PRACTICA 3. CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANA Y MUTAGENESIS POR RADIACION ULTRAVIOLETA PARTE 1. CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANA 1.

OBJETIVOS

Medir el crecimiento de una poblacin microbiana de E.coli utilizando el mtodo turbidimetrico. Obtener la curva de crecimiento del microorganismos en estudio.

2. MARCO TEORICO El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nmero de clulas, es decir, se refiere al crecimiento de cada clula individual y su crecimiento divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como:

El microorganismo en si. Por ejemplo, en condiciones ptimas, E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas.

La composicin del medio de cultivo. Las clulas crecern ms lentamente en un medio mnimo (MM) que en un medio rico (RM) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecern ms o menos rpidamente

En biotecnologa es muy importante conocer las caractersticas de crecimiento de los microorganismos, ya que de este modo podemos reproducir eficientemente los procesos industriales o las transformaciones realizadas (Para obtener plsmidos reproducibles o una buena produccin y estabilidad de protenas recombinantes). La diferencia de crecimiento en los diferentes medios depende de los niveles de nutrientes y de la aireacin 3. MATERIALES Agar Nutritivo Caldo Nutritivo - BHI Espectofotmetro Vortex Pipetas estriles de 1 y 10ml Tubos de Ensayo Cajas de Petri Agua peptonada 0,85%

Cepas Escherichea coli 4. METODOLOGIA En esta prctica se van a utilizar dos mtodos para determinar la curva de crecimiento de los microorganismos, los cuales consisten en el contaje en placa de agar para determinar slo clulas viables y densidad ptica que nos determinan masa celular. 4.1. 4.2. Inocular la cepa asignada en 50ml de caldo nutritivo, incubar preferiblemente en agitacin durante 18-24 horas. Agregar todo el inculo a 100ml de caldo nutritivo (Tiempo 0). Realizar anlisis de recuento en placa utilizando diluciones 10-3 y 10-5 en agar nutritivo. 4.4. A partir del inculo inicial, preparado en el punto 4.2, repartir el medio en tubos de ensayo estriles, a razn de obtenga 10 tubos 4.5. Maque los tubos asi: Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4.6. 4.7. Tiempo (horas) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5 ml por tubo, de tal forma que

4.3.

Lleve a incubar los tubos (excepto el tiempo 0), a 37C. Cumplido el tiempo determinado para cada tubo, realice las pruebas de recuento en placa. Simultneamente, realice la determinacin de absorbancia a 600nm (en espectrofotmetro calibrado), utilizando el medio de cultivo estril como blanco.

4.8. 4.9.

Anote y grafique los resultados obtenidos. Verifique la pureza mediante coloracin de Gram

Medida del crecimiento en espectrofotometra 4.10. Encender el aparato mantenindolo 5 minutos de precalentamiento antes de realizar la lectura.

4.11. Fijar la longitud de onda en 600nm. Para absorbancia mxima de E.coli y

mnima del medio de cultivo. 4.12. Colocar el blanco correspondiente al medio de cultivo sin inocular. Ajustar al 100% de trasmitancia a 0% de absorbancia, 4.13. Para medir las muestras, tomar 1 ml de cultivo bien homogenizado de un tubo y situarlo en el lugar de las muestras y anotar la absorbancia. 5. RESULTADOS Anote los resultados en el siguiente tabla Absorbancia 600nm Recuento E. coli en

Tiempo

placa 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Con los datos, elabore dos graficas en papel logartmico. En la primera enfrente en el eje X el tiempo y en el eje Y la concentracin celular y en la segunda el tiempo en el eje X y absorbancia en el eje Y. 6. PRELABORATORIO 6.1. Que cree usted que sucede, respecto a la curva de crecimiento, cuando se utiliza un medio enriquecido y un medio mnimo para los microorganismos problema? 6.2. Cules son los inconvenientes cuando se emplea un sustrato como panela o melaza para realizar la curva? Como considera, que vara la curva de crecimiento de un microorganismos como E coli , cuando se varia la temperatura de incubacin ( 0C, 18C, 37C, 45C). 6.4. 6.5. 6.6. Cules son los mtodos utilizados para medir la curva de crecimiento de un microorganismo? Que factores afectan la determinacin por densidad ptica y por qu? Cuales son las ventajas y desventajas de la tcnica?

6.3.

7. Bibliografa CRUEGER. W & CRUEGER. A. 1989. Biotecnologa: Manual de Microbiologa Industrial. Edit Acribia, Zaragoza, Espaa. PEDRAZA. A., ARIAS. J & POUTOU. R. 1999. Tecnologa de Fermentaciones. Manual de laboratorio. Pontificia Universidad Javeriana. SCRIBAN. R. 1985. Biotecnologa. Ed El Manual Moderno. Mxico D.F PARTE 2 MUTAGENESIS POR RADIACION ULTRAVIOLETA 1. OBJETIVO Reconocer el efecto de la radiacin ultravioleta sobre el crecimiento de microorganismos a nivel de laboratorio. 2. MARCO TEORICO 3. MATERIALES Cultivo Escherichia coli, Lactobacillus sp, y B.cereu Cajas de Petri con agar nutritivo Lmpara luz UV Pipetas Pasteur Incubadora Hisopos estriles 4. METODOLOGIA 4.1. Tome 8 cajas de agar nutritivo y mrquelas de la siguiente forma: Marque cada uno de los cuadrantes con E. coli, Lactobacillus sp. y B. Introduzca un escobilln estril dentro de cada tubo que contienen la control, 1,2,3,4,5,6 y 7, a continuacin divdalas en tres partes.

4.2.
4.3.

cereus emulsin bacteriana y rtelo contra las paredes del mismo para remover el exceso del inoculo. 4.4. 4.5. Siembre en cada uno de los cuadrantes con el microorganismo Someta las cajas a la luz UV de la siguiente forma. correspondiente.

Caja

de

Tiempo

Petri (segundos) Control 0 1 20 2 40 3 60 4 80 5 300 6 1800 7 2400 4.6. Incube las cajas a 37C en oscuridad por 24-48 horas ( con el fin de evitar el fenmeno de fotorreactivacin) 4.7. Compare el crecimiento en cada uno de los cuadrantes, teniendo en cuenta el control y completa el cuadro. 5. RESULTADOS Realice la lectura de las cajas despus del tratamiento mutagnico y estime el crecimiento teniendo en cuenta: (-) sin crecimiento (+) crecimiento escaso (++) crecimiento moderado y (+++) crecimiento abundante. Tiempo exposicin (segundos) Control (0) 20 40 60 80 300 1800 2400 6. PRELABORATORIO 6.1. 6.2. 6.3. Porque la luz UV se considera mutagenica? Cul es el efecto de la luz UV sobre el DNA? Que es la fotoreactivacion? de E.coli Lactobacillus sp. B. cereus