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El conocimiento de las estructuras del ser vivo est basado totalmente en el estudio del microscopio. El microscopio ptico es un instrumento que permite la observacin de objetos y detalles de las estructuras tan pequeas que no podran ser observadas a simple vista. Adems permite ampliar y facilitar la visibilidad de las estructuras, gracias a un conjunto de lentes, dispuestos convenientemente. Las principales dificultades de la observacin y el estudio de las estructuras biolgicas son el reducido tamao y la transparencia a la luz invisible. El uso del microscopio y las diferentes tcnicas de microscopia han facilitado el manejo y la observacin de especies de modo ms sencillo y completo. El microscopio compuesto, puede ser monocular o binocular, permite obtener aumentos de 100 a 1500 veces. Los objetos a observar deben ser muy pequeos o cortados en lminas tan delgadas que la luz puede atravesarlos. Estos se colocan en lminas de vidrio especiales como los portaobjetos y cubreobjetos. Las imgenes que se obtienen son bidimensionales o invertidas.
OBJETIVOS
Adquirir habilidad en el cuidado, uso y manejo del microscopio compuesto. Ubicar correctamente las partes y la funcin determinada del microscopio. Determinar el campo visual con diferentes objetivos. Adquirir habilidad y destreza en la realizacin y montaje de muestras frescas . Realizar montaje de muestras permanentes.
MATERIALES
MATERIAL PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO DE LA UFPS Microscopio Compuesto Cajas de petri Estuches de diseccin MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ESTUDIANTE Fibras de lana de pequeos tamaos y colores oscuros Papel milimetrado Frasco de agua estancada Trozo de papel peridico con letra muy pequea Una flor pequea Billetes de cualquier denominacin Corcho MATERIALES BSICOS
Bata Portaobjetos y cubreobjetos Guantes Tapabocas Gorro Goteros Toalla para limpiar Papel para lentes Papel absorbente Zapatos cerrados Ropa adecuada Lupa
Juego de agujas de diferentes tamaos Bistur Block blanco de tamao carta Lpiz o portaminas Gua de la practica Material bibliogrfico o de consulta.
Teniendo en cuenta las bases tericas propuesta para esta prctica determine las partes pticas, mecnicas y de iluminacin. Luego de haber identificado las partes del microscopio compuesto seleccione una de ellas, determinando que criterio utilizo para identificarlo. Al terminar su trabajo, limpie las lentes del microscopio compuesto con papel para lentes que usted debe conseguir y al guardar el microscopio asegrese que el revlver est ubicado en el objetivo de menor aumento en posicin de enfoque. UBICARLO AL FINAL
deje caer el cubreobjetos en un ngulo de 45 en relacin con el portaobjetos, para evitar que se formen burbujas.
(A)
(B)
Figura 1. (A) realizacin del ngulo de 45 en el montaje de la muestra. (B) posicin del cubreobjeto para no formar burbujas en la muestra. Fotografa tomada con cmara canon 12,1 Mpx por Marly Paola y Aida luz.
c.
Presione suavemente el cubreobjetos con el borrador de un lpiz o con el extremo del agitador, para eliminar posibles burbujas de aire o del lquido utilizado.
(A)
(B)
Figura 2. (A) y (B) realizacin del squash con el borrador del lpiz. Fotografa tomada con cmara canon 12,1 Mpx por Marly Paola y Aida luz
d. Realiza el procedimiento del montaje de la muestra sealado en el punto 1, 2 y 3 para el papel impreso (recortar una letra o una palabra) y el milimetrado. e. Describe lo observado y compare las observaciones con lana de colores y cabello humano.
c.
c.
Reporte lo observado y limpie solo con papel para lente y la muestra con papel absorbente y se eliminan estos papeles en la papelera de color verde.
MARCA DEL MICROSCOPIO= VALOR DE OCULAR= VALOR DEL OBJETIVO= MUESTRA= DIBUJO= NOMINACION= (SEALE LAS PARTES DE LA MUESTRAS OBSERVADAS) DESCRIPCION= g. Utilizando la misma preparacin desplace el portaobjetos de izquierda a derecha y en sentido contrario (barrido de la muestra), mientras observa a travs del ocular. h. Desplace ahora la preparacin hacia arriba y hacia abajo siempre observando a travs del ocular. i. Realice observaciones con todos los objetivos excepto con el objetivo de 100X y esquematice lo observado- Explique su observacin.
Para realizar mediciones con el microscopio se usa el micrmetro, escala graduada que se inserta en el ocular y permite determinar la longitud y anchura de determinada estructura que aparece en el campo visual. Si no se tiene micrmetro se puede determinar el dimetro del campo visual, para medir el dimetro de los objetos observados a travs del papel milimetrado.
2
Corte 1 cm de papel milimetrado y elabore la muestra fresca solida. Realice el Enfoque con el objetivo del rango de menor aumento y reporte lo observado. Calcule el nmero de divisiones que aparece en el campo visual para calcular el dimetro de este. Utilizar el Teorema de Pitgoras:
2 2
C =a +b
Dimetro del campo visual objetivo 10X= 1.414,2 micras Objetivo menor aumento 10X Objetivo? (objetivo 40X) Entonces: l dimetro del objetivo 40X=1.414.2 micras 40X 10X Para determinar el dimetro total:
Multiplicar el valor de aumentos del ocular por el valor de aumentos del objetivo. Ejemple: hallar el aumento total de un microscopio cuyo ocular es =10X y su objetivo es 12.5X. Aumentado total= ocular x objetivo. Aumentado total= 10X x 12.5X= 12.5 aumentos Unidades utilizadas en microscopia 1 milmetro = 1000 micras micras= () 1 micra (micrn) = 0.001 mm
RESULTADOS
El estudiante debe entregar una recopilacin esquemtica de lo observado especificando las caractersticas de los tipos de microscopio compuestos existentes en el laboratorio determinando los objetivos del microscopio utilizado, observacin del numero de aumentos y el dimetro del campo visual necesario en cada una de las muestras observadas. Realiza los esquemas necesarios para complementar el trabajo de laboratorio en esta prctica.
DISCUSION
1. En todos los tipos de muestras se utilizan el cubreobjeto? Justifique su respuesta. 2. Consulte cual es el origen y el procedimiento para la obtencin de las muestras Postmortem. 3. Explique la funcin de los Colorantes y Fijadores ms utilizados frecuentemente en el laboratorio de biologa:
4. Explique brevemente las siguientes Tcnicas ms utilizadas en la preparacin de muestras (frotis, extendido, squash y flameo). 5. Explique qu significa: Solucin de glucosa al 10% Solucin de HCl al 1 N
CONCLUSIONES
Registre sus propias conclusiones del trabajo desarrollado en su informe.
BIBLIOGRAFIA
Consulte la propuesta del programa en las bases tericas y en pginas Web
Fotografa tomada con cmara canon 12,1 Mpx por Marly Paola y Aida luz.
El microscopio compuesto consta de: Sistema ptico: objetivos y Oculares. Sistema de iluminacin: diafragma, condensador, filtros, fuentes de luz natural o artificial(lmpara). Sistema mecnico: pie, columna, platina ,tubo de los oculares, tornillo macromtrico, tornillo micromtrico, revolver, ganchos de la platina, y tornillo del condensador.
Sistema ptico:
Ocular: lentes dispuestos en la parte superior del tubo cercano al ojo del observador. Generalmente el valor del ocular de la mayora de los microscopios compuestos es de 10X. Objetivos del microscopio compuesto: lentes que se colocan encima de la muestra. La mayor parte de los microscopios estn equipados con tres o cuatro objetivos, de diferente grado de amplificacin cada uno.(3,5X; 4X, 10X, 40X y 100X). El objetivo 4X tiene una lnea de color rojo, el objetivo 10X presenta una lnea amarilla y el objetivo 40X presenta una lnea de color azul.
Sistema de iluminacin
Diafragma: abertura que regula la cantidad de luz que llega a la preparacin. Condensador: lente que concentra el haz luminoso hacia la preparacin. Lmpara: proporciona la luz que llega hasta el objeto de estudio. Algunos presentan
Filtros: son vidrios hexagonales generalmente de color azul, estn ubicados en algunos microscopios entre la fuente luminosa y el condensador. Tienen por finalidad modificar la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto a observar.
Sistema mecnico:
Pie: base que da soporte y estabilidad al microscopio. Columna: Estructura que une el pie con la platina y el tubo. Sostiene adems el condensador y el diafragma. Platina: Superficie plana para sostener el porta objetos y el cubre-objetos que contienen a las preparaciones. Ganchos de la platina: permiten sujetar la muestra sobre la platina. Tornillo macromtrico: Permite movimientos muy cortos en un ajuste fino del enfoque para lograr una observacin precisa. Este tornillo de mayor tamao. Est ubicado en la parte media de la base del microscopio. Se usa con los objetivos de 4x y 10x. Tornillo micromtrico: se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Este se utiliza para movilizar la platina a distancias muy pequeas, por lo tanto se utiliza principalmente para afinar el enfoque. nico a usarse cuando observamos objetos con el objetivo de magnificacin alta. Da un enfoque preciso de la imagen, se usa con los objetivos de 40x y 100x. Revlver: sistema giratorio relacionado con el tubo, que porta los lentes objetivos para diversos aumentos, pudiendo utilizarlos alternativamente.
9. TIPOS DE MUESTRAS:
Las muestras en el laboratorio de biologa son consideradas una parte representativa del objeto de estudio. Las muestras pueden ser de dos tipos entre otras: frescas y permanentes. Muestras Frescas: se clasifican en hmedas, liquidas, slidas y secas. Por ejemplo sangre, semen, orina, agua estancada, cortes de porciones mnimas de tejidos vegetales y animales, hebras de hilo, lana y papel milimetrado. Estas muestras se pueden desechar una vez que se hayan observado o guardar para convertirlas en muestras permanentes. Muestras Permanentes: llamadas tambin micropreparados o Post mortem, se elaboran mediante ciertas tcnicas como: fijacin, aclaramiento, deshidratacin. Estas muestras se pueden almacenar por varios aos y utilizarlas muchas veces, adems estn guardadas en el laboratorio y clasificadas segn el origen vegetal o animal y se encuentran codificadas de forma especfica para poder reconocerlas e identificarlas, estas muestras representan un alto valor econmico.
PREPARACIONES MICROSCOPICAS
Montaje hmedo: es la suspensin de microorganismos en un lquido. La tcnica de montaje hmedo o de gota pendiente permite examinar organismos vivos suspendidos en un fluido.
Funciones de la tincin: es el mtodo utilizado para colorear muestras para observar mejor. Adems permite: a. Observar mejor. b. Identificar partes estructurales o morfologa de microorganismos. c. Identificar y diferenciar organismos.
Pasos para realizar pelculas o frotis secos 1. Colocar el frotis (pelcula finas de microorganismos sobre el portaobjetos) 2. Fijar el frotis (calentando tres veces, para que los microorganismos se fijen o se adhieran al portaobjetos) 3. Aplicar: Un solo colorante (Tincin simple) Soluciones de colorantes o reactivos (Tincin diferencial)
Tincin simple
Tie 1 color
2. Clases de Tincin Tincin diferencial microbianas entre especficas. (permite establecer diferencias clulas microbiales o partes
Soluciones utilizadas Cristal violeta. Solucin de yodo. Alcohol (agente decolorante). Safranina Gram + Bacterias Gram color rojo pierden el color violeta. conservan cristal violeta coloracin.
LA TINCION DE GRAM
+ se tien de violeta
Gram las clulas se tien de violeta Las clulas violetas Las clulas quedan incoloras
Las clulas continan violetas Las clulas se deshidratan, las clulas permanecen de color violeta Las clulas no se afectan permanecen de color violeta Resumen de preparaciones
4. Safranina
Tcnica A. Preparacin hmeda o gota pendiente. Procedimiento de Tincin 1. Tincin simple. 2. Tincin diferencial. 3. Gram
Aplicacin Estructura morfolgica, estructuras internas-movilidad. Varios procedimientos Tincin. Muestra forma-tamao ordena las clulas. Clulas o partes especficas. (CV) Gram de
Suspensin de microorganismo, se fija en el portaobjetos. Un solo colorante. Usan dos o ms reactivos. El colorante primario
violetas
aplica al frotis. El frotis con fuscina fenica, decolorada y tincin de contraste con azul de metileno.
Gram
rojas
B. Acido resistente
Separa las bacterias. Permite observar protozoos en frotis de sangre: ritkesias (pequeas bacteriasparsitos). El material nuclear de las bacterias.
C. Giemsa
D. Esporas
El colorante primario (verde malaquita) se aplica calentando para que penetre en las esporas; las clulas vegetativas reciben coloracin de contraste con safranina. Se tie el frotis despus de un tratamiento con sulfato de cobre. Un mordiente acta engrosando los flagelos antes de ser teido. La mezcla se combina con tinta china y se extiende formando una pelcula fina.
E. De cpsulas
La capsula aparece como una zona dura que rodea a los rganos que la poseen. Observar bacterias. los flagelos en
F. De flagelos
G. Tincin negativa
Morfologa: tincin y reactivos muy suaves. Los microorganismos no se tien se observan porque el fondo est oscuro.
Nutricionales
De cultivo
Determina aspectos de crecimiento microbianos en varios medios (slidos y lquidos) Identificacin y medida de cambios qumicos a determinadas sustancias. Determinacin de la constitucin qumica de los compuestos celulares. Caracterizacin de microorganismos (bacteriasvirus) estudio antgenos. Determina el potencial productor de enfermedad de un cultivo microbiano en animales o vegetales con cultivos puros de microorganismos.
Metabolismo
Composicin qumica
Composicin antignica
patognicas
empleados. Por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo de 45X y un ocular de 10X, la ampliacin con que estamos viendo la muestra ser: 45X x 10X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto est ampliada 450 veces, tambin expresado como 450 dimetros.
10. Para observar una muestra con el objetivo de inmersin, se coloca una gota de aceite de cedro encima de la lmina de la preparacin antes de girar el revlver. Esto permite que la imagen se vea con nitidez para realizar la observacin ya que este tipo de lentes requiere que el ndice de refraccin sea similar al del vidrio. 11. Terminada la observacin, girar el revlver para colocar el objetivo de menor aumento en la primera posicin de trabajo. 12. Retirar la preparacin y dejar limpio el microscopio, secando la platina con cuidado. 13. Si us el objetivo de inmersin, debe limpiarse inmediatamente despus de su uso con ayuda del papel de lente. Quitar el grueso del aceite con una hoja, luego limpiar con una segunda impregnada en xylol y finalmente con una tercera, secar el lente. No usar cantidades excesivas de solvente pues pueden disolver el cemento de los componentes de los lentes. 14. Mantener cubierto o guardado el microscopio cuando no est en uso. 15. En sitios con excesiva humedad ambiental deber guardarse el microscopio en una campana de vidrio con un desecante como carbonato
TIPOS DE MICROSCOPIOS
En el laboratorio de Biologa de la Universidad Francisco de Paula Santander existen diversas clases de microscopios, la cual consiste en: MICROSCOPIO Marca Leica Los microscopios marca Leica ofrecen alta resolucin en imagen y desempeo ptimo, el microscopio que existe en la universidad presenta 3 objetivos de menor aumento u objetivos secos, ellos son 4x tiene una lnea de color rojo, 10 x presenta una lnea amarilla y 40 x de lnea azul, adems presenta un objetivo de mayor aumento o hmedo que es 100 x, el ocular de este microscopio es de 10. MICROSCOPIO Marca OLIMPUS CX21 El microscopio marca Olimpus cx21, presenta los mismos objetivos y las lneas de colores que el microscopio Leica, tiene mayor calidad de objetivos y presenta
Fotografa tomada con cmara canon 12,1 Mpx por Marly Paola y Aida luz.
luz amarilla y filtro de color azul en el condensador, lo cual no produce cansancio en el visin momento de observar. MICROSCOPIO Marca CARL ZEIS JENA
al
Este microscopio tiene mejores oculares hasta 16x, los objetivos son de vidrio (4x, 10x, 40x, 100x) y el aumento de los lentes es de 10. MIROSCOPIO Marca LEITZ Este microscopio no presenta diafragma, tienen un transformador para la luz, presentan objetivos de menor aumento 10x, 40x, 100x y el aumento es de 10. MIROSCOPIO Marca LEITZ DE LAMPARA DIRECTA La luz se le puede regular con el diafragma, presentan objetivos de menor aumento 10x, 40x, 100x y el aumento es de 10.
MIROSCOPIO marca LEITZ DE LAMPARITA No tiene objetivo de inmersin, presenta filtro azul y solo tiene tres objetivos, el de menor aumento es de 3.5 x, 10x y 40x.
ACTIVIDAD PEDGOGICA
Estas actividades son propuestas para mejorar el aprendizaje de cada educando, en donde cada actividad pretende reforzar las prcticas de cada laboratorio visto. Estas actividades contienen la pedagoga dialogico.critica, constructivista y conductual ya que cada estudiante es autnomo de realizar las actividades individualmente o en grupo para optimizar sus conocimientos y estos sean aplicables a solucionar problemas mediante el criterio cientfico. 1. Indica los tipos de lentes que conozcas. _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ 2. Qu se entiende por distancia perfocal de un lente? _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________
3. Cuntas preparaciones microscpicas existen? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 4. Cules son las tinciones ms importantes que son usadas en biologa? _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ 5. Cul es la importancia de la tincin (simple y diferencial) y cuantas clases existen? _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________
6.
Indica las partes del microscopio de la siguientes figura y nombra sus componentes
TA
7.
Qu nombre recibe la parte del ojo que funciona como una lente?
_______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ 8. Explique brevemente las soluciones ms utilizadas en la tincin de Gram _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________
PAGINAS WEB
ROJAS TRIVIO, Alberto. Conceptos y prctica de microbiologa general. (en lnea). Disponible en internet en: http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf PIA LPEZ, Carmen Eugenia. Gua de laboratorio de biologa. Microscopa. (en lnea). Disponible en internet en: http://canal.unad.edu.co/laboratorio/pdf/manual.pdf FARAS CHAGOYA, Hugo A; VILLASEOR GMEZ, Jos Fernando; MNDEZ GARCA, Francisco; GARCA GARRIDO, Pedro; PREZ MURGUA, Ricardo y LPEZ GARCA, Ramn. Manual de prcticas de la materia de biologa general. (en lnea). Disponible en internet en: http://bios.biologia.umich.mx/files/manualbiologiageneral.pdf