Desarrollo y validacin de un mtodo analtico para la dosificacin de Ibandronato sdico en comprimidos

Cespedes, M.; Colman, S.; Lopez, L.; Gonzalez,M.; Saucedo, S.; Bez,E. * Departamento de Desarrollo de Productos Laboratorios Lasca, Ruta Mcal Estigarribia Km 9,5,San Lorenzo,Paraguay *e-mail:evelyn@lasca.com.py

1-Introduccion El ibandronato sdico es un bisfosfonato nitrogenado de tercera generacin caracterizado por presentar una cadena lateral de amina terciaria aliftica. El nombre qumico del ibandronato sdico es sal 5 monosdica de cido (1-hidroxi-3-(N-metil-N-pentilamino)propilidn)bisfosfnico y la frmula emprica del ibandronato sdico es C9H22NO7P2NaH2O con un peso molecular de 359,24. El ibandronato sdico se presenta como polvo blanco o casi blanco . Es fcilmente soluble en agua y prcticamente insoluble en disolventes orgnicos. Este principio activo ha sido desarrollado para el tratamiento de trastornos seos tales como la hipercalcemia por tumor maligno, osteolisis, enfermedad de Paget, osteoporosis y enfermedad sea metastsica . Diversos estudios justifican su gran utilidad para el aumento de la densidad mineral ,con mejora de la resistencia reduciendo notablemente el riesgo de fracturas (1) Se comercializa en las formas inyectables y comprimidos. Estos ultimos presentan una dosificacin mensual, con pocos efectos adversos considerando la relacion riesgo -beneficio, con alto potencial de prevencin en un transtorno que afecta a la Salud Pblica. Este activo no se encuentra codificado en farmacopeas y las referencias bibliograficas encontradas al momento del presente estudio sobre dosificacion del mismo, se refieren a fluidos biologicos utilizando derivatizacion (2) o cromatografia de intercambio ionico (3) 2-Objetivo Desarrollar y validar un metodo analitico HPLC-UV simple y accesible,especifico, exacto ,preciso y robusto para la dosificacin de ibandronato sdico, para luego ser utilizado en control de calidad y estudios de estabilidad de comprimidos en laboratorios farmaceuticos pblicos o privados. 3-Metodologa El desarrollo y validacin del mtodo analtico fueron llevados a cabo en un equipo Waters Alliance con modulo de separacion 2695, auto sampler y detector de arreglo de fotodiodos (PDA) 2996 a una longitud de onda de 195 nm y una temperatura de 30 C. La seal de salida fue monitoreada y procesada utilizando el software Empower residente en una computadora personal. La separacin cromatogrfica fue lograda en una columna Octa Decyl Silyl (C-18, 250 mm x 4.6 mm con particulas de 5 m ) con una mezcla de 995 mL de Agua a pH 2.0 con Acido fosforico,0.87 g de LiChropur (cido hexano-1-sulfnico, sal sdica ),0.1 g Titriplex III (cido etilendinitrilotetraactico, sal disdica, dihidrato) y 5 mL de acetonitrilo como fase movil.

El flujo fue de 1.5 mL/min, con una concentracion de solucion de 3000 ug de Acido Ibandrnico/mL usando agua destilada como solvente y un loop de inyeccion de 20 uL. Se obtuvieron Platos tericos = 1000 Factor de cola: 2.0 y un Tiempo de retencin aprox.de 7.5 min.(ver figura 2)
Los analisis se efectuaron sobre un lote piloto de tabletas conteniendo 150 mg de Acido

Ibandronico ( como sal sodica), se elabor un placebo con excipientes, y se utiliz como standard Ibandronato sodico standard de trabajo proveido por JPN Pharma PVT LTD. Figura 2

Validacin del metodo: Siguiendo los lineamientos de ICH Q2 (4) y USP (5) se evaluaron los siguientes parametros: 1. Especificidad: Considerando una posible interferencia del solvente y la matriz de excipientes se evalu la implicancia de ambos factores en el metodo HPLC. Para ello se prepararon e inyectaron : a) mezcla de excipientes del comprimido (placebo o Matriz de excipientes) b) solucion de excipientes c) solucion de Matriz de excipiente cargada con Solucin Referencia d) solucion del standard de referencia (Solucin Referencia). El mtodo debe ser capaz de cuantificar un % de Discrepancia inferior al 2 % entre la Solucin Referencia y la Matriz de excipiente cargada con Solucin Referencia segn la siguiente formula: % Discrepancia = Area sol Ref. sin placebo - Area sol. Ref.con placebo x 100 Area sol. Ref. sin placebo Tambien se evalu la especificidad del mtodo sometiendo la muestra a degradacin forzada o stress por hidrolisis acida con la incorporacin de Acido Clorhdrico al 5 % (v/v),sonicando por 30 minutos . El mtodo debe ser capaz de cuantificar la degradacin del principio activo con una disminucin en los mg/mL recuperados y segn la siguiente frmula:

% Degradacin = Dosis Muestra sin tratar - Dosis Muestra tratada x 100 Dosis Muestra sin tratar

2. Robustez: Para la realizacin del estudio de robustez se utiliz la Matriz de Plackett

Burman (6) , para lo cual se definen previamente 5 factores que puedan incidir sobre la metodologa analtica. Se utiliz un lote piloto de Ibandronato sdico comprimidos. Se incluyen 2 factores falsos, o celdas dummys para completar la matriz ( ver Tabla 1) Tabla 1

A Ensayo pH del componente de FM (Agua) 2.5 2.5 2.5 2 2.5 2 2 2

B Factor FALSO + + + + -

Nivel del factor C D Longitud de Columna 125 125 250 250 250 125 250 125 Loop 50 20 20 50 50 50 20 20

E Factor FALSO + + + + -

F Flujo 1,7 1,3 1,7 1,3 1,3 1,7 1,7 1,3

G Temperatura de la columna 40 40 30 40 30 30 40 30

1 2 3 4 5 6 7 8

En base a la concentracin en mg de Acido ibandronico /comp obtenidos en los 8 ensayos, se calcularon los factores y factores falsos segun las formulas:

CA= Y1 + Y2 + Y3 + Y5 - (Y4 + Y6 + Y7 + Y8) CB= Y2 + Y3 + Y4 + Y6 - (Y1 + Y5 + Y7 + Y8) CC= Y3 + Y4 + Y5 + Y7 - (Y1 + Y2 + Y6 + Y8) CD= Y1 + Y4 + Y5 + Y6 - (Y2 + Y3 + Y7 + Y8) CE= Y2 + Y5 + Y6 + Y7 - (Y1 + Y3 + Y4 + Y8) CF= Y1 + Y3 + Y6 + Y7 - (Y2 + Y4 + Y5 + Y8)
CG= Y1 + Y2 + Y4 + Y7 - (Y3 + Y5 + Y6 + Y8)

Luego se calcul la suma de cuadrados para cada factor, la suma de cuadrados del error, el cuadrado medio y el clculo de la Fcal para cada factor segn las siguientes frmulas: Suma de cuadrado para cada factor SCci = Ci2/8 Donde Ci : Factor A, C, D, F, G. Suma de cuadrados del error Donde Cf Cuadrado medio del error : Factor B y E. SCe = (Cf2/8)

MCe = SCe/f

Donde SCe f F calculado para cada factor Donde SCci : Suma de cuadrados de cada factor MCe : Cuadrado medio del error
Fcal : F calculado para cada factor

: Suma de cuadrados del error : N de ensayos falso.

Fcal = SCci/MCe

Luego se compar el F calculado contra el F de tablas, con un = 0.05 y los grados de libertad: 1 de numerador y 2 de denominador. Ftablas = 18.51. Los criterios de aceptacin se encuentran en la Tabla 2 Tabla 2 Parmetro Si el Fcal F,gl Si el Fcal F,gl Criterio de aceptacin El factor analizado presenta efecto sobre el mtodo analtico El factor analizado no presenta efecto sobre el mtodo analtico

3. Linealidad: Se evaluaron soluciones con concentraciones equivalentes al 80,90,100,110 y

120 % de acido ibndronico en relacion a la concentracion propuesta para el mtodo, en muestras triplicadas ( total 15 muestras con inyecciones triplicadas cada una) . Se calcularon las concentraciones agregadas y recuperadas segun las formulas:

Concentracin agregada (%):= Cm *F/X Donde: Cm : Concentracin de la muestra, en g/mL (para los 5 diferentes niveles). F : 100, para la expresin porcentual de g cada 100 g X : Concentracin terica agregada de (3000 g de Acido Ibandrnico). Concentracin recuperada (%):= Cstd* Am * %Std * T/ Cm * Astd Donde: Cm : Concentracin de la muestra en g/mL Cstd : Concentracin de la referencia en g/mL Am : Area de la muestra. Astd : Area de la referencia. %Std : Pureza de la referencia en mg de referencia, por mg de droga tal cual
T : Niveles de concentracin, g cada 100 g (80, 90, 100,110, 120). Luego se grafic la curva de regresin lineal utilizando Area (Y) vs Concentracion recuperada (X) donde la ecuacin de la pendiente de la curva es: Y = b* x + a ; el coeficiente de regresin lineal (r) no deber ser menor a 0,999. 4- Exactitud: Sobre las 15 muestras con inyecciones triplicadas cada una se calcula el porcentaje de recuperacion de Ibandronato sobre la cantidad real agregada , la desviacion standard, intervalo de confianza , t observado de Student ; segn las siguientes frmulas:

Desviacin estndar

( x promedio )
i

N 1

Coeficiente de variacin (CV): promedio Intervalo de confianza (LC): promedio

100

t N

Donde t tablas = 2,14 para un nivel de probabilidad del 95% y un grado de libertad de 14.
T observado =

( xagregado

xrecuperado N

; N=15

Utilizando la teoria de la Hipotesis nula , si el T observado es menor al t de tablas, se rechaza la Hipotesis nula y el mtodo es considerado exacto.

5- Precision: Se evalua la Repetibilidad calculando el Coeficiente de Variacin (CV) de los resultados obtenidos sobre 15 muestras con inyecciones triplicadas, segn la siguiente frmula:

Coeficiente de variacin (CV): Donde: : ( xi % de Recuperacin - promedio N1 xi % de Recuperacin___ N

prom edio

100

% de Recuperacin

Promedio:

Siendo N = 15

El CV debe ser inferior al 2% . Se evala la Reproducibilidad repitiendo el anlisis de 15 muestras con inyecciones triplicadas, con un analista diferente, el CV entre analista 1 y 2 debera ser menor a 2%, segn la siguiente frmula:

6- Lmite de deteccin: A partir de los datos obtenidos en el ensayo de linealidad ,se calculan para cada nivel: Desviacin estndar de rea (YA): Donde: (N 1) nmero de muestras. (yi promedio)2 N-1

Pendiente (b) =

( x x ) * ( y y ) (x x)2

Interseccin (a) = Lmite de Deteccin (LD) =

Donde: n = 3 nmero de tratamiento por nivel.

yb* x a (X/Y) + [3* a (X/ YA) ] b (X/Y) * n

El lmite de deteccin (LD) deber ser menor a Acido Ibandrnico: 2400 g/mL (equivalente a 80% de la conc. final de la muestra)

7 -Lmite de cuantificacin: Se calcul segn la siguiente formula: Lmite de cuantificacin (LC) =

Donde n = 3, numero de tratamiento por nivel.

a (X/Y) + [10* a (X/ YA) ] b (X/Y) * n

El lmite de cuantificacin (LC) deber ser menor a: Acido Ibandrnico: 2400 g/mL (equivalente a 80% de la conc.final de la muestra) Resultados 1-Especificidad: Los resultados se encuentran en la Tabla 3 , en figura 3 se puede ver el cromatograma obtenido. Tabla 3 Criterio de aceptacin El mtodo es capaz de cuantificar la Porcentaje de degradacin del principio activo (ver degrdacin figura 3), con una disminucin en los mg/mL recuperados El mtodo es capaz de cuantificar un % de Discrepancia inferior al 2 % Capacidad de Discrepancia del entre la Solucin Referencia y la procedimiento Matriz de excipiente cargada con Solucin Referencia. Parmetro Limites > 2,0 % Resultado 17,98% CUMPLE

< 2,0 %

0,42 % CUMPLE

Figura 3

2-Robustez : Los resultados se encuentran tabulados en Tablas 4 y 5 Tabla 4

Factor pH del componente de FM (Agua) Longitud de Columna Loop Flujo Temperatura de la columna Factor

Fcal 5001,10 0,96 1,23 0,77 0,96

Tabla 5

F0,05;1,2

18,51

Decisin Presenta efecto No presenta efecto No presenta efecto No presenta efecto No presenta efecto

Conclusin El mtodo analtico no es robusto para el principio activo en el intervalo de pH del componente pH 2,0 + 0,5 de la fase mvil, por lo cual el pH de la Fase Mvil deber ser de FM (Agua) 2,0 El mtodo analtico es robusto para los principios activos utilizando como Longitud de columna longitud de columna 125 mm y 250 mm, por lo tanto la longitud de columna en el ensayo podr ser de 125 mm y 250 mm El mtodo analtico es robusto para el principio activo utilizando loop de 20 Loop y 50 L.

Flujo Temperatura de la columna

El mtodo analtico es robusto para los principios activos en el intervalo de 1,5 0,2 mL/min, por lo tanto el flujo del ensayo podr ser de1,5 0,2 mL/min. El mtodo analtico es robusto para el principio activo con temperatura de 30C y 40C por lo tanto la temperatura de la columna podr ser de 30C y 40C.

4. Linealidad: Los resultados se encuentran tabulados en Tabla 6 y Figura 4 Cuadro Concentracin vs. Respuesta . Tabla 6
Datos correspondientes a (%) 80 80 80 90 90 90 100 100 100 110 110 110 120 120 120 coeficiente de correlacin r coeficiente de correlacin r2 X(conc. recuperada) 78,29 78,77 78,30 87,91 89,01 89,38 99,39 99,96 99,08 108,20 107,95 107,93 119,11 118,53 119,55 Lm > 0,999

Y(rea) 1212368 1221743 1214604 1351796 1369634 1375646 1532088 1541138 1526266 1685383 1680577 1680327 1844385 1835079 1850516 1,000 0,999

Se graficaron los datos obtenidos y se determin la ecuacin de la recta obtenindose un coeficiente de regresin lineal (R) de 1,0 .

Figura 4

Linealidad Ac. Ibandrnico y = 15618x - 14300 R2 = 0,9992 1900000 1800000 1700000 1600000 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 70,00 90,00 110,00 CONC. 130,00 150,00

AREA

4- Exactitud:

Hiptesis nula (H0): Se postula que no existe relacin entre la cantidad agregada (valor verdadero) y la cantidad recuperada (valor obtenido), en otras palabras el mtodo no es exacto. Para comprobar o rechazar la hiptesis nula, se calcula la t de Student Si t observado < a t tablas; se rechaza la Hiptesis nula y el mtodo es considerado exacto. T tablas para un grado de libertad de 14 y un intervalo de confianza del 95 %= 2,14
T observado = 0,59< 2,14 El mtodo es considerado Exacto Se grafican los resultados obtenidos con Analista 1 en la Tabla 7. Tabla 7
AREA ST1 M1 M2 M3 M1 M2 M3 ST2 M1 M2 M3 ST3 M1 M2 M3 ST4 M1 M2 M3 ST5 1.476.840 1.212.368 1.221.743 1.214.604 1.351.796 1.369.634 1.375.646 1.466.897 1.532.088 1.541.138 1.526.266 1.468.963 1.685.383 1.680.577 1.680.327 1.487.095 1.844.385 1.835.079 1.850.516 1.474.774 CONC. (mg/mL) 3040 2386 2390 2390 2687 2689 2689 3044 2989 2989 2986 3044 3285 3284 3284 3048 3584 3583 3583 3040 CONC. Agregada (%) 80,47 80,60 80,61 90,62 90,68 90,70 100,80 100,81 100,72 110,80 110,75 110,75 120,87 120,85 120,83 CONC. % de Promedio Recuperada recuperacin % de recup. (%) 78,29 78,77 78,30 87,91 89,01 89,38 99,39 99,96 99,08 108,20 107,95 107,93 119,11 118,53 119,55 97,30 97,74 97,12 97,00 98,16 98,55 98,60 99,15 98,37 97,65 97,47 97,46 98,55 98,08 98,94

80%

97,39

90%

97,91

100%

98,71

110%

97,53

120%

98,52

Media Desviacin estndar Coeficiente de variacin Intervalo de Confianza T observado

100,72 Lim < 2 para t = 2,14

99,18

98,01 0,67 0,69 97,6 - 98,38 0,59

98,01

5- Precisin: Repetibilidad: El Coeficiente de Variacin (CV) obtenido fue de 0,69 Lim < 2 . Reproducibilidad: Los resultados obtenidos en las determinaciones efectuadas con el analista 2 se tabulan en Tabla 8, se obtuvo un Coeficiente de Variacin (CV) entre ambos analistas de 0,81 % Lim < 2

Tabla 8
AREA ST1 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 1.465.052 1.204.856 1.208.252 1.211.005 1.361.282 1.365.485 1.371.412 1.468.086 1.496.154 1.503.694 1.510.453 1.476.244 1.666.167 1.672.013 1.679.898 1.473.599 1.835.385 1.833.776 1.827.853 1.472.734 CONC. (g/mL) 3040 2386 2387 2388 2685 2688 2688 3036 2988 2991 2989 3036 3284 3284 3286 3036 3584 3586 3584 3044 CONC. Agregada (%) 80,49 80,50 80,54 90,57 90,64 90,66 100,78 100,87 100,80 110,77 110,75 110,82 120,87 120,96 120,87 CONC. % de Promedio Recuperada recuperacin % de recup. (%) 78,42 78,62 78,76 88,28 88,48 88,85 96,35 96,75 97,26 107,58 107,98 108,41 118,84 118,65 118,36 97,43 97,66 97,79 97,48 97,62 98,01 95,61 95,92 96,49 97,12 97,50 97,83 98,33 98,09 97,92

80%

97,63

90% ST2

97,70

100% ST3

96,01

110% ST4

97,48

120% ST5 Media Desviacin estndar Coeficiente de variacin entre porcentajes de recuperacin de analista 1 y analista 2

98,11

100,72

98,49

97,39 0,79

97,39

Lim < 2 %

0,81 %

6- Lmite de deteccin y Lmite de cuantificacin: Los resultados obtenidos se tabulan en Tabla 9.

Desviacin Estandard 4897 4897 4897 12404 12404 12404 7494 7494 7494 2850 2850 2850 7773 7773 7773

Rango 80 80 80 90 90 90 100 100 100 110 110 110 120 120 120 Interseccin Pendiente Lim. Deteccin Lim. Cuantificacin. R

Area (Y) 1212368 1221743 1214604 1351796 1369634 1375646 1532088 1541138 1526266 1685383 1680577 1680327 1844385 1835079 1850516

Conc(x) 2321 2336 2321 2606 2639 2650 2947 2964 2938 3208 3201 3200 3532 3514 3544,51 -14300,19 526,75

Media 1216238

1365692

1533164

1682096

1843327

Lim < 2400 g/mL Lim < 2400 g/mL

10374,43 -1,12 18,439

g/mL
98,036

g/mL
1,000

Conclusin.
No se ha detectado interferencia con el solvente y la matriz de excipientes , y se ha logrado la deteccin esperada tras la degradacin forzada,indicando la especificidad del mtodo. La robustez del mtodo fue demostrada, excepto frente al Factor pH de la fase mvil, recomendndose que este factor no se vare al lleva a cabo el mtodo. La repetibilidad y reproducibilidad produjeron un coeficiente de variacin menor a 2 demostrndose precisin. El coeficiente de regresin lineal fue superior a 0.999 demostrandose linealidad en un rango de 80 a 120 % de la concentracion de trabajo y se comprb la exactitud del mtodo con un t observado menor a 2.14, rechazndose as la Hipotesis Nula. Los lmites de deteccin y cuantificacin se encotraron dentro de los valores esperado. El mtodo,por tanto, se considera validado y apto para los anlisis de control de calidad y de estudios de estabilidad de comprimidos de Ibandronato sdico, resultando en una alternativa sencilla y accesible para cualquier laboratorio analtico.

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