl, pH 9, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, y 0,1% de Tritn X-100), 200 M de dATP, de dCTP, de dTTP y de dGTP, 1 M de cebador EubA, 1 M de cebador EubB, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq. Se cubre la mezcla con 50 l de aceite mineral. Se desnaturaliza la mezcla a 94C durante 2 minutos y luego se amplifica mediante 35 ciclos a 94C durante 1 minuto, 50C durante 2 minutos, y 72C durante 3 minutos. La segunda amplificacin se realiza aadiendo 2 l de los primeros productos de la PCR a 48 l de una mezcla de reaccin que contenga 2 M de cada uno de los cebadores PS2S y PS2AS en vez de EubA y EubB bajo las siguientes condiciones de reaccin: se desnaturaliza la mezcla a 94C durante 2 minutos y luego se amplifica mediante 35 ciclos a 94C durante 1 minuto, 65C durante 2 minutos y 72C durante 3 minutos. El ADN amplificado (476 pb) (10 l de mezcla de reaccin para la PCR) se analiza mediante electroforesis en gel TAE de agarosa al 2% (40 mM de Tris acetato/1 mM de EDTA) que contenga 1 mg por 50 ml de bromuro de etidio. Para confirmar la identificacin, se pueden digerir 10 l de alcuotas de la mezcla de amplificacin por PCR con EcoR1 y Pst1 siguiendo las instrucciones del fabricante (productos esperados: EcoR1 994, 546; Pst1 541, 519, 480). Si se obtiene un producto con cebadores especficos para P. salmonis pero no corta segn lo esperado, se debe obtener una confirmacin adicional del aislamiento mediante secuenciacin. c) Identificacin directa mediante reaccin en cadena de la polimerasa Se aade 5 l de preparacin de ADN a los 45 l de mezcla de reaccin que consta de tampn para la PCR (10 mM de Tris/HCl, pH 9, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, y 0,1% de Tritn X-100), 200 M de dATP, de dCTP, de dTTP y de dGTP, 2 M de cada uno de los cebadores PS2S y PS2AS, y 2,5 unidades de ADN de polimerasa Taq. Se cubre esta mezcla con 50 l de aceite mineral si el termociclador no tiene una tapa caliente. La PCR directa se lleva a cabo en las mismas condiciones de reaccin que las del segundo paso de la PCR anidada. Se han desarrollado otros ensayos de PCR para detectar P. salmonis (19). Estas primeras secuencias y las condiciones de reaccin pueden ser apropiadas para la confirmacin de la presencia de P. salmonis.

ii)

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