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FML 2008/09

Biologia Molecular da Clula Cooper, 4th Edition

Cooper para Tots


A ideia de fazer esta sebenta partiu da necessidade de estudar para a 2 fase do exame de BMC. A meros 5 dias antes do exame da 2 fase, e com pouco tempo para estudar, resolvi arriscar, e pedi ajuda. Alguns colegas meus ajudaram e estou grato, por hoje, na vspera do exame, termos reunido todo o material. Sem eles este projecto no teria sido possvel num to curto espao de tempo. Fica aqui o agradecimento pela excelente e rigorosa colaborao dos meus colegas: Maria Maia (Captulo 7), que mesmo sem necessitar de estudar, uma vez que no iria repetir o exame, resolveu ajudar. O mesmo se passou com o Miguel Guia (Captulos 12 e 17), que se voluntariou de seguida para ajudar, sem pretender estudar. Quanto ao Ricardo Vale de Andrade (Captulos 10 e 16), ao Marcos Mesquita (Captulo 11), e Snia Cavaco (Captulo 13), deixo aqui os agradecimentos sinceros pela colaborao. Espero que esta sebenta vos ajude, e se no futuro desejarem melhor-lha, contactem-me por favor: fredericobarreto@campus.ul.pt

Frederico Crisstomo Barreto 1 de Maro de 2009

Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Snia

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ndice
Captulo 1 Viso geral sobre as clulas ................................................................................. 10 Origem e evoluo das clulas ............................................................................................ 10 A primeira clula ............................................................................................................. 10 Evoluo do Metabolismo ............................................................................................... 11 Procaritas Actuais.......................................................................................................... 11 Eucaritas Actuais ........................................................................................................... 12 A origem dos eucaritas .................................................................................................. 12 Desenvolvimento de Organismos Multicelulares ............................................................. 12 Clulas como modelos experimentais ................................................................................. 13 E.coli ............................................................................................................................... 13 Leveduras........................................................................................................................ 13 Caenorhabditis elegans ................................................................................................... 13 Drosophila melanogaster ................................................................................................ 13 Vertebrados .................................................................................................................... 14 Captulo 2 Composio das clulas ....................................................................................... 15 As molculas das clulas ..................................................................................................... 15 Glcidos ........................................................................................................................... 15 Lpidos ............................................................................................................................ 15 cidos Nucleicos ............................................................................................................. 15 Protenas......................................................................................................................... 18 Membranas celulares .......................................................................................................... 18 Lpidos Membranares...................................................................................................... 18 Protenas membranares .................................................................................................. 19 Transporte atravs de membranas celulares ................................................................... 19 Proteomics: Anlise de Protenas celulares a larga-escala.................................................... 19 Identificao de protenas celulares ................................................................................ 20
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Anlise global da localizao proteica .............................................................................. 20 Interaces proteicas ...................................................................................................... 20 Captulo 4 Fundamentos da Biologia Molecular .................................................................... 21 Hereditariedade, Genes e DNA ............................................................................................ 21 Genes e Cromossomas .................................................................................................... 21 Genes e Enzimas ............................................................................................................. 21 Identificao de DNA como o Material Gentico ............................................................. 21 Estrutura do DNA ............................................................................................................ 22 Replicao do DNA .......................................................................................................... 23 Expresso da Informao Gentica...................................................................................... 25 Colinearidade de Genes e Protenas ................................................................................ 25 O papel do mRNA ............................................................................................................ 25 DNA recombinante.............................................................................................................. 27 Enzimas de restrio ....................................................................................................... 27 Formao de molculas de DNA recombinante ............................................................... 28 Vectores de DNA recombinante ...................................................................................... 30 Sequenciao de DNA ..................................................................................................... 31 Expresso de genes clonados .......................................................................................... 33 Deteco de cidos Nucleicos e Protenas ........................................................................... 34 Amplificao de DNA por PCR.......................................................................................... 34 Hibridao de cidos nucleicos ........................................................................................ 34 Anticorpos como sondas para protenas .......................................................................... 37 Funo de Genes em Eucaritas .......................................................................................... 39 Transferncia Gentica em Plantas e Animais.................................................................. 39 Mutagnese de DNAs clonados ....................................................................................... 44 Introduo de Mutaes em genes celulares ................................................................... 44 Interferindo com a Expresso Gentica Celular................................................................ 44

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Captulo 5 Organizao e Sequncias dos Genomas Celulares .............................................. 45 A Complexidade dos Genomas Eucariotas ........................................................................... 45 Intres e Exes ................................................................................................................ 45 Sequncias de DNA Repetitivas ....................................................................................... 46 Duplicao de Genes e Pseudogenes ............................................................................... 47 Composio dos Genomas de Eucaritas ......................................................................... 47 Cromossomas e Cromatina.................................................................................................. 48 Cromatina ....................................................................................................................... 48 Centrmeros ................................................................................................................... 50 Telmeros ....................................................................................................................... 50 Sequncias de Genoma Completos ..................................................................................... 51 O Genoma Humano - Experincia .................................................................................... 51 Captulo 6 Replicao, Manuteno, e Rearranjos no DNA Genmico ................................... 53 Replicao do DNA .............................................................................................................. 53 DNA polimerases............................................................................................................. 53 Forquilha de Replicao .................................................................................................. 54 Fidelidade da Replicao ................................................................................................. 58 Origens e Iniciao da Replicao .................................................................................... 60 Telmeros e Telomerase: Manuteno das extremidades de cromossomas .................... 60 Reparao de DNA .............................................................................................................. 63 Reverso directa de danos a DNA .................................................................................... 64 Reparao por exciso .................................................................................................... 64 Sntese de DNA transleso............................................................................................... 64 Reparao Recombinacional ........................................................................................... 64 Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA .......................................................... 64 Modelos de Recombinao Homloga............................................................................. 64 Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga ............................................................ 64

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Rearranjos de DNA .............................................................................................................. 64 Recombinao Site-Specific ............................................................................................. 65 Transposio atravs de Intermedirios de DNA.............................................................. 65 Transposio atravs de Intermedirios de RNA .............................................................. 66 Amplificao Gnica ........................................................................................................ 67 Captulo 7 - Processamento e Sntese de RNA ......................................................................... 68 Transcrio em procariotas ................................................................................................. 68 RNA polimerase e Transcrio ......................................................................................... 68 Repressores e controlo negativo da transcrio ............................................................... 71 Controlo positivo da transcrio ...................................................................................... 72 RNA polimerases eucaritas e Factores de transcrio ........................................................ 72 RNA polimerases eucariotas ............................................................................................ 72 Factores de transcrio e Incio da transcrio pela RNA polimerase II............................. 73 Transcrio pela RNA polimerase I e III ............................................................................ 73 Regulao da transcrio em Eucariotas .............................................................................. 73 Sequncias Cis-acting reguladoras: Promotores e Enhancers ........................................... 73 Estrutura e funcionamento de Activadores da Transcrio .............................................. 75 Repressores eucaritas ................................................................................................... 75 Relao da estrutura da cromatina com a transcrio...................................................... 76 Regulao da transcrio por RNAs no codificantes ....................................................... 78 Metilao do DNA ........................................................................................................... 78 Processamento de RNA e turnover ...................................................................................... 79 Processamento de mRNA em Eucaritas ......................................................................... 79 Mecanismos de Splicing .................................................................................................. 80 Splicing Alternativo (Alternative splicing)......................................................................... 82 Edio de RNA ................................................................................................................. 82 Degradao de RNA ........................................................................................................ 83

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Captulo 8 Sntese, processamento e regulao proteica ...................................................... 84 Traduo do mRNA ............................................................................................................. 84 RNAs de transferncia ..................................................................................................... 84 O Ribossoma ................................................................................................................... 85 Organizao do mRNA e incio da traduo ..................................................................... 85 Processo de Traduo ..................................................................................................... 86 Regulao da Traduo ................................................................................................... 87 Dobragem Proteica e Processamento .................................................................................. 88 Chaperonas e Dobragem Proteica ................................................................................... 89 Enzimas que catalisam a Dobragem Proteica ................................................................... 89 Clivagem Proteica............................................................................................................ 89 Glicolizao ..................................................................................................................... 90 Ligao de Lpidos ........................................................................................................... 91 Captulo 10 Encaminhamento e transporte de protenas ...................................................... 92 O retculo endoplasmtico .................................................................................................. 92 O retculo endoplasmtico e a secreco de protenas .................................................... 92 Encaminhamento de protenas para o Retculo Endoplasmtico ...................................... 92 Insero de protena na membrana do Retculo Endoplasmtico ..................................... 94 Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequncia-sinal clivvel e uma nica stop-transfer sequence .......................................................................................... 94 Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequncia-sinal interna sequncia (e, portanto, no-clivvel) ............................................................................... 94 Insero de uma protena na membrana do RE com mltiplas stop-transfer sequences (domnios transmembranares) ........................................................................................ 95 Folding e Processamento proteico no Retculo Endoplasmtico ....................................... 95 Controlo de Qualidade no Retculo Endoplasmtico ........................................................ 96 O retculo endoplasmtico liso e a sntese de lpidos ....................................................... 96 Exportao de Lpidos e Protenas a partir do Retculo Endoplasmtico ........................... 97 O Aparelho de Golgi ............................................................................................................ 98
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Organizao do Golgi ...................................................................................................... 98 Glicosilao de protenas no Golgi ................................................................................... 98 Metabolismo dos lpidos e dos polissacardeos no Golgi .................................................. 99 Encaminhamento e exportao das protenas a partir do Golgi ....................................... 99 O mecanismo do transporte de vesculas .......................................................................... 100 A experimentao e a compreenso dos mecanismos do transporte de vesculas ......... 100 Selectividade do Cargo, Protenas Coat e Destacamento de Vesculas ........................... 100 Fuso de Vesculas ........................................................................................................ 101 Lisossomas ........................................................................................................................ 101 Hidrolases cidas prprias dos lisossomas ..................................................................... 101 Endocitose e formao do lisossoma ............................................................................. 102 Fagocitose e Autofagia .................................................................................................. 102 Captulo 11 Bioenergtica e Metabolismo..................................................................... 103

Mitocndrias..................................................................................................................... 103 Organizao e Funo das Mitocndrias ........................................................................ 103 O Sistema Gentico das Mitocndrias ........................................................................... 103 Importao de Protenas e Montagem de Mitocndrias ................................................ 104 Peroxissomas .................................................................................................................... 107 Funes dos Peroxissomas ............................................................................................ 107 Construo de Peroxissomas ......................................................................................... 107 Captulo 12 O citoesqueleto e o movimento celular ........................................................... 108 Estrutura e Organizao dos filamentos de actina ............................................................. 108 Montagem e Desmontagem dos Filamentos de Actina .................................................. 108 Organizao dos filamentos de Actina ........................................................................... 108 Associao com a Membrana Plasmtica....................................................................... 109 Projeces da Superfcie Celular .................................................................................... 109 Actina, Miosina e Movimento Celular ................................................................................ 109

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Filamentos Intermdios .................................................................................................... 110 Protenas dos Filamentos Intermdios........................................................................... 110 Montagem dos Filamentos Intermdios ........................................................................ 110 Organizao Intracelular dos Filamentos Intermdios ................................................... 110 Epidermlise Bulhosa Simples ....................................................................................... 111 Microtbulos .................................................................................................................... 111 Estrutura e organizao Dinmica dos Microtbulos ..................................................... 111 Organizao Intracelular dos Microtbulos ................................................................... 111 Drogas que Afectam a Estabilidade dos Microtbulos ................................................... 111 Motores Microtubulares e Movimento ............................................................................. 112 Clios e Flagelos ............................................................................................................. 112 Resumo das Funes ............................................................................................................. 112 Captulo 13 Membrana Plasmtica ..................................................................................... 113 Transporte de pequenas molculas ................................................................................... 113 Medicina Molecular: Fibrose Cstica (FC) ....................................................................... 113 Endocitose ........................................................................................................................ 114 Fagocitose ..................................................................................................................... 114 Endocitose Mediada por Receptor................................................................................. 115 Key Experiment: O Receptor de LDL .............................................................................. 116 Trfego de Protenas na Endocitose............................................................................... 118 Captulo 15 Sinalizao Celular ........................................................................................... 120 Molculas Sinalizadoras e os seus receptores .................................................................... 120 Modos de sinalizao clula-clula ................................................................................ 120 Hormonas esterides e a Superfamlia dos receptores nucleares................................... 122 Neurotransmissores ...................................................................................................... 122 Hormonas Peptdicas e Factores de crescimento ........................................................... 123 Funes dos Receptores da Superfcie Celular ................................................................... 123

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Receptores Acoplados a Protenas G ............................................................................. 123 Receptores associados a tirosina-cinases....................................................................... 124 Receptores de citocinas, e Tirosinas cinases no receptoras .......................................... 125 Receptores ligados a outros tipos de enzimas................................................................ 125 Vias de transmisso de sinais intracelulares ...................................................................... 125 A via do cAMP: Mensageiros Secundrios e Fosforilao de Protenas ........................... 125 GMP cclico ................................................................................................................... 126 Fosfolpidos e CA2+ ........................................................................................................ 126 Vias da MAP cinase ....................................................................................................... 126 Captulo 16 O ciclo celular .................................................................................................. 128 O ciclo celular da clula eucariota ..................................................................................... 128 Fases do ciclo celular ..................................................................................................... 128 Regulao do Ciclo Celular por Sinais de Crescimento e Sinais Extracelulares ................ 129 Checkpoints do ciclo celular .......................................................................................... 130 Restringindo a replicao do DNA a uma nica vez por ciclo .......................................... 130 Reguladores da progresso do ciclo celular ....................................................................... 131 Protenas-cinases e regulao do ciclo celular ............................................................... 131 Famlias de Ciclinas e Cinases dependentes de ciclinas .................................................. 132 Factores de crescimento e regulao das Cdks da fase G1 ............................................ 133 Checkpoints de verificao de erros no DNA.................................................................. 133 Captulo 17 Morte e Renovao Celular.............................................................................. 134 Morte Celular Programada ................................................................................................ 134 Eventos Durante a Apoptose (Fig 17.1) .......................................................................... 134 Fagocitose de Clulas e Fragmentos de Clulas Apoptticas (Fig 17.2) ........................... 134 Caspases ....................................................................................................................... 135 Reguladores Centrais da Apoptose: A famlia Bcl-2 ........................................................ 135 Vias Sinalizadoras que regulam a apoptose ................................................................... 136

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Clulas Estaminais e a Manuteno de Tecidos Adultos..................................................... 137 Proliferao de Clulas Diferenciadas ............................................................................ 137 Clulas Estaminais ......................................................................................................... 137 Aplicaes Mdicas de Clulas Estaminais Adultas ........................................................ 137 Clulas Estaminais Embionrias e Clonagem Teraputica .............................................. 137 Transferncia Nuclear Somtica .................................................................................... 137

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Captulo 1 Viso geral sobre as clulas


Origem e evoluo das clulas
As clulas dividem-se em duas classes principais: clulas procariticas (que no tm envelope nuclear), e clulas eucariotas que tm um ncleo que separa o material gentico do citoplasma. Em geral os procariotas so menores e mais simples que os eucariotas, o seu genoma menos complexo, e no contm organelos citoplasmticos ou citoesqueleto. Mas ambos os tipos de clulas governam as suas vidas com base em mecanismos moleculares semelhantes.

A primeira clula
Na base do aparecimento de vida est uma teoria que postula que a formao espontnea de molculas orgnicas conduziu posterior formao de macromolculas. Uma caracterstica crucial das macromolculas que deram origem vida ter sido a capacidade de autoreplicao, pois s uma macromolcula capaz de direccionar a sntese de novas cpias de si mesma seria capaz de direccionar a reproduo e posterior evoluo. As molculas com a capacidade de auto-replicao so os cidos nucleicos, cujas cadeias servem de moldes para a sntese da nova macromolcula, atravs do emparelhamento especfico de nucletidos complementares. Estudos descobriram as capacidades catalticas do RNA, que consegue direccionar a sntese de uma nova cadeia de RNA atravs de uma cadeia molde. Consequentemente, o RNA considerado o sistema gentico inicial (RNA world). Interaces entre RNA e aminocidos (aa) deram origem ao cdigo gentico actual, e o DNA substituiu o RNA como material gentico.

Auto-Replicao de RNA

A primeira clula gerou-se supostamente pelo enclausuramento de RNA auto-replicante numa membrana composta de fosfolpidos, que so os componentes bsicos de das membranas biolgicas, como as membranas plasmticas dos procaritas e eucaritas. O que permite aos fosfolpidos formar membranas que eles so molculas anfipticas, ou seja, uma poro da molcula solvel e gua e a outra no. Os fosfolpidos tm longas cadeias de carbono e hidrognio insolveis em gua (hidrofbicas), juntas a cabeas de fosfato solveis em gua (hidroflicas). Quando em meio aquoso, os fosfolpidos agregam-se espontaneamente numa bicamada, em que os grupos fosfato esto em contacto com a gua, e as cadeias de carbono e hidrognio no interior em contacto umas com as outras. Esta bicamada forma uma barreira
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estvel entre dois compartimentos aquosos - por exemplo o interior e o exterior de uma clula.

Enclausuramento de RNA Auto-Replicante numa membrana de fosfolpidos

Evoluo do Metabolismo
As clulas necessitaram de desenvolver os seus prprios mecanismos de gerao de energia e sntese de molculas necessrias replicao. Todas as clulas usam adenosina 5-trifosfato (ATP) como fonte de energia para conduzir a sntese de constituintes celulares e outras actividades que implicam o gasto de energia, como o movimento celular. Os mecanismos para gerao de ATP surgiram em 3 fases, a gliclise, a fotossntese, e o metabolismo oxidativo. A gliclise um mecanismo pelo qual a energia em molculas orgnicas pr-formadas poderia ser convertido em ATP, que poderia ser depois usado como fonte energtica para conduzir outras reaces metablicas. O desenvolvimento da fotossntese foi o passo evolucionrio seguinte, permitindo clula colher energia da luz solar, tornando-a independente da utilizao de molculas orgnicas pr-formadas. O uso de H2O em reaces fotossintticas produz O2, e foi este mecanismo o responsvel por tornar a atmosfera terrestre abundante em O2, que consequentemente alterou o ambiente em que as clulas habitavam, levando ao desenvolvimento do metabolismo oxidativo. Como o O2 uma molcula muito reactiva, providenciou um mecanismo de gerao de energia a partir de molculas orgnicas muito mais eficiente que a simples gliclise anaerbica.

Procaritas Actuais
Os procaritas actuais dividem-se em dois grupos: archeabacteria (algumas vivem em ambientes extremos) e eubacteria, as formas comuns de bactrias da actualidade. Os procaritas mais complexos so as cianobactrias, as quais desenvolveram inicialmente a fotossntese. A estrutura tpica de uma clula procarita ilustrada pela E.coli, uma habitante do trato intestinal humano: rodeada por uma parede celular rgida (porosa), abaixo da qual existe uma membrana plasmtica, na qual uma bicamada fosfolipdica est associada a protenas. O
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seu DNA uma molcula circular no nucleide, no sendo separada do citoplasma, como nos eucaritas. O seu citoplasma abunda em ribossomas (locais da sntese proteica).

Eucaritas Actuais
Todas so envolvidas por uma membrana plasmtica e contm ribossomas, mas so maiores e mais complexas, sendo o seu organelo mais proeminente o ncleo (local de sntese de RNA e replicao de DNA; a traduo d-se em ribossomas, no citoplasma). Contm outros organelos no citoplasma, que ao compartimentalizarem as diferentes actividades metablicas da clula as tornam muito mais eficientes. As mitocndrias (onde se d o metabolismo oxidativo e produo de ATP) e os cloroplastos tm papis fundamentais no metabolismo energtico. Os lisossomas e peroxissomas so compartimentos metablicos especializados na digesto de macromolculas e reaces oxidativas, respectivamente. O retculo endoplasmtico (processa e transporta protenas e sintetiza lpidos) e o aparelho de Golgi (matura protenas e sintetiza lpidos) dedicam-se distribuio e transporte de protenas destinadas secreo, incorporao na membrana plasmtica e lisossomas. As clulas eucaritas ainda tm uma rede de filamentos proteicos que se estende no citoplasma, o citoesqueleto, que d estrutura clula, determinando o seu formato, e organizao geral do seu citoplasma, sendo tambm responsvel pelo movimento celular e transporte e posicionamento de organelos numa clula.

A origem dos eucaritas


Um passo crucial na evoluo das clulas eucariticas foi a aquisio de organelos, que lhes permitiu tornarem-se mais complexas. Estes organelos surgiram supostamente por endossimbiose (uma clula a viver dentro de outra), em que clulas procaritas viviam nas clulas que deram origem s eucaritas. Esta hiptese bem suportada por estudos de mitocndrias e cloroplastos, que se pensam ter evoludo de eubacterias a viver em clulas maiores, pois tanto as mitocndrias como os cloroplastos contm o seu prprio DNA, que codifica alguns dos seus componentes. Assim, pensa-se que as mitocndrias surgiram de eubacterias aerbias.

Desenvolvimento de Organismos Multicelulares


Os seres multicelulares evoluram de seres unicelulares que formavam agregados multicelulares. Por exemplo, alguns tipos de clulas de algas associam-se umas s outras para formar colnias multicelulares. A progressiva especializao celular levou transio de agregados coloniais a seres multicelulares. O corpo humano composto por mais de 200 tipos de clulas diferentes, que so considerados componentes de 5 tipos principais de tecido: epitelial (cobrem as superfcies do corpo e rgos internos), conjuntivo (osso, cartilagem, tecido adiposo), sanguneo (contm glbulos vermelhos e brancos), nervoso (neurnios) e muscular (produo de fora movimento).

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Clulas como modelos experimentais


Porque as propriedades fundamentais das clulas tm sido conservadas durante a evoluo, os princpios bsicos retirados de experincias com uma clula geralmente so aplicveis a outras.

E.coli
Os procaritas so os seres de eleio para o estudo de aspectos fundamentais da bioqumica e da biologia molecular, devido sua simplicidade, quando comparados a outros seres. A E.coli a espcie de bactria mais estudada, pois relativamente simples, e fcil de propagar e estudar em laboratrio. O seu pequeno genoma (4.6 milhes de pb e 4300 genes), aliado sua rpida proliferao laboratorial, confere-lhe vantagens na anlise gentica. Alm disso, uma populao clone de E.coli, na qual todas as clulas derivam da mesma clula original, pode ser facilmente isolada num meio de cultura com agar, permitindo tornar a escolha de espcies resistentes a antibiticos rpida e fcil. As misturas de nutrientes na qual a E.coli se divide mais rapidamente (20 minutos) inclui glicose, sais, compostos orgnicos (aa, vitaminas e precursores de cidos nucleicos). Tambm pode ser cultivada num meio mais pobre, contendo apenas amnia e glicose, sendo contudo o crescimento mais lento.

Leveduras
As leveduras, os eucariotas mais simples, tm vantagens experimentais semelhantes E.coli, sendo o modelo da biologia celular dos eucariontes. A espcie mais estudada a s.cerevisiae, contendo um genoma com aproximadamente 6000 genes. Apesar da sua simplicidade, exibe as caractersticas tpicas das clulas eucaritas: ncleo rodeado por uma membrana nuclear, DNA organizado em cromossomas, e o citoplasma contm citoesqueleto e organelos. Em condies ptimas dividem-se a cada 2 horas, sendo ideais para manipulaes genticas semelhantes quelas realizadas em bactrias.

Caenorhabditis elegans
As leveduras unicelulares so modelos muito importantes para o estudo de clulas eucaritas, mas a compreenso de seres multicelulares requer o uso de plantas ou de animais, organismos mais complexos. A c.elegans permite o estudo do desenvolvimento animal e da diferenciao celular. O seu genoma bem maior e mais complexo do que o de eucariontes unicelulares mas bem mais simples e manusevel que o da maioria dos outros animais, sendo facilmente sujeitado a manipulao gentica. Os indivduos adultos so compostos por apenas 959 clulas somticas, e entre 1000 e 2000 clulas da linha germinativa.

Drosophila melanogaster
Esta mosca da fruta tem sido um modelo crucial no estudo da biologia do desenvolvimento, e apesar de conter mais pb no seu genoma, contm menos genes que a c.elegans, sendo tambm fcil de manter e reproduzir laboratorialmente (tem um ciclo reprodutivo curto duas semanas). A anlise gentica realizada na Drosophila permitiu a identificao de inmeros genes que controlam o desenvolvimento e a diferenciao.

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Vertebrados
Os animais mais complexos so os vertebrados, que incluem os humanos, mamferos, entre outros. O genoma humano tem aproximadamente 3 mil milhes de pb, contm 20 000 a 25 000 genes, e mais de 200 tipos diferentes de clulas especializadas. Esta complexidade torna os vertebrados difceis de estudar do ponto de vista da biologia molecular. Uma abordagem para o estudo de seres humanos e outros mamferos o crescimento de clulas isoladas em cultura, onde podem ser manipuladas, sob condies laboratoriais. O uso de clulas em cultura permitiu elucidar os mecanismos da replicao de DNA, expresso gentica, sntese proteica, processamento, e diviso celular. Alm do mais, as propriedades de algumas clulas altamente especializadas (neurnios, clulas musculares), tornam-nas modelos importantes para o estudo de aspectos particulares da biologia celular. Por exemplo, os neurnios so excelentes modelos para o estudo do transporte de ies atravs da membrana. Entre os mamferos, o rato o modelo mais adequado para anlise gentica, que facilitada pela disponibilidade do seu genoma completo. A adequao do rato como modelo para o desenvolvimento humano indicada no s pela semelhana entre os genomas humano e do rato, como tambm pelo facto de mutaes em genes homlogos provocarem o desenvolvimento de defeitos em ambas as espcies.

Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Snia

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Captulo 2 Composio das clulas


As molculas das clulas
As clulas so compostas por gua (muito abundante), ies inorgnicos e molculas orgnicas (substncias que contm carbono e hidrognio). A interaco entre a gua e os outros constituintes celulares de grande importncia, e como a gua uma molcula polar (atmos de hidrognio tm uma carga ligeiramente positiva e os de oxignio uma ligeiramente negativa) , pode formar pontes de hidrognio com outras molculas de gua, bem como interagir com ies carregados positiva ou negativamente. Assim, ies e molculas polares dissolvem-se em gua (hidroflicas), e as molculas apolares so pouco solveis em gua (hidrofbicas), tendendo assim a minimizar o seu contacto com a gua, associando-se umas com as outras. Os ies inorgnicos celulares (sdio, potssio, cloro, clcio, magnsio, fosfato, bicarbonato), esto envolvidos em aspectos metablicos. Os compostos orgnicos dividem-se em 4 classes moleculares: glcidos, lpidos, protenas e cidos nucleicos. As protenas, cidos nucleicos, e a maioria dos glcidos (polissacridos) so macromolculas formadas pela polimerizao (juno) de vrios precursores moleculares: aminocidos (aa), nucletidos e monossacridos, respectivamente.

Glcidos
Incluem acares simples (monossacridos), bem como polissacridos. Os monossacridos (como a glicose) so os principais nutrientes de uma clula, e a sua degradao a fonte de energia celular e de precursores para a biossntese de componentes celulares. Os polissacridos so a forma de armazenamento de acares e formam os componentes estruturais das clulas, servindo tambm como marcadores em processos de reconhecimento celular.

Lpidos
So os principais componentes das membranas celulares, sendo tambm uma forma de armazenamento energtico muito importante, alm de funcionarem como molculas sinalizadoras e hormonas esterides (estrognios, testosterona, etc).

cidos Nucleicos
Os cidos nucleicos DNA e RNA so as molcula de armazenamento de informao da clula. O DNA tem como funo servir de material gentico, sendo que nos eucariontes se localiza no ncleo. Existem diferentes tipos de RNA: mRNA (mensageiro), que transporta informao do DNA para os ribossomas, servindo como molde para a sntese proteica; o rRNA e o tRNA esto envolvidos na sntese proteica. O RNA alm de transportar informao, capaz de catalizar algumas reaces qumicas (de sntese proteica e processamento de RNA). O RNA e o DNA so polmeros de nucletidos, que consistem em bases: purinas (dois anis), como a Adenina (A) e a Guanina (G); ou pirimidinas (um anel), como a Citosina (C), a Timina (T) e o Uracilo (U).

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O DNA consiste em duas purinas (A e G), e duas pirimidinas (C e T). O RNA contm Uracilo em vez de Timina, como no DNA.

Componentes dos cidos Nucleicos

As bases (purinas e pirimidinas) esto ligadas a glcidos, no caso do DNA desoxirribose; no caso do RNA ribose, formando assim nuclesidos. Os nuclesidos ligam-se a um ou mais grupos fosfato no carbono 5, formando os nucletidos.

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A polimerizao de nucletidos para formar cidos nucleicos envolve a formao de ligaes fosfodister, entre o fosfato 5 de um nucletido e o grupo hidroxilo 3 de outro. Oligonucletidos so pequenos polmeros de nucletidos, enquanto que os maiores polmeros se chamam polinucletidos. Os polinucletidos so sempre sintetizados de 5->3, com a adio de um nucletido livre na extremidade 3 da cadeia em crescimento (ligao ao grupo hidroxilo). Assim, por conveno, as sequncias de bases escrevem-se no sentido 5->3. A informao est contida no DNA e no RNA atravs da ordem das bases (A, T, G, C e U) na cadeia de polinucletidos. O DNA uma molcula de dupla cadeia, cujas duas cadeias de polinucletidos correm em sentidos opostos. As bases ficam no interior da molcula, e as duas cadeias so juntas por pontes de hidrognio entre bases complementares: A emparelha com T (A T) por 3 pontes, e G emparelha com C (G = C) por duas pontes. Esta complementaridade de bases permite que uma cadeia de DNA ou RNA sirva de molde para a sntese da cadeia complementar. A informao carregada no DNA e no RNA direcciona, entre outras coisas, a sntese de protenas especficas, que controlam as actividades celulares. Os nucletidos tambm participam noutros processos celulares. Por exemplo, o ATP (adenosina 5-trifosfato), que um nucletido, a principal forma de energia qumica das clulas, existindo tambm outros nucletidos com estas funes. Alm disso, alguns nucletidos (como o cAMP) so importantes molculas intracelulares sinalizadoras.
A diferena entre uma ribose e uma desoxirribose no carbono 2 sendo que a ribose a este carbono tem ligado um grupo hidroxilo (HO) enquanto a desoxirribose tem apenas ligado um hidrognio (H). O grupo fosfato dos nucletidos tem tendncia a reagir com o HO do carbono 2 atacando-o. Ora quando isto acontece a molcula de RNA torna-se instvel e degradada. Como o DNA no tem o grupo hidroxilo este no reage com o grupo fosfato e por isso esta molcula mais estvel. por esta razo que a nossa informao gentica codificada por DNA e no por RNA (Exame 1 Fase, 2008/2009).

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Protenas
As protenas executam as tarefas implcitas pela informao gentica, sendo as macromolculas mais diversas, e realizando uma grande variedade de funes: componentes estruturais das clulas, transporte e armazenamento de pequenas molculas (hemoglobina armazena O2), transmisso de informaes entre clulas (hormonas), e defesa imunolgica (anticorpos). A sua propriedade fundamental a capacidade de actuarem como enzimas, que catalizam praticamente todas as reaces qumicas dos sistemas biolgicos. So polmeros de 20 tipos de aa, que se distinguem pelas diferenas nas cadeias laterais. Os aa so ligados por ligaes peptdicas, entre o grupo -amina de um aa e o grupo -carboxilo de outro aa. Os polipptidos so cadeias lineares de centenas ou milhares de aa, que tm duas extremidades: N-terminus, ou terminal amina; C-terminus, ou terminal carboxilo. Os polipptidos so sintetizados do N-terminus para o C-terminus, e a sequncia de aa num polipptido escrita na mesma ordem. Cada protena consiste numa sequncia de aa especfica, que define a estrutura de uma protena. A conformao tridimensional de uma protena corresponde ao seu estdio termodinmico mais estvel, que depende das interaces entre os diferentes aa. Logo, a sequncia de DNA que d origem protena tambm determina a sua estrutura.

Membranas celulares
A estrutura e funo das clulas depende em muito das membranas, que para alm de separarem os ambientes intracelular do extracelular, definem compartimentos internos nas clulas eucaritas, delimitando o ncleo e os organelos celulares. As membranas biolgicas so bicamadas de fosfolpidos associadas a protenas, que so responsveis por diversas funes especializadas: receptores de sinais externos; transporte selectivo de molculas atravs da membrana; transporte de electres de fosforilao oxidativa. Alm disso, as protenas membranares controlam as interaces entre as clulas de seres multicelulares.

Lpidos Membranares
Os constituintes essenciais das membranas celulares so os fosfolpidos, que so molculas anfipticas, que consistem de duas cadeias hidrofbicas de cidos gordos ligadas a uma extremidade polar hidroflica que contm um grupo fosfato. Como as cadeias de cidos gordos so pouco solveis em gua, os fosfolpidos tendem a formar bicamadas em meio aquoso (efeito entrpico e ligaes Van der Waals), gerando uma barreira estvel entre dois compartimentos aquosos. As bicamadas lipdicas funcionam como fluidos bi-dimensionais, nos quais molculas individuais (lpidos e protenas), podem rodar e mover-se em direces laterais. Esta fluidez uma caracterstica crucial das membranas, e depende da temperatura e da composio da lipdica da membrana. Por exemplo, as interaces entre cadeias curtas de cidos gordos so mais fracas que entre cadeias longas, logo membranas com cidos gordos curtos so menos rgidas e mantm-se fluidas a temperaturas mais baixas. Lpidos compostos por cadeias insaturadas tambm aumentam a fluidez da membrana, pois a presena de ligaes duplas dificulta o empacotamento dos lpidos. 18

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O colesterol possui anis de hidrocarbonetos que so rgidos, e interagem com as cadeias de cidos gordos dos outros lpidos, diminuindo a mobilidade dos cidos gordos, tornando a membrana mais rgida. Por outro lado , a insero do colesterol interfere com as interaces entre as cadeis de cidos gordos, mantendo a fluidez a baixas temperaturas. Assim, o colesterol funciona como um tampo de fluidez da membrana.

Protenas membranares
As protenas so os constituintes principais das membranas celulares, estando inseridas numa bicamada lipdica, segundo o modelo do mosaico fluido. As protenas dividem-se em duas classes principais: protenas intrnsecas (inseridas directamente na bicamada), e protenas extrnsecas (associadas indirectamente membrana, geralmente interagindo com protenas intrnsecas). A maioria das protenas intrnsecas so transmembranares, pois cruzam a bicamada lipdica, tendo pores expostas a ambos os lados da membrana. As pores transmembranares so geralmente -hlices, formadas por resduos apolares, que interagem com a poro hidrofbica da membrana. A membrana pode tambm ser atravessada por uma estrutura em -barril. As protenas transmembranares so molculas anfipticas, pelo que as suas pores hidroflicas esto expostas ao ambiente aquoso. As protenas tambm podem ser ancoradas a membranas por lpidos ligados covalentemente a cadeias polipeptdicas, e as diferentes modificaes lipdicas ditam a que face da membrana as protenas ficam ancoradas.

Transporte atravs de membranas celulares


Apenas pequenas molculas sem carga (H2O, O2 e CO2) se conseguem difundir livremente atravs das membranas. Molculas maiores, mesmo que apolares (glicose) no conseguem difundir-se livremente pela membrana, bem como ies. Assim, necessrio que a passagem destas molculas e ies seja mediada por protenas transmembranares, que podem assim, determinar a permeabilidade selectiva de membranas celulares. H duas classes de protenas transportadoras: canais proteicos, que formam poros atravs da membrana, permitindo a livre passagem de molculas com tamanho apropriado, podendo ser selectivamente abertos ou fechados; protenas carregadoras, que se ligam selectivamente e transportam molculas especficas, como a glicose. Quando o movimento das molculas a favor do gradiente, o transporte denominado difuso passiva. Quando o transporte contra gradiente e acoplado hidrlise de uma fonte energtica, o processo denomina-se transporte activo.

Proteomics: Anlise de Protenas celulares a larga-escala


Genomics a anlise sistemtica de genomas celulares. Proteomics o estudo em larga escala das protenas celulares. Proteome a identificao e quantificao de todas as protenas expressas numa clula, bem como a identificao das suas redes de interaco.

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Identificao de protenas celulares


O n de espcies diferentes de protenas de uma clula maior que o nmero de genes, pois um gene pode corresponder a mais do que uma protena, devido a fenmenos de splicing alternativo e de modificaes proteicas. O primeiro mtodo desenvolvido para estudos de proteomics a electroforese em gel de protenas, que pode separar centenas de protenas. A espectofotometria de massa outro mtodo, que permite identificar protenas, separadas por electroforese ou no.

Anlise global da localizao proteica


Organelos subcelulares isolados podem ser analisados por espectofotometria de massa, para determinar os seus constituintes proteicos. Grande poro das protenas das leveduras pode ser marcada por protenas fluorescentes verdes para estudos globais da sua localizao.

Interaces proteicas
Vrias abordagens a larga-escala tm sido aplicadas para identificar interaces entre protenas e complexos, com o objectivo de elucidar as redes complexas das interaces proteicas que regulam o comportamento celular.

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Captulo 4 Fundamentos da Biologia Molecular


Hereditariedade, Genes e DNA
A propriedade mais fundamental de todos os seres vivos a sua capacidade para se reproduzirem. Todos os organismos herdam a informao gentica, que especifica a sua estrutura e funo, dos seus pais. Todas as clulas derivam de clulas preexistentes, por isso o material gentico tem que ser replicado e passado das clulas pais para a descendncia a cada diviso gentica.

Genes e Cromossomas
Cada caracterstica de um ser determinada por um par de factores herdados, que se chamam genes. Uma cpia de um gene (alelo) que especifica uma caracterstica herdada de cada progenitor. Quando mais de que um alelo diferente est presente num ser, aquele que se manifesta dito alelo dominante, e o outro recessivo. O gentipo a composio gentica de um organismo, enquanto o fentipo so as caractersticas observveis, que resultam da expresso dos genes de um organismo. Os genes so transportados pelos cromossomas, sendo que a maioria dos animais e plantas apresentam duas cpias de cada cromossoma: so diplides. Durante a formao das clulas da linha germinativa, d-se a meiose (tipo de diviso celular), na qual apenas um cromossoma do par de cromossomas transmitido descendncia. Assim, o ocito e o espermatozide so haplides, contendo apenas uma cpia de cada cromossoma. A unio destas duas clulas haplides durante a fecundao cria um novo ser diplide, contendo agora cada par de cromossomas, derivado um do pai e outro da me. O comportamento dos pares de cromossomas semelhante ao dos genes, levando concluso que os genes so transportados pelos cromossomas.

Genes e Enzimas
Um gene especifica a sequncia de aa de uma cadeia polipeptdica.

Identificao de DNA como o Material Gentico


Os cromossomas so compostos por DNA e protenas. A experincia que ditou inicialmente que o DNA seria o material gentico e no as protenas deriva de estudos com a bactria que causa a pneumonia, pneumococcus. A estirpe patognica do pneumococcus envolvida por uma cpsula de polissacridos que protege as bactrias de um ataque por parte do sistema imunitrio do hospedeiro. A estirpe encapsulada a estirpe S (smooth) e a estirpe mutante que perdeu a capacidade de gerar a cpsula a estirpe R (rough), que no tendo cpsula, no patognica quando inoculada em ratos. Experimentalmente verificou-se que, ratos inoculados com bactrias R mais bactrias S mortas por calor desenvolviam pneumonia e morriam. Quando extradas bactrias dos ratos mortos, verificavam-se que estas eram da estirpe S. Denotou-se que extractos de bactrias S eram tambm capazes de converter a bactria R para uma bactria S. Assim, uma substncia no extracto da bactria S eram responsvel pela induo da transformao gentica de uma bactria R (no patognica) para uma S (patognica).

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Transferncia da informao gentica pelo DNA

Outra experincias vieram demonstrar que era o DNA, e no protenas o material gentico. Foi provada que a actividade do extracto transformador (como no caso dos pneumococcus) era abolida quando se procedia a digesto enzimtica de DNA e no de protenas. Foi tambm demonstrado que quando um vrus (bacterifago) infecta uma clula, necessrio que o DNA viral entre na bactria, e no o protena viral, de forma a que o vrus se replique. Alm disto, o DNA viral que se transmite s partculas virais descendentes.

Estrutura do DNA
A molcula de DNA uma hlice que d uma volta a cada 3,4 nm, sendo que a cada volta existem 10 bases. Esta dupla hlice possui um backbone (coluna) de acar e fosfato do lado de fora, contendo na poro interna bases, orientadas para formarem pontes de hidrognio entre as purinas e as pirimidinas de cadeias opostas. Para justificar que A emparelha com T e G com C, esto os resultados de experincias que demonstram que a quantidade de adenina sempre igual de timina, e que a quantidade de guanina sempre igual de citosina. Assim, devido a esta complementaridade de bases, as duas cadeias de DNA so complementares. Logo, cada cadeia contm a informao necessria para especificar a sequncia das bases da outra.

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A estrutura do DNA

Replicao do DNA
As duas cadeias de DNA podem-se separar e servir como moldes para a sntese de novas cadeias complementares, cuja sequncia seria ditada pelo emparelhamento especfico de bases complementares. Este processo denomina-se replicao semiconservativa, pois cada cadeia de DNA pai conservada, constituindo metade da nova cadeia sintetizada (apenas metade da dupla hlice sintetizada, sendo a outra herdada).

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Replicao semi-conservativa do DNA

A experincia por detrs da teoria da replicao semiconservativa foi realizada marcando o DNA com istopos de diferentes densidades. E.coli foram cultivadas durante vrias geraes num meio contendo o istopo de azoto pesado (15N) no lugar do istopo normal de azoto leve (14N). O DNA destas bactrias continha, consequentemente, 15N e era mais pesado que o das bactrias cultivadas num meio com 14N. Depois as bactrias seriam transportadas de volta para o meio contendo 14N e cresceriam durante apenas uma gerao adicional. O DNA extrado destas bactrias e analisado por ultracentrifugao numa soluo com CsCl formaria bandas segundo as densidades das molculas de DNA. O DNA da bactria transferida do meio com 15N para o meio com 14N durante uma gerao gerava bandas com uma densidade intermdia entre a densidade do DNA de 15N e o DNA de 14N, indicando que esta densidade representa uma molcula hbrida com uma cadeia leve e outra pesada.

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A capacidade do DNA servir como molde da sua prpria replicao foi demonstrada pois, a DNA polimerase (enzima da E.coli) consegue catalisar a replicao de DNA in vitro, apenas na presena de um molde de DNA, ao incorporar directamente os nucletidos numa molcula de DNA complementar.

Demonstrao experimental da replicao semi-conservativa

Expresso da Informao Gentica


Os genes determinam a estrutura das protenas, que so responsveis por direccionar o metabolismo celular, funcionando como enzimas. As protenas so polmeros de 20 aa diferentes, cuja sequncia determina a sua funo e estrutura.

Colinearidade de Genes e Protenas


A ordem dos nucletidos no DNA especifica a ordem dos aa numa protena. Mutaes num gene correspondem a alteraes no DNA, que podem resultar na adio ou deleco de nucletidos, que poderiam levam alterao da sequncia de aa da protena codificada pelo gene em questo.

O papel do mRNA
Apesar da sequncia de nucletidos no DNA especificar a ordem dos aa nas protenas, no o prprio DNA que intervm directamente na sntese proteica. Como nos eucariontes, o DNA se encontra no ncleo e a sntese proteica se d no citosol, ter que existir outra molcula que transporte a informao gentica para os locais de sntese (ribossomas). Assim, o mRNA o intermedirio da sntese proteica, sendo sintetizado a partir de um molde de DNA.

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O RNA difere do DNA, pois: constitudo por uma cadeia simples (o DNA uma cadeia dupla); o seu componente glicdico a ribose e no a desoxirribose (no carbono 2 de uma ribose liga-se o grupo OH (hidroxilo) e de uma desoxirribose um H); e a sua base pirimidnica Uracilo (U) substitu a Timina (T) do DNA. Como o RNA se localiza principalmente no citoplasma, aparece como sendo o intermedirio lgico da passagem de informao do DNA para os ribossomas. Com estes dados surgiu o dogma central: DNA RNA Protenas. As molculas de RNA so sintetizadas a partir de um molde de DNA (transcrio) e as protenas so sintetizadas de moldes de RNA (traduo). As molculas de RNA que servem como moldes para a sntese proteica chamam-se de mRNAs: RNAs mensageiros. So transcritos pela enzima RNA polimerase, que catalisa a sntese de RNA a partir de um molde de DNA. Existem mais 2 tipos de RNA importantes para a sntese proteica: RNA ribossomal (rRNA) que um componente dos ribossomas e o RNA de transferncia (tRNA) que serve como molcula adaptadora dos aminocidos ao longo do mRNA.

Cdigo Gentico
Devido no complementaridade entre os aminocidos e o mRNA, existem tRNAs que servem de adaptadores durante a traduo. Cada aminocido diferente ligado, por uma enzima especfica, ao tRNA apropriado. O emparelhamento entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminocido que lhe est ligado para o local correcto do molde de mRNA. A partir de sequncias das quatro bases nucleotdicas do DNA - adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) - possvel formar exactamente 64 palavras cdigo de trs letras diferentes, tripletos ou codes, pois 43=64. Estes tripletos so a unidade da mensagem gentica que vai codificar a ordenao de sries de aminocidos que caracterizam diversas protenas. Das 64 palavras possveis, 3 so sinais de paragem (codes STOP), indicando se chegou ao fim do cdigo de uma protena. Os restantes tripletos codificam os 20 aminocidos, por isso mais que um tripleto pode codificar o mesmo aminocido (degenerescncia do cdigo gentico). A leitura dos nucletidos comea num local fixo, gerando um quadro de leitura (reading frame), que o conjunto sucessivo de 3 bases que 26

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forma codes sucessivos. Uma alterao no quadro de leitura (frameshift) causa a mudana da sequncia de codes, de uma mesma cadeia de DNA. No caso de mutaes por adio ou remoo de 1 ou 2 nucletidos, esta causa uma mudana no quadro de leitura, fazendo com que todos os aa subsequentes sejam alterados. Adies ou remoes de 3 nucletidos alteram apenas um aa, sendo que o quadro de leitura do resto do gene se mantm normal. O cdigo gentico tem caractersticas muito importantes: Universalidade, que postula uma linguagem comum a praticamente todas as clulas. As excepes existem em certos protozorios e no DNA mitocondrial. Redundncia ou degenerescncia do cdigo gentico, o resultado da existncia de 61 codes a indicar a sntese de protenas, e apenas existirem 20 aa diferentes. Assim, vrios codes codificam o mesmo aa. No ambiguidade, o mesmo codo no codifica aa diferentes. Pouca especificidade do 3 codo, vrios codes que sintetizam o mesmo aa tm o 3 codo igual, pelo que o 3 codo menos especfico, e o 1 o mais especfico. O tripleto AUG tem duas funes, codificando a metionina e representando o codo de iniciao da traduo (sntese proteica). Os tripletos UAA, UAG e UGA so codes de finalizao, no codificando aa, e sinalizando o fim da sntese proteica.

Vrus de RNA e Transcrio Reversa


Certos vrus contm RNA em vez de DNA, como material gentico. Apesar de alguns replicarem directamente o seu RNA atravs do RNA original, este mecanismo no era utilizado por certos vrus animais (vrus de RNA tumorais), que eram capazes de causar cancro s clulas animais infectadas. Apesar de conterem RNA como material gentico, a sua replicao exige a sntese de DNA, o DNA provrus, a partir de um molde de DNA. Esta capacidade de sintetizar DNA a partir de um molde de RNA denomina-se transcrio reversa, e parte da actividade da enzima transcriptase reversa. A transcriptase reversa tambm existe noutras clulas, permitindo a transposio de uma sequncia de DNA de uma cromossoma para outro, e o estudo do mRNA de clulas, permitindo o estudo das transcries que nelas ocorrem.

DNA recombinante
At dcada de 1970 parecia impossvel o isolamento e manipulao de genes. Este obstculo foi superado pelo desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, que possibilitou aos cientistas isolar, sequenciar e manipular genes individuais.

Enzimas de restrio
O primeiro passo no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante foi a caracterizao de enzimas de restrio, que clivam o DNA em sequncias especficas. So o bisturi que
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permite cortar o DNA, fazendo parte do grupo das nucleases, enzimas responsveis por clivar as ligaes fosfodister entre nucletidos adjacentes. Estas enzimas foram identificadas em bactrias, onde servem como mtodo de defesa contra a entrada de DNA estranho (provindo de vrus, etc) na clula. As enzimas de restrio reconhecem de 4 a 8 pb, sendo estas sequncias especficas, que originam fragmentos de DNA. Porque que o DNA da bactria no digerido pelas suas prprias endonucleases (enzimas de restrio)? As enzimas de restrio no funcionam sozinhas numa bactria, trabalhando em conjunto com enzimas que modificam o DNA bacteriano, tornando-o irreconhecvel pelas endonucleases. Este sistema permite que apenas DNA estranho-no modificado seja digerido por endonucleases. Os fragmentos gerados pela clivagem de uma endonuclease podem ser separados, identificados e purificados numa electroforese de DNA em gel, consoante o comportamento dos fragmentos de DNA num campo elctrico. O gel pode ser de agarose ou poliacrilamida, sendo fundido na presena de um tampo. A soluo deitada num molde e deixada solidificar, formando uma matriz cuja densidade depende da agarose. Ao ser aplicado um campo elctrico atravs do gel, o DNA carregado negativamente (grupos fosfato) migra em direco ao nodo, o elctrodo positivo. A velocidade de migrao depende: tamanho da molcula, concentrao de agarose, intensidade do campo elctrico. O gel funciona como um filtro, retardando o movimento das molculas maiores. Para a separao de molculas leves, usa-se um gel com maior concentrao de agarose. Para se visualizar o gel de agarose utiliza-se o corante brometo de etdio, que possui grupos qumicos que se intercalam com as bases do DNA, sendo que o corante ligado ao DNA fluoresce com mais intensidade que o corante livre, quando irradiado com UV. rea do gel perpendicular ao poo denomina-se pista. Os fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distncia gerando bandas. Os locais de restrio para diferentes endonucleases de restrio gera mapas de restrio de molculas de DNA.

Formao de molculas de DNA recombinante


A estratgia bsica de clonagem molecular a insero de um fragmento de DNA de interesse (ex: segmento de DNA humano) numa molcula de DNA (vector) que seja capaz de se replicar numa clula hospedeira. O resultado uma molcula recombinante ou clone molecular, composto pelo pedao de DNA de interesse ligado ao DNA do vector. A replicao apropriada da molcula recombinante no hospedeiro permite obter grandes quantidades do DNA de interesse. O plasmdeo um exemplo de um vector, sendo uma molcula de DNA circular que se replica de forma independente, sem estar associada a DNA cromossomal numa bactria. Plasmdeos recombinantes transportando o DNA de interesse podem ser introduzidos em E.coli, onde se podem replicar, gerando milhes de cpias do DNA plasmdeo. O DNA destes plasmdeos pode ento ser isolado, constituindo uma fonte enorme de molculas recombinantes que contm um fragmento de DNA humano clonado. O fragmento pode isolado do resto do vector atravs de enzimas de restrio, permitindo a anlise e manipulao de um fragmento de DNA humano puro.

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Juno de molculas de DNA

Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Snia

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Os fragmentos de DNA gerados para criar molculas recombinantes so normalmente digeridos por enzimas de restrio. Estas clivam nos locais de restrio deixando extremidades com cadeias simples soltas, que se podem associar umas com as outras por complementaridade de bases, sendo que as ligaes entre nucletidos adjacentes so catalisadas por DNA ligases. Assim, dois fragmentos de DNA digeridos pela mesma endonuclease pode ser ligados criando uma molcula de DNA recombinante. Em certos casos, podem-se sintetizar DNA linkers (oligonucletidos, que contm os locais de restrio), e adicion-los s extremidades do DNA de interesse, e posteriormente inseri-lo no vector.

Vectores de DNA recombinante


Os vectores so molculas de DNA que tm como funo transportar o DNA de interesse para a clula hospedeira. As caractersticas mais importantes de um vector de clonagem so: Origem de replicao (ORI), que permite que o vector (molcula de DNA recombinante), se mantenha na clula e seja transmitida descendncia, ao permitir a sua replicao. Marca de seleco - a maioria dos vectores possui um gene que confere resistncia a um antibitico. Assim, apenas as bactrias que possuem o DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presena desse antibitico. Local de policlonagem (MCS): pequena sequncia de DNA que contm locais de corte nicos para vrias enzimas de restrio. neste local que introduzido o fragmento de DNA que se pretende clonar. Promotor: presente apenas em vectores de expresso (sintetizam protenas recombinantes) e localizado a montante (antes) do local de policlonagem. A maquinaria de transcrio gentica identifica a sequncia do promotor e transcreve a partir desse local.

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Clonagem atravs de vectores plasmdicos

Sequenciao de DNA
A sequenciao uma tcnica que permite: inferir a sequncia de aa sintetizados por um gene especfico, ao sabermos a sequncia de nucletidos desse gene; estudar as propriedades de sequencias de DNA que regulam a expresso do gene. Processo de sequenciao 1. Desnaturao do DNA a sequenciar 2. Incubao do DNA com um primer (sequncia de DNA complementar essencial para comear a replicao do DNA), na presena de DNA polimerase e dos quatro desoxinucletidos (dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais radioactivo.

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3. O produto desta reaco depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais se junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP), que so nucletidos modificados, desprovidos de grupo hidroxilo no carbono 3, e, portanto, impedem o alongamento das cadeias de DNA em que so incorporados. 4. Como em cada tubo existem milhes de molculas de DNA, originam-se fragmentos de diversos tamanhos consoante a posio de cada nucletido na sequncia original. 5. O DNA de cada tubo desnaturado e colocado num gel de acrilamida com ureia (para evitar a renaturao do DNA durante a electroforese). 6. No final, o gel seco e autoradiografado. 7. Os nucletidos radioactivos incorporados do origem a uma srie de bandas que indicam o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos em cada tubo de reaco. 8. Ao contrrio dos gis de agarose, os gis de acrilamida permitem resolver molculas de DNA cujo comprimento difere apenas num nucletido. 9. Como a sntese de DNA ocorre de 5 para 3, os fragmentos menores resultam de uma incorporao do dNTP mais prxima da extremidade 5.

10. Em consequncia, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequncia de nucletidos da cadeia 5-3. Para iniciar a reaco de sequenciao necessrio um primer, logo o DNA desconhecido tem de ser enquadrado numa sequncia conhecida, para a qual o primer ser complementar.

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Sequnciao de DNA automtica

A sequenciao automtica permite acelerar e mecanizar a maior parte do processo de anlise dos resultados. Os diferentes produtos de reaco (G; A; T; C) tm incorporados nucletidos fluorescentes em vez de nucletidos radioactivos, cada um deles com uma cor diferente, num total de 4 cores. A leitura do sinal fluorescente feita por um scanner apropriado que, estando acoplado ao aparelho de electroforese, faz a leitura directamente do gel enquanto a electroforese decorre. A leitura feita em simultneo com a migrao dos fragmentos atravs do gel: sempre que no local do scanner passa uma banda que fluoresce numa cor representado um pico no grfico dos resultados e o software atribui-lhe a letra correspondente cor detectada.

Expresso de genes clonados


Muitas protenas de interesse esto presentes nas clulas apenas em pequenas quantidades, no podendo ser purificadas por mtodos convencionais. Assim, a criao de vectores de expresso (permitem a sntese de protenas), veio colmatar esta dificuldade. O cDNA de interesse clonado num vector de expresso que contm as sequncias de expresso que permiter a transcrio de traduo do gene de interesse em clulas bacterianas. Por vezes o vector inserido em eucariontes, de forma a assegurar uma correcta maturao proteica, uma vez que os procariontes no tm os organelos necessrios (RE e Golgi).

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Deteco de cidos Nucleicos e Protenas


Amplificao de DNA por PCR
A clonagem molecular de DNA permite o isolamento de grandes quantidades do DNA de interesse, sendo contudo necessria a existncia de seres onde inserir os vectores para que estes sejam clonados. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction) apresenta-se como um mtodo alternativo de amplificao de DNA, permitindo obter grandes quantidades de uma molcula de DNA de sequncia definida. apenas necessrio o conhecimento das sequncias que ladeiam o fragmento a amplificar. Para uma reaco PCR so necessrios os seguintes componentes: DNA molde; primers (ligamse s extremidades que se pretendem ladear e permitem a adio de nucletidos por parte da polimerase); DNA polimerase (taq polimerase, termoestvel, polimeriza de 53); nucletidos dNTP; tampo de reaco; termocycler, que assegura ciclos rpidos de aquecimento e arrefecimento. Processo de amplificao a regio de DNA a amplificar flanqueada por 2 primers que permitem a sntese de DNA. A cadeia dupla inicial aquecida e separada. Depois as duas cadeias simples so arrefecidas, permitindo a sua hibridao com os primers, que se ligam a cada cadeia de DNA. A taq polimerase usada para sintetizar as novas cadeias de DNA partindo dos primers, resultado na formao de 2 molculas de DNA, ao partir de uma original. Este processo pode ser repetido por inmeros ciclos, resultando numa amplificao de DNA na ordem de 2n. A nica molcula de DNA de uma mistura que ser amplificada aquela que complementar aos primers adicionados ao sistema, sendo que o PCR uma forma selectiva de amplificao.

Hibridao de cidos nucleicos


A chave para detectar sequncias especificas de cidos nucleicos o emparelhamento de bases complementares de cadeias de DNA e RNA. A altas temperaturas as cadeias complementares de DNA separam-se (desnaturam-se) originando cadeias simples de DNA, que se forem incubadas nas condies ideais, renaturam pela complementaridade de bases hibridao de cidos nucleicos. Podem-se formar hbridos com 2 cadeias de DNA, 2 de RNA ou uma de cada. A hibridao de cidos nucleicos permite detectar sequncias de DNA ou RNA complementares de um cido nucleico isolado, como um genoma viral ou sequncia de DNA clonado. O DNA clonado marcado radioactivamente ou por fluorescncia, sendo sintetizado na presena de

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nucletidos radioactivos ou fluorescentes. DNA radioactivo usado como sonda para hibridao com sequncias complementares de DNA e RNA, detectados devido radioactividade dos hbridos resultantes de 2 cadeias. O Southern Blotting permite a anlise de fragmentos genticos de grandes dimenses e no exige o conhecimento prvio da sequncia de nucletidos da regio de interesse. A tcnica envolve: 1. Separao de DNA por electroforese em gel de agarose; 2. Transferncia das molculas separadas para um suporte slido (membrana ou filtro de nitrocelulose) e hibridao com uma sonda marcada (radioactivamente ou por fluorescncia); 3. Deteco do sinal da sonda (por autoradiografia ou UV). Devido s grandes dimenses do DNA genmico, para que se possa proceder sua separao, necessrio trat-lo com uma enzima de restrio. Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsvel, dando origem a milhares de fragmentos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos, produzindo um aspecto tpico de mancha arrastada (smear) aps a electroforese. As dimenses dos fragmentos genmicos formados vo ser caractersticos de cada indivduo, j que so consequncia da existncia de um local de restrio da enzima usada em determinada posio do genoma e, portanto, reflectem a sequncia do genoma.

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Southern blotting

Aplicaes da Southern blotting: Estudo de variaes polimrficas da sequncia do genoma: STRs short tandem repeats; VNTRs - variable number of tandem repeats; SNPs - single nucleotide polymorphisms As mutaes podem causar diferenas no tamanho dos fragmentos de restrio observados numa populao (RFLPs - restriction fragment length polymorfisms): por destruio ou criao de locais de restrio; por aumento ou reduo do nmero de nucletidos situado entre dois locais de restrio (so diferenas de dimenso facilmente detectveis por esta tcnica).

O Northern Blotting permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA , e como o RNA j fragmentado o passo da digesto com enzimas no necessrio. Esta tcnica d-nos a informao da expresso de um gene.

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A Hibridao in situ (FISH) de cidos nucleicos pode ser usada para detectar sequncias de DNA ou RNA homlogas em cromossomas ou clulas intactas , sendo os resultados analisados por examinao microscpica de fluorescncia. Esta tcnica pode ser utilizada para detectar o locus do gene no cromossoma, e mRNAs especficos em clulas do mesmo tecido.

Anticorpos como sondas para protenas


Os anticorpos reagem selectivamente com protenas nicas, sendo protenas produzidas pelo sistema imunitrio (linfcitos B) que reagem contra molculas (antignios) presentes em substncias estranhas, identificando-as. O sistema imunitrio produz milhes de anticorpos que identificam antignios especficos, que podem ser protenas, hidratos de carbono, etc. Um linfcito apenas produz um tipo de antignio. Os anticorpos podem ser produzidos pela inoculao de um animal com qualquer protena estranha. Os anticorpos podem ser criados contra protenas purificadas de clulas, tal como outros materiais que podem ser utilizados para imunizao. Os anticorpos podem tambm servir para reconhecer protenas recombinantes. Existem anticorpos que reconhecem pptidos de 10 a 15 aminocidos, por isso, conhecendo apenas o inicio do gene que se pretende clonar, possvel produzir anticorpos que reagem contra a protena inteira. No Western Blotting ou Imunoblot as protenas extradas das clulas so separadas por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS, devido aos diferentes tamanhos e carga elctrica. As protenas so colocadas numa soluo de SDS, um detergente carregado negativamente que se liga s protenas desnaturando-as (passam a ter uma estrutura linear), ficando tambm carregadas negativamente. Passam depois para um filtro que permite a reaco com os anticorpos contra a protena de interesse.

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Western blotting

Na Imunoprecipitao as clulas so incubadas com aminocidos radioactivos que vo marcar as suas protenas. Os extractos celulares marcados so incubados com anticorpos que se ligam com o seu antignio-alvo. Os complexos anticorpo-antignio obtidos so isolados e sujeitos a electroforese permitindo a deteco dos antignios radioactivos por autoradiografia.

Imunoprecipitao

Funo de Genes em Eucaritas


O estudo da funo dos genes requer a sua anlise em clulas ou seres intactos, e no simplesmente de clones moleculares em bactrias. possvel investigar a funo de um gene clonado atravs da sua reintroduo em clulas eucaritas. Esta abordagem acoplada capacidade de gerar mutaes in vitro, permitiu o uso de DNA recombinante no estudo funcional de genes dos eucariontes mais complexos.

Transferncia Gentica em Plantas e Animais


A funo de genes pode ser estudada em seres mais complexos atravs da introduo de um DNA clonado em clulas animais mtodo de transferncia gentica. A metodologia de introduo de DNA em clulas animais foi inicialmente desenvolvida para DNAs virais, chamando-se transfeco (transformao+infeco). O DNA pode ser introduzido em clulas animais por diversos mtodos: microinjeco no ncleo celular; coprecipitao de DNA com fosfato de clcio, formando pequenas partculas que so absorvidas pelas clulas; incorporao de DNA em vesculas lipdicas (lipossomas), que se fundem com a membrana plasmtica, e a exposio temporria de clulas a um pulso elctrico que cria poros (electroporao). Grande parte do DNA aborvido pelas clulas transportado pelo ncleo onde pode ser transcrito vrios dias (expresso passageira). Numa pequena poro de clulas, o DNA completamente integrado no genoma e transferido para clulas da descendncia. Se

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o vector possuir um marcador de seleco, pode-se escolher as clulas correctamente transformadas, cultivando-as num meio que inibe o crescimento de clulas normais.

Introduo de DNA em clulas animais

Os retrovrus podem tambm ser usados como vectores para a insero de um gene de interesse numa clula animal. Eles so particularmente teis, uma vez que o seu ciclo de vida envolve a integrao estvel do DNA viral no genoma da clula infectada.

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Vectores retrovirais

Genes clonados podem tambm ser introduzidos na linha germinativa de seres multicelulares, permitindo o seu estudo no contexto de um animal intacto, em vez de apenas clulas em cultura. Um mtodo utilizado para gerar ratos que transportam o gene de interesse (ratos transgnicos) a microinjeco directa de DNA clonado no proncleo de um ovo fertilizado. Os ovos injectados so ento transferidos para mes de aluguer, e desenvolvem-se. Uma fraco da descendncia ter integrado o DNA de interesse no seu genoma, sendo que este est presente em todas as clulas do animal. Como o DNa est presente tanto nas somticas,
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como nas clulas da linha germinativa, o DNA de interesse transferido cruzando a descendncia.

Produo de ratos transgnicos

As propriedades de clulas estaminais embrionrias (ES) providenciam um meio alternativo para a introduo de genes clonados em ratos. As clulas ES podem ser cultivadas a partir de embries de ratos precoces, podendo depois ser reintroduzidos na me e desenvolver um novo ser. por isso tambm possvel introduzir o DNA clonado em clulas ES em cultura, seleccionar as clulas transformadas de forma estvel, e introduzi-las de volta num embrio de rato. Estes embries originam uma descendncia quimrica, na qual algumas clulas derivam das clulas embrionrias normais, e outras das clulas ES transformadas. Em alguns ratos, as clulas ES so incorporadas na linha germinativa, e o cruzamento destes ratos com outros permite que a descendncia herde o gene de interesse.

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Introduo de genes em ratos via clulas estaminais embrionrias

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Mutagnese de DNAs clonados


Em estudos, os genes mutantes so detectados pois resultam em alteraes fenotpicas observveis. Contudo, agora j possvel a introduo de qualquer modificao desejvel num gene clonado, e determinar o efeito da mutao na funo do gene. A capacidade de introduzir mutaes especficas em DNAs clonados (mutagnese) uma ferramente para o estudo da expresso e funo de genes eucaritas. Genes podem ser alterados por procedimentos de mutagnese in vitro, que levam introduo de deleces, inseres, e alteraes de nucletidos. Um dos mtodos consiste na utilizao de um oligonucletido sinttico (que carrega a mutao desejada) como primer para a sntese de DNA. As cadeias de DNA sintetizadas a partir deste primer passaro a conter a mutao, e podem ser estudadas: aa especficos de uma protena podem ser alterados para caracterizar o seu papel na funo da protena.

Introduo de Mutaes em genes celulares


Geralmente as clulas usadas como receptoras dos genes clonados tm cpias normais desse gene, nos seus DNAs cromossomais, e estes genes normais continuam a desempenhar as suas funes na clula. Determinar a funo biolgica de um gene requer a eliminao da actividade celular dos genes normais. Mutao de genes cromossomais baseia-se na habilidade de um gene introduzido numa clula sofrer recombinao homloga com a sua cpia cromossomal. Na recombinao homloga, o gene clonado substitui o alelo normal, e por isso, as mutaes introduzidas no gene clonado in vitro so incorporadas na cpia cromossomal do gene.

Interferindo com a Expresso Gentica Celular


Um mtodo utilizado para inibir a expresso de um gene de interesse a introduo de cidos nucleicos antisense, que so cadeias de RNA ou DNA (de cadeia simples), complementares com o mRNA do gene de interesse, que hibridam com o mRNA e bloqueiam a sua traduo. Os RNAs de interferncia (iRNAs) so molculas de RNA de cadeia dupla, que so clivadas pela enzima DIcer em RNAs de interferncia curtos (siRNAs). Estes siRNAs associam-se a complexos (RISC) e so desdobrados em cadeias simples, que ao se hibridarem com o mRNA complementar, induz a sua clivagem por parte do complexo, que depois fica livre para clivar outros mRNAs. A inibio directa da funo proteica pode ser conseguida pela: microinjeco de anticorpos que se ligam s protenas dentro das clulas, inibindo a sua normal funo; adio de protenas mutantes que interferem com a funo das protenas normais, podendo competir com elas por molculas alvo.

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Captulo 5 Organizao e Sequncias dos Genomas Celulares


A Complexidade dos Genomas Eucariotas
O Genoma Eucaritico muito maior e mais complexo que o procaritico. Contudo o tamanho do genoma de muitos eucaritas no est directamente relacionado com o grau de complexidade gentica destes seres. Isto ocorre pois o genoma eucarita contm no s genes funcionais, mas tambm grande quantidade de DNA que no codifica protenas. Assim, da totalidade do genoma humano (6x10 bp) s cerca de 1,5% que contribuem para a codificao de protenas
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Intres e Exes
Em termos moleculares, gene um segmento de DNA que expresso num produto funcional (RNA ou protena). Muito do DNA eucaritico consiste em sequncias entre genes (spacer sequences). Mas dentro do prprio gene tambm podem existir: Exes (sequncias codificantes) e Intres (sequncias no codificantes). O gene totalmente transcrito a RNA que posteriormente sofre splicing (processamento) - remoo dos intres, ficando apenas os exes de modo a formar um mRNA maduro.

A estrutura dos genes eucaritas

A quantidade de DNA em intres muito maior que em exes, sendo que na maioria dos genes humanos a percentagem de intres de aproximadamente 90% do material gentico. Os intres esto presentes na maioria dos genes eucariticos, excepto nalguns seres mais simples (leveduras) e em alguns procaritas. Todavia, intres aparecem em genes raros de alguns procaritas. Logo, a presena ou ausncia de intres no permite uma distino absoluta entre genes procaritas e eucaritas (apesar de prevalecerem principalmente em eucaritas mais complexos). Pensa-se que os intres representam sequncias que foram importantes no inicio da evoluo, ou que a facilitaram, permitindo a recombinao de exes de alguns genes. O desaparecimento de intres em alguns procaritas deve-se seleco natural por rpida 45

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replicao (genoma sem intres menor e replica-se mais rapidamente), que no foi to relevante para os eucaritas, que assim mantiveram os seus intres. Os intres tm um papel no controlo da expresso gentica: a presena de intres permite que os exes de um gene sejam combinados de formas diferentes, resultando na sntese de diferentes protenas. Este processo denomina-se splicing alternativo, e responsvel por estender o reportrio funcional de 20 a 25 mil genes do genoma humano (por isso que so sintetizados mais tipos diferentes de protenas que o nmero de genes diferentes existente). Os intres podem tambm ter ajudado a evoluo, facilitando a recombinao entre exes de diferentes genes exon shuffling. Isto suportado pelo facto de alguns genes serem quimeras de exes derivados de vrios outros genes.

Sequncias de DNA Repetitivas


Os intres contribuem muito para o grande tamanho dos genomas eucaritas, constituindo aproximadamente 20% do genoma humano. Porm, uma poro ainda maior do genoma de eucaritas complexos consiste um sequncias de DNA no codificantes altamente repetidas. A sua existncia foi demonstrada durante estudos dos rcios de reassociao de fragmentos de DNA celular desnaturados. As cadeias de DNA desnaturado hibridam umas com as outras (reassociam-se), voltando a formar molculas de cadeia dupla. Como a reassociao de DNA uma reaco bimolecular (duas cadeias separadas de DNA desnaturado devem colidir para hibridarem), o rcio de reassociao depende da concentrao das cadeias de DNA. Quando fragmentos do DNA de E.coli eram desnaturados e hibridados, seria esperado que todos hibridassem ao mesmo ritmo, no caso de cada sequncia (fragmento) surgir uma vez apenas no genoma. Contudo, estudos demonstraram que, aproximadamente 50% dos fragmentos de DNA reassociavam ao ritmo esperado (caso cada sequncia estivesse presente apenas uma vez no genoma), mas os restantes fragmentos reassociavam muito mais rapidamente que o esperado. Isto acontece pois algumas sequncias estavam presentes no genoma um umltiplas cpias e, consequentemente, reassociavam-se mais rapidamente que as sequncias que ocorriam apenas uma vez no genoma. Descobriu-se que aproximadamente 50% do DNA dos mamferos composto por sequncias altamente repetitivas.

Tipos de sequncias repetitivas


Repeties de sequncias simples so mltiplas cpias de pequena sequncias de DNA, que podem ser separadas do resto do genoma por uma centrifugao de equilbrio em gradiente de densidade de CsCl. As sequncias ricas em A=T so menos densas que as ricas em GC. As sequncias repetitivas aparecem como bandas afastadas da banda principal de DNA, denominando-se de DNAs satlite. Estas sequncias no so transcritas, nem contm informao gentica, podendo desempenhas um papel importante na estrutura dos cromossomas. SINEs e LINEs so respectivamente elementos curtos dispersos e elementos longos dispersos, que fazem parte do conjunto de elementos repetitivos de DNA dispersos, que contribuem para aproximadamente 45% do tamanho do genoma. Alguns SINEs e LINEs so transcritos e at codificam protenas, mas no tm funo fisiolgica a nvel celular. Ambos so exemplos de
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elementos do tipo transposo, mais especificamente retrotransposes (captulo 6), o que significa que a sua transposio mediada pela transcriptase reversa. Uma terceira classe de elementos dispersos so os elementos tipo-retrovrus (8% do DNA humano), que tambm se movem no DNA como retrotransposes. Uma quarta classe de elementos dispersos, os Transposes de DNA (3% do DNA humano), movem-se ao longo do genoma, sendo copiados e reinseridos como sequncias de DNA, em vez de se moverem por meio da transcrio reversa. Assim, praticamente metade do genoma humano consiste em elementos repetitivos dispersos, que se replicaram e moveram ao longo do genoma, por meio de intermedirios de DNA ou RNA. Assim, 40% do genoma humano deve-se transcrio reversa. Algumas destas sequncias ajudam a regular a expresso genica, mas a maioria parece no ter contribuio para a clula, representando selfish DNA elements, que foram seleccionados, pela sua capacidade de se replicarem no genoma do hospedeiro, mais do que por lhe conferirem uma vantagem selectiva.

Duplicao de Genes e Pseudogenes


Outro factor que contribui para o tamanho do genoma de eucaritas que muitos genes esto presentes em mltiplas cpias, algumas das quais no so funcionais. Nalguns casos, cpias mltiplas de genes so necessrias para produzir RNAs ou protenas em grandes quantidades (rRNAs e histonas). Noutros casos, membros distintos de um grupo de genes relacionados (famlia de genes) podem ser transcritos em tecidos diferentes ou em diferentes fases do desenvolvimento. As famlias de genes surgiram possivelmente pela duplicao de um gene ancestral original, com os diferentes membros da famlia a divergirem como consequncia de mutaes durante a evoluo, e esta divergncia levou evoluo de protenas relacionadas que so optimizadas para funcionarem em diferentes tecidos ou fazes do desenvolvimento. Contudo, nem todas as mutaes aumentam a funcionalidade de um gene, e algumas cpias de genes podem ter sofrido mutaes que resultaram na perda da sua capacidade de gerar um produto funcional. Estes genes no funcionais, os pseudogenes, so relquias da evoluo que aumentam o tamanho dos genoma eucariticos. As duplicaes de genes surgem por dois mecanismos: 1. Duplicao de um segmento de DNA Transferncia de um bloco de DNA para uma nova localizao no genoma Representam 5% do genoma 2. Transcrio reversa de um mRNA integrao do cDNA num novo local do genoma gera cpias que no contm intres e no contem as sequncias cromossomais que induzem a transcrio do gene a mRNA. Assim, a duplicao de um gene por transcripo reversa normalmente gera uma cpia inactiva do gene, chamada pseudogene processado (2/3 dos pseudogenes do genoma humano).

Composio dos Genomas de Eucaritas


Genoma da E.coli Contm aproximadamente 4 000 genes, sendo 90% do genoma sequncias que codificam protenas.

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Genoma da levedura S 4% do seu genoma contm intres, sendo 70% do genoma sequncias que codificam um total de 6 000 protenas. Genomas de C.elegans e Drosophila So 10 vezes maiores que o da levedura, mas contm apenas 2 a 3 vezes mais genes, contendo mais intres. Genoma de seres humanos 20 a 30 vezes maiores que o da C.elegans e Drosophila mas contm apenas 20 000 a 25 000 genes. Apenas 1,2% do genoma humano codifica protenas, sendo 20% constitudo por intres, e mais de 60% constitudo por vrios tipos de sequncias repetitivas ou duplicaes de DNA, sendo que o restante corresponde a pseudogenes, e exes que esto presentes nas extremidades 5 e 3 dos mRNAs mas no so traduzidos a protenas. Concluindo, o tamanho aumentado dos genomas de eucaritas superiores deve-se muito mais presena de grandes quantidade de sequncias repetitivas e intres do que ao aumento no nmero de genes.

Cromossomas e Cromatina
O genoma de procaritas contm cromossomas nicos, que so normalmente molculas de DNA circular, enquanto que o genoma de eucaritas composto por vrios cromossomas, contendo cada um uma molcula de DNA linear. O DNA de clulas eucaritas est ligado a pequenas protenas (histonas) que compactam o DNA de forma ordenada no ncleo.

Cromatina
Chama-se cromatina ao complexo formado pelo DNA e as protenas. As protenas mais abundantes so as histonas que contm uma proporo alta de aminocidos bsicos que facilitam a ligao molcula de DNA carregada negativamente. Existem outras protenas para alm das histonas (nonhistone chromossomal proteins) que participam em vrios processos como a replicao de DNA e a expresso gentica.

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A organizo de cromatina em nucleossomas

O nucleossoma a unidade estrutural bsica da cromatina, que consiste em DNA enrolado num ncleo de histonas. O cromatossoma a subunidade da cromatina que consiste numa sequncia de 166 pb enroladas volta do ncleo das histonas. O empacotamento do DNA com as histonas compem uma fibra de cromatina composta por cromatossomas separados por segmentos de DNA ligante (DNA linker).

Estrutura de um cromatossoma

A condensao da cromatina varia durante o ciclo celular: Em Interfase a maior parte da cromatina est relativamente descondensada (eucromatina) e distribuda ao longo do ncleo. Em interfase os genes so expressos e o DNA replicado (preparao para a diviso celular). Os genes que so mais expressos esto num estado mais descondensado para facilitar o acesso da maquinaria de transcrio. Todavia, 10% da cromatina em interfase est altamente condensada (heterocromatina) e estando inactiva para transcrio, contendo tambm muitas sequncias repetitivas. Durante a Mitose os cromossomas esto muito condensados e no podem servir de molde para a sntese de RNA, pelo que a transcrio cessa.

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Centrmeros
O centrmero uma regio especializada do cromossoma que assegura a distribuio correcta dos cromossomas duplicados pelas clulas filhas, durante a mitose. 1. O DNA replicado durante a interfase, resultando na formao de 2 cpias de cada cromossoma; 2. Assim que a clula entra em mitose, a condensao da cromatina leva formao de cromossoma que consistem em 2 cromatdeos idnticos, que esto ligados na regio do centrmero; 3. Os microtbulos do fuso acromtico ligam-se ao centrmero e os 2 cromatdeos separam-se e movem-se para plos opostos. 4. No fim da mitose, a membrana nuclear reposta e os cromossomas descondensam Assim, os centrmeros servem de locais de associao entre os cromatdeos e os microtbulos, consistindo em sequncias especificas de DNA qual protenas (centromere-associated protenas) se ligam, formando uma estrutura especializada: kinetochore ou cinetocoro. a ligao dos microtbulos ao cinetocoro que medeia a juno dos cromossomas ao fuso acromtico. As protenas associadas aos centrmeros actuam como motores moleculares que conduzem o movimento dos cromossomas ao longo das fibras

O centrmero de um cromossoma em metfase

Telmeros
Os telmeros so sequncias no final dos cromossomas eucaritas que so importantes para a replicao e manuteno. Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo
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resduos G numa cadeia. Estas sequncias so repetidas milhares de vezes terminando com uma cadeia simples de DNA. As sequncias repetidas do telmero formam loops no final dos cromossomas aos quais se juntam protenas que protegem a terminao do cromossoma da degradao. Os telmeros so importantes para a replicao do final das molculas de DNA linear. A DNA polimerase capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas no capaz de iniciar a sntese na extremidade 5 de uma cadeia de DNA linear ( nesta extremidade que se liga o primer para a replicao, pelo que a extremidade 5 no replicada). Assim, as extremidades dos cromossomas no podem ser replicados pela aco normal da DNA polimerase. A manuteno dos telmeros parece determinar a capacidade reprodutiva das clulas. Esta manuteno realizada pela Telomerase, que uma protena capaz de produzir telmeros e de os associar molcula que est a ser replicada para continuar a replicao. uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a partir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que complementar s sequncias repetidas que sintetiza os telmeros.

Estrutura de um telmero

Sequncias de Genoma Completos


O Genoma Humano - Experincia
As Experincias Dois grupos de cientistas abordaram a questo de sequenciar o genoma humano de formas diferentes. A equipa liderada por Eric Lander sequenciou fragmentos de DNA a partir de clones BAC (Bacterial Artificial Chromossome), que tinham sido mapeados para cromossomas humanos previamente. Em contraste a equipa de Craig Venter usou um mtodo no qual fragmentos de DNA eram sequenciados ao acaso, e a sobreposio de fragmentos era utilizada para montar o genoma completo. Contudo, ambas as tcnicas apenas cobriam as pores de eucromatina, deixando a heterocromatina por sequenciar. Estas experincias iniciais

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funcionaram como esboos para que com esforos subsequentes se completasse a sequenciao do genoma. O Impacto Descobriu-se que o nmero de genes humanos eram muito pequeno (20 a 25 mil genes), e ao que parece, o splicing alternativo muito comum no genoma humano, pelo que muitos genes codificam mais que uma protena. Alm disso, os intres representam 20 % do genoma humano, e as sequncias repetitivas aproximadamente 60%. de realar ainda que 40% do genoma humano composto por sequncias que derivaram da transcrio reversa.

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Captulo 6 Replicao, Manuteno, e Rearranjos no DNA Genmico


Replicao do DNA
A enzima central envolvida na replicao de DNA a DNA polimerase, que catalisa a juno de desoxiribonuclesidos 5-trifosfato (dNTPs) para formar a cadeia de DNA em crescimento. Mas outras protenas esto tambm envolvidas, bem como mecanismos de proofreading. Protenas e sequncias de DNA especficas so ainda necessrias para iniciar a replicao, como para copiar as extremidades de cromossomas eucaritas.

DNA polimerases
A polimerase I descoberta na E.coli a principal responsvel na reparao de DNA danificado. As clulas eucaritas e procaritas contm DNA polimerase diferentes, que tm funes diferentes, como replicao e reparao. Nos procarionte, a DNA polimerase III a polimerase responsvel pela replicao do DNA. Em eucariontes, existem 3 DNA polimerases (, e ) responsveis pela replicao do DNA. Finalmente, a DNA polimerase est localizada na mitocndria e responsvel pela replicao do DNA mitocondrial. Todas as DNAs polimerase tem 2 caractersticas fundamentais: 1. Todas sintetizam apenas na direco 53, adicionando um dNTP ao grupo hidroxilo do carbono 3 da cadeia em crescimento. 2. Apenas conseguem adicionar dNTPs a uma cadeia primer pr-formada, no so capazes de iniciar a sntese de DNA de novo, ao catalisar a polimerizao de dNTPs livres. As RNA polimerases por outro lado, conseguem iniciar a sntese de uma nova cadeia de RNA na ausncia de um primer. Estas caractersticas das DNA polimerases atribuem um alto grau de fidelidade replicao.

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Reaco catalisada pela DNA polimerase

Forquilha de Replicao
As forquilhas de replicao so regies de sntese de DNA activa. Em cada forquilha, as cadeias pais de DNA separam-se e as duas novas cadeias filhas so sintetizadas. Mas, se as duas cadeias da dupla hlice so antiparalelas (correm em sentidos opostos), a sntese contnua das duas cadeias na forquilha de replicao requereria que uma cadeia fosse sintetizada no sentido 53 e a outra no sentido 35. Mas as DNA polimerases apenas adicionando dNTPs no sentido 53. Como pode ento a outra cadeia ser sintetizada? Estudos demonstram que apenas uma cadeia sintetizada de uma forma contnua na direco global da replicao de DNA, sendo que a outra formada de curtos pedaos de DNA sintetizados no sentido contrrio ao do movimento da forquilha de replicao. Estes pedaos, fragmentos de Okazaki, so juntos pela aco da DNA ligase, formando uma nova cadeia de DNA intacta. A cadeia sintetizada continuamente chamada de leading strand, enquanto que a outra cadeia (dos fragmentos de Okazaki) se denomina lagging strand.

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Sntese da leading e da lagging strads de DNA

Como ento iniciada a sntese dos fragmentos de Okazaki? Pequenos fragmentos de RNA servem como primers para a replicao de DNA. A sntese de RNA pode iniciar-se de novo, atravs da enzima primase, que sintetiza pequenos fragmentos de RNA, complementares lagging strand, na forquilha de replicao. Os fragmentos de Okazaki so depois sintetizados estendendo estes primers de RNA atravs da actividade da DNA polimerase.

Iniciao dos fragmentos Okazaki com primers de RNA

Para se formar uma lagging strand contnua de DNA, os primers de RNA devem ser removidos e substitudos por DNA. Em procariontes a DNA polimerase I encarrega-se de remover os primers de RNA, funcionando tambm como uma exonuclease, que hidrolisa DNA ou RNA em ambas a direces. A aco de exonuclease da DNA polimerase I no sentido 53 remove os ribonucletidos das extremidades 5 dos fragmentos de Okazaki, permitindo que estes sejam substitudos por dNTPs, gerando fragmentos constitudos apenas por DNA. Em eucariontes, os primers de RNA so removidos pela actividade conjunta de RNase H (degrada o RNA de hbridos RNA-DNA) e exonucleases 53. Os espaos so preenchidos pela DNA polimerase e os fragmentos de DNA so ligados pela DNA ligase, gerando uma lagging strand intacta.
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Remoo dos primers de RNA e juno dos fragmentos de Okazaki

Funes das DNAs polimerases


E.coli Sntese da leading strand Sntese da lagging strand pol III Primase + pol III Clulas de Mamfero pol / pol /primase + pol /

Existem outras protenas que actuam ao nvel da forquilha de replicao. Uma classe de protenas liga-se s DNAs polimerases e mantm-nas ligadas ao molde de DNA, para que continuem a sntese da nova cadeia de DNA. Estas protenas formam complexos com as DNA polimerases responsveis pela polimerizao das cadeias, reconhecendo e ligando-se poro de DNA entre o primer de RNA e o molde de DNA. O anel formado por este complexo mantm a associao necessria entre a DNA polimerase e o molde de DNA, para que a replicao proceda, permitindo a sntese ininterrupta de milhares de nucletidos de DNA.

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Protenas acessrias da polimerase

Outras protenas desdobram o molde de DNA e estabilizam as regies de cadeia simples. As helicases so enzimas que catalisam o desdobramento do DNA pai (acoplado com a hidrlise de ATP) a jusante da forquilha de replicao. Depois o DNA desdobrado estabilizado por protenas de ligao ao DNA de cadeia simples, que mantm o molde de DNA desdobrado e estendido numa cadeia simples, para que possa ser copiado pela polimerase. O desdobramento da cadeia de DNA na forquilha de replicao causa o enrolamento do DNA sobre si prprio, que evitado pela aco de topoisomerases. A sntese simultnea da leading e da lagging strand na forquilha de replicao conseguida atravs da formao de dmeros de DNAs polimerases, auxiliadas pelas protenas acessrias. Em eucariontes, as histonas ligadas cromatina do DNA pai so divididas pelas cadeias de DNA filhas, e novas histonas so depois adicionadas.

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Modelo da forquilha de replicao da E.coli

Fidelidade da Replicao
A preciso na replicao de DNA crtica para a reproduo de uma clula. A frequncia de erros durante a replicao corresponde incorporao de uma base incorrecta por cada 108 a 109 nucletidos incorporados. A seleco de uma base simplesmente pela sua ligao por hidrognio base complementar resultaria numa frequncia de erros na ordem de uma base incorrecta a cada 100 a 1000 nucletidos incorporados. Assim, o elevado grau de fidelidade atingido resulta em grande parte das actividades da DNA polimerase. A DNA polimerase no catalisa a incorporao de qualquer nucletido que se ligue por pontes de hidrognio cadeia molde. Em vez disso, discrimina activamente a incorporao de bases no correspondentes. Alm disto, existe outro mecanismo responsvel pela preciso da replicao de DNA, que a actividade de proofreading da DNA polimerase. As DNA polimerases replicativas tm actividade de exonuclease na direco 35. Esta exonuclease remove selectivamente bases incorrectamente emparelhadas incorporadas na extremidade da cadeia em crescimento, aumentando a preciso da replicao.

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Proofreading pela DNA polimerase

Quando o DNA sintetizado na direco 53, a energia requerida para a polimerizao deriva da hidrlise do grupo trifosfato 5 de um dNTP livre aquando da sua reaco com o grupo hidroxilo 3 da cadeia em crescimento. Se o DNA se estendesse no sentido 35, a energia para a polimerizao derivaria da hidrlise do grupo trifosfato 5 do nucletido terminal j incorporado na cadeia. Este arranjo eliminaria a possibilidade de proofreading, pois a remoo de um nucletido terminal mal emparelhado eliminaria tambm o grupo trifosfato 5 necessrio como fonte de energia para a elongao posterior da cadeia. Assim, como a sntese do DNA se d no sentido 53 pode-se assegurar uma maior preciso no processo de replicao.

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Existem ainda mecanismos adicionais (Reparao de DNA) que permitem a remoo de bases incorrectamente incorporadas na nova cadeia de DNA, contribuindo tambm para a correcta replicao da informao gentica.

Origens e Iniciao da Replicao


A replicao do DNA, tanto de procariontes como de eucariontes, comea em locais chamados Origens de Replicao, que servem de locais de ligao para as protenas que iniciam o processo de replicao. Origem de Replicao em E.coli Em E.coli, a replicao inicia-se num local nico do cromossoma, designado origem (ori). O primeiro acontecimento a ligao de uma protena iniciadora ori do DNA, que leva ao desdobramento parcial do DNA. O restante desdobramento efectuado pela helicase e assegurado pelas protenas de ligao ao DNA de cadeia simples. Depois primers de RNA so sintetizados pela primase. Surgem assim duas forquilhas de replicao na origem, que se movem em direces opostas ao longo da molcula de DNA circular.

Apesar de origens de replicao nicas serem suficientes para replicar os genomas virais e bacterianos, mltiplas origens so necessrias para replicar os genomas muito maiores dos eucariontes durante um perodo de tempo razovel. Nas leveduras as origens de replicao denominam-se ARS (autonomuosly replicating sequences), e so os locais de ligao dum complexo proteico, o ORC (origin recognition complex), que necessrio para a iniciao da replicao de DNA em origens de leveduras. Este complexo ORC recruta outras protenas (helicases, etc) para a origem, levando iniciao da replicao. A funo das protenas do complexo ORC a mesma para todos os eucariontes, das leveduras aos mamferos. Contudo, para eucaritas mais complexos, a iniciao da replicao pode ser determinada por aspectos como a estrutura da cromatina.

Telmeros e Telomerase: Manuteno das extremidades de cromossomas


Como as polimerases apenas estendem primers no sentido 53, so incapazes de copiar a extremidade 5 de molculas de DNA lineares. So necessrios mecanismos para replicar as sequncias lineares terminais (telmeros) dos cromossomas eucaritas. Os telmeros consistem em sequncias de repeties simples de DNA, e so mantidos pela actividade da enzima telomerase, que catalisa a sntese de telmeros na ausncia de um molde de DNA. A telomerase uma transcriptase reversa, uma classe de DNA polimerases que sintetizam o DNA a partir de um molde de RNA. A telomerase transporta consigo o seu prprio molde de RNA, que complementar s sequncias repetitivas do telmero, como parte do seu complexo enzimtico. O uso deste molde de RNA permite telomerase gerar mltiplas cpias das

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sequncias repetitivas dos telmeros, mantendo-os na ausncia de um molde de DNA para dirigir a sua sntese.

Aco da telomerase
O DNA dos telmeros uma sequncia de repeties simples, com uma extremidade 3 de cadeia simples, na leading strand. A telomerase transporta a sua prpria molcula de RNA, que complementar ao DNA dos telmeros. A extremidade 3 de cadeia simples emparelha com o RNA da telomerase, que serve de molde para a extenso da leading strand por uma unidade de repetio. A lagging strand de DNA telomrico pode ento ser elongada por priming de RNA convencional e actividade da DNA polimerase. Defeitos na telomerase e a normal manuteno dos telmeros esto associados a inmeras doenas humanas. A actividade da telomerase regulada em clulas em diviso de forma a manter o tamanho dos telmeros. Apesar de nas clulas embrionrias o tamanho dos telmeros no ser afectado, nas clulas somticas a actividade da telomerase no suficiente para manter o tamanho dos telmeros por um nmero indefinido de divises. Assim, os telmeros encurtam gradualmente com a idade, levando morte celular. Muitos sndromas de envelhecimento precoce esto ligados perda anormal e elevada de telmeros. Por outro lado, clulas cancerosas exprimem elevados nveis de telomerase, permitindo-lhes continuar a dividir indefinidamente.

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Aco da Telomerase

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Reparao de DNA
O DNA pode sofrer mutaes durante a replicao, atravs da incorporao incorrecta de bases. Pode tambm sofrer mudanas qumicas espontneas ou como resultado da exposio a qumicos ou radiaes. Tais danos ao DNA podem bloquear a replicao ou transcrio. Para manter a integridade dos genomas, as clulas desenvolveram mecanismos de reparao de DNA, que se didivem em duas classes: reverso directa da reao qumica responsvel pelos danos; remoo das bases danificadas seguida da subsitituio por novos nucletidos. Quando a reparao de DNA falha, outros mecanismos celulares entram em aco. Existem duas formas de danificao espontnea do DNA: desaminao (perda da amina NH2) da adenina, citosina e guanina; e depurinao (perda das bases de purinas), que resulta da quebra da ligao entre as bases de purina e a desoxirribose.

Danificao espontnea do DNA

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Reverso directa de danos a DNA


A luz UV uma das maiores fontes de danos para o DNA, e geralmente induz a formao de dmeros de pirimidinas, nos quais pirimidinas adjacentes na mesma cadeia de DNA se juntam atravs da formao de um anel. A formao destes dmeros distorce a estrutura do DNA e bloqueia a transcrio ou replicao a jusante do local danificado. Um mecanismo de reparao a reverso directa desta dimerizao, chamado fotoreactivao, pois a energia derivada da luz visvel utilizada para quebrar a estrutura do anel.

Reparao por exciso


A maioria dos DNAs reparada por exciso do DNA danificado. O intervalo ento preenchido pela sntese de novo DNA, recorrendo cadeia complementar como molde. Na reparao por exciso, certos tipos de bases podem ser removidas nuns casos, e noutros, grupos de nucletidos podem ser removidos, sendo detectados por distores na estrutura do DNA.

Sntese de DNA transleso


Existem DNA polimerases (pol V) especializadas na replicao de DNA atravs de uma zona de DNA danificado, apesar da sua actividade possuir uma alta taxa de incorporao incorrecta de bases.

Reparao Recombinacional
O DNA danificado pode ser substitudo pela recombinao com uma molcula ntegra. Este mecanismo muito importante em casos de reparao de DNA durante a replicao, e de quebras de DNA em ambas as cadeias.

Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA


importante a preciso da replicao e reparao do DNA de modo a manter a informao gentica, no entanto igualmente importante a recombinao de forma a que genes sejam rearranjados de diferentes formas, contribuindo para a diversidade gentica das espcies.

Modelos de Recombinao Homloga


A recombinao envolve a quebra e rejuno das molculas de DNA. O alinhamento entre molculas de DNA homlogas feito atravs do emparelhamento de bases complementares. Molculas de DNA com quebras numa das cadeias (nicks), geram pores livres que invadem a outra molcula de DNA homloga, formando uma juno cruzada, a juno Holiday. Molculas recombinantes so ento formadas pela clivagem e religao dessas cadeias cruzadas.

Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga


As enzimas envolvidas na recombinao catalisam no s a troca de cadeias entre DNAs homlogos, mas tambm a formao de nicks e o desdobramento dos DNAs e e formao das junes Holiday.

Rearranjos de DNA
A recombinao homloga rearranja os cromossomas homlogos, mas no produz alteraes nas posies dos genes ao longo do genoma. Estes fenmenos de rearranjo que movem os
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genes ao longo do genoma so importantes tanto para a regulao gnica, como para a evoluo de gerao de biodiversidade.

Recombinao Site-Specific
Com ampla homologia entre as sequncias, a recombinao site-specific ocorre entre sequncias especificas do DNA, normalmente homlogas em apenas uma pequena parte do DNA. Esta interaco mediada por protenas e no por complementaridade de bases. Um exemplo desta recombinao a integrao e remoo do DNA viral aquando da infeco da E.Coli pelo bacterifago. Esta recombinao ainda importante para os rearranjos programados que ocorrem nos genomas celulares, como o caso do desenvolvimento do sistema imunolgico. Os anticorpos so resultado deste tipo de recombinao entre os genes para as imunoglobulinas (linfcitos B) e os receptores de clulas T, o que lhes permite identificar um grande nmero de antignios. As RAG 1 e RAG 2 esto envolvidas em processos de clivagem e juno na recombinao site-specific para a formao de anticorpos.

A recombinao VDJ

Transposio atravs de Intermedirios de DNA


A transposio o movimento de sequncias atravs do genoma, e no requer homologia. Os transposes so os elementos transponveis, podendo ser de dois tipos: atravs de intermedirios de DNA ou RNA. Os transposes so sequncias de insero, flaqueados por sequncias repetitivas, ou outros genes, e que se movem como uma unidade. Geralmente as sequncias de insero movem-se de um local no cromossoma para outro, mas existem certos tipos de transposes que sofrem 65

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replicao e integrao num novo local, ficando a sequncoa de insero original no seu local inicial.

Transposo via um DNA intermedirio

Transposio atravs de Intermedirios de RNA


Muitos transposes em eucaritas movem-se atravs de intermedirios de RNA (retrotransposes) em vez de DNA, sendo o seu mecanismo de transposio similar replicao dos retrovrus. Os LTRs so sequncias repetitivas de vrias centenas de nucletideos em ambas as extremidades do DNA viral. Os retrotransposes de classe I so idnticos a retrovrus e possuem LTRs, enquanto retrotransposes classe II no possuem LTRs. Nos mamferos a principal classe desses retrotranspsoes consiste em elementos longos dispersos altamente repetitivos LINEs. Outros elementos que no codificam as suas prprias transcriptases reversas e que tambm sofrem transposio atravs de RNA so os elementos repetitivos dispersos curtos SINEs. Estes no codificam protenas, logo representam pseudogenes que surgem atravs da transposio mediada por RNA. Os pseudogenes processados correspondem a pseudogenes que surgiram, similarmente, por transcrio reversa de pequenos mRNAs.

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Formao de um pseudogene processado

Amplificao Gnica
A amplificao gnica resulta na replicao repetitiva de uma certa regio do cromossoma. Em certos casos, a amplificao gnica serve para aumentar a expresso gentica durante o desenvolvimento. A amplificao tambm ocorre frequentemente em clulas cancerosas, onde pode resultar na elevada expresso de genes que contribuem para a proliferao celular descontrolada.

Amplificao gnica

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Captulo 7 - Processamento e Sntese de RNA


Transcrio em procariotas
O mRNA foi primeiro descoberto na E.Coli, e foi tambm deste organismo que se purificou e estudou pela primeira vez a RNA polimerase.

RNA polimerase e Transcrio


A principal enzima responsvel pela sntese de RNA a RNA polimerase, que catalisa a polimerizao de ribonucletidos. A sntese de RNA semelhante de DNA, mas a RNA polimerase no precisa de um primer, como a DNA polimerase, para iniciar a sntese. Assim, a transcrio comea de novo em locais especficos no incio dos genes. A RNA polimerase uma enzima complexa, constituda por mltiplas cadeias polipeptdicas e vrias subunidades - , , , , . Esta ltima tem uma fraca ligao e facilmente se separa das outras. A RNA polimerase capaz de fazer a transcrio sem a subunidade , mas sem ela no se consegue ligar especificamente s sequencias de DNA que sinalizam o incio da transcrio a subunidade essencial para o inicio da transcrio. A sequencia especifica de DNA ao qual a RNA polimerase se liga para dar inicio transcrio chamada promotor. A regio antes do inicio da transcrio contem dois sets de sequncias que so semelhantes numa srie de genes. Estes sets tm 6 nucletidos cada, e localizam-se nas posies -10 e -35, relativamente ao inicio da transcrio, nucletido +1.

Sequncias de promotores de E.coli

Primeiro, genes com promotores que diferem destas sequncias consenso so transcritos menos eficientemente do que genes com promotores com sequncias mais prximas. Segundo, mutaes nas sequncias consenso -10 ou -35 tm fortes efeitos na funcionalidade do promotor. Terceiro, os locais onde a RNA polimerase se liga ao promotor foram identificados por experiencias footprinting. A subunidade liga-se especificamente a sequncias nas regies -10 e -35 do promotor, confirmando a importncia destas sequncias. O DNA footprinting uma tcnica que permite identificar exactamente onde uma protena se liga ao DNA (por exemplo a identificao dos locais de ligao da RNA polimerase).

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Footprinting de DNA

Concluindo, na ausncia de a RNA polimerase liga-se no especificamente ao DNA, com baixa afinidade. direcciona a RNA polimerase para o promotor, levando ao inicio da transcrio. Aps a adio de cerca de 10 nucletidos, a subunidade libertada da RNA polimerase, que depois deixa o promotor e continua a elongao. medida que avana, a RNA polimerase desenrola a cadeia de DNA frente, e volta a enrolar atrs.

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Transcrio na E.coli pela RNA polimerase

A sntese continua at a polimerase encontrar um sinal de terminao. A transcrio cessa, o RNA libertado da polimerase, e a enzima desassocia-se. H dois mecanismos alternativos: 1. O mais simples inverso simtrica da sequncia repetida GC seguida de aproximadamente 7 A. Isto leva a formao de um segmento de RNA que pode formar um loop estvel por complementaridade de bases, que por sua vez leva quebra da sua associao com a cadeia de DNA e termina a transcrio. 2. Pode ser terminada por uma protena especfica (Rho) que se liga a segmentos de grande extenso.

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Terminao da transcrio

Repressores e controlo negativo da transcrio


A transcrio pode ser regulada tanto no incio como durante a transcrio. Mas a grande maioria no incio. Foi analisado o caso da expresso de enzimas envolvidas no metabolismo da lactose na E.Coli. A enzima que catalisa a clivagem da lactose a -galactosidase e apenas expressa quando a lactose est presente na bactria. Quando no est a clula economiza. A lactose por isso, induz a sntese de enzimas que a degradam. O metabolismo da lactose envolve o produto de dois linked-genes: a lactose permease- transporta a lactose para a clula; a transacetilase inactiva uma srie de enzimas txicas que entram na clula com a permease. Foram isolados mutantes que tinham defeitos na regulao de genes envolvidos no metabolismo da lactose. Vrias experincias foram feitas que fizeram perceber que alelos estavam envolvidos e que mutaes eram dominantes ou recessivas. O conjunto de genes que codifica a -galactosidade, permease e a transacetilase chamado opero. O operador controla a transcrio. O gene i codifica uma protena que regula a transcrio ligando-se ao operador. Esta protena denominada repressor, porque quando ligada ao operador bloqueia a transcrio. Na presena de lactose, esta liga-se ao repressor, inactivando. Como o repressor j no se pode ligar ao operador, a transcrio do opero iniciase. O principio da regulao por genes que o controlo da transcrio mediado por sequncias especificas de DNA. Este sistema aplicvel a procaritas e a eucaritas.

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Controlo negativo do opero lac

Controlo positivo da transcrio


O efeito da glicose na expresso de genes envolvidos no seu metabolismo um bom exemplo de controlo positivo da transcrio. A glicose sempre preferencialmente usada, por isso, enquanto esta estiver disponvel, as enzimas envolvidas noutros catabolismos de fontes de energia alternativas, no so expressas.

RNA polimerases eucaritas e Factores de transcrio


A transcrio mais complexa nas clulas eucaritas. Estas contm RNA polimerases mltiplas, que precisam de interagir com uma grande variedade de protenas adicionais para iniciar a transcrio.

RNA polimerases eucariotas


Existem trs diferentes: 1. Genes de protenas codificantes so transcritos pela RNA polimerase II 2. rRNA e tRNA so transcritos pela RNA polimerase I e III. 3. A RNA polimerase II transcreve tambm microRNA (importantes reguladores na transcrio e traduo em eucaritas). Apesar de reconhecerem diferentes promotores e transcreverem diferentes classes de genes, as RNA polimerases tm caractersticas comuns.

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Factores de transcrio e Incio da transcrio pela RNA polimerase II


RNA polimerase II foi o foco da maior parte dos estudos na transcrio em clulas eucaritas. Ao contrrio da RNA polimerase das bactrias que consegue comear a transcrio apenas com a subunidade , a RNA polimerase II no. Precisa de uma srie de protenas, factores de transcrio, que no esto associados RNA polimerase. Cerca de 10% dos genes do genoma humano codificam factores de transcrio. O promotor de muitos genes transcritos pela polimerase II contm uma sequncia semelhante a TATAA localizada entre 25-30 nucletidos acima do local de inicio da transcrio. Esta sequncia TATA box assemelha-se sequncia em -10 no promotor das bactrias. Os promotores da polimerase II contm ainda uma segunda sequncia bastante importante uma sequncia de iniciao ou Inr. Apesar de alguns promotores possurem estas duas sequncias, h outros que apenas tm uma delas. Muitos promotores que no tm a TATA box, mas tm a sequncia Inr tm uma sequncia adicional DPE que funciona em cooperao com a sequncia Inr. O primeiro passo na formao do complexo de transcrio a ligao do factor de transcrio TFIID ao promotor. Este factor ele prprio constitudo por vrias subunidades. De seguida liga-se o factor TFIIB, que vai fazer de ponte entre o promotor e a RNA polimerase II. Mais trs factores so adicionados TFIIF, TFIIH, TFIIE. Estes tm subunidades que so helicases, protenas cinase, etc. O terminal C da polimerase II constitudo por tandem repeats de 7 aminocidos. A fosforilao destes aminocidos liberta da polimerase da sua associao com o complexo inicial e leva ao recrutamento de outras protenas que permitem a RNA polimerase II comear a transcrio. Um grande complexo de protenas denominado Mediator, tambm necessrio. Consiste em 20 subunidades diferentes e essencial a uma srie de regulaes.

Transcrio pela RNA polimerase I e III


As RNA polimerases I e III tambm necessitam de factores de transcrio adicionais para se ligarem aos promotores dos genes que codificam rRNAs, tRNAs e snRNAs

Regulao da transcrio em Eucariotas


Como nas bactrias, a transcrio em seres eucaritas controlada pela ligao de protenas a sequncias de regulao especficas que modulam a actividade da RNA polimerase. Um diferena importante, no entanto, consiste na condensao do DNA em cromatina, que limita a sua disponibilidade para molde de transcrio. Como resultado, modificaes na estrutura da cromatina tm um importante papel no controlo da transcrio nas clulas eucaritas.

Sequncias Cis-acting reguladoras: Promotores e Enhancers


A transcrio em bactrias regulada pela ligao de protenas a sequncias cis-acting que controlam a transcrio de genes adjacentes. Nas clulas eucaritas h sequencias que desempenham um papel semelhante.

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Promotor eucarita

Genes transcritos pela RNA polimerase II tm alguns elementos importantes no promotor, como a TATA box e a sequencia Inr, que servem como local de ligao especifico para os factores de transcrio. Mas existem outras sequncias igualmente importantes que servem como local de ligao a diversos factores de regulao que controlam a expresso de genes individualmente. Localizam-se na maior parte das vezes a montante (upstream) da TATA box, a 100 nucletidos, ou at a 10 Kb. Estas sequncias so chamadas enhancers 2 repeties de 72 pares de bases, essenciais transcrio a partir deste promotor. Descobriu-se que estas repeties estimulavam a transcrio, e que a sua actividade no depende nem da distncia ao promotor, nem da sua orientao relativamente ao promotor so eficazes tanto upstream, como downstream, forward ou backward.

Aco de enhancers

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Isto possvel devido capacidade do DNA fazer loopings, que permite que um factor de transcrio ligado a um enhancer muito distanciado, possa interagir com as protenas associadas RNA polimerase ou Mediador. A ligao de protenas especificas reguladoras da transcrio a enhancers responsvel pelo controlo da expresso de genes durante o desenvolvimento e a diferenciao, assim como durante a resposta da clulas a hormonas e factores de crescimento. Um exemplo: O enhancer da imunoglobulina est apenas activo nos linfcitos. Assim esta sequncia reguladora em parte responsvel pela especificidade destas clulas. Apesar do DNA looping permitir aos enhancers actuar a uma distncia considervel, a actividade de qualquer enhancer especfica a um determinado promotor. Esta especificidade mantida em parte por insulator ou elementos barreira, que dividem os cromossomas em domnios independentes e apenas permitem que um enhancer actue apenas no seu promotor. Nota: Uma grande barreira para a terapia gentica que os genes introduzidos so muitas vezes mal regulados ou inactivados por causa da estrutura da cromatina prxima.

Estrutura e funcionamento de Activadores da Transcrio


Como os factores de transcrio so centrais para a regulao da expresso genica, perceber os seus mecanismos um dos desafios da Biologia Molecular. Os activadores da transcrio ligam-se a sequncias reguladoras de DNA e estimulam a transcrio. Normalmente consistem em dois domnios independentes: um que se liga especificamente ao DNA e outra que estimula a transcrio interagindo com outras protenas. A principal funo do domnio que se liga ao DNA precisamente ligar o factor de transcrio ao local certo do DNA, e o domnio de activao estimular a transcrio atravs de interaces protena-protena. Existem diferentes activadores da transcrio, que contm diferentes tipos de domnios de ligao ao DNA. Exemplos: domnio zinc fingers (encontram-se no factor TFIIA, receptores de hormonas esterides); leucine zipper, helix-loop-helix. Os domnios de activao dos activadores da transcrio no esto to bem caracterizadas como domnios de ligao ao DNA. Eles interagem com as protenas do Mediador e com os factores de transcrio, para recrutar a RNA polimerase e facilitar a formao do complexo de transcrio. Os factores de transcrio interagem ainda com uma vasta variedade de coactivadores que estimulam a transcrio modificando a estrutura da cromatina. importante notar que os activadores no regulam apenas o inicio da transcrio: Elongao e processamento de RNA podem tambm ser regulados, ambos por modulao directa da actividade da RNA polimerase e pelos efeitos na estrutura da cromatina.

Repressores eucaritas
A expresso gentica das clulas eucaritas regulada por repressores assim como por activadores da transcrio. Os repressores ligam-se a sequencias especificas de DNA e inibem a transcrio. Nalguns casos, os repressores limitam-se a interferir com a ligao de outras factores de transcrio ao DNA. Por exemplo, a ligao de um repressor perto do local de inicio da transcrio, pode bloquear a interaco da RNA polimerase com o promotor, que uma aco semelhante aos repressores nas bactrias.
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Ao contrrio dos repressores que simplesmente interferem com o local de activao da transcrio, h outros, os repressores activos, que contm locais especficos que inibem a transcrio via interaces protena-protena.

Aco de repressores eucaritas

Muitos repressores activos tm um importante papel na regulao, como por exemplo no crescimento celular e diferenciao. Os alvos dos repressores so diferentes: os repressores podem inibir a transcrio interagindo com protenas especficas, com o Mediador ou factores de transcrio, e corepressores que actuam modificando a estrutura da cromatina. Um importante papel dos repressores, tambm inibir a expresso de certos genes em certas clulas, levando assim diferenciao celular.

Relao da estrutura da cromatina com a transcrio


Como se viu anteriormente, a regulao da transcrio feita tambm atravs da estrutura da cromatina. O DNA das clulas eucaritas est ligado a histonas. A unidade de estrutura o nucleossoma, que consiste em 147 bp de DNA, enrolado volta de uma histona (que constituda por vrias subunidade, que podem estar presentes numa ou em duas quantidade). A cromatina depois condensada, sendo enrolada em estruturas altamente organizadas. Esta
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condensao tem implicaes claras na transcrio, por isso a estrutura da cromatina um aspecto crtico da expresso gentica nas clulas eucaritas. Genes que esto a ser transcritos encontram-se na forma descondensada (eucromatina). Os factores de transcrio e a RNA polimerase tm de ultrapassar o problema do DNA estar condensado, em vez de estar livre, pois difcil ligarem-se estando o DNA enrolado nas histonas, podendo at nem conseguir reconhecer o local de ligao. Vrias modificaes so caractersticas de cromatina transcricionalmente activa, como modificaes nas histonas, rearranjo dos nucleossomas, e a associao de duas protenas cromossomais no histnicas, chamadas protenas HMGN. A acetilao de histonas (HAT) est relacionada com a activao da transcrio nos cromossomas em diversas clulas eucaritas. As histonas tm dois domnios: um domnio envolvido nas interaces com outras histonas e no enrolamente de DNA volta do nucleossoma, e um outro domnio, o domnio amino-terminal, rico em lisina e que pode ser modificado por acetilao. (A lisina tem carga positiva, o DNA carga negativa devido ao grupo fosfato. Se se acetilar as lisinas estas deixam de ser posigtivas, e deixam de ser atradas pelo DNA, descondensando.) Estudos fizeram a ligao entre a acetilao de histonas e a regulao da transcrio, demonstrando que os activadores da transcrio e os repressores esto associados com as histonas acetiltransferases (HAT) e desacetilases (HDAC), respectivamente. Parece que alteraes especficas nas histonas afectam a expresso dos genes, providenciando locais de ligao para as protenas reguladoras histone code.

Acetilao de Histonas

Outro modo de regular a estrutura da cromatina atravs dos factores de remodelao dos nucleossomas, que actuam sem remover ou alterar as histonas.

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Regulao da transcrio por RNAs no codificantes


A expresso dos genes pode ser regulada no s por factores de transcrio, mas tambm por sequencias de RNA no codificantes. Por sua vez, o RNA no codificante pode reprimir a transcrio induzindo alteraes nas histonas que levam condensao do DNA. MicroRNA (miRNA) so sequencias de RNA naturalmente no codificantes. Os miRNAs so transcritos como precursores contendo repeties inversas que formam estruturas steam-loop. De seguida so clivados e do origem a miRNA maduros. Estes podem associar-se a complexos RISC ou a RITS. O fenmeno de inactivao do cromossoma X um outro exemplo de RNA no codificante. Em muitos animais, incluindo o Homem, as fmeas tm dois cromossomas X, e os machos um X e outro Y. O cromossoma X contm centenas de genes que no esto presentes no pequeno cromossoma Y. Deste modo, as fmeas tm quase o dobro de genes em relao aos machos. No entanto, tanto os machos como as fmeas possuem nas clulas o mesmo nmero de protenas. Para isto, necessrio haver um fenmeno de compensao, que consiste num mecanismo que inactiva a maior parte dos genes de um dos cromossomas X, na fmea, por converso em heterocromatina (cromatina condensada) desde cedo. Consequentemente, apenas uma cpia da maioria dos genes localizados no cromossoma X esto disponveis para transcrio tanto na fmea como no macho. Apesar do fenmeno ainda no ser completamente claro, parece que a chave est nas sequncias no codificantes de RNA.

Metilao do DNA
Este outro mecanismo que controla a transcrio nos eucaritas. Os resduos de citosina podem ser modificados pela adio de um grupo metilo. O DNA metilado especificamente em citosinas localizadas antes de Guaninas, na cadeia de DNA, e esta metilao est relacionada com a represso da transcrio. Os genes no cromossoma X inactivo esto tambm metilados, o que supe que este processo est tambm envolvido no processo de inactivao.

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Metilao de DNA

A metilao tem tambm um importante papel de regulao num fenmeno conhecido como genomic imprinting, que controla a expresso de alguns genes envolvidos no desenvolvimento de embries. H alguns imprinting genes cuja expresso depende se provm do pai ou da me. Nalguns casos apenas o alelo paterno expresso, e o alelo materno transcricionalmente inactivo. Metilao de DNA parece ter um papel chave na distino entre alelos paternos e maternos. O gene H19 um exemplo. transcrito apenas o alelo materno. Este gene especificamente metilado durante o desenvolvimento das clulas germinativas masculinas, mas no nas femininas.

Imprinting gentico

Processamento de RNA e turnover


RNA acabado de ser sintetizado tem de ser modificado de vrias maneiras de modo a poder ser convertido na sua forma funcional. O RNA das bactrias uma excepo, pois no necessita de qualquer modificao. O splicing (processamento) um dos processos que o RNA sofre, sendo mais um local de regulao.

Processamento de mRNA em Eucaritas


Nas bactrias os ribossomas tm acesso directo ao mRNA, mas nas clulas eucaritas isto no se passa. O mRNA tem de ser transportado do ncleo para o citoplasma antes de poder se usado. O produto inicial da transcrio nos eucaritas o pr-mRNA. O processamento inclui modificaes nas extremidades do mRNA, assim como remoo dos intres. O primeiro passo no processamento a modificao do terminal 5 do pr-mRNA, pela adio de uma estrutura a 7-metilguanosina cap. Este cap adicionado aps a transcrio dos primeiros 20-30 nucletidos. Este estabiliza o RNA, e ajuda o mRNA a ficar alinhado no ribossoma durante a traduo. O terminal 3 definido pela clivagem do que foi transcrito, e adio de uma cauda apenas com adeninas (A) poliadenilao. Aps este processo o RNA que tinha sido transcrito depois destas sequncias degradado, terminado a transcrio.
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Mas a modificao mais significativa a remoo dos intres, por splicing. As sequncias codificantes de RNA (exes) so interrompidas por outras no codificantes (intres) que so retiradas.

Processamento de mRNAs eucariticos

Formao das extremidades 3 de mRNAs eucariticos

Mecanismos de Splicing
Vrios sistemas foram desenvolvidos in vitro para explicar este mecanismo.

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1. Primeiro, o pr-mRNA clivado no local de splicing 5, e a extremidade 5 do intro une-se a um nucletido de adenina perto da extremidade 3 do intro (branch point). Neste passo, uma ligao pouco usual faz-se entre o terminal 5 do intro, e o grupo hidroxilo, no carbono 2, da adenina. O resultado um loop formado pelo intro. 2. O segundo passo a clivagem na extremidade 3 do intro e a ligao dos 2 exes. O intro retirado e posteriormente degradado. Estas reaces envolvem 3 sequncias especficas: sequncias na extremidade 5 do intro, na extremidade 3 deste, e no local de ligao (branch point) (onde a extremidade 5 se liga ao intro, formando um loop).

Splicing de pr-mRNA

Anlises bioqumicas revelaram que o splicing ocorre num grande complexo spliceossoma composto por protenas e RNAs. Os RNAs constituintes do spliceosoma denominam-se small nuclear RNA (snRNA) e so U1, U2, U4, U5 e U6. O primeiro passo realizado pelo spliceossoma a ligao de U1 snRNA ao local de splicing 5. Esta ligao involve o reconhecimento de certos pares de bases. U2 snRNA liga-se de seguida ao branch point, tambm por complementariedade de bases. De seguida, um complexo formado por U4/U6 e U5 snRNAs incorporado no spliceosoma. A reaco de splicing acompanhada por rearranjos nos snRNAs. U5 liga-se de seguida s sequncias na extremidade 3 do intro, seguido do corte e ligao dos exes. Os snRNA no se limitam a reconhecer as sequncias consenso, mas clivam tambm o intro self-splicing. So capazes de remover os seus prprios intres na ausncia de outras protenas ou factores de RNA. Os intres contm frequentemente vrias sequncias que so semelhantes s sequncias consenso, por isso o spliceossoma tem de ter capacidade para identificar os locais correctos, de modo a reproduzir um mRNA funcional.

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Intres Self-splicing

Splicing Alternativo (Alternative splicing)


O papel central do slipicing no processamento de pr-mRNA abre vrias possibilidades na regulao da expresso dos genes. Como a maior parte dos pr-mRNA contem mltiplos intres, diferentes mRNA podem ser produzidos a partir do mesmo gene por diferentes combinaes de terminaes 5 e 3 do intro. A possibilidade de juntar exes de vrias maneiras origina uma nova maneira de controlo, gerando mltiplos mRNA a partir do mesmo pr-mRNA. Este processo chamado splicing alternativo. Este mecanismo providencia tambm um papel importante na diferenciao celular dos diferentes tecidos. O splicing alternativo actua pela aco de um repressor que funciona bloqueando a ligao de um factor do spliceossoma, e um grande grupo de protenas regulam o splicing alternativo, ligando-se a sequncias silenciadoras nos pr-mRNA. Noutros casos, o splicing alternativo controlado por activadores que recrutam factores do spliceosoma para locais de ligao do intro, que de outra maneira no seriam reconhecidos. O activador de splicing melhor estudado pertence famlia das protenas SR.

Edio de RNA
A Edio de RNA refere-se a eventos que introduzem alteraes nas sequncias codificantes de protenas de alguns mRNA. Este tipo de alteraes inclui a desaminao das citosinas em uridinas e adenosinas em inosinas. Um dos melhores exemplos a edio de mRNA da apolipoprotena B, que transporta lpidos no sangue. Neste caso, dois diferentes tecidos geram duas formas diferentes de apolipoprotenas a partir do mesmo mRNA. Nos humanos, a ApoB100 sintetizada no fgado por traduo de um mRNA no editado. No entanto, uma protena mais curta sintetizada no intestino como resultado da traduo de um mRNA editado, onde um C foi trocado por um U por desaminao. Esta alterao altera do codo da glutamina (CAA) no mRNA no editado, para um codo de terminao (UAA), resultando na sntese de um mRNA mais curto.

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Edio do mRNA da apolipoprotena B

Degradao de RNA
Os mRNAs funcionais de eucaritas so degradados a diferentes velocidades, funcionando como um mecanismo adicional de controlo da expresso gentica. Em alguns casos, sinais extracelulares so responsveis pelas taxas de degradao de mRNAs. As clulas possuem um sistema de controlo de qualidade (nonsense-mediated mRNA decay) que leva degradao de mRNAs que no tm a sequncia completa prevenindo a sntese de protenas anormais. A degradao no citoplasma outro modo de controlo da expresso dos genes. Enquanto o rRNA e tRNA so muito estveis, o mRNA bacteriano rapidamente degradado, permitindo respostas rpidas e variaes ambientais. mRNA eucarita por outro lado tem taxas de degradao variadas, sendo outra forma de regulao da expresso gentica. A degradao no citoplasma ocorre por: encurtamento das cadeias poli-A; remoo do cap na extremidade 5; degradao por nucleases a partir das extremidades. Existem ainda mRNAs instveis que codificam protenas reguladoras e contm muitas sequncias ricas em AU perto da extremidade 3.

Regulao da estabilidade do mRNA do receptor de transferrina B Regulao do mRNA para o receptor transferrina: Os nveis de mRNA para o receptor transferrina (receptor membranar que permite a entrada de ferro na clula) so controlados pela disponibilidade de ferro. Se a disponibilidade de ferro for adequada, o mRNA rapidamente degradado, como resultado de uma clivagem perto da extremidade 3. Se o ferro for escasso, contudo, uma protena reguladora liga-se sequncia perto da extremidade 3 do mRNA, protegendo-o da clivagem.

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Captulo 8 Sntese, processamento e regulao proteica


Traduo do mRNA
A traduo a transformao da mensagem contida no mRNA na sequncia de aminocidos que constituem uma cadeia polipeptdica. O mRNA contm a informao para a sntese proteica, sendo lido no sentido 53. A cadeia polipeptdica sintetizada do N-terminus para o C-terminus. Cada aminocido especificado por codes do RNA e o mecanismo de traduo semelhante em todas as clulas. Na traduo temos vrios intervinientes: o mRNA que contm a informao gentica para a sntese de protenas; os aminocidos que so monmeros das protenas; tRNA que selecciona e transporta o aminocido apropriado e reconhece o codo correspondente do mRNA; ribossomas que so sistemas de leitura, que promovem a ligao entre aminocidos, sendo constitudos por RNA ribossmico (rRNA) e protenas; enzimas que catalisam as reaces e ATP que transfere energia para o sistema.

RNAs de transferncia
Cada um dos 20 aminocidos tem que ser alinhado com os codes correspondentes do mRNA. Para isso existe o tRNA, que serve como adaptador para este processo, fazendo a ligao entre o mRNA e o aminocido correspondente. Este tem uma estrutura de L, requerida para se encaixar do ribossoma durante a traduo. Todos os tRNAs terminam numa extremidade 3 com a sequncia CCA qual se liga o aminocido. Na outra poro do tRNA localiza-se uma sequncia de 3 nucletidos complementar ao codo (anticodo). A ligao dos aminocidos ao tRNA especfico catalisada pela aminoacil tRNA sintetase (ATP-dependente), que reconhece um aminocido para o tRNA correcto.

Estrutura dos tRNAs

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O Ribossoma
Os ribossomas so locais de sntese proteica, tanto nos procaritas, como nos eucaritas. Neles se faz a ligao entre o tRNA e o mRNA. Os ribossomas tm duas subunidades que geralmente se apresentam separadas no citoplasma, s se ligando para efectuar a sntese proteica, contendo cada uma delas protenas e rRNA. O ribossoma permite manter os aa juntos e a realizao das ligaes peptdicas durante a sntese proteica.

Organizao do mRNA e incio da traduo


A traduo no comea na extremidade 5 do mRNA, mas em locais especficos. Assim, existem locais entre a extremidade 5 e o local de iniciao que no so traduzidos 5 untranslated regions (UTRs). Em procaritas, o mRNA pode codificar mais que uma cadeia polipeptdica especfica, denominando-se policistrnico. Nos eucariontes, porm, cada mRNA codifica apenas uma cadeia polipeptdica, sendo monocistrnico.

mRNAs procariticos e eucariticos

Nos procaritas os codes de iniciao de mRNAs so precedidos por uma sequncia, a sequncia Shine-Dalgarno, que alinha o mRNA no ribossoma para a traduo, atravs da complementaridade de bases com a extremidade 3 do rRNA. Assim, este emparelhamento permite no s a iniciao da traduo na extremidade 5, como em locais internos do mRNA, no caso de mRNAs policistrnicos

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Sinais para a iniciao da traduo

Em contraste, os ribossomas eucariticos reconhecem o mRNA ligando-se ao cap de 7metilguanosina na extremidade 5. Depois os ribossomas descem ao longo do mRNA at encontrarem o codo de iniciao (geralmente AUG - metionina). Em engenharia gentica muito importante notar que RNAs humanos no contm a sequncia Shine-Dalgarno, e por isso quando se recorre a um vector plasmdico e se coloca num procarita, se o gene de interesse no contiver esta sequncia, o ribossoma do procarita no conseguir reconhecer o local a partir do qual se comea a sntese proteica.

Processo de Traduo
A traduo divide-se em 3 etapas: iniciao, elongamento e finalizao. Iniciao 1. Ligao do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta usualmente o aminocido metionina subunidade menor de um ribossoma; 2. A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto, ficando o ribossoma funcional. So necessrias protenas no ribossomais especificas factores de iniciao eucariticos. Alongamento a fase de traduo dos codes sucessivos do mRNA e da ligao dos aminocidos. Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se stios P, A e E. 1. O tRNA iniciador liga-se ao stio P; 2. O prximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo codo; 3. H a formao de uma primeira ligao peptdica entre o aminocido que ele transporta e a metionina;

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4. Durante este processo o ribossoma move 3 nucletidos ao longo do mRNA, posicionando o codo seguinte no sitio A vazio; 5. O alongamento do pptido continua at que um codo STOP seja translocado no sitio A do ribossoma. Finalizao 1. Os codes de finalizao no tm nenhum anticodo complementar, mas existem factores de libertao que reconhecem os sinais e terminam a sntese proteica. Estes factores ligam-se a um codo STOP no sitio A e estimulam a hidrlise do polipptido completo do ribossoma; 2. O tRNA libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se.

Viso geral da traduo

A sntese proteica um processo com as seguintes propriedades: 1. Complexidade: faz interferir vrios agentes 2. Rapidez: uma clula eucaritica junta 140 aminocido de uma cadeia de hemoglobina em dois a trs minutos. 3. Amplificao: a mesma zona de DNA pode ser transcrita vrias vezes, formando-se assim vrias molculas de mRNA idnticas. Por outro lado, os polirribossomas mostram que a traduo da mesma mensagem descodificada simultaneamente por vrios ribossomas. Originam-se, deste modo, vrias cadeias polipeptdicas idnticas, resultando cada uma delas da traduo efectuada por cada ribossoma. Desta forma, apesar de o mRNA ter curta durao, como a sua mensagem podem ser traduzida vrias vezes amplificada a sua actividade.

Regulao da Traduo
A traduo de mRNAs particulares pode ser regulada pela ligao de protenas repressoras, microRNAs no-codificantes, e poliadenilao controlada. De forma global, a actividade das clulas modulada em resposta ao stress celular, disponibilidade de nutrientes, e estimulao por factores de crescimento (FC).
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Um mecanismo de regulao da traduo a ligao de protenas repressoras (que bloqueiam a traduo) a sequncias de RNA especficas. Um exemplo a regulao da sntese de ferritina, a protena que armazena ferro dentro a clula. A traduo da ferritina regulada pela disponibilidade de ferro: mais ferritina sintetizada se o ferro for abundante. Esta regulao mediada por uma protena, que na ausncia do ferro se liga a uma sequncia na UTR 5 do mRNA da ferritina, bloqueando a sua traduo. Na presena de ferro, o repressor no se liga UTR 5, permitindo que a traduo prossiga.

Regulao traducional da ferritina

de realar que a ligao da mesma protena reguladora a locais diferentes do mRNA pode gerar efeitos diferentes na expresso gnica, num caso podendo inibir a traduo, e noutro estabilizando o mRNA, aumentando a sntese proteica. Outro mecanismo envolve a modulao da actividade dos factores de iniciao, particularmente o IF-2. No entanto este processo tem efeitos globais na actividade de traduo, no sendo especfico. Contrariamente a estes processo, existe um que envolve o factor IF-4E que se vai ligar extremidade 5 dos mRNAs e age como uma protena reguladora da traduo, estimulando o inicio da traduo, pelo recrutamento da pequena subunidade do ribossoma. A regulao da traduo pode ainda ser efectuada por miRNAs (cadeia dupla), que se associam ao complexo RISC, desdobrando-se em duas cadeias simples. Depois o miRNA conduz o RISC sequncia complementar de mRNA, levando clivagem do mRNA ou represso da sua traduo.

Dobragem Proteica e Processamento


A traduo completa o fluxo de informao gentica dentro da clula, no entanto gera-se uma sequncia de aminocidos que no corresponde a uma protena funcional. Para que esta seja funcional, a cadeia de aminocidos tem que se dobrar sobre si mesma e adquirir uma conformao tridimensional, possivelmente associando-se a outros polipptidos formando complexos funcionais. Muitas protenas sofrem ainda outras modificaes ps-traducionais, como a clivagem, ligaes covalentes a lpidos e glcidos, que vo determinar a sua funo e localizao correcta dentro da clula.

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Chaperonas e Dobragem Proteica


Toda a informao necessria para uma protena adoptar a conformao tridimensional correcta fornecida pela sua sequncia de aminocidos. No entanto existem protenas que facilitam essa dobragem, denominadas chaperonas, que apenas catalisam a dobragem de cadeias, pois a forma como esta feita determinado unicamente pela sequncia de aminocidos. Na ausncia de chaperonas, as cadeias polipeptdicas dobradas ou no seriam instveis, dobrando-se incorrectamente ou agregando-se em complexos insolveis.

Aco de Chaperonas durante a traduo

Enzimas que catalisam a Dobragem Proteica


A formao de ligaes dissulfito entre os resduos de cistenas importante na estabilizao de estruturas dobradas de muitas protenas, pelo que a enzima dissulfito isomerase catalisa a quebra e a formao destas ligaes. As ligaes dissulfito so restritas a protenas destinadas a serem segregadas ou incorporadas na membrana, porque o citosol contem agentes redutores que mantm a cistena na sua forma reduzida, impedindo que se formem pontes dissulfito.

Clivagem Proteica
A clivagem proteica da cadeia polipeptdica, designada de protelise, um passo importante na maturao de muitas protenas (um exemplo a frequente remoo da metionina iniciadora). So frequentemente adicionadas sequncias sinalizadoras, que marcam o destino da protena. necessrio clivar essa sequncia para que a protena mature.

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O papel de sequncias-sinal na translocao atravs da membrana

Outro exemplo o da insulina, que sintetizada contendo uma nica cadeia, que contm uma sequncia sinalizadora. Inicialmente clivada essa sequncia sinalizadora, pelo que a restante cadeia estabelece as ligaes que iro dar origem sua conformao tridimensional. Por fim, esta cadeia clivada em dois pontos, sendo retirado um segmento intermdio, originando-se assim dois domnios diferentes. A presena daquele segmento intermdio no para contribuir para a funo da protena, mas sim para a sua correcta conformao.

Processamento proteoltico da insulina

Glicolizao
Muitas protenas so modificadas por adio de glcidos, num processo denominado de glicosilao, e passam a designar-se glicoprotenas. As pores glicdicas desempenham um papel importante na dobragem proteica no retculo endoplasmtico, na marcao de protenas e como locais de reconhecimento nas interaces clula a clula. As glicoprotenas so geralmente segregadas ou incorporadas na membrana, e o processo de glicosilao ocorre no reticulo endoplasmtico, geralmente, durante a traduo. Existe a N ou O glicosilao,

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dependendo do local onde esta ligado o glcido, e isso faz com que difira o local onde e realizada a glicosilao

Ligao de Lpidos
Algumas protenas so modificadas pela ligao de lpidos cadeia polipeptdica, que geralmente marcam e ancoram essas protenas membrana plasmtica. Existem trs tipos de adio de lpidos: N-miristoilao, prenilao e palmitoilao. Um quarto tipo, a adio de glicolpidos, tem um papel importante no ancoramento de algumas protenas na face extracelular da membrana.

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Captulo 10 Encaminhamento e transporte de protenas


Alm da presena de ncleo, outro aspecto determina a diferena entre clulas procaritas e clulas eucaritas: a compartimentao de actividades celulares em organitos delimitados por membranas. A esta diviso do citoplasma corresponde uma maior eficincia nos processos das clulas eucaritas, apesar do maior volume, que pode ser 1000 vezes superior ao de uma bactria. Porque a organizao das clulas eucaritas complexa, tarefas como o encaminhamento das protenas aos seus destinos de grande relevncia. O primeiro passo do encaminhamento proteico toma lugar ainda durante a traduo pelos ribossomas livres, que podem ligar-se membrana do retculo endoplasmtico. O elongamento da cadeia peptdica prossegue neste organito com o seu deslocamento para o lmen, local em que ocorre o folding (dobragem). a partir do retculo endoplasmtico que as protinas so dirigidas para organitos como o Aparelho de Golgi, em que so processadas e encaminhadas selectivamente para os seus destinos: endossomas, lisossomas, membrana citoplasmtica ou exterior da clula. Estes organitos distinguem-se dos restantes pelo seu papel no processamento de protenas, qual se associa o transporte de vesculas entre eles.

O retculo endoplasmtico
O RE um organito que consiste num conjunto de tubos e sacos (cisternas) que se estendem da membrana nuclear para o citoplasma, sendo o maior organito de muitas clulas eucariticas. Estas cisternas encontram-se delimitadas pela membrana do retculo endoplasmtico. Consideram-se 3 domnios na membrana do retculo: RE rugoso, coberto de ribossomas na sua superfcie externa; RE de transio, em que ocorre a exportao de vesculas para o Golgi; e, por fim, RE liso, que est envolvido no metabolismo de lpidos.

O retculo endoplasmtico e a secreco de protenas


O papel do RE na secreo de protenas foi entendido atravs de experincias em que foram utilizados aminocidos radioactivos que, aps a sua incluso em protenas sintetizadas, poderiam ser observados atravs de autoradiografia, revelando assim o percurso destas biomolculas na clula. Estes resultados permitiram estabelecer o percurso das protenas destinadas ao exterior da clula: REr > Golgi > vesculas de secreo > exterior da clula. Estudos posteriores mostraram que esta via de secreo no serve unicamente o transporte de protenas para o exterior da clula, mas tambm o encaminhamento daquelas para outros compartimentos membrana citoplasmtica, lissossomas. Algumas protenas so ainda retidas nos primeiros organitos da via RE, Golgi desempenhando funes nestes.

Encaminhamento de protenas para o Retculo Endoplasmtico


A entrada de protenas no RE uma das principais etapas no transporte intracelular de protenas nas clulas eucariotas, j que um ponto comum a todas as vias desse transporte. Com efeito, protenas destinadas membrana citoplasmtica, aos lisossomas ou ao Golgi so, numa fase inicial da via, encaminhadas para o RE. Esse encaminhamento pode ser feito
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durante ou aps a traduo dos mRNA pelos ribossomas livres. Nos mamferos, este encaminhamento ocorre principalmente durante a traduo dos mRNA (embora possa ser pstraduo), enquanto nas leveduras, por exemplo, o encaminhamento maioritariamente posterior traduo. As protenas destinadas a outros organitos, tais como citoplasma, mitocndrias, cloroplastos ou peroxisomas so sintetizadas nos mesmos ribossomas livres e libertadas directamente no citosol. No existe diferena estrutural entre os ribossomas livres e os ribossomas associados a RE. Toda a sntese proteica se inicia em ribossomas livres. No entanto, ribossomas livres envolvidos na sntese de protenas de secreo so encaminhados para a membrana do retculo endoplasmtico atravs de uma sequncia-sinal intrnseca prpria protena em traduo. Estes pequenos segmentos de sinalizao so normalmente clivados da cadeia polipeptdica durante a transferncia da protena para o lmen do retculo endoplasmtico. Esta hiptese foi estudada em 1971, atravs de experiencias in vitro em que se conclui que ribossomas livres traduzem protenas de secreo um pouco maiores do que a protena secretada in vivo. No entanto, se na experincia fossem includos microssomas (a unidade bsica do retculo endoplasmtico rugoso) verificava-se uma clivagem daquelas protenas dimenso esperada. Estas experincias deram mais detalhe hiptese que propunha a existncia de uma sequncia no terminal amina que encaminharia a cadeia polipeptdica at ao ER e seria posteriormente clivada por uma protease microssomal. As concluses foram confirmadas por outras experincias envolvendo DNA recombinante, em que a adio de uma sequncia codificante de uma sequncia sinal se mostrou suficiente para direccionar a protena recombinante ao retculo endoplasmtico. Depois de emergirem do ribossoma, durante a traduo, as sequncias-sinal so reconhecidas e acopladas a uma signal recognition particle (SRP) que consiste em seis polipptidos e ainda um pequeno RNA (srpRNA). A SRP liga-se ento ao ribossoma e sequncia-sinal, inibindo a traduo at que o complexo SRP, ribossoma e cadeia polipeptdica em crescimento se ligue ao receptor de SRP, na membrana do RE. A ligao daquele complexo ao receptor de SRP promove a separao deste ltimo do complexo, originando-se uma SRP livre para um novo ciclo de encaminhamento. J acoplado membrana do RE, o ribossoma liga-se ento a uma protena de translocao, que promove a insero da sequncia-sinal num canal da membrana - translocon. Todo este processo mediado pela ligao de GTP SRP e ao receptor de SRP. a transferncia do complexo ribossoma + cadeia polipeptdica para o translocon que abre o canal de membrana e permite, a prossecuo da traduo atravs deste. A sequncia-sinal ento clivada e a cadeia polipeptdica libertada no lmen do RE. O encaminhamento de cadeias polipeptdicas para o RE pode, nalguns casos, ser feito aps a traduo. Estas protenas so sintetizadas nos ribossomas livres, mantidas na estrutura primria por protenas (chaperonas) do citosol (para que possam entrar no translocon) e a sua sequncia-sinal reconhecida por receptores da membrana do RE associados ao translocon. No h necessidade de SRP.

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Insero de protena na membrana do Retculo Endoplasmtico


As protenas destinadas ao exterior da clula ou permanncia no lmen dos organitos envolvidos no transporte proteico permanecem no lmen do ER. No entanto, as protenas destinadas incorporao nas membranas celulares (citoplasmtica, Golgi, RE, lisossomas) comeam por ser inseridas na membrana do RE, ao invs de libertadas no seu lmen. Embora transportadas pela mesma via de secreo de protenas, estas protenas so transportadas como componentes de membrana e no como protenas solveis. As protenas integrais de membrana mantm-se nestas atravs das suas sequncias hidrofbicas que a atravessam, maioritariamente hlices de 20 a 25 aminocidos, diferindo na forma como esto inseridas na mesma relativamente a 1) nmero de domnios transmembranares e 2) localizao das pores amino-terminal ou carboxilo-terminal da cadeia, que tanto podem estar no lado citoslico como no lado do lmen. Este ltimo aspecto determinado pelo processo de translocao da cadeia at ao interior do RE.

Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequnciasinal clivvel e uma nica stop-transfer sequence1
A sequncia-sinal clivada medida que o polipptido atravessa a membrana do RE e, portanto, a poro terminal amina da cadeia exposta ao interior do lmen. No entanto, a translocao do pptido interrompida por uma stop-transfer sequence que fecha o translocon e sai deste lateralmente, de forma a ancorar-se s caudas hidrofbicas dos fosfolpidos da membrana do ER. A continuao da traduo aps a stop-transfer sequence resulta numa protena de transmembranar com a poro carboxlica no lado citoslico.

Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequnciasinal interna sequncia (e, portanto, no-clivvel)2
Esta posio interna da sequncia sinal pode levar introduo de protenas na membrana do RE em ambas as orientaes. Assim, a sequncia-sinal pode determinar uma insero tal do polipptido que a sua poro N-terminal se expe no lado citoslico. A restante cadeia polipeptdica translocada para o interior do lmen do RE medida que a traduo ocorre. A sequncia sinal no clivada e actua, ento, como domnio transmembranar, ancorando a protena bicamada lipdica. Pode tambm acontecer que a sequncia-sinal promova a translocao do domnio N-terminal atravs da membrana; a prossecuo do processo de traduo resulta numa protena transmembranar com a sua poro N-terminal voltada para o lmen do RE. Note-se que a orientao a mesma obtida quando a sequncia-sinal clivvel e seguida por uma stop-transfer sequence.

Sequncia usualmente em hlice- que impede a translocao da cadeia peptdica a montante para o lmen do RE. Figura 10.12 2 Figura 10.12
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Insero de uma protena na membrana do RE com mltiplas stoptransfer sequences (domnios transmembranares)3
Uma sequncia-sinal interna pode determinar na insero de uma cadeia polipeptdica com a sua poro N-terminal no lado citoslico. Uma stop-transfer sequence sinaliza o encerramento do canal de translocao, originando-se um loop no lmen do retculo endoplasmtico. A traduo continua no citosol at que uma nova sequncia-sinal traduzida reabre o canal de translocao; a prossecuo da traduo origina um loop no citosol. O processo pode ser repetido mltiplas vezes, resultando em protenas que atravessam a membrana vrias vezes. A maior parte das protenas transmembranares destinadas a outros compartimentos na via de secreo so a eles dirigidas atravs de vesculas de transporte. No entanto, h excepes, como por exemplo protenas da membrana interna do ncleo, que contgua membrana do RE.

Folding e Processamento proteico no Retculo Endoplasmtico


Eventos como (1) o folding das cadeias polipeptdicas na sua correcta estrutura tridimensional, (2) a congregao de vrias cadeias peptdicas para originar protenas de mltiplas subunidades, (3) modificaes covalentes envolvidas no processamento das protenas que entram na via de secreo, (4) primeiros estgios da glicosilao e (5) adio de glicolpidos a algumas protenas da membrana citoplasmtica ocorrem tanto durante a translocao ao longo da membrana do RE como no lmen desse organito. Ao servio destes eventos esto protenas do lmen do retculo endoplasmtico, como as chaperones. Uma destas protenas a BiP, cuja funo ser por um lado ligar-se a cadeias polipeptdicas unfolded, medida que estas atravessam a membrana do RE e entram no lmen, e, por outro, mediar o processo de folding. Protenas correctamente estruturadas so libertadas pelas chaperones e podem ser transportadas para o Golgi. Caso existam erros de folding, as protenas seguem uma via de degradao. A formao de pontes dissulfito entre as cadeias laterais de duas cistenas um importante aspecto deste processo de folding no interior do RE, j que o poder redutor no citosol no permite estas ligaes. Outro evento importante que ocorre no RE a glicosilao de resduos de asparagina, que consiste na adio de um oligossacardeo de 14 resduos (9 manoses, 2 N-acetilglucosamina e 3 Glucoses [estes ltimos removidos ainda durante o processo de glicosilao]). Algumas protenas esto unidas membrana lipdica atravs de GPI (um glicolpido) que substitui, aps a traduo, o domnio transmembranar daquela protena, constituindo, dessa forma, o nico ponto de contacto entre a protena e a membrana. A orientao destas protenas no retculo determina que aquelas protenas so expostas superfcie da clula.

Figura 10.14

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Controlo de Qualidade no Retculo Endoplasmtico


Algumas das protenas sintetizadas no RE so degradadas antes de prosseguirem na via de secreo. Este o princpio do controlo de qualidade que se verifica no RE e que consiste no encaminhamento de protenas cujo folding foi errado para vias de degradao. Este processo de verificao, ainda no totalmente compreendido, implica, entre vrias outras protenas, pelo menos quatro chaperones. H no entanto duas chaperones cujo funcionamento conhecido. So protenas do lmen do RE que assistem o folding e que verificam a correco do processo. Caso o folding de uma cadeia polipeptdica ocorra de forma errada, essas protenas comeam por ser encaminhadas para uma repetio do folding. Se, depois de mltiplos ciclos, o folding continuar a ser errado, os resduos de manose so removidos e a protena segue uma retro-translocao atravs do translocon, chegando ao citosol onde marcada pela ubiquinona e degradada pelo proteossoma. No caso de uma acumulao de protenas unfolded, um processo de sinalizao mediado pelo BiP desencadeado, resultando numa inibio da sntese proteica, aumento da expresso gentica de protenas chaperones e um aumento na actividade do proteossoma, visando uma acelerao do processo de eliminao de protenas misfolded (folding errado).

O retculo endoplasmtico liso e a sntese de lpidos


Alm das actividades de processamento e secreo de protenas, o RE [liso] o principal organito envolvido na sntese de lpidos. Porque os lpidos so biomolculas muito hidrofbicas, a sua sntese ocorre em associao com membranas celulares pr-existentes, sendo posteriormente transportados at aos seus destinos. Na composio das membranas celulares entram principalmente trs tipos de lpidos: fosfolpidos, colestrol e glicolpidos. Os primeiros, mais abundantes, so sintetizados no lado citoslico da membrana do RE, atravs de precursores solveis. Na sntese de fosfolpidos, os cidos gordos so transferidos para o Glicerol-3-fosfato, em reaces catalisadas por enzimas associadas membrana. Posteriormente, o fosfolpido inserido na membrana, podendo ser alterado por enzimas. Esta sntese no lado citoslico da membrana do RE permite que a cauda hidrofbica do fosfolpido esteja embutida na membrana, enquanto ocorrem outras reaces a partir de precursores solveis. Nota para o facto de a sntese de lpidos ocorrer apenas no lado citoslico da membrana do RE, pelo que a integridade da camada interna assegurada por movimentos de flip-flop (mediados por flippases, com gasto de energia). Alm de ser o local de sntese de fosfolpidos, o RE tambm local de sntese de outros componentes lipdicos da membrana, como o colestrol e a ceramida, sendo que esta ltima precursora da sntese de esfingomielina no Golgi. Devido ao seu papel na sntese de lpidos, o RE liso encontra-se muito desenvolvido nas clulas secretoras de hormonas esterides.

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Exportao de Lpidos e Protenas a partir do Retculo Endoplasmtico


Tanto as protenas como os fosfolpidos so transportados ao longo da via de secreo em vesculas de transporte. Estas molculas so exportadas a partir do RE em vesculas que se destacam da membrana deste organito e que transportam contedo cargo atravs do ERGIC (compartimento intermedirio entre o RE e o Golgi) e, posteriormente, do Golgi. Processos de transporte posteriores envolvem a passagem do cargo entre as diferentes cisternas daquele organito e deste para os lisossomas ou membrana citoplasmtica. Na maioria dos casos, as protenas do lmen so empacotadas em vesculas que, depois de libertadas pelo organelo-origem, se fundem com a membrana do organelo-receptor, libertando o seu contedo no lmen deste organito. Note-se que a orientao topolgica das protenas associadas membrana mantida ao longo da via de secreo. Assim, protenas expostas na superfcie citoslica da membrana do RE mantm-se expostas nas superfcies citoslicas da membrana do Golgi ou do citoplasma, enquanto protenas voltadas para o lmen do RE sero expostas no lmen do Golgi e superfcie extracelular da clula. A maior parte das protenas que entram no RE de transio so transportadas para o ERGIC e para o Golgi. No entanto, esto sinalizadas por sequncias que determinam ou a sua exportao ou a sua reteno no RE. Existem protenas na membrana do RE que parecem reconhecer protenas do lmen destinadas secreo; no entanto, detectaram-se muito poucos sinais (ligandos daquelas protenas transmembranares) pelo que se aponta para uma via de secreo default em que protenas no marcadas para exportao so tambm transportadas at ao Golgi. Coloca-se ento a situao de as protenas do lmen, como as isomerases de pontes dissulfido ou as chaperones, se perderem para a clula. Esta situao no ocorre de facto, pois muitas dessas protenas apresentam sequncias-sinal de aminocidos na poro C-terminal (KDEL) que promovem o retro-transporte das mesmas ao RE. Verifica-se ainda que protenas s quais foi retirada a sequncia-sinal no retornam ao RE, prosseguindo a via da secreo. Estas sequncias ligam-se ento a protenas especficas da membrana dos compartimentos celulares e retornam selectivamente ao RE. As sequncias KDEL e KXXX (no cdigo de aminocidos de uma s letra) so os sinais conhecidos mais relevantes no retro-transporte das protenas do lmen (KDEL) e da membrana (KXXX) do RE. O retro-transporte destas protenas a primeira ramificao do sorting proteico. Outros pontos de ramificao desta via, como a reteno no Golgi versus exportao para membrana citoplasmtica ou lisossomas, ocorrem noutros nveis de transporte.

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O Aparelho de Golgi
O aparelho (ou complexo) de Golgi funciona como uma fbrica em que as protenas recebidas do RE so processadas e destinadas a vrios locais: endossomas, membrana citoplasmtica, lisossomas ou meio extra-celular. Conforme j referido, a sntese de esfingomielina e glicolpidos tem lugar neste organito.

Organizao do Golgi
Na maioria das clulas o Golgi constitudo por cisternas e vesculas cujos limites so membranas lipdicas. Uma das propriedades deste organito a sua polaridade, tanto em estrutura como em funo. Assim, as protenas do RE entram pela face cis, convexa e orientada para o ncleo, e saem pela face trans, cncava. Este processo de transporte essencial na manuteno da estrutura e funcionalidade do complexo de Golgi, como demonstram experincias em que o transporte de vesculas a partir do RE bloqueado. Ao passar pelo Golgi, as protenas so modificadas e destinadas aos seus locais. No Golgi podem considerar-se quatro compartimentos: a rede cis, a rede trans e as pilhas Golgi medial e trans. nestas ltimas que ocorrem os principais metabolsimos do complexo de Golgi. As protenas modificadas so posteriormente transportadas rede trans, um centro de distribuio, dirigindo as molculas aos seus destinos.

Glicosilao de protenas no Golgi


O processamento proteico que ocorre no Golgi envolve a modificao e a sntese da poro glicdica das glicoprotenas. A modificao dos oligossacardeos adicionados no RE uma das etapas cruciais deste processamento. O processamento desses N-linked oligossacardeos feito atravs de uma sequncia de reaces:

A extenso destas modificaes depende de diversos factores tais como estrutura da protena e quantidade de enzimas de processamento disponveis no Golgi, que varia de acordo com o tipo de clula. Assim, consoante estes factores variem possvel obter glicoprotenas muito variadas. As glicosiltransferases adicionam resduos de monossacardeos, enquanto as glicosidades removem esses mesmos resduos.

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O processamento dos resduos glicdicos N-linked das protenas lisossomais difere do aplicado s protenas dirigidas membrana citoplasmtica ou secreo. Estes so modificados por uma reaco de fosforilao de manose, cuja enzima reconhece a estrutura tridimensional das protenas lisossomais (folding). Esta etapa previne a remoo dos resduos noutras etapas de processamento. O sinal manose-6-fosfato ento reconhecido por um receptor prprio na regio trans do Golgi, que encaminha a glicoprotena para os lisossomas ou endossomas.

Outras modificaes proteicas podem ter lugar no Golgi, tais como: adio sequencial de resduos glicdicos s cadeias laterais de serina e treonina dentro de sequncias especficas.

Metabolismo dos lpidos e dos polissacardeos no Golgi


Sntese da esfingomielina (v. p. 413)

Encaminhamento e exportao das protenas a partir do Golgi


O encaminhamento selectivo de lpidos, protenas e glcidos a partir do Golgi para outros organitos implica a sua distribuio prvia por diferentes tipos de vesculas, que se destacam da face trans do Golgi e se dirigem aos locais-alvo. Ao contrrio do que acontece no retculo endoplasmtico, a preservao no Golgi de protenas prprias daquele organito feita atravs de uma reteno associada ligao das mesmas membrana do Golgi. Assim, esses sinais correspondem a domnios transmembranares que impedem a incluso dessas protenas no lmen das vesculas. Sinais na poro citoplasmtica dessas protenas transmembranares asseguram o retro-transporte daquelas protenas at ao Golgi. A via de secreo constitutiva, que ocorre em todas as clulas, conduz a uma secreo no regulada de protenas. No entanto, clulas responsveis pela secreo de hormonas possuem vias alternativas em que protenas especficas so secretadas como resposta a estmulos ambientais. A secreo de hormonas, neurotransmissores e enzimas digestivas pelas clulas do pncreas so exemplos dessa via de secreo regulada, caracterizada por vesculas de secreo maiores que se fundem com a membrana citoplasmtica quando o ambiente for apropriado. A polaridade das clulas de alguns tecidos (como o epitelial) encerra uma ainda maior complexidade no transporte de protenas para a membrana citoplasmtica, j que esta no apresenta caractersticas uniformes, sendo constituda por um domnio apical e outro basolateral. A via de secreo constitutiva (no regulada) tem ento de promover o carregamento de, pelo menos, dois tipos de vesculas de secreo. A via de distribuio proteica mais conhecida a que encaminha protenas com manoses-6-fosfato aos lisossomas. Nota para o facto de o M6P ser responsvel pela incluso das protenas lisossomais em
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vesculas especficas dirigidas queles organitos. No caso das plantas e leveduras, em que no existem lisossomas, as protenas so transportadas para os vacolos.

O mecanismo do transporte de vesculas


Conforme ficou claro, as vesculas de transporte so essenciais ao metabolismo das clulas, pois permitem o transporte de biomolculas entre organitos, bem como do seu interior para o meio extra-celular. Alm disso, as vesculas so tambm relevantes em processos como a endocitose. O transporte de vesculas , ento, uma actividade crucial das clulas. A selectividade desse processo assegura a organizao da clula e das suas funes. Como visto, a especificidade do transporte baseia-se no empacotamento selectivo e na fuso dirigida das vesculas aos locais-alvo.

A experimentao e a compreenso dos mecanismos do transporte de vesculas


Os progressos na compreenso do transporte de vesculas assentaram em 3 grandes vectores experimentais: (1) isolamento de leveduras mutantes que so deficientes no distribuio e transporte de protenas; (2) reconstituio do transporte vesicular em sistemas in vitro; (3) anlises bioqumicas de vesculas sinpticas, responsveis pela regulao da secreo de neurotransmissores. As concluses dos vrios estudos convergem numa certa uniformidade dos processos envolvidos na secreo. Estudos recentes com protenas GFP de fuso permitiram observar a via de transporte de protenas especficas in vivo.

Selectividade do Cargo, Protenas Coat e Destacamento de Vesculas


A maioria das vesculas que transporta protenas do RE para o Golgi e deste para os seus alvos est revestida por protenas citoslicas que, por via da sua funo, se designam por protenas de revestimento. Inicialmente, as protenas de secreo so seleccionadas de outras protenas. As protenas de revestimento aderem vescula medida que esta se destaca da membrana dadora e so geralmente removidas antes de a vescula atingir a membrana alvo. Os processos de formao e destacamento das vesculas so regulados por protenas ligadas a GTP. Os complexos proteicos envolvidos na gnese das vesculas parecem ser prprios de cada via de destacamento, transporte e fuso de vesculas. H a considerar trs tipos de vesculas de revestimento: vesculas cop-coated (I e II) e vesculas chlatrin-coated. As vesculas COPII destacam-se do RE para o ERGIC ou para o Golgi; as vesculas COPI destacam-se do ERGIC ou do Golgi, mediando tambm o transporte de vesculas entre as cisternas deste organito; as vesculas chlatrine-coated so responsveis pelo uptake de molculas do meio extra-celular, por endocitose, bem como pelo transporte de molculas desde a rede trans do Golgi at aos seus destinos. A formao destas ltimas vesculas requer clatrina, GTP binding-protein ARF1 - e pelo menos duas outras molculas. A clatrina desempenha um papel estrutural na formao da vescula constituindo uma rede semelhante de um cesto que distorce a membrana e inicia o destacamento. Durante o transporte, o GTP ligado a ARF1 hidrolisado a GDP. Este conjunto libertado para o citosol e reciclado. A perca do ARF1 e a aco de enzimas uncoating promovem a desintegrao da rede de clatrina. Enquanto as vesculas COPI e COPII esto confinadas a alvos especficos, as

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vesculas clathrin-coated podem ter variados destinos. Como os alvos requerem diferentes protenas, diferentes protenas medeiam o seu transporte at aos diferentes destinos.

Fuso de Vesculas
A fuso de uma vescula de transporte com a membrana do alvo envolve dois eventos: (1) o reconhecimento da membrana alvo por parte da vescula e (2) a fuso das membranas e a consequente libertao do contedo para o organelo-alvo. Estudos dos ltimos anos sustentam modelos de fuso de vesculas baseados no reconhecimento entre protenas da vescula e do alvo tethering, seguida de fuso das mesmas. Anlises destas protenas permitiram o desenvolvimento da hiptese SNARE, em que a fuso das vesculas mediada por interaces entre protenas transmembranares SNARE (vSNAREs [protenas transmembranares das vesculas] e t-SNARES [dos alvos]). a interaco entre as SNAREs que promove a aproximao das membranas, a sua instabilidade e consequente fuso das mesmas. No entanto, todo este processo, que envolve docking, tehtering e fusion envolve a formao de um complexo proteico semelhana do que acontece no destacamento de vesculas. As protenas Rab, GTP bindind-proteins, participam em muitos destes processos de fuso e destacamento de vesculas e esto directamente envolvidas na especificidade dos transportes de vesculas. (Para pormenores, v. p. 423). A exocitose um tipo especfico de fuso de vesculas transportadoras com a membrana citoplasmtica, em que o contedo da vescula libertado secretado para o exterior da clula (Cooper tambm utiliza o termo exocitose para fuses com outras membranas celulares, v. tabela 10.1). Neste processo intervm tambm GTP-binding proteins e um complexo proteico de oito subunidades.

Lisossomas
Os lisossomas so organelos delimitados por membrana que contm enzimas capazes de degradar todos os tipos de biomolculas aos seus monmeros constituintes. Pode dizer-se que o lisossoma funciona como o sistema digestivo da clula, permitindo a digesto de molculas provindas do meio extra-celular ou dos prprios constituintes das clulas. Podem apresentar diferentes formas consoante o seu contedo.

Hidrolases cidas prprias dos lisossomas


Os lisossomas contm mais de 50 diferentes tipos de enzimas degradativas que hidrolisam todo o tipo de biomolculas. Mutaes nos genes que codificam estas protenas so responsveis por mltiplas doenas, designadas por lysossomal storage diseases, em virtude da acumulao de material orgnico nos lisossomas dos indivduos afectados. A doena de Gaucher uma delas e consiste numa mutao no gene que codifica uma enzima responsvel pela degradao de glicolpidos. Outras doenas lisossomais podem ter a sua gnese em
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mutaes nos genes que codificam as enzimas responsveis pela adio do sinal de manose-6fosfato s protenas destinadas aos lisossomas. Estas enzimas tm um pH de actuao ptimo consideravelmente abaixo do pH citoplasmtico, o que garante uma digesto controlada. O carcter cido dos lisossomas assegurado pelo uptake de H+, que, com gasto de ATP, assegura uma concentrao de protes 100 vezes superior no lisossoma.

Endocitose e formao do lisossoma


O papel dos lisossomas na digesto de produtos da endocitose no se resume sua funo, mas tambm sua formao. Com efeito, os lisossomas so formados quando uma vescula de transporte provinda da rede trans do Golgi se funde com uma vescula endoctica. A formao de lisossomas corresponde, ento, a um ponto de contacto entre a via endoctica e a via de secreo. fuso das vesculas endocticas com os early endossomes segue-se uma reciclagem dos receptores da superfcie celular, que retornam membrana e a maturao dos endossomas, que consiste no abaixamento do pH. Como referido anteriormente, as hidrolases cidas so incorporadas em vesculas dirigidas aos lisossomas atravs do resduo de M6P. Depois da remoo das clatrinas destas vesculas, elas fundem-se com os endossomas maturos. O pH cido promove a dissociao dos complexos receptor-M6P, libertando-se as enzimas no interior do endossoma. Os receptores podem ser dirigidos at ao Golgi (reciclagem). Os late endossomes so ento maturados em lisossomas, adquirindo um carcter muito cido que promove a digesto de biomolculas.

Fagocitose e Autofagia
Nos lisossomas, alm da via da secreo e da via endoctica, convergem tambm duas outras vias: a fagocitose e a autofagia. A fagocitose consiste num uptake de grandes partculas, associadas emisso de pseudpodes pela clula fagoctica. Origina-se uma vescula fagoctica que se funde com o lisossoma, procedendo-se digesto do seu contedo. Os lisossomas assim formados podem ser muito grandes e heterogneos, em funo do seu contedo. Os lisossomas so tambm responsveis pela autofagia, ou seja, o gradual turnover os prprios componentes da clula. A autofagia, ao contrrio da fagocitose, ocorre em todas as clulas e desempenha tarefas crticas em certas etapas do desenvolvimento embrionrio. O primeiro passo da autofagia a enclausura de um organelo numa membrana derivada da membrana do retculo endoplasmtico. A vescula resultante um autofagossoma funde-se com um lisossoma, ocorrendo a digesto do material nela presente.

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Captulo 11 Bioenergtica e Metabolismo


Mitocndrias
Geram energia metablica em clulas eucariticas, criando ATP de glcidos e cidos gordos atravs de fosforilao oxidativa. Contm o seu prprio DNA, RNA (mRNA, tRNA e rRNA) e as suas protenas provm tanto do genoma nuclear, sintetizadas em ribossomas livres no citosol, como do seu prprio genoma.

Organizao e Funo das Mitocndrias

So constitudas por uma dupla membrana com um espao intermembranar e uma matriz. Na matriz esto presentes o patrimnio gentico do organito e enzimas necessrias ao metabolismo oxidativo. A membrana interna, que apresenta cristas projectadas na matriz que aumentam a sua rea, possui protenas envolvidas na fosforilao oxidativa e protenas de transporte. tambm impermevel maioria dos ies e pequenas molculas, mantendo o gradiente de protes que dirige a fosforilao oxidativa. A membrana externa possui porinas que permitem a passagem de pequenas molculas, tornando o espao intermembranar anlogo ao citoplasma.

O Sistema Gentico das Mitocndrias

As mitocndrias possuem o seu prprio sistema gentico, constitudo por molculas de DNA circular. Pensa-se que evoluram de bactrias, provavelmente de Rickettsias, por endossimbiose. O DNA mitocondrial contm praticamente todos os genes que codificam os rRNAs e tRNAs mitocondriais, sendo as restantes protenas necessrias ao seu metabolismo codificadas pelo genoma nuclear.

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O seu cdigo gentico ligeiramente diferente do das restantes clulas, atravs de uma extenso do mecanismo wobble e alteraes da correspondncia entre codo e aminocido. As mitocndrias de um organismo so provenientes exclusivamente do ocito, pelo que as doenas mitocondriais so transmitidas pela me.

(estes assuntos esto explicados em muito maior detalhe dos documentos disponibilizados pela Teresa Tomaz)

Importao de Protenas e Montagem de Mitocndrias

Como j foi referido, a maioria dos genes que codificam protenas necessrias replicao e expresso do DNA mitocondrial esto no ncleo da clula. Alguns destes genes foram transferidos para o ncleo aquando a associao endossimbitica entre clulas. As protenas mitocondriais codificadas pelo genoma nuclear so sintetizadas em ribossomas livres e tm que atravessar parte ou toda dupla membrana mitocondrial para o seu destino final, a matriz, o espao intermembranar ou a prpria membrana.

Importao de protenas para a matriz mitocndrial:


As protenas destinadas matriz da mitocndria possuem pr-sequncias, em hlice-, clivada aps a sua importao pela MPP.

1. Ligao das pr-sequncias a receptores membranares associados ao complexo Tom. 2. Passagem atravs de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Passagem pelo do espao intermembranar. 4. Passagem atravs do complexo Tim (poro), na membrana interna. 5. A continuao da passagem da protena requer o potencial electroqumico gerado atravs da membrana interna. Este torna a matriz negativa e o espao intermembranar positivo, o que dirige a pr-sequncia positiva para a matriz.

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Existem vrias chaperonas que auxiliam a importao:

1. Hsp70 citoslica mantm as protenas num estado apenas parcialmente folded para que possam ser translocadas atravs das membranas. 2. Hsp70 mitocondrial (associada ao complexo Tim) funciona como alavanca para puxar a protena para a matriz. 3. Hsp70 mitocondrial (da matriz) ajudam ao trmino do folding proteico. 4. Hsp60 mitocondrial (chaperonina) dentro da qual pode existir folding adicional.

NOTA: todas as interaces entre protenas e chaperonas necessitam de ATP dentro e fora da mitocndria e do potencial electroqumico gerado atravs da membrana interna.

Importao de protenas para as membranas interna ou externa:

As protenas destinadas s membranas possuem sinais de importao mitocondriais internos em conjunto ou no com pr-sequncias.

Caso possuam apenas sinais de importao mitocondriais internos:

1. Reconhecimento, em associao com uma chaperona Hsp90, por um complexo Tom diferente do do primeiro caso. 2. Passagem atravs do mesmo complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Reconhecimento, no espao intermembranar, por complexos Tim e levados a outro complexo Tim (poro), na membrana interna. 4. Reconhecimento de sinais stop-transfer que promovem a integrao das protenas na membrana.

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Caso possuam sinais de importao mitocondriais internos e pr-sequncias:

1. Reconhecimento, em associao com uma chaperona Hsp70, pelo mesmo complexo Tom do caso anterior. 2. Passagem atravs de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Umas protenas so integradas directamente na membrana atravs do complexo Tom (poro), quanto que outras migram para o espao intermembranar e so depois integradas na membrana.

Importao de protenas para o espao intermembranar*:

As protenas destinadas ao espao intermembranar possuem sequncias-sinal complexas.

1. Reconhecimento, em associao com uma chaperona Hsp70, pelo mesmo complexo Tom do caso anterior. 2. Passagem atravs de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Umas protenas migram directamente para o espao intermembranar. 4. Outras so transportadas pelo complexo Tim (poro) na membrana interna at matriz, onde a sequncia sinal clivada e expe um sinal secundrio que as dirigem para o espao intermembranar *ou para a membrana interna.

NOTA: A translocase que dirige as protenas do caso anterior a partir da matriz tambm responsvel pela integrao das poucas protenas membranares codificadas pelo genoma da mitocndria.

Os fosfolpidos mitocondriais so removidos do retculo endonplasmtico por protenas de transferncia de fosfolpidos e integrados nas membranas mitocondriais. As mitocndrias sintetizam cardiolipina, um fosfolpido incomum.

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Peroxissomas

So pequenos organitos revestidos por membrana que contm enzimas envolvidas num leque de reaces metablicas, algumas de metabolismo energtico. No possuem genoma, todas as suas protenas (peroxinas) esto codificadas no genoma nuclear e so na sua maioria* sintetizadas em ribossomas livres. Normalmente replicam-se por diviso.

Funes dos Peroxissomas

1. Diversas reaces de oxidao, tendo como substratos cido rico, purinas, metanol e o mais importante, cidos gordos. 2. Degradao do perxido de hidrognio (H2O2, gua oxigenada) atravs da enzima catalase, criado nas suas prprias reaces de oxidao. 3. Biossntese de lpidos, do aminocido lisina e plasmalogneos - fosfolpidos presentes apenas no crebro e corao).

Construo de Peroxissomas

*As peroxinas provm tanto de ribossomas livres como do retculo endoplasmtico. As provenientes do retculo podem fundir-se entre si ou com peroxissomas preexistentes, e funcionam tambm como receptores para as peroxinas sintetizadas nos ribossomas livres, que so reconhecidas atravs de sequncias especficas. Protenas e lpidos so constantemente integrados nos peroxissomas, o que implica numa variao da sua constituio ao longo da sua maturao. As doenas lisossomais devem-se tanto falta de enzimas individuais como disfuno das vias de integrao de protenas, sendo estas ltimas responsveis pela falha em mltiplas enzimas.

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Captulo 12 O citoesqueleto e o movimento celular


O citoesqueleto apresenta uma funo estrutural, determinando tambm a forma da clula, a posio dos organelos e a organizao geral do citoplasma. igualmente responsvel pelo movimento celular. uma estrutura dinmica que constantemente reorganizada. composto por trs tipos de filamentos proteicos: filamentos de actina, filamentos intermdios e microtbulos.

Estrutura e Organizao dos filamentos de actina


Os filamentos de actina so particularmente abundantes junta membrana plasmtica, onde formam uma rede que proporciona suporte mecnico, determina a forma da clula e movimentos da superfcie celular.

Montagem e Desmontagem dos Filamentos de Actina


Os monmeros de actina (actina G) polimerizam para formar filamentos de actina (actina F). Este processo comea com a formao de dmeros e trmeros (nucleao), que depois vo crescendo pela adio de monmeros s duas extremidades. (Fig 12.2) Os filamentos de actina apresentam polaridade: possuem uma extremidade positiva e outra negativa. A polimerizao faz-se em ambas as extremidades, todavia na extremidade positiva o crescimento mais rpido do que na extremidade negativa. A actina ligada a ATP (maior afinidade ao filamento) associa-se extremidade positiva (em rpido crescimento), verificando-se que na extremidade negativa h uma dissociao de monmeros ligados a ADP (Fig 12.4) Existem protenas, denominadas protenas de ligao actina, que regulam a unio e separao dos filamentos. Entre estas destacam-se Arp2/3, que se liga extremidade positiva, iniciando a formao de ramificaes (Fig 12.7), formina, que facilita a nucleao (que requer um correcto alinhamento dos trs primeiros monmeros de actina para o seguimento da polimerizao) (Fig 12.6), ADF/cofilina, que possui dois tipos diferentes de actividade: por um lado, despolimerizao de actina atravs do aumento da taxa de dissociao de monmeros de actina na extremidade negativa, por outro, diviso do filamento em dois, o que cria novas extremidades positivas (Fig 12.8), profilina, que estimula troca de ADP por ATP, o que resulta na formao de monmeros actina/ATP que se dissociam da cofilina e ficam disponveis para integrarem filamentos (Fig 12.8).

Organizao dos filamentos de Actina


Os filamentos individuais de actina organizam-se em dois tipos principais de estruturas: feixes e redes (Fig 12.9). Os feixes podem ser paralelos ou contrcteis. Os primeiros esto associados protena fimbrina. Os segundos esto associados a -actinina. Quer a fimbrina quer a actinina contm dois domnios de ligao de clcio (Fig 12.10). As redes encontram-se associadas a filamina, que um dmero de duas subunidades que formam um V flexvel que

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estabelece ligaes cruzadas entre os filamentos de actina, originando redes ortogonais (Fig 12.11).

Associao com a Membrana Plasmtica


Os filamentos de actina tambm se ligam membrana plasmtica, o que permite a manuteno da estrutura e da funo da clula, sendo esta ligao feita por protenas da famlia da calponina. Um exemplo a distrofina. H doenas genticas ligadas ao cromossoma X (por exemplo distrofia de Duchenne e distrofia de Becker), que resultam de mutaes no gene da distrofina, e que levam degenerao progressiva do msculo esqueltico. Existem filamentos de actina nos locais de adeso entre clulas adjacentes. As adeses focais so mediadas pela ligao de integrinas (protenas transmembranares) a protenas da matriz extracelular. As fibras stress (feixes de filamentos de actina ligados de forma cruzada por actinina) encontram-se ligadas ao domnio citoplasmtico das integrinas por complexos que envolvem vrias protenas (Fig 12.16). Nas znulas de adeso, as protenas transmembranares so as caderinas. Estas, que so dependentes de clcio, ligam-se a outras caderinas no espao extracelular e a cateninas no lado citoslico. a este complexo que se ligam os filamentos de actina (Fig 12.17).

Projeces da Superfcie Celular


A superfcie da maioria das clulas tem uma variedade de protuses e extenses que esto envolvidas no movimento celular, na fagocitose ou em funes especializadas, como o caso da absoro de nutrientes. Um exemplo so as microvilosidades, que apresentam um esqueleto formado por filamentos de actina, empacotados em feixes por fimbrina e vilina. Esto ligados membrana ao longo do seu comprimento por braos laterais constitudos por miosina I e calmodulina. Os feixes de filamentos de actina encontram-se assentes na trama terminal (Fig 12.9). Temos ainda outros exemplos de projeces: pseudpedes (envolvidos na fagocitose), lamelipdias e filipdias (associadas ao movimento celular).

Actina, Miosina e Movimento Celular


A interaco entre a actina e a miosina II responsvel pela contraco muscular. Esta associao tambm ocorre em clulas no contrcteis, conduzindo a fenmenos como a citocinese, transporte vesicular e movimento celular. Na citocinese verifica-se que, aps a mitose, a clula dividida em duas por um anel contrctil constitudo por filamentos de actina e por miosina II (Fig 12.30). No transporte vesicular, verifica-se a interaco entre os filamentos de actina e a miosina I (que, ao contrrio da miosina II, apresenta uma cauda pequena e no forma nem dmeros nem filamentos). A cauda da miosina I liga-se membrana da vescula e a sua cabea liga-se ao filamento de actina (Fig 12.32). Na migrao celular, verifica-se a emisso de filipdias, que depois aderem ao substrato. Finalmente, a parte de trs recolhida (Fig 12.34). Vrias experincias demonstraram que a extenso de projeces envolve a ramificao e polimerizao de filamentos de actina. A emisso de projeces regulada pelas protenas Rho (ligadas ao GTP), que estimulam a Arp 2,3e a ADF/Cofilina.

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Filamentos Intermdios
Ao contrrio dos filamentos de actina e dos microtbulos, os filamentos intermdios no esto directamente envolvidos no movimento celular. Apresentam uma funo estrutural, visto que fornecem fora mecnica s clulas e tecidos.

Protenas dos Filamentos Intermdios


Enquanto os filamentos de actina e os microtbulos so polmeros de um nico tipo de protenas (actina e tubulina, respectivamente), os filamentos intermdios so compostos por uma grande variedade de protenas que so expressas em diferentes tipos de clulas (para ver alguns exemplos consultar Tab 12.2). As protenas dos filamentos intermdios apresentam um domnio central em -hlice, uma cabea e uma cauda com tamanho e formas variveis (Fig 12.36).

Montagem dos Filamentos Intermdios


Os polipptidos unem-se volta um do outro para formar dmeros. Estes associam-se de forma anti-paralela para formar tetrmeros, que por sua vez se associam pelas extremidades para formar protofilamentos e lateralmente para formar filamentos. Cada filamento apresenta aproximadamente 8 protofilamentos (Fig 12.37). Ao contrrio dos filamentos de actina e dos microtbulos, os filamentos intermdios so apolares, dado que no apresentam extremidades positivas e negativas distintas. Os filamentos intermdios so geralmente mais estveis que os filamentos de actina e os microtbulos, no apresentando o comportamento dinmico associado a estes outros elementos do citoesqueleto.

Organizao Intracelular dos Filamentos Intermdios


Os filamentos intermdios formam uma rede elaborada no citoplasma da maioria das clulas, estendendo-se desde um anel a rodear o ncleo at membrana plasmtica (Fig 12.38). Os filamentos de queratina e vimentina servem, aparentemente, para posicionar o ncleo. Os filamentos intermdios podem-se associar no s membrana plasmtica como tambm a outros elementos do citoesqueleto. Os filamentos de queratina das clulas epiteliais esto firmemente ancorados membrana plasmtica por duas reas de contacto celular especializado: desmossomas e hemidesmossomas. Os desmossomas so junes entre clulas adjacentes nas quais o contacto clula-clula mediado por protenas transmembranares da famlia das caderinas. No lado citoslico, os desmossomas esto associados a uma placa densa de protenas intracelulares qual os filamentos de queratina esto unidos. Estas unies so mediadas por desmoplaquina, um membro de uma famlia de protenas chamada plaquinas. Os hemidesmossomas so ligaes entre clulas epiteliais e tecido conjuntivo nos quais os filamentos de queratina esto ligados por diferentes membros da famlia das plaquinas (p.e. plectina) a integrinas (Fig 12.39). A plectina contribui para a ligao entre elementos do citoesqueleto, aumentando a estabilidade mecnica da clula (Fig 12.40).

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Epidermlise Bulhosa Simples


Doena gentica causada por uma mutao no gene que codifica a queratina. Os indivduos afectados por esta doena apresentam severas anormalidades a nvel da pele, de entre as quais se destacam lise das clulas da epiderme aps traumas mecnicos mnimos. Consultar o texto Expression Of Mutant Keratin Causes Abnormal Skin Development pg. 502/503

Microtbulos
So o terceiro componente do citoesqueleto, sendo estruturas rgidas que, tal como a actina, so dinmicas. Esto envolvidos na determinao da forma da clula, numa grande variedade de movimentos celulares, no transporte intracelular de organelos e na separao dos cromossomas durante a mitose.

Estrutura e organizao Dinmica dos Microtbulos


Os microtbulos so constitudos por um nico tipo de protena globular, neste caso a tubulina, que um dmero formado por uma tubulina- e por uma tubulina- que se polimerizam para formar os protofilamentos. Estes vo constituir os microtbulos (cada um composto por 13 protofilamentos) (Fig 12.42) Os microtbulos so polares, uma vez que, tal como a actina, apresentam uma extremidade positiva (de crescimento rpido) e uma extremidade negativa (de crescimento lento) (Fig 12.43). Nos microtbulos verifica-se instabilidade dinmica, resultante da hidrlise de GTP ligado a tubulina- durante ou logo aps a polimerizao, o que reduz a afinidade de ligao em relao a molculas adjacentes (Fig 12.44).

Organizao Intracelular dos Microtbulos


A extremidade negativa dos microtbulos est ancorada nos nos centrossomas, que, em interfase, esto localizados perto do ncleo. Durante a mitose, os microtbulos reorganizamse para formar o fuso mittico (Fig 12.45). Os centrossomas possuem um par de centrolos, que so estruturas cilndricas altamente polares compostas por 9 tripletos de microtbulos associados a diversas protenas, como por exemplo a -tubulina (associada ao lmen do centrolo) (Fig 12.48).

Drogas que Afectam a Estabilidade dos Microtbulos


Actualmente existem drogas que influenciam a estabilidade dos microtbulos, sendo usados, por exemplo, no tratamento de cancro, uma vez que a diviso celular travada se no se verificar uma correcta formao e organizao do fuso mittico. Exemplos de drogas destabilizadoras dos microtbulos: colchicina, vimblastina,... Droga estabilizadora dos microtbulos: taxol
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Motores Microtubulares e Movimento


O movimento de vesculas e organelos ao longo dos microtbulos baseado na aco de protenas motoras: cinesinas, que fazem o transporte em direco extremidade positiva dos microtbulos, ou seja, para zonas mais perifricas, e dinenas, que fazem o transporte em direco extremidade negativa, que se encontra no centro da clula (Fig 12.51).

Clios e Flagelos
Os clios e os flagelos so projeces baseadas em microtbulos, que permitem o movimento (locomoo) de uma grande variedade de clulas eucariticas. Para visualizar exemplos de clios e flagelos consultar Fig 12.53. A principal estrutura dos clios e flagelos o axonema, que composto por micortbulos e por protenas a eles associadas. Os microtbulos encontram-se organizados numa disposio 9+2, na qual um par central de microtbulos est rodeado por 9 conjuntos de 2 microtbulos. Os microtbulos perifricos esto ligados por pontes de nexina e apresentam 2 braos de dinenas. a actividade motora dessas dinenas axonemais que dirige o batimento dos clios e dos flagelos. (Fig 12.54) As extremidades negativas dos microtbulos dos clios e flagelos esto ancorados no corpo basal, que uma estrutura similar ao centrolo e que contm 9 tripletos de microtbulos (Fig 12.55) Resumo das Funes Os microtbulos permitem a locomoo (os clios e os flagelos apresentam um esqueleto de microtbulos). Os microtbulos participam no transporte intracelular de vesculas e organelos. Os microtbulos intervm na separao dos cromossomas durante a mitose, visto que so essenciais para a formao do fuso mittico, que pode ser visualizada na Fig 12.58

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Captulo 13 Membrana Plasmtica


Transporte de pequenas molculas
Medicina Molecular: Fibrose Cstica (FC)
A Doena
A fibrose cstica uma doena letal hereditria recessiva. Afecta um em cada 2500 recmnascidos brancos, rara nas outras raas. A disfuno caracterstica da fibrose cstica a produo de muco anormalmente espesso e aderente por vrios tipos de clulas epiteliais, incluindo as clulas que revestem os tractos respiratrio e gastrointestinal. A manifestao clnica primria uma doena respiratria resultante da obstruo das vias areas superiores por muco, seguida por infeces bacterianas recorrentes. Na maioria dos doentes o pncreas tambm fica comprometido, pois os ductos pancreticos ficam obstrudos por muco. As glndulas sudorparas tambm apresentam um funcionamento anormal e a presena excessiva de sal no suor um indicativo para o diagnstico da fibrose cstica. Os procedimentos-padro para esta doena incluem terapia fsica para promover drenagem bronquial, administrao de antibiticos e reposio de enzimas pancreticas.

Bases Moleculares e Celulares


Defeito no transporte de Cl- nos epitlios afectados (que incluem os ductos de glndulas sudorparas e as clulas que revestem o tracto respiratrio). O gene da fibrose cstica codifica uma protena (denominada CFTR regulador da condutncia transmembranar da fibrose cstica) que pertence famlia dos transportadores ABC. A CFTR funciona como um canal de Cl, portanto as mutaes responsveis pelo estabelecimento da fibrose cstica resultam directamente no transporte deficitrio de Cl-.

Preveno e Tratamento O isolamento do gene da fibrose cstica possibilita um mapeamento gentico para a identificao dos indivduos portadores do alelo mutado. A compreenso do funcionamento da CFTR como canal de Cl- tem sugerido novas abordagens para o tratamento. Uma possibilidade a utilizao de drogas que estimulem a abertura de outros canais de CL- nos epitlios afectados. Alternativamente, a terapia gnica possibilita a potencial reposio dos genes da CFTR normal no epitlio respiratrio dos pacientes com fibrose cstica. Esta possibilidade baseou-se em experincias que demonstraram que a introduo do gene normal da CFTR em cultura de clulas de paciente com fibrose cstica era suficiente para restaurar a funo do canal de CL-. Alm disso, a aplicao em potencial da terapia gnica para FC grande pela facilidade de acesso s clulas epiteliais que revestem as vias areas superiores (utilizando o sistema de asperso de aerosis).

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Estudos com animais experimentais tm demonstrado que vectores virais podem transmitir o cDNA da CFTR para o epitlio respiratrio, e em 1993 iniciou-se o primeiro protocolo experimental de tratamento em humanos contudo a eficincia de de transferncia tem sido baixa e a expresso do cDNA da CFTR transferido tem sido mantida por menos de um ms.

Endocitose
Endocitose o processo atravs do qual as clulas eucariticas so capazes de englobar macromolculas e partculas do meio que as circunda. Na endocitose, o material a ser internalizado circundado por uma rea de membrana plasmtica, que brota para o lado de fora para formar a vescula que conter o material a ser internalizado.

Fagocitose
Durante a fagocitose as clulas internalizam grandes partculas como bactrias, resto celulares ou at clulas intactas. A ligao de uma partcula aos receptores de superfcie de uma clula fagoctica leva emisso de pseudpodes, que circundam as partculas e depois as suas membranas fundemse para formar uma grande vescula intracelular (fagossoma). Os fagossomas fundem-se com os lisossomas, formando fagolisossomas, nos quais o material ingerido digerido por aco de hidrolases cidas dos lisossomas. As amibas utilizam a fagocitose para capturar partculas alimentares, como bactrias ou outros protozorios. Em animais multicelulares, o principal papel da fagocitose fornecer defesa contra microrganismos invasores e eliminar clulas velhas ou danificadas do corpo. Nos mamferos a fagocitose uma funo de dois tipos de glbulos brancos, os macrfagos (eliminam microrganismos de tecidos infectados e clulas velhas ou mortas) e os neutrfilos (eliminam microrganismos de tecidos infectados).

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Endocitose Mediada por Receptor


A endocitose mediada por receptor um exemplo de pinocitose (captao de fluidos ou macromolculas em pequenas vesculas). A endocitose mediada por receptor possibilita o mecanismo de captao selectiva de macromolculas especficas. As macromolculas que sero internalizadas ligam-se inicialmente a receptores especficos de superfcie celular, que esto concentrados em regies especializadas da membrana plasmtica, denominadas regies recobertas por clatrina. Depois originam-se pequenas vesculas cobertas por clatrina contendo os receptores e as suas respectivas macromolculas ligadas. Estas vesculas fundem-se com os endossomas jovens, nos quais os seus contedos so classificados para serem transportados para o lisossoma ou para serem reciclados na membrana plasmtica.

Formao de vesculas cobertas por clatrina

A internalizao do colesterol por clulas de mamferos permite uma melhor compreenso da endocitose mediada por receptor. O colesterol transportado atravs da corrente sangunea na forma de partculas lipoproteicas, sendo a mais comum a lipoprotena de baixa densidade (LDL). A internalizao de LDL por clulas de mamferos d-se mediante a ligao do LDL com receptores especficos de superfcie celular que se encontram concentrados nas regies recobertas por clatrina e so internalizados por endocitose. A hipercolesterolmia familiar (abordada de forma mais detalhada mais frente) permitiu descobertas importantes no processo de internalizao do LDL. uma doena hereditria e os pacientes com esta doena apresentam nveis muito elevados de colesterol srico e sofrem de ataques cardacos precocemente. As clulas desses pacientes so incapazes de internalizar LDL a partir dos fluidos extracelulares, resultando na acumulao de altos nveis de colesterol na circulao, pois a doena resulta de uma mutao no receptor de LDL (concentrado nas regies recobertas por clatrina). Essas mutaes podem ser de dois tipos: as clulas podem simplesmente no ser capazes de se ligar ao LDL (demonstrando que os receptores especficos
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de superfcie celular so necessrios para a internalizao de LDL); ou as clulas podem ligar-se mas ser incapazes de internaliz-lo (os receptores destes pacientes so incapazes de se concentrar nas regies recobertas por clatrina, o que evidencia o papel central das regies recobertas por clatrina na endocitose mediada por receptores).

A clatrina organiza-se numa estrutura semelhante a uma cesta de basquete que distorce a membrana, formando pontos de invaginao. Uma protena de ligao a GTP, a dinamina, organiza-se em anis em redor desses pontos invaginados, promovendo finalmente a liberao das vesculas cobertas para o lado de dentro da clula. Fluidos extracelulares tambm podem ser incorporados nas vesculas cobertas conforme estas brotam da membrana plasmtica, de modo que a endocitose mediada por receptor resulta numa internalizao no-selectiva de fluidos extracelulares e outros materiais (endocitose de fase fluida), alm da internalizao de macromolculas especficas. As regies recobertas por clatrina geralmente ocupam 1 a 2% da rea da superfcie da membrana plasmtica. Enquanto a endocitose dependente da clatrina a principal via de internalizao tanto de fluidos como de macromolculas especficas, as clulas tambm usam vrios mecanismos independentes da clatrina, um desses mecanismos envolve a captao de molculas em caveolas (pequenas invaginaes da membrana plasmtica), noutro mecanismo, vesculas grandes podem mediar a internalizao de fluidos, num processo conhecido por macropinocitose.

Key Experiment: O Receptor de LDL


O Contexto
A hipercolesterolmia familiar (FH) uma doena gentica, apresentando os pacientes altos nveis sricos de colesterol e sofrendo ataques cardacos em idade jovem. Brown e Goldstein em 1972 iniciaram os seus trabalhos sobre esta doena, com a ideia de que a superproduo de colesterol resultava de um defeito no mecanismo de controlo que normalmente regula a biossntese de colesterol. Aps terem realizado algumas experincias, detectaram que a adio de LDL a um meio de cultura de fibroblastos* humanos normais inibe a actividade da HMGCoA redutase, que uma enzima cuja actividade limita a via de biossntese do colesterol. Em
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contraste a HMG-CoA redutase no afectada pela adio de LDL s clulas dos pacientes, resultando numa superexpresso de colesterol pelas clulas FH. Contudo, experincias subsequentes indicaram que esta anomalia na regulao da enzima HMG-CoA redutase no resultante de mutaes no gene da enzima, em vez disso, a regulao anormal da enzima parecia estar relacionada com uma incapacidade das clulas FH de extrai colesterol a partir do LDL. Brown e Goldstein, em 1974, demonstraram que a leso nas clulas FH resultante de um defeito na ligao do LDL ao seu receptor na superfcie celular.

Esquematicamente:
Fibroblastos humanos normais Adio de LDL Inibe a actividade de HMG-CoA redutase (enzima cuja actividade limita a via de biossntese de colesterol) Clulas dos pacientes Adio de LDL Actividade de HMG-CoA redutase no afectada Resulta numa superexpresso de colesterol pelas clulas FH Mas esta anomalia no resultante de uma mutao no gene da enzima, porque as clulas estavam incapacitadas para extrair colesterol a partir da LDL. Leso nas clulas FH resultante de um defeito na ligao de LDL ao seu receptor na superfcie celular

As experincias
Em 1974 Brown e Goldstein realizaram experincias em que analisaram a ligao de LDL marcado com istopo radioactivo a fibroblastos obtidos tanto de indivduos normais como pacientes de FH.

Os dados das experincias sugerem que os fibroblastos normais possuem um receptor especfico para o LDL que est ausente ou alterado nas clulas FH, eles concluram que o defeito da ligao de LDL observado em clulas FH pode representar uma leso gentica primria nesta enfermidade, respondendo pela incapacidade do LDL em inibir a HMG-CoA redutase e pela resultante superproduo de colesterol. Experincias adicionais demonstraram que o LDL ligado a fibroblastos normais estava associado com a membrana da clula, sugerindo que o receptor de LDL seja uma protena de superfcie celular.
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O Impacto
Aps a identificao do receptor de LDL, Brown e Goldstein demonstraram que o LDL ligado superfcie celular rapidamente internalizado e degradado nos lisossomas, gerando colesterol livre. Posteriormente, em colaborao com Richard Anderson, estabeleceram que o receptor de LDL internalizado por endocitose a partir de regies recobertas por ligantes. Alm disso, os seus estudos iniciais demonstraram que o receptor de LDL reciclado para a membrana plasmtica aps a dissociao do seu ligante dentro da clula.

Trfego de Protenas na Endocitose


Aps a sua internalizao, as vesculas cobertas por clatrina libertam-se das suas coberturas e fundem-se com os endossomas jovens, que so vesculas com extenses tubulares localizadas na periferia das clulas (a fuso mediada pelas protenas de ligao ao GTP Rab). Os endossomas jovens funcionam como um tipo de compartimento de seleco, onde as molculas colectadas pela endocitose so tanto recicladas para a membrana plasmtica como transportadas para os lisossomas, onde so degradadas.

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Os endossomas jovens mantm um pH interno cido (de 6 a 6,2) como resultado da aco da bomba de H+ da membrana, o que leva dissociao de vrios ligantes dos seus receptores dentro do endossoma jovem. A reciclagem para a membrana plasmtica o principal destino das protenas de membrana internalizadas pela endocitose mediada por receptores, com vrios receptores (como o receptor LDL) regressando membrana plasmtica aps a dissociao dos seus ligantes nos endossomas jovens. Ligantes e protenas de membrana que so destinados para a degradao nos lisossomas so transportados dos endossomas jovens para os endossomas maduros (mais cidos que os jovens), que esto localizados prximos ao ncleo. Estes endossomas maduros evoluem para lisossomas e tornam-se ainda mais cidos (pH em torno do 5). Dentro dos lisossomas o material endocitado degradado por aco de hidrolases cidas. Alguns receptores so transportados para os lisossomas, onde so degradados juntamente com os seus ligantes. H um tipo especializado de reciclagem dos endossomas que desempenha uma importante funo na transmisso de impulsos nervosos. As vesculas sinpticas vazias so recolhidas da membrana plasmtica em vesculas cobertas por clatrina, que se fundem com endossomas jovens, a as vesculas so regeneradas, acumulam novos suprimentos de neurotransmissores e so recicladas para a membrana plasmtica, ficando ento disponveis para um novo ciclo de transmisso sinptica.

gEm clulas polarizadas, receptores internalizados tambm podem ser transferidos atravs da clula para domnios celulares opostos da membrana plasmtica (p. e. domnio basolateral endossoma jovem membrana apical), um processo denominado transcitose.

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Captulo 15 Sinalizao Celular


Molculas Sinalizadoras e os seus receptores
Modos de sinalizao clula-clula
Existem 3 tipos de sinalizao: 1. Endcrina, em que as hormona so secretadas por clulas endcrinas e transportadas pela circulao, at chegarem s clulas alvo (estrognios). 2. Parcrina, em que a molcula sinalizadora libertada pelas clulas e actua nas clulas vizinhas alvo (neurotransmissores). 3. Autcrina, que a produo de um factor de crescimento pela clula, que ao ser secretada e recebida pela prpria clula, a vai estimular (sistema auto-imune).

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Modos de sinalizao celular

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Hormonas esterides e a Superfamlia dos receptores nucleares


Todas as molculas sinalizadoras actuam ligando-se aos receptores das clulas alvo. Alguns receptores so expressos na superfcie da clula alvo, mas alguns so protenas intracelulares, localizados no citosol, ou no ncleo. Estes receptores intracelulares responde a pequenas molculas sinalizadoras hidrofbicas que se conseguem difundir atravs da membrana plasmtica. As hormonas esterides so um exemplo clssico, sendo todas sintetizadas a partir do colesterol. Entre elas, incluem-se: testosterona, estrognios, progesterona, corticoesterides, etc. Outro exemplo de uma hormona lipossolvel a hormona tiride.

Aco de hormonas esterides

Devido aos seus caracteres hidrofbicos, estas hormonas so capazes de entrar nas clulas, difundindo-se pela membrana celular. Dentro da clula ligam-se a receptores intracelulares, que so membros da superfamlia dos receptores nucleares. Estes so factores de transcrio que contm domnios para a ligao ao ligando, ligao ao DNA, e activao da transcrio. A ligao do ligando regula funo destes receptores, activando ou inibindo os genes alvo, pelo que estas hormonas esto directamente relacionadas com a regulao da expresso gentica.

Neurotransmissores
Os neurotransmissores transportam sinais entre neurnios, ou de um neurnio para clulas alvo (como as clulas musculares). So pequenas molculas hidroflicas, que incluem: acetilcolina; dopamina; epinefrina (adrenalina); serotonina; histamina; glutamato; glicina; e o cido GABA. A libertao dos neurotransmissores sinalizada pela chegada de um potencial de aco no terminal do neurnio. Os neurotransmissores difundem-se pela fenda sinptica e
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ligam-se aos receptores na superfcie da clula alvo. H neurotransmissores que tambm tm funo hormonal, como a epinefrina. Como so molculas hidroflicas, os neurotransmissores so incapazes de se difundirem atravs da membrana celular. Muitos receptores so canais inicos dependentes de ligandos, pelo que a ligao dos neurotransmissores induz uma mudana conformacional que abre estes canais, resultando num fluxo de ies atravs da membrana. Outros receptores de neurotransmissores esto associados a protenas G, que indirectamente induzem a abertura de canais.

Hormonas Peptdicas e Factores de crescimento


As hormonas peptdicas so hormonas sinalizadoras compostas por aa. Os exemplos mais conhecidos so: insulina, glucagina, hormonas de crescimento. Os neuropptidos so molculas sinalizadoras peptdicas secretadas por neurnios. Funcionam como neurotransmissores, e em certos casos neurohormonas. Os factores de crescimento (FC) so polipptidos que induzem o crescimento e diferenciao de clulas animais. Um exemplo da actividade de um FC a cura de feridas, por parte do FC derivado de plaquetas (PDGF). Este est armazenado em plaquetas, e libertado durante a coagulao sangunea no local do ferimento. Estimula a proliferao de fibroblastos vizinhos, contribuindo para o crescimento do tecido lesado. As citocinas, por outro lado, regulamo desenvolvimento e diferenciao das clulas sanguneas, e controlam a actividade dos linfcitos durante a resposta imunolgica. Existem ainda os FC ancorados membrana da clula, que medeiam interaces directas entre clulas. As hormonas peptdicas, e os FC so incapazes de cruzar a membrana celular, por isso actuam ligando-se a receptores na superfcie das clulas alvo.

Funes dos Receptores da Superfcie Celular


A ligao de um ligando a um receptor na superfcie da clula inicia uma cadeia de reaes intracelulares, chegando em ltima instncia ao ncleo celular, e resultando em alteraes na expresso gnica.

Receptores Acoplados a Protenas G


Os receptores acoplados a protenas G so receptores cuja ligao do ligando causa uma mudana conformacional que activa a protena G. A protena G uma protena da famlia protenas sinalizadoras, que regulada pela ligao do nucletido guanina. O funcionamento das protenas G pode ser descrito da seguinte forma: 1. As protenas G heterotrimricas consistem em 3 subunidades (, e ). A subunidade liga-se a nucletidos de guanina que regulam a actividade da protena G. No estado de repouso, a est ligada ao GDP mais a e ;

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2. A ligao da hormona altera a conformao do receptor acoplado protena G, estimulando a libertao do GDP e a sua troca por GTP; 3. A subunidade ligada ao GTP fica activa e dissocia-se do complexo ( e ); 4. Tanto a , como o complexo e vo actuar sobre as molculas alvo; 5. A actividade da terminada quando o GTP se hidrolisa a GDP; 6. A subunidade inactiva (ligada ao GDP) reassocia-se ao complexo e , voltando tudo ao ponto de partida (de repouso), pronto para um novo ciclo.

Activao hormonal da adenilil ciclase

H vrios tipos de protenas G, e estas ligam-se a diferentes tipos de receptores. Alm disto, algumas subunidades de certas protenas G regulam canais inicos. (neurotransmissor acetilcolina).

Receptores associados a tirosina-cinases


Alguns receptores da superfcie celular esto directamente ligados a enzimas intracelulares, como o caso dos receptores associados a tirosina-cinases, que fosforilam os seus substratos nos resduos de tirosina. Esta famlia inclui receptores para a maioria dos FC polipeptdicos. H muitos tipos de tirosina cinases. Mas o mecanismo pelos quais actuam similar: 1. Os receptores associados a tirosina cinases ligam-se, no domnio extracelular, aos ligandos (exemplo: FC); 2. Activao dos domnios cinases citoslicos; 3. Desta activao resulta uma autofosforilao (fosforilao dos prprios receptores), e uma fosforilao das molculas alvo; 4. Fosforilao das protenas alvo propaga o sinal iniciado pela ligao do FC. Em alguns tipos de receptores, o ligando induz a formao de dmeros (dois receptores iguais juntam-se), o que provoca a autofosforilao da poro citoslica desses receptores. Esta
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autofosforilao aumenta a actividade cinsica, e induz a criao de locais para a ligao com protenas alvo, que sero fosforiladas.

Receptores de citocinas, e Tirosinas cinases no receptoras


Alguns receptores estimulam tirosinas-cinases s quais no esto covalentemente ligados. o caso da superfamlia dos receptores de citocinas. A principal diferena entre os receptores acoplados a tirosina cinases e os receptores de citocinas, que os ltimos esto associados de forma no covalente a tirosinas cinases na sua poro citoslica. Mas apesar desta diferena, o mecanismo semelhante, ou seja, a ligao de um ligando poro extracelular do receptor induz a actividade cinsica da tirosina cinase. Alguns receptores de citocina so usados pelo HIV como receptores da superfcie celular para a infeco dos linfcitos.

Receptores ligados a outros tipos de enzimas


H receptores com outras actividade enzimticas, como o caso dos receptores associados a fosfatases, a serina ou treonina cinases, e guanilil ciclases. As tirosina fosfatases removem grupos fosfato de resduos de tirosina, contrabalanando os efeitos das tirosina cinases. Em certos casos tm efeitos regulatrios negativos na sinalizao celular, terminando os sinais iniciados pela fosforilao de tirosinas cinases. Alguns ligandos peptdicos ligam-se a receptores cujos domnios citoslicos so guanilil ciclases, que catalisam a formao de cGMP. Receptores Guanilil ciclases tm um domnio extracelular que permite a ligao do ligando, pelo que esta estimula a formao de cGMP. O cGMP um mensageiro secundrio.

Vias de transmisso de sinais intracelulares


Na maioria dos casos de estimulao de receptores, uma cadeia de reaces transmite sinais da superfcie celular para uma variedade de alvos intracelulares o processo denomina-se transmisso de sinais intracelular. Alguns dos alvos dessas vias incluem factores de transcrio que regulam a expresso gentica, pelo que tais vias ligam a superfcie celular ao ncleo: estmulos extracelulares levam alterao na expresso gentica.

A via do cAMP: Mensageiros Secundrios e Fosforilao de Protenas


O cAMP uma adenosina monofosfato na qual o grupo fosfato se liga covalentemente aos carbonos 3 e 5, formando uma estrutura cclica. um importante mensageiro secundrio na resposta ao estmulo de diversas hormonas. Um mensageiro secundrio um composto cujo metabolismo alterado pela interao de um ligando com um receptor. Funciona como um transmissor de sinais, regulando vias intracelulares. O ATP transformado em cAMP pela adenilil ciclase e o cAMP degradado a AMP pela cAMP fosfodiesterase. A aco do cAMP repercute-se sobre a protena cinase dependente de cAMP, ou protena cinase A (PKA), da seguinte forma: 1. A forma inactiva da protena cinase A possui subunidades regulatrias e catalticas.
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2. O cAMP liga-se s subunidades regulatrias da PKA, libertando as subunidades catalticas 3. As subunidades catalticas livres ficam activas e fosforilam resduos de serina das protenas alvo. Cada ligando activa apenas um receptor, contudo um receptor por estimular centenas de molculas. E cada uma dessas molculas pode estimular a produo de outras, ao longo da cascata de sinalizao. Assim, a ligao de hormonas a um pequeno nmero de receptores activa um grande nmero de enzimas alvo intracelulares. Em certos casos, o cAMP pode regular canais inicos (sensao de odores).

GMP cclico
O GMP cclico (cGMP) tambm ele um importante mensageiro secundrio em clulas animais. O cGMP formado pela guanilil ciclase, e degradado por uma fosfodiesterase. A estimulao das guanilil ciclases (NO ou ligandos peptdicos) eleva os nveis de cGMP, que vo mediar respostas biolgicas (exemplo: dilatao de vasos sanguneos). A maioria das vezes o cGMP activa protenas cinases dependentes de cGMP, podendo tambm regular canais inicos.

Fosfolpidos e CA2+
Os fosfolpidos e o clcio so mensageiros secundrios comuns, activados a jusante de receptores associados a protenas G ou associados a tirosina cinases. A hidrlise do fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) gera diacilglicerol e inositol 1,4,5 trifosfato (IP3), que activa a protena cinase C e mobiliza o clcio de reservas intracelulares, respectivamente. O aumento dos nveis de clcio intracelulares activam diversas protenas alvo, como as cinases dependentes de Ca2+/calmodulina.

Vias da MAP cinase


As vias da MAP cinase so cascatas de protenas cinases, que transmitem sinais. Os elementos centrais so as MAP cinases, que so activadas em resposta a factores de crescimento, ou outras molculas sinalizadoras. Nos mamferos, as MAP cinases so reguladoras do crescimento celular e diferenciao.

FC + Receptor ocorre troca de GDP por GTP na Ras activa a Raf cinase fosforila/activa MEK fosforila/activa ERK ERK passa para o ncleo e liga-se a regies reguladoras de DNA (activa determinados genes) transcrio protena determina entrada no ciclo celular
Esquema da via das MAP cinases cascatas de fosforilao

Cortesia de Lus Carreto

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Activao das ERK MAP cinases

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Captulo 16 O ciclo celular


A auto-reproduo talvez seja a principal caracterstica das clulas, algo que se aplica a todos os organismos vivos, sejam eles unicelulares ou multicelulares. Todas as clulas se reproduzem dividindo-se em duas, considerando-se uma clula-progenitora que origina duas clulas filha. Estas por sua vez possuem as capacidades de crescer e de se dividir, originando-se, por sucessivas divises, uma populao de clulas com um ancestral comum. As bactrias so o exemplo mais simples desta capacidade, podendo formar colnias de milhes de clulas numa noite apenas, se colocadas em meio adequado sua proliferao. No caso do homem, um organismo multicelular mais complexo, ciclos sucessivos de diviso celular aps a formao do ovo resultam num nmero de 1014 clulas, em mdia. A diviso de todas as clulas um processo que tem de ser cuidadosamente regulado para assegurar a transmisso de genomas intactos s clulas-filhas. Nos eucariontes, a progresso no ciclo celular regulada por uma srie de protenas-cinases, verificando-se, por comparao de leveduras e humanos, que este processo foi conservado ao longo da evoluo. Nos higher eukaryotes, toda a maquinaria envolvida na regulao do ciclo ela prpria regulada por factores de crescimento que controlam a proliferao celular, permitindo, desta forma, uma coordenao com a diviso celular das outras clulas do organismo. Pouco surpreendente o facto de anomalias na regulao do ciclo celular poderem causar uma anormal proliferao de clulas cancergenas. Por isto, o estudo do cancro, do ciclo celular e das vias de sinalizao celular esto interligados.

O ciclo celular da clula eucariota


O ciclo de diviso da maioria das clulas compreende 4 processos coordenados: crescimento, replicao do DNA, distribuio dos cromossas duplicados s clulas-filhas e diviso celular (propriamente dita). Nas bactrias, o crescimento e a regulao do ciclo celular ocorrem ao longo de grande parte do ciclo de diviso, sendo os cromossomas e a membrana plasmtica distribudos s clulas-filhas. Nos eucariotas o ciclo mais complexo e compreende quatro discretas fases. Embora o ciclo celular seja um processo contnuo, pode afirmar-se que a replicao do DNA ocorre durante uma nica fase do ciclo, sendo os cromossomas replicados posteriormente distribudos aos ncleos das clulas filhas por intermdio de um conjunto de processos que precede a diviso propriamente dita. Todo o ciclo regulado, como referido anteriormente.

Fases do ciclo celular


A diviso de clulas eucariotas pode ser estudada por cultura de clulas humanas, que se dividem aproximadamente a cada 24 horas. A observao microscpica do ciclo celular levou sua diviso em duas grandes fases: fase M e interfase. Durante a interfase, que compreende G1, S e G2, a clula prepara a diviso celular. Ao nvel microscpico, nesta fase os cromossomas encontram-se descondensados no ncleo, pelo que este apresenta um aspecto uniforme; ao nvel molecular, a clula cresce e replica o seu DNA. A fase M, embora represente apenas 5% do tempo de
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vida da clula, o processo mais crtico de todo o ciclo, pois nele que ocorre a separao dos cromossas e a citocinese. Compreende uma srie de sub-etapas que sero abordadas mais frente. Clulas embrionrias e clulas estaminais correspondem a dois exemplos em que os ciclos celulares escapam regra geral. Com efeito, aps a fertilizao do ovo ocorrem ciclos sucessivos que incluem, entre as mitoses, apenas uma rpida fase S. No ocorre crescimento celular. No caso das clulas estaminais, estas percorrem a fase G1 e seguem para a fase G0, uma fase de latncia em que as clulas permanecem metabolicamente activas, mas no proliferam, salvo se houver um estmulo externo, como um factor de crescimento. O estudo das fases do ciclo celular requer a identificao das clulas. Enquanto as sub-fases da fase M so facilmente vislumbradas ao microscpio ptico, as fases G1, S e G2 necessitam de uma interpretao bioqumica. Clulas em fases S podem ser facilmente identificadas por autoradiografia, se cultivadas num meio com nucletidos radioactivos durante poucos minutos. Estas anlises permitem estimar o tempo que dura cada uma das fases. Considere-se a situao de se colocarem nucletidos radioactivos num meio com clulas em cultivadas durante diferentes tempos. Clulas que se encontravam na fase S sero observadas durante vrias horas, pois incorporaram os ditos nucletidos. Clulas marcadas radioactivamente em mitose sero observadas apenas passadas 4 horas, o que sugere que entre G2 e Fase M medeia esse intervalo de tempo. Clulas em diferentes fases do ciclo celular apresentam diferentes quantidades de DNA (para pormenores, v. p. 652). Experimentalmente, pode determinar-se essa quantidade (entre 2n e 4n) clulas com recurso a marcadores fluorescentes e a uma posterior medio da intensidade.

Regulao do Ciclo Celular por Sinais de Crescimento e Sinais Extracelulares


A progresso da clula pelas vrias fases do ciclo celular regulada tanto por sinais intracelulares como extracelulares. A prova disso a proliferao de clulas animais em cultura quando expostas a factores de crescimento. Todo a progresso pelas vrias fases do ciclo regulada e acompanhada por uma srie de pontos de controlo que regulam essa mesma progresso. Um destes pontos de controlo, conhecido nas leveduras como START, ocorre no final da fase G1 e controla a transio entre esta e a fase S. Nas leveduras este ponto conhecido como START; quando ultrapassado, as clulas entram em fase S e prosseguem para a diviso. No caso das leveduras, esta passagem muito regulada por factores externos, como a disponibilidade de nutrientes, mas tambm pela dimenso da clula; ainda nestes seres vivos, que podem reproduzir-se por gemulao, importante assegurar que tanto clula-progenitora como clula-filha atingem
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dimenses mnimas para que a diviso possa prosseguir. O START representa, assim, uma verificao da existncia, ou no, das condies necessrias divisog. Na maior parte das clulas animais o processo anlogo, designando-se o checkpoint START por restriction point. No entanto, so factores de crescimento extracelulares que sinalizam a proliferao e determinam a entrada na fase S e no resto do ciclo, diferentemente do que acontece nas leveduras, em que a disponibilidade de nutrientes no meio mais relevante. No caso da ausncia de factores de crescimento durante a fase G1, a clula no progride no ciclo e entra num estado de latncia denominado G0, em que a taxa metablica reduzida. Os fibroblastos so um exemplo pertinente de clulas que permanecem num estado de latncia G0 at que factores de crescimento derivados de plaquetas, extravasados dos vasos sanguneos quando, por exemplo, h uma ferida, estimulam a sua proliferao. Existem tambm clulas eucariotas em que o principal ponto de controlo das condies necessrias diviso feito no final da fase G2, como por exemplo S. Pombe. No caso dos vertebrados, os ocitos ilustram esta regulao, podendo estas clulas ficar retidas na fase G2 vrias dcadas at que um contexto hormonal adequado permite a prossecuo para a Fase M.

Checkpoints do ciclo celular


Os vrios eventos que correm durante os vrios estgios do ciclo celular tm de ser coordenados para que ocorram na sequncia apropriada por exemplo, de extrema importncia que a clula no inicie a fase M antes de ter terminado a replicao do seu genoma (checkpoint G2), para que no se originem clulas filhas com informao gentica incompleta. S depois de terminada a replicao se passa esse checkpoint, podendo a clula progredir. Vrios destes checkpoints G1, S e G2 - tm a funo de assegurar que material gentico incompleto ou danificado no transmitido descendncia; se forem detectados erros, a clula corrige-os antes de atravessar o checkpoint. A paragem do ciclo nalgum destes checkpoints mediada por duas protenas-cinases ATM e ATR que so activadas em resposta a dano no DNA, desencadeando uma via de sinalizao que culmina na reparao do DNA ou, por vezes, na apoptose. Outro checkpoint importante aquele que ocorre no final da mitose e que verifica o estado de alinhamento dos cromossomas, para que se garanta uma correcta distribuio destes s duas clulas-filha. Caso haja erro, a mitose fica bloqueada em metfase at que os cromossomas estejam alinhados.

Restringindo a replicao do DNA a uma nica vez por ciclo


O checkpoint da fase G2 previne, por um lado, o incio da mitose at que a fase S esteja terminada. No entanto, tambm necessrio assegurar que o material gentico se replica uma e uma s vez. Assim, as vrias origens de replicao que apresentam os genomas das clulas dos mamferos tm de ser rigidamente controladas para que, uma vez replicados, os segmentos a que elas correspondam no o voltem a ser.
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O mecanismo molecular que controla as origens de replicao envolve as protenas helicases MCM que a elas se ligam, juntamente com protenas de reconhecimento da origem de replicao. As MCM actuam como factores que controlam o incio da replicao. Assim, as MCM associam-se s origens da replicao exclusivamente durante a fase G1 e abandonamnas assim que a replicao se inicia j na fase S. A ligao das MCM durante as outras fases do ciclo impedida pela actividade das protenas-cinases que regulam a progresso no ciclo.

Reguladores da progresso do ciclo celular


O avano na compreenso dos mecanismos envolvidos na regulao do ciclo celular foi conseguido com a obteno de resultados convergentes obtidos atravs de experincias realizadas em vrias clulas eucaritas. Esses estudos mostraram que o ciclo de todas as clulas eucaritas regulado por protenas-cinases, responsveis pela transio entre os diferentes estgios do ciclo.

Protenas-cinases e regulao do ciclo celular


Trs distintos projectos experimentais contriburam para a identificao das molculas chave envolvidas no processo de regulao do ciclo celular. O primeiro consistiu numa experincia envolvendo ocitos de r cujo resultado foi o seguinte: a microinjeco de um fragmento de citoplasma retirado de uma clula sujeita a um contexto hormonal que promove a meiose induz, quando introduzido numa clula no sujeita a esse contexto hormonal, a transio da fase G2 para a fase M; assim, conclui-se que o factor que promove esta transio nos ocitos (e, de resto, noutras clulas somticas) est presente no citoplasma das clulas. A segunda experincia visou a anlise gentica de leveduras mutantes cujas protenas-cinases responsveis pela regulao do ciclo eram sensveis temperatura. Verificou-se que quando a temperatura no permitia a funcionalidade dessa protena, o ciclo ficava preso no START. Conclui-se tambm que as protenas codificadas pelos genes mutados estudados esto conservadas em todos os eucariontes. A terceira linha de investigao visou o estudo da sntese proteica em embries do ourio-do-mar. Constatou-se que a entrada destas clulas embrionrias na mitose implica a sntese de novas protenas e verificou-se que a concentrao destas protenas designadas por ciclinas A e B - aumentava durante a interfase e caa a pique na mitose, facto que sugere o papel de indutoras da mitose. Esta hiptese foi confirmada por estudos posteriores, com a injeco de Ciclina A num ocito a desencadear a fase M nessa clula. Estas trs linhas de investigao convergiram em 1988, quando se conseguiu purificar MPF Maturation Promoting Factor (um dmero), a partir de ovos. Conclui-se que o MPF um regulador do ciclo muito conservado constitudo por Cdk1 e Ciclina B; esta ltima uma subunidade regulatria da actividade cataltica da Cdk1 (uma cinase), o que consistente com a afirmao de que a actividade do MPF controlada pela acumulao e degradao peridicas de Ciclina B durante o ciclo celular. A Cdk1 tambm regulada por fosforilaes em 3 aminocidos. O esquema ilustra este mecanismo (deve ler-se Cdk1 em vez de Cdc2, conforme o The Cell, 4th Edition).
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ACdc2 forma complexos com a ciclina B durante S e G2. A Cdc2 ento fosforilada no aminocido 161, o que lhe confere actividade, como tambm no aminocido 15 (e tambm no aminocido 14 nas clulas dos vertebrados), o que inibe a Cdc2. A dos aminocidos 14 e 15 activa o MPF ao nvel da transio entre G2 e a fase M. A actividade da MPF terminada no fim da Mitose por degradao proteoltica da ciclina B.

Uma vez fosforilada, a Cdk1 fosforila vrias protenas que iniciam os eventos da fase M. Por seu turno, esta protena estimula tambm a degradao da Ciclina B, que ocorre por um processo de degradao proteoltca mediado pela ubiquinona. Esta degradao, por seu turno, inactiva a Cdk1 e termina a Mitose.

Famlias de Ciclinas e Cinases dependentes de ciclinas


Os estudos acerca da estrutura e funo do MPF (Ciclina B / Cdk1) trouxeram a conhecimento outras protenas da mesma famlia, com diferentes membros dessa mesma famlia a controlar a progresso do ciclo noutras fases. Como referido anteriormente, a Cdk1 controla a progresso no ponto START e tambm o incio da mitose em leveduras. No entanto, esta regulao acontece em articulao com outras ciclinas; assim, a transio de G2 para M mediada por uma interaco da Cdk1 com ciclinas B (1,2,3,4); j a passagem do ponto START mediada por ciclinas G1; a passagem da fase G1 para a fase S mediada por ciclinas B (5,6). As interaces levadas a cabo pela Cdk1 e que permitem a progresso so fosforilativas. O esquema ilustra os principais pares Cdk1/ciclinas envolvidas na progresso das diversas fases do ciclo. Vrios estudos confirmaram, no entanto, que este emparelhamento no estanque. Com efeito, verificou-se que ratinhos mutados para algumas ciclinas D e E e tambm Cdk(2,4,6) so capazes de proliferar, sugerindo uma redundncia no funcionamento destas protenas. A actividade das Cdks regulada por quatro mecanismos moleculares: (1) associao com ciclinas, que so sintetizadas e degradadas periodicamente; (2) fosforilao do aminocido 160; (3) fosforilao inibitria de resduos de aminocidos (posies 14 ou 14 e 15) na poro amino-terminal; (4) protenas inibitrias das CDKs. a combinao e o balano destes mltiplos processos de regulao que dirige a progresso no ciclo celular e, consequentemente, a proliferao.

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Factores de crescimento e regulao das Cdks da fase G1


Como j referido, a proliferao de clulas em animais regulada por vrios factores extracelulares, que tm implicaes vias de sinalizao intracelulares, sem os quais as clulas no avanam no restriction point que existe na poro final de G1, entrando, no caso dessa ausncia, num estado de latncia G0. Um ponto de contacto entre os factores de crescimento extracelulares e a progresso do ciclo so as ciclinas D, cuja sntese induzida por aqueles enquanto os factores esto presentes. Estas protenas so tambm rapidamente degradadas se ocorrer a remoo desses factores de crescimento. Assim, so os pares Cdk(4,6) / CicD que conduzem a passagem do ciclo celular pelo restriction point (v. esquema da pgina anterior). Dada a importncia destas Ciclinas D, entendvel que um descontrolo na regulao (por exemplo, por mutaes em protenas regulatrias) destas protenas possa ter como consequncias uma proliferao descontrolada de clulas cancro. A ligao entre as Ciclinas D, o controlo do ciclo e o cancro ainda corroborado por estudos que mostraram que uma protena RB (provinda de um gene imunosupressor) mutada est envolvida em muitos cancros humanos. Esta protena um regulador de factores de transcrio E2F, controlando a actividade destes ltimos. Assim, uma protena RB no funcional pode determinar uma transcrio de genes (por exemplo para a protena Ciclina E) desregulada e uma falta de coordenao entre esta tarefa e a presena/ausncia de factores de crescimento externos, o que pode comprometer o ciclo celular. O par Cdk2 / Ciclina E, inibido pela protena p27 em G0 e na fase inicial de G1, responsvel pela entrada na fase S. Assim, compreende-se outro ponto de contacto entre os factores de crescimentos externos e as vias reguladores do ciclo internas, j que as concentraes dessa protena p27, inibitria da entrada na fase S, so controladas pelos tais factores externos.

Checkpoints de verificao de erros no DNA


A proliferao das clulas no controlada apenas por factores de crescimento, mas tambm por sinais que inibem a progresso no ciclo. A este nvel, h a considerar os sinais que interrompem a progresso para que DNA possa ser reparado antes que a diviso prossiga. Essa interrupo mediada pelas protenas-cinases ATM e ATR que, detectando problemas na replicao do DNA, fosforilam protenas que medeiam a interrupo do ciclo, como a CHK1 e a CHK2. Estas protenas, por seu turno, inibem fosfatases responsveis pela activao dos pares Cdk/Ciclina, que tanto interrompem o ciclo em G1 como G2. Nas clulas de mamferos, h ainda a considerar a protena p53 - um factor de transcrio que medeia a interrupo do ciclo na fase G1 -, que se mostrou no-funcional em muitos doentes com cancro.

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Captulo 17 Morte e Renovao Celular


Nos organismos adultos, a morte celular tem que ser compensada pela renovao celular, pelo que a maioria dos tecidos contm clulas estaminais capazes de compensar a perda de outras clulas.

Morte Celular Programada


Uma clula pode morrer devido a uma leso traumtica (necrose) que pode ser mecnica, causada por txicos ou qumicos, ou ento por suicdio (morte celular programada), denominado de apoptose. A morte celular programada um processo cuidadosamente regulado, com vista a que o destino de cada clula individual satisfaa as necessidades do organismo como um todo. Nos adultos, responsvel pelo balanceamento da proliferao celular e pela manuteno de um nmero constante de clulas nos tecidos em renovao. Os neurnios e as clulas musculares no sofrem apoptose. A apoptose verifica-se, por exemplo, a nvel da destruio do endomtrio, de clulas do sistema imune, de clulas infectadas por vrus e de clulas com alteraes do DNA. A apoptose essencial na embriognese, por exemplo, na formao dos dedos, na qual as clulas que esto entre os futuros dedos sofrem apoptose; se houver erros neste processo no h separao completa.

Eventos Durante a Apoptose (Fig 17.1)


Comea por haver fragmentao do DNA e condensao da cromatina, seguidas de fragmentao do ncleo e, por fim, fragmentao da clula (esta no rebenta, ao contrrio do que se verifica na necrose), pelo que esta se divide em pequenos corpos apoptticos.

Fagocitose de Clulas e Fragmentos de Clulas Apoptticas (Fig 17.2)


Um dos sinais reconhecidos pela clula fagocitria que remove a clula em apoptose a fosfatidil-serina, que durante a apoptose expressa na superfcie celular em vez de o ser no lado interno da membrana plasmtica. Famlias de Proteases Lisossomais Proteossomas (destroem protenas no citosol) Caspases (responsveis pela apoptose)

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Caspases
As caspases so uma famlia de proteases que conduzem aos acontecimentos que caracterizam a apoptose. Entre os seus alvos esto as lminas nucleares. Elas clivam ao longo da protena logo a seguir ao aspartato, fazendo com que a lmina fique fragmentada (Fig 17.4). As principais aces das caspases so destruir o inibidor da DNase, clivar lminas nucleares e protenas do citoesqueleto, o que conduz fragmentao do ncleo, destruio do citoesqueleto, e fragmentao celular. Todas as caspases so sintetizadas como precursores inactivos, que podem ser convertidos na sua forma activa atravs de clivagem proteoltica, catalisada por outras caspases. Assim, a activao de uma caspase iniciadora desencadeia uma cadeia de reaces que levam activao de caspases a jusante e morte celular. Nas clulas de mamferos, a caspase iniciadora a Caspase 9, que activada ligando-se Apaf1 e formando um complexo com mltiplas subunidades chamado apoptossoma. A formao deste apoptossoma tambm requer citocromo C (cytC), que libertado da mitocndria por estmulos que desencadeiam a apoptose. Uma vez activada no apoptossoma, a Caspase9 cliva e activa caspases efectoras, que levam morte celular.

Reguladores Centrais da Apoptose: A famlia Bcl-2


A famlia Bcl-2 divide-se em 3 grupos funcionais de protenas: 1. Antiapoptticas (Bcl-2) 2. Pro-apoptticas multidomnios (Bax e Bak) 3. Pro-apoptticas BH3-only (Bid, Bad, Noxa, Puma, Bim)

Interaces regulatrias entre membros da famlia Bcl-2 Clula Normal Pro-apoptticas BH3-only esto inactivas Pro-apoptticas multidomnios so inibidas pelas Antiapoptticas. Clula em Apoptose 1. Sinais que desencadeiam a apoptose activam as Proapoptticas BH3-only 2. Pro-apoptticas BH3-only inibem as Antiapoptticas 3. Activao das Pro-apoptticas multidomnios 4. Libertao de cyt C 5. Activao das caspases 6. Apoptose

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As caspases tambm so reguladas pela famlia de protenas IAP, que suprimem directamente a apoptose, inibindo as caspases, e marcando-as para degradao em proteossomas.

Vias Sinalizadoras que regulam a apoptose


Uma das funes da apoptose a eliminao de clulas danificadas. Clulas com genomas danificados so particularmente perigosas pois h a possibilidade de terem sofrido mutaes que possam conduzir ao desenvolvimento de cancro. Assim, danos no DNA desencadeiam a apoptose. Papel do p53 na apoptose induzida por danos no DNA (Fig. 17.9) 1. Danos no DNA 2. Activao de cinases (ATM e CHK2) 3. Fosforilao e estabilizao do p53 4. Aumento dos nveis de p53 5. p53 induz a transcrio dos genes que codifica pr-apoptticas BH3-only (Puma e Noxa) 6. Morte celular Nota: O p53 medeia tanto a paragem do ciclo celular como a apoptose, em resposta a danos no DNA, o que depende da sua extenso (se no se conseguir corrigir os erros ocorre apoptose). Outras vias promovem a sobrevivncia das clulas, inibindo a apoptose. Um exemplo o do desenvolvimento do sistema nervoso dos vertebrados. 50% dos neurnios morrem por apoptose, pelo que os restantes sobrevivem pois recebem quantidade suficientes de sinais de sobrevivncia provindos das suas clulas alvo. Estes sinais de sobrevivncia so factores de crescimento. A maioria das clulas dos animais mais complexos est programada para sofrer apoptose, a no ser que esta seja suprimida por sinais de sobrevivncia provindos de outras clulas. Uma das vias de sobrevivncia celular consiste em factores de sobrevivncia que estimulam um receptor membranar tirosina cinase, que activa uma cadeia de fosforilaes, que lvam fosforilao da protena pr-apopttica BH3-only, mantendo-a estvel na sua forma inactiva. Controla-se assim a supresso da apoptose. Existem alguns pptidos (famlia dos tumor necrosis factor TNF) que induzem directamente a apoptose. Estes TNF ligam-se a receptores da superfcie, induzindo a activao directa de caspases (caspase 8), que activam a protena BH3-only, desencadeando todo o processo que leva apoptose. Nota: No final do captulo encontram-se resumos da matria feitos pelo Miguel Guia.

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Clulas Estaminais e a Manuteno de Tecidos Adultos


De forma a manter o nmero constante de clulas nos tecidos e rgos de organismos adultos, necessrio que a morte celular seja compensada pela proliferao celular. Assim, muitos tecidos possuem uma subpopulao de clulas que se divide continuamente ao longo da vida, substituindo as clulas que nos indivduos adultos tm elevadas taxas de turnover.

Proliferao de Clulas Diferenciadas


A maioria das clulas diferenciadas em animais adultos perde a capacidade de proliferar, e se morrer substituda por outras clulas menos diferenciadas (clulas estaminais renovveis). No caso dos fibroblastos, estes esto dispersos pelos tecidos conjuntivos, secretando colagnio. Os fibroblastos da pele esto normalmente suspensos em G0, mas rapidamente proliferam se for necessrio reparar danos (feridas). Coagulao sangunea no local da ferida liberta o factor de crescimento PDGF, que activa os receptores tirosina cinases , estimulando a proliferao e migrao dos fibroblastos para a ferida, e a secreo de colagnio, que levar reparao do tecido lesado. As clulas do endotlio so estimuladas a proliferar pelo factor de crescimento VEGF, que secretado por clulas privadas de O2, levando ao crescimento de novos capilares em tecidos com falta de suprimento sanguneo. No caso das clulas hepticas, que esto paradas em G0, quando grande quantidade destas se perde, as clulas restantes so estimuladas a proliferar, substituindo o tecido perdido.

Clulas Estaminais
Clulas Estaminais so clulas que se dividem para produzir clulas-filhas, uma das quais se mantm clula estaminal, e a outra se diferencia. Servem para manter os tecidos e rgos de organismos adultos, ao contriburem para a reposio de clulas perdidas. As clulas estaminais foram identificadas em diversos tecidos adultos, como o sistema hematopoitico, a pele, o intestino, msculo esqueltico, crebro e corao.

Aplicaes Mdicas de Clulas Estaminais Adultas


A capacidade das clulas estaminais repararem tecidos ds-lhe um enorme potencial teraputico. Recorre-se a clulas estaminais adultas para reparar danos feitos ao sistema hematopoitico atravs do transplante de medula ssea, e enxertos para reparar a epiderme.

Clulas Estaminais Embionrias e Clonagem Teraputica


Ao contrrio das clulas estaminais adultas, as clulas estaminais embrionrias so fceis de isolar e de propagar. Estas so capazes de se dividir indefinidamente, dando origem a todas as clulas diferenciadas em organismos adultos.

Transferncia Nuclear Somtica


Mamferos j foram clonados por transferncia nuclear somtica, na qual o ncleo de uma clula somtica adulta transplantado para um ovo anucleado. Isto abre as portas clonagem 137

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teraputica, na qual as clulas estaminais embrionrias derivariam de um embrio clonado e usado para transplantao teraputica. ATENO: Para uma compreenso rpida e geral dos mecanismos da apoptose, foram feitos apontamentos pelo Miguel Guia, que ajudam a assimilar a matria.

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