OBSERVACIN DE BACTERIAS

1. Introduccin:
Leewenhoek realiz observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta entonces slo se poda especular de la existencia de agentes infecciosos ms pequeos que lo que el ojo humano poda distinguir. Desde ese momento el microscopio ptico se ha transformado en una herramienta muy importante en la determinacin y clasificacin microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con slo unas pocas coloraciones y un microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo individual ms eficiente y econmico para el diagnstico rpido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos: a. Reconocer la morfologa de las bacterias y aprender a distinguir los distintos tipos de
agrupaciones que existen.

b. Adquirir destreza en la obtencin de un frotis c. Describir las tcnicas de coloracin simple y compuesta. d. Adquirir destreza en la Tincin de Gram.

3. Marco Terico:
El termino Gram positivo y Gram negativo son parte de un lenguaje comn en salud y muchas veces solo se tendr esta identificacin de la bacteria antes de iniciar un tratamiento. Es tambin por esto habitual, que al tomar un cultivo de una muestra para su anlisis microbiolgico, se realice un extendido que se conoce como Gram y est relacionado con estas tcnicas que sern para algunos alumnos motivo de mayor estudio en sus ramos posteriores.

a. Microorganismos Gram. Positivos: Las eubacterias Gram. positivas son clulas con una gruesa pared celular de peptidoglicano. Ests clulas poseen una membrana citoplasmtica con fosfolpidos y protenas. Por fuera de la membrana citoplasmtica se encuentra la pared celular que est compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que se entrecruzan. Estos puentes peptdico son caractersticos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto ms completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la clula, y evita que la clula estalle en medios hipotnicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalticas y productos de secrecin hacia el exterior de la clula.

b. Microorganismos Gram Negativos: Las eubacterias Gram. Negativas son clulas con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa. Las clulas se encuentran envueltas por una membrana citoplasmtica formada por una bicapa fosfolipdica y protenas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida a unas lipoprotenas de anclaje que fijan la membrana externa.

4. Procedimiento Experimental: a. Obtencin de un frotis.- El frotis constituye la extensin y fijacin de la muestra sobre
una lmina portaobjetos limpia y desengrasada. Extensin: Se coloca en el centro de una lmina portaobjetos una gota del cultivo lquido. si el cultivo fuera solido, se coloca previamente una gota de solucin salina o agua destilada sobre la lmina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequea

porcin de una colonia tomada con el asa de Kolle en ambos casos se extiende la muestra formando una capa delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lmina. Fijacin: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea arrastrado durante el lavado. se puede fijar por el calor suave del mechero.

b. Coloracin simple.- Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de

metileno, fucsina, safranina, etc.

Procedimiento:
En una lamina porta objetos realizar el frotis de la muestra. Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5 minutos. Lavar el frotis a chorro de agua. Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio y esquematizar.

c.

Coloracin compuesta: Tcnica de Gram. Coloracin compuesta es aquella que se

utiliza ms de un colorante. La ms comn es la tincin de Gram, donde las bacterias se tien con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las bacterias Gram positiva, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.

Procedimiento:
En una lamina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el frotis, Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos.

 Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto. Lavar a chorro de agua y decolorar rpidamente con alcohol acetona.

Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos. Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersin. Comparar y esquematizar.