Bioqumica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professora: Marta Silva

Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Objectivos
Tentar reproduzir os resultados das experincias realizadas por Brian Chappell

Protocolo Bioqumica Experimental II 2011/2012

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Resumo
Isolamento dos mitocndrios Centrifugao diferencial

Sais de amnio de metabolitos

7 ensaios (VT = 2,5 mL)

Sais com malato/fosfato de potssio

Inchamento mitocondrial (Abs520 nm)

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento

Isolamento dos Mitocndrios

Meio de isolamento

Descascou-se batatas, cortaram-se em cubos pequenos e pesou-se cerca de 300g.

Suspenso Mitocondrial Ressuspenso do sedimento

4

Centrifugaes e ressuspenso do sedimento sucessivas

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento

Isolamento dos Mitocndrios

Alteraes ao protocolo:

1.

Menor quantidade de batatas

Processo mais rpido

Melhor funcionamento dos transportadores

Extraco do

2.

sedimento de cor esverdeada

Menor acidificao do meio

Integridade dos mitocndrios

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento

Inchamento mitocondrial na presena de sais de amnio de cidos fracos ou metabolitos

Ensaio 1
2,4 mL de H2O

Ensaio 2
1 mL de cloreto de potssio 0,150 mL de extracto mitocondrial

Ensaio 3
1 mL de cloreto de amnio 0,150 mL de extracto mitocondrial 1,350 mL de Tris-HCl/EDTA pH7,4

Ensaio 4
1 mL de acetato de amnio 0,150 mL de extracto mitocondrial 1,350 mL de Tris-HCl/EDTA pH 7,4

0,100 mL de extracto mitocondrial

1,350 mL de Tris-HCl/EDTA pH 7,4

Leituras de absorvncia a 520nm a 30C

6
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento

Inchamento mitocondrial na presena de sais de amnio de cidos fracos ou metabolitos

Ensaio 5
1 mL de fosfato de amnio 0,150 mL de extracto mitocondrial

Ensaio 6
1 mL de malato de amnio 00,025 mL de rotenona 0,150 mL de extracto mitocondrial 1,225 mL de TrisHCl/EDTA pH 7,4

Ensaio 7
1 mL de citrato de amnio 0,025 mL de rotenona 0,150 mL de extracto mitocondrial 1,225 mL de TrisHCl/EDTA pH 7,4 0,100 mL de fosfato de sdio* 0,100 mL de malato de potssio**
*Aps 1 minuto **Aps 1 minuto
DQB-Licenciatura em Bioqumica

1,350 mL de TrisHCl/EDTA pH 7,4

0,100 mL de fosfato de sdio*

Leituras de absorvncia a 520nm a 30C

7

Anlises: Ensaio 1
H2O (controlo positivo)

Figura 1. Espectro do ensaio 1 de inchamento mitocondrial controlo positivo.

Figura 2. Espectro do ensaio 1 para a PL1. Este ensaio foi o controlo positivo.

Esperado: Positivo
8

Experimental: Positivo
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 1 Em esquema

Os mitocndrios so colocados numa soluo hipotnica em relao ao seu meio interior A gua atravessa a membrana mitocondrial para igualar as concentraes

GUA

Matriz Mitocondrial

Meio

Inchamento Mitocondrial

Figura 3. Passagem de gua atravs de uma membrana. Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 2
KCl
Controlo Positivo

Controlo Positivo

Figura 4. Espectro do ensaio 2 de inchamento mitocondrial. Houve a adio de cloreto de potssio para este estudo.

Figura 5. Espectro do ensaio 2 de inchamento mitocondrial da PL1.

Esperado: Negativo
10

Experimental: Negativo
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 2 Em esquema

Para que ocorra inchamento mitocondrial os ies K+ e Cl- teriam de atravessar a membrana A membrana impermevel a ies

No ocorre Inchamento Mitocondrial

Figura 5. Passagem de KCl atravs de uma membrana. Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

11

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 3
NH4Cl
Controlo Positivo Controlo Positivo

Figura 6. Espectro do ensaio 3 de inchamento mitocondrial. Para este ensaio utilizou-se cloreto de amnio.

Figura 7. Espectro do ensaio 3 de inchamento mitocondrial da PL1.

Esperado: Negativo
12

Experimental: Negativo
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 3 Em esquema

Tal como no caso do KCl, para que ocorra inchamento mitocondrial os ies NH4+ e Cl- teriam de atravessar a membrana A membrana impermevel a ies

No ocorre Inchamento Mitocondrial

Figura 8. Passagem de NH4Cl atravs de uma membrana. Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

13

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 4
Acetato de Amnio

Controlo Positivo Controlo Positivo

Figura 9. Espectro do ensaio 4 de inchamento mitocondrial . Para este ensaio utilizou-se acetato de amnio.

Figura 10. Espectro do ensaio 4 de inchamento mitocondrial da PL 1. Para este ensaio utilizou-se acetato de amnio.

Esperado: Positivo
14

Experimental: Positivo
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 4 Em esquema

Figura 11. Esquema da entrada de malato no mitocndrio por adio de acetato de amnio. Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

Dissociao do acetato de amnio nos seus ies

Desprotonao/protonao

Inchamento mitocondrial
15

Perda do gradiente

Entrada por difuso simples

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 5
Fosfato de Amnio
Controlo Positivo

Controlo Positivo

Figura 12. Espectro do ensaio 5 de inchamento mitocondrial . Para este ensaio utilizou-se fosfato de amnio.

Figura 13. Espectro do ensaio 5 de inchamento mitocondrial da PL1.

Esperado: Positivo
16

Experimental: Positivo
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 5 Em esquema

Figura 14. Esquema da entrada de fosfato de amnio no mitocndrio.

Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

Desprotonao do NH4+ Transportador Io fosfato

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Difuso atravs da membrana

Simporte do io fosfato com H+/ antiporte com OHDQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlises: Ensaio 6
Malato de amnio/Rotenona
1 min

Fosfato de sdio

Controlo Positivo

Controlo Positivo

Figura 15. Espectro do ensaio 6 de inchamento mitocondrial. Houve a adio de malato de amnio, fosfato de sdio e rotenona para este estudo.

Figura 16. Espectro do ensaio 6, fornecido pela PL 1, de inchamento mitocondrial. Houve a adio de malato de amnio, fosfato de sdio e rotenona para este estudo.

Experimental: Negativo
18

Esperado: Positivo

Experimental: Positivo
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Anlises: Ensaio 6 Em esquema

Figura 17. Esquema da entrada de malato no mitocndrio por adio de malato de amnio e fosfato de sdio. Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

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Anlises: Ensaio 7
Citrato de amnio
1 min

Fosfato de amnio

1 min

Malato de sdio

Controlo Positivo

Controlo Positivo

Figura 18. Espectro do ensaio 7, de inchamento mitocondrial. Houve a adio de malato de amnio, fosfato de sdio e rotenona para este estudo.

Figura 19. Espectro do ensaio 7, fornecido pela PL 1, de inchamento mitocondrial. Houve a adio de malato de amnio, fosfato de sdio e rotenona para este estudo.

Experimental: Negativo
20

Esperado: Positivo

Experimental: Positivo
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Anlises: Ensaio 7 Em esquema

Figura 20. Esquema da entrada de citrato no mitocndrio por adio de citrato de amnio, fosfato de sdio e malato de potssio. Adaptado Aulas Tericas de Processos de Oxidao Reduo em Bioqumica 2011/2012

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Concluses
Incham No Incham

Acetato de amnio
Fosfato de amnio

Cloreto de potssio

Malato de amnio + fosfato de sdio Citrato de amnio + fosfato de sdio + malato de potssio
Cloreto de amnio
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Concluses
Estequiometria:
H2PO4Malato Citrato Entrada de 1 H+ Entrada de 2 H+ Entrada de 3 H+

Os mitocndrios respondem a mudanas na presso osmtica do

meio de suspenso; A membrana mitocondrial impermevel a pequenos ies;

A membrana mitocondrial permevel a molculas neutras pequenas.

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Referncias
Nelson, D., Cox, M., Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition, W. H. Freeman and Company, New York, 2008.

Nicholls, D., Ferguson S. (2002) Bioenergetics 3, Second Edition. UK : Academic Press.

Chappell, J.B. & Haarhoff, K.N. (1967) The penetration of the mitochondrial membrane by anions and cations. In Biochemistry of Mitochondria (Slater, E.C., Kaniuga, Z. & Wojtczak, L., eds.), pp.75-91, London and New York; Academic Press. Cain, K. & Skilleter, D.N. (1987) Preparation and use of mitochondria in toxicological research. In Biochemical Toxicology a practical approach (Snell, K. & Mullock, B., eds.), pp 217-254, Oxford: IRL Press. Ng, L.T., Selwyn, M.J., Choo, H.L. (1993) Effect of buffers and osmolality on anion uniport across the mitochondrial inner membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1143, 29-37.

Rickwood, D., Wilson, M.T., Darley-Usmar, V. (1987) Isolation and characteristics of intact
mitochondria. In Mitochondria a practical approach (Darley-Usmar, V., Rickwood, D., Wilson, M.T.), pp. 1-16, Oxford: IRL Press. Verleur, J.D. (1965) Studies on the Isolation of Mitochondria from Potato Tuber Tissue, Plant Physiol 40, pp.1003-1007. 24
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