Biorreatores e Processos Fermentativos

Aula 4 Profa. Dra Ilana L. B. C. Camargo Cincias Fsicas e Biomoleculares IFSC - USP

Biotecnologia do bioprocesso tem trs estgios:

Processo Upstream

Biorreatores e biorreao

Processo Downstream

Parte I

Estgios do processo produtivo

Bioprocesso aplicao industrial de reaes ou vias biolgicas mediadas por clulas vivas inteiras de animais, plantas ou microrganismos, ou enzimas sobre condies controladas para a biotransformao de matrias primas em produtos. Produto alimento, medicamento ou composto industrial Bioprocesso tambm pode ocorrer sem resultar em um produto direto biorremediao, desintoxicao de resduos ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados

Escala laboratorial

Escala industrial

Biorreatores, reatores bioqumicos, reatores biolgicos so os reatores qumicos nos quais ocorrem uma srie de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores

Enzimas

Clulas vivas

Reatores enzimticos Reatores bioqumicos

Biorreatores Reatores Biolgicos

Biorreatores

Sistema no assptico onde no absolutamente necessrio se operar com culturas inteiramente puras (sistemas de descarte de efluentes);

Sistema assptico onde as condies de assepsia so prrequisitos para a formao do produto com sucesso;

Nem todo processo de fermentao precisa ser livre de contaminaes!!

Produo caseira dos vinhos

Antigamente, a macerao das uvas era feita com os ps!!

Nem todo processo de fermentao precisa ser livre de contaminaes!!

Produo artesanal de queijo, vinho, vinagre, iogurte e cerveja, muitas vezes eram processadas satisfatoriamente, mesmo sob condies precrias de assepsia

Queijo de leite de bfala

http://www.viagemesabor.com.br/noticias/roteiros/br/norte/para/marajo

Tanque de macerao das uvas Produo de vinhos (Hoje: prensa hidrulica) Quanto mais controle se tem sobre o processo de fermentao, maior a facilidade em se manter a qualidade e garantir a reproduo do processo.

Macerao das uvas Hoje: prensa hidrulica

Dixido de enxofre (conservante)

Biorreator ou fermentador

Biorreator ou fermentador
Variao em forma e tamanho dependendo da aplicao O design do biorreator depende de um nmero de fatores que incluem: -Tipo de clulas -Tipo de reao metablica -Informao sobre a transferncia de massa e calor -Viscosidade e homogeneizao

Tamanhos: -Frascos agitados (erlenmeyers): 100 1.000 mL -Fermentadores de bancada: 1 L 30L -Fermentadores piloto: 100 1.000 L -Fermentadores industriais: 1.000 1.000.000 L Tambm podem ser bandejas, garrafas (fermentao slida), colunas (imobilizao clulas ou enzimas)

Biorreator ou fermentador
Escala laboratorial ~1L

Biorreator de bancada
http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

Biorreator ou fermentador
1943 EUA, Primeira planta industrial de fermentao para produo de penicilina em fermentadores de ao-carbono de 54 m3 Reatores em ao-carbono Sistemas de agitao e aerao Fundo e esterilizveis tampa torriesfricos

Entrada para a adio de inculo Antiespumante Coleta de amostras Descarga e sada dos gases formados durante a fermentao, etc.

Biorreator ou fermentador
Padres de materiais usados nos fermentadores sofisticados: Todos os materiais que esto em contato com as solues ou com a cultura do organismo devem ser resistentes corroso para prevenir a contaminao do processo com traos de metais; No podem ser txicos pois se houver alguma dissoluo do material ou componente no haver inibio do crescimento da cultura; Inspeo visual do meio e cultura uma vantagem, por isso deve haver materiais transparentes quando possvel O sistema de agitao, portas de entrada e de sada devem ser rgidas o suficiente para no deformar ou quebrar sob estresse mecnico; Materiais precisam suportar repetidas esterilizaes por vapor em alta presso;

Biorreator ou fermentador
Sistema de agitao

Reator agitado mecanicamente (STR: stirred tank reactor)

Sonda pH Sonda oxignio dissolvido

Agitadores: turbinas
Camisa de resfriamento

Estudo atual Aumento de escala 12 Kg 800 Kg

http://www.cetem.gov.br/publicacao/CTs/CT2005-084-00.pdf

Serpentinas

Capacidade dos biorreatores de escala industrial

1- Pequena escala: 1 a 2 m3 de capacidade cultivo de microrganismos patognicos, ou para crescimento de clulas animais ou vegetais. Em geral, seu uso tem como objetivo produtos ligados rea de sade

2 Escala intermediria: dezenas de metros cbicos at 100 a 200 m3 especificamente empregado na produo de enzimas, antibiticos e vitaminas.

3- Grande escala: reatores com milhares de metros cbicos de capacidade para processos que exigem poucos ou at mesmo nenhum cuidado de assepsia: fermentao alcolica ou do tratamento biolgico de resduos

Para satisfazer a funo primria de fermentao, que a de fornecer condies ambientais adequadas ao crescimento dos microrganismos, 12 pontos devem ser observados: 1- O reator deve ser capaz de manter-se estril por muitos dias, trabalhar sem problemas por longos perodos e satisfazer todas as exigncias legislativas de conteno ambiental; 2- As exigncias metablicas dos microrganismos, quanto a aerao e agitao, devem ser plenamente satisfeitas, mantendo porm a integridade fsica dos mesmos; 3- A potncia absorvida deve ser a menor possvel; 4- Um eficiente sistema de controle de temperatura deve estar disponvel; 5- Um sistema de controle de pH deve estar disponvel; 6- Um sistema de tomada de amostras prova de contaminao do contedo do fermentador deve ser parte integrante do equipamento

Para satisfazer a funo primria de fermentao, que a de fornecer condies ambientais adequadas ao crescimento dos microrganismos, 12 pontos devem ser observados: 7- Perdas por evaporao devem ser mantidas ao mnimo;

8- Eficiente sistema de controle dos gases e sada do fermentador devem estar disponveis; 9 - O reator deve exigir o mnimo em mo-de-obra para sua operao, limpeza e manuteno; 10 O reator deve preencher, sempre que possvel, a caracterstica de multipropsito, contudo, a regulamentao de conteno ambiental e a possibilidade de contaminaes cruzadas podem ser fatores limitantes

Para satisfazer a funo primria de fermentao, que a de fornecer condies ambientais adequadas ao crescimento dos microrganismos, 12 pontos devem ser observados: 11- O reator deve ter as superfcies internas polidas e todas as suas conexes, na medida do possvel, devem ser soldadas e no rosqueadas;

12- Na medida do possvel, o reator deve manter uma geometria similar dos reatores menores ou maiores, a fim de facilitar a ampliao de escala do processo.

Fermentao microbiana: um sistema de trs fases

1. Fase lquida: contm sais, substratos e metablitos dissolvidos. Pode tambm possuir substrato imiscvel em gua; 2. Fase slida: consiste nas clulas, substratos ou produtos insolveis;

3. Fase gasosa: oxignio, CO2

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

Sistema de agitao

Fatores importantes:
Sondas para determinao de pH pO2

1 - Oxignio 2 - Temperatura 3 - pH

Sistema de aerao

Entrada de Inculo meios/nutrientes anti-espumante

Sistema de colheita de amostras

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Processos aerbios tm destaque na Biotecnologia Industrial, pois esto envolvidos no cultivo de microrganismo para produo de antibiticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, protenas recombinantes (hormnios, insulina), etc.

Processos fermentativos envolvendo cultivo de clulas aerbias ou aerbias facultativas visando formao de produtos ou tratamento biolgico de guas residurias tm em comum o aspecto de exigirem um adequado dimensionamento do sistema de transferncia de oxignio (fase gasosa fase lquida)

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio
ltimo elemento a aceitar eltrons

Permite: - Armazenamento de energia ATP; - Reoxidao das coenzimas que participam das reaes de desidrogenao.
NADH

Participam das reaes de sntese de

NADH

molculas levando sobrevivncia das clulas e ao surgimento de novas

NADH

clulas no processo de proliferao da biomassa microbiana, para a qual a energia fundamental.

Diagrams: Prokaryotic Mariana Ruiz

(Tortora, Funke & Case, 2000)

Binary Fission, JW Schmidt6

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O Para a oxidao de 1 mol de glicose, necessrio o consumo de 6 mols de O2 Glicose bastante solvel, j O2 pouco solvel em gua. A concentrao de oxignio dissolvido na saturao apenas da ordem de 7 mg O2/L (7ppm), ao se borbulhar ar atmosfrico presso de 1 atm e a 35oC. Nada adianta alimentar o biorreator se no houver um timo sistema de transferncia de oxignio - Transferncia entre fases gasosa e aquosa; - Oxignio dissolvido deve chegar s clulas; - Oxignio deve penetrar nas clulas; - Oxignio deve ser consumido na reao
http://www.pptechnologygroup.com/cfd_engineering.htm

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Em reatores no aerados, o oxignio transferido do espao livre acima do lquido. A agitao quebra continuamente a superfcie do lquido e aumenta a rea de transferncia. O efeito da velocidade de agitao na entrada do gs em um biorreator de 2 L :

300 rpm

450 rpm

750 rpm

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Chicanas/Baffles Aumentam a turbulncia e assim, melhoram a oxigenao do meio

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Chicanas, quebra vrtice ou baffles Aumentam a turbulncia e assim, melhoram a oxigenao do meio Normalmente: 4 chicanas equidistantes Largura: 10% do dimetro do reator Devem ser fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do fermentador para evitar zonas de estagnao

Anlise computacional de dinmica de fluxos

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Chicanas afastadas da parede do biorreator Evita zonas de estagnao

Concentrao de Oxignio dissolvida aumenta com a agitao

Concentrao de O2

Co Co

Co 1

t0

t1

Tempo

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Injetar ar esterilizado

Devagar

rpida

Quando a velocidade de agitao pequena, as bolhas no sero quebradas tendendo a subir direto para a superfcie. Alm disso, iro se acumular no eixo do agitador, coalescendo e diminuindo a transferncia de oxignio. Quando a velocidade de agitao grande, as bolhas pequenas iro circular por todo o reator e tero o seu tempo de residncia aumentado.

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

1- Oxignio Mtodos para aumentar a taxa de transferncia de oxignio (kLa) no sistema:

kLa diminui com o aumento do volume do lquido

kLa aumenta com a rea superficial do lquido

kLa maior quando as pequenas chicanas esto presentes

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

Mtodos para aumentar a taxa de transferncia de oxignio (kLa) no sistema:

-Aumento da presso; -Aumento da concentrao de O2 no ar inserido no reator; -Aumento da agitao; -Aumento do fluxo de ar; -Reduo de espumas e remoo de bolhas de ar da superfcie.

Biorreator ou fermentador
Sistema de Controle de espuma Formao excessiva de espuma pode: 1. Bloquear os filtros de sada de ar; 2. Aumentar a presso do biorreator O controle feito com a adio de agentes antiespumantes baseados em silicone ou leos vegetais que desestabilizam a espuma pela reduo da tenso superficial.

ON-OFF. Uma parte fica no meio e a outra acima do nvel do lquido. Quando a espuma atinge a superfcie do sensor que est em cima, existe a produo de uma corrente eltrica que detectada pelo controlador, resultando na ativao da bomba.

Biorreator ou fermentador
Sistema de Controle de espuma Fatores que favorecem a formao de espuma:

Meio de fermentao: meios ricos em protenas tendem a formar mais espuma. Muitas clulas produzem molculas tipo detergente (cidos nuclicos e protenas excretadas aps lise das clulas ou compostos lipdicos produzidos durante o crescimento);

Taxa de aerao e velocidade do agitador (, formao de espuma);

Biorreator ou fermentador
Sistema de Controle de espuma Fatores que auxiliam na diminuio da formao da espuma: O volume livre no reator: em sistemas nos quais a espuma formada facilmente, o volume de trabalho deve ser reduzido para facilitar o controle de espuma. Quanto maior o volume livre, maior a probabilidade da espuma colapsar por causa do seu prprio peso; Temperatura do condensador: em reatores de laboratrio, uma temperatura mais baixa pode ajudar no controle da espuma. A densidade da espuma aumenta quando ela se move de uma regio mais quente para a regio fria do condensador, causando o colapso da espuma; Quebradores mecnicos de espuma: agitador de alta velocidade. A bolha puxada para o agitador e colapsa por ao de foras mecnicas. Em pequenos reatores de laboratrio so utilizados quebradores ultrasnicos, que geram vibraes de alta frequncia responsveis por quebrar as bolhas da espuma

Fatores que alteram a aerao de uma cultura microbiana

Geometria do biorreator
DT WB

Li Wi Di

HL

Geralmente cilndricos. So construdos em dimenses padro publicadas pela International Standards Organisation e British Standards Institution.

Reatores do tipo STR, em geral:

-Tanque cilndrico -Relao de altura:dimetro (H:D) 2:1 ou 3:1

Geometria do biorreator
DT WB

Esquema de tanque agitado por turbinas de ps planas, com indicao de dimenses importantes na transmisso de potncia ao lquido

Li Wi Di

HL

Mxima potncia com mais de um impelidor: Di < Hi < 2Di

Hi = distncia entre impelidores

Di = Dimetro do impelidor (m) DT = Dimetro do tanque (m) HL = altura da coluna do lquido (m) C = distncia do impelidor ao fundo do reator (m) Wi = altura da p da turbina (m) WB = altura da chicana (m) Nmero

de impelidores para uma mxima transferncia de potncia > NImpelidores > HL 2Di Di

HL Di Di

Geometria do biorreator

Razo Altura do lquido do reator e altura do reator Ht/Hl

Valores Tpicos ~ 0,7 - 0,8

OBS Depende do nvel de espuma produzido durante a fermentao Reatores europeus tendem a ser mais altos que os projetados nos EUA Reatores com turb. Rushton so geralmente 1/3 do dimetro do tanque. Os de fluxo axial so maiores

Altura do reator e dimetro do tanque

Ht/Dt

~1-2

Dimetro do impelidor e dimetro do tanque

Da/Dt

1/3 1/2

Dimetro das chicanas e dimetro do tanque Altura da p do impelidor e dimetro do impelidor Largura da p do impelidor e dimetro do impelidor Distncia mdia entre o impelidor e a sada de gs e altura da p

Db/Dt W/Da L/Da E/W

~0,08 0,1 0,2 0,25 1

Geometria do biorreator

Fluxos: Axial e Radial

Geometria do biorreator
Fluxo axial: o lquido dirigido para a base do reator, isto , paralelo ao eixo do agitador. So deficientes em gerar turbulncia e quebra das bolhas de ar, o que os tornam indesejveis para cultivos aerados.

Algumas marcas comerciais: Impelidor Lightnin 320, Impelidor KPC KROMA, Impelidor Pitched Impelidor Lightnin

Geometria do biorreator
No fluxo radial, o lquido inicialmente dirigido a parede do reator, isto , ao longo do raio do tanque. No to eficiente quanto o fluxo axial. Maior quantidade de energia necessria para gerar o mesmo fluxo que o axial; Algumas marcas comerciais: tipo Arrowhead, de ps curvas, de ps retas verticais, Impelidor Rushton, Impelidor Smith.

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

2- Temperatura A reao que ocorre no biorreator pode ser exotrmica ou endotrmica, por isso, os equipamentos deve ser equipados com um sistema de transferncia de temperatura.

- Sistema de circulao de vapor e gua quente podem aquecer o sistema e tambm pode ser til para esterilizao do biorreator antes do incio do processo da fermentao;

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

2- Temperatura

Para o resfriamento de culturas, o biorreator pode possuir uma camisa ou serpentina de resfriamento por onde podem passar gua, por exemplo, com temperaturas menores.

Fatores fsico-qumicos que devem ser considerados em uma fermentao industrial

3- pH No biorreator deve haver um sistema de determinao de pH assim como uma entrada para balancear a reao com cido/base que no oferea nenhum risco de contaminao para o sistema.

Temperatura e pH tambm ficam mais homogneos com a agitao

Importncia da agitao e mistura

Agitao adequada essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas trs fases: 1- Disperso do ar no meio de cultivo 2- Homogeneizao para igualar a temperatura, pH e concentrao de nutrientes 3- Suspenso dos microrganismos e dos nutrientes slidos 4- Disperso de lquidos imiscveis

Importncia da agitao e mistura

Quanto maior a agitao, melhor ser o crescimento?
CUIDADO!! Agitao excessiva pode romper as clulas e aumentar a temperatura o que ocasiona uma reduo na viabilidade celular!!

Deve-se buscar o equilbrio entre a necessidade de mistura do meio evitando-se o dano celular.

Caractersticas bsicas de biorreatores

1. Sistema de agitao; 2. Sistema de distribuio de O2; 3. Sistema de controle de espuma; 4. Sistema de controle de temperatura; 5. Sistema de controle de pH; 6. Portas de amostragem; 7. Sistema de limpeza e esterilizao; 8. Linhas para esvaziar o biorreator.

Bibliografia

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioqumica. Volume 2. Ed Edgard Blcher LTDA, So Paulo, 2001. Cap. 8

Smith JE. Biotechnology. 4th ed. Cambridge University Press, 2004. Cap. 4