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INTRODUCCIN La clasificacin de los seres vivos ha sido una actividad fundamental del humano seguramente desde que tuvo

uso de razn. Por ejemplo, el poder identificar un grupo de hongos venenosos de un grupo de hongos comestibles hubiera sido una tcnica de sobrevivencia muy til. Sin querer, estos humanos primitivos estaban usando un sistema de clasificacin basado primariamente en caractersticas morfolgicas y posiblemente etolgicas. Este tipo de clasificacin de seres vivos se conoce ahora como sistemtica, o taxonoma (CITA). As como a los primeros seres humanos, la sistemtica nos permite almacenar mucha informacin acerca de lo que nos rodea, y acceder a ella con facilidad. Pero la sistemtica actual no es una slo mtodo si no que se compone de varios como la fentica, la cladstica y la sistemtica filogentica, con la finalidad de obtener una clasificacin ms objetiva de los seres vivos. La fentica se basa en la idea de agrupar taxones por su similitud a nivel global, comparando todos los caracteres posibles de forma matemtica, pero este mtodo ahora es casi obsoleto a causa de los inconvenientes que presenta su forma de analizar datos. En cambio, la cladstica trabaja con clados, organizando a los organismos en grupos que comparten caracteres que han sido determinados objetivamente como evolutivamente significantes. De la cladstica deriva la sistemtica filognica que usa los criterios cladsticos para establecer grupos de organismos monofilticos (descendidos de un solo ancestro comn) en base a su genealoga (Brown, 2008 y Morrone, 2001). Hoy en da se hace uso de la disciplina de la filogentica molecular, que usa secuencias de protenas del ADN como marcadores en los anlisis. Es conveniente usar esos marcadores moleculares porque la informacin contenida en las secuencias de nucletidos es sumamente detallada y pueden decirnos hasta tiempos de divergencia entre especies, basados en la tasa de mutacin de las bases nucleotdicas (Brown, 2008). A la acumulacin de estas mutaciones, o cambios en las frecuencias de las bases, se le conoce como reloj molecular.

Este vara su velocidad de cambio segn la importancia de la protena, y que parte de la protena, en cuestin (Curtis et al., 2006). Se usan distintos marcadores (ribosomales, mitocondriales, etc.) de acuerdo al propsito del estudio y del nivel taxonmico estudiado. Para estudiar taxones menores, por ejemplo en el caso de mamferos, se usaran marcadores ms variables como la regin control o displacement loop (D-loop) porque es la regin con la mayor tasa de mutacin del genoma mitocondrial con dos regiones de rpida evolucin y una ms conservada (Larizzaet al., 2001; Silva et al., 2011). Otro marcador con la misma utilidad es el Citocromo C oxidasa subunidad I (COI), se usa principalmente porque los nucletidos de la tercera base mutan a una velocidad tan alta que su taza de evolucin molecular es casi tres veces la de ADN ribosomal (Herbert et al., 2003), y es la subunidad ms larga del citocromo oxidasa (Luntet al., 1996) La subunidad II del Citocromo c oxidasa, es utilizada por razones similares a la primera y, aunque es ms corta, tiene una seal filogentica fuerte proveniente de la segunda posicin (ms conservada) cuando se consideran muchos taxones en el estudio, y de la tercera posicin (ms variable) cuando se analizan a nivel genrico (Ascunceet al., 2002). Para una comparacin a nivel de gnero, familia y orden se usan marcadores con menos variabilidad como el citocromo b (cyt b) (Hernndez et al. 2001). Hay varios mtodos de reconstruccin filogentica que se emplean para generar resultados grficos (rboles filogenticos). Dos de los ms son el mtodo de Mxima Verosimilotud y el mtodo de Neighbor-Joining. El de primero encuentra rboles filogenticos que tiene una probabilidad muy alta de explicar los datos analizados. Es un mtodo relativamente sencillo, como buen modelo estadstico que slo se aproxima a la realidad, al que no poder asumir dependencia de los datos, porque de ser as sera demasiado complicado para funcionar adecuadamente (Felsenstein, 1981). El mtodo de Neighbor-Joining es ms fcil de emplear por el usuario comn gracias a su alta velocidad de computo y es especialmente acertado cuando se emplean secuencias de

evolucin lenta, o en procesos evolutivos cortos, ya que asume que los procesos evolutivos dentro de los linajes han permanecido constantes a travs de la historia evolutiva (Kumar y Gadagkar, 2000). Con la informacin apropiada se pueden generar diagramas en forma de rboles que muestran la filogenia de un grupo de organismos del punto de vista de distintos marcadores. Se pueden comparar diferentes rboles para tener una imagen ms acertada de la historia evolutiva del sujeto de estudio. En este se analiza la filogenia de los cetceos misticetos, ballenas barbadas, comparando los rboles filogenticos resultantes y, principalmente, evaluar que mtodo y que gen son los ms apropiados en el estudio evolutivo de estos organismos. OBJETIVOS General Verificar el poder del anlisis filogentico molecular, usando secuencias de ADN mitocondrial de misticetos. Particular Identificar y ejecutar los pasos de un anlisis filogentico molecular, aplicando algoritmos de optimizacin robustos como: Neighbor-Joining y Mxima Verosimmilitud. MATERIALES Y MTODOS Se estimaron las relaciones filogenticas existentes entre las 14 especies de cetceos del suborden Mysticetii utilizando cuatro diferentes secuencias del genoma mitocondrial: Citocromo C Oxidasa I (COI), Citocromo C oxidasa II (COII), Citocromo B (Cyt b) y la regin control (D-loop). Tambin se usaron las secuencias del Jabal para utilizarlo como especie fuera. Todas las secuencias fueron obtenidas de la base de datos en lnea National Centerfor Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las alineaciones de las secuencias se realizaron mediante el programa Clustal X versin 2.0 y para las estimaciones

filogenticas se utiliz MEGA 5. Dentro de ste se obtuvo el modelo de sustitucin nucleotdica que se ajustara mejor a cada secuencia para despus crear los rboles filogenticos en base a dichos modelos. Para cada regin mitocondrial analizada se cre un rbol mediante el mtodo de Mxima Verosimilitud (MV) y otro mediante el de Neighbor-Joinig (NJ). En todas las ocasiones los rboles se sometieron a una prueba bootstrap de 1000 replicaciones. RESULTADOS El modelo de sustitucin de ADN que tuvo un mayor ajuste para cada una de las secuencias fue el de Hasegawa-Kishino-Yano (HKY). En el caso de los modelos resultantes para los genes mitocondriales COI, COII y CYT B se registr la presencia de una tasa de sustitucin gama (+G) y sitios invariantes (+I) mientras que para la secuencia de la regin control (D- loop) slo registr una tasa de sustitucin gama sin sitios invariantes. Sin embargo, el modelo HKY no est disponible en el software MEGA 5 para la creacin de rboles filogenticos utilizando el mtodo de NJ; su realizacin slo es posible mediante el mtodo de MV. Por tal razn se opto por usar el modelo Tamura-Nei que fue el mejor se ajust a las secuencias despus del HKY. Los parmetros de sustitucin gama y sitios invariantes fueron similares para ambos tipos de modelos de sustitucin de ADN. Los dos rboles filogenticos obtenidos mediante el anlisis del gen COI fueron estructuralmente muy similares entre s. La diferencia ms marcada radica en el grupo formado por Eubalaena japonica, Eubalaena australis, Balaenoptera mysticetus y Caperea marginata que est presente en el mtodo de NJ pero parcialmente ausente en el modelo MV donde C. marginata se encuentra muy separada del grupo que forman las primeras tres especies (figura 1). En cuanto a tiempos de divergencia se observa que en el segundo rbol las especies ms cercanas son E. australis y E. japnica, seguidas por la mayora de las baleonopteras. La divergencia ms temprana aparenta haberse dado

entre el grupo de los eubalaenidos (incluyendo B. mysticetus y C. marginata) y el resto de las especies (figura 1, izq.).

Figura 1. rbol filogentico realizado a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo C oxidasa subunidad I mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el mtodo MV (izquierda) y NJ (derecha).El nmero indicado en cada rama es nmero de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabal Sus Scrofa. Al igual que en el caso de los rboles filogenticos del gen COI, los obtenidos mediante el anlisis de COII tambin fueron muy similares entre s. En ambos casos C. marginata aparece fuera del grupo formado por E. japonica, E.australis, B.mysticetus tal y como se muestra en el rbol de COI y MV. Sin embargo, difieren en la posicin del grupo formado por Megaptera novaeangliae y Balaenoptera physalus (figura 2). En el rbol de NJ se nota que los grupos que divergieron primero (observado en la longitud de las ramas) fueron los eubalaenidos (con B. mysticetus) del resto, seguido por C. marginata del resto, mientras que los ms cercanos en tiempo son Balaenoptera edeni con Balaenoptera brydeiy por otro lado E. australis con E. japonica (figura 2, izq.).

Figura 2. Arboles filogenticos realizados a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo C oxidasa subunidad II mediante el modelo de TamuraNei y utilizando el mtodo de MV (izquierda) y NJ (derecha). El nmero indicado en cada rama es nmero de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabal Sus Scrofa. Por otro lado, los rboles filogenticos resultantes del anlisis del Citocromo B difieren notoriamente en la estructuras de grupos de tres o ms organismos. Sin embargo, los principales ramas del rbol creado por medio del mtodo de MV presenta valores bootstrap muy bajos (36, 42 y 19) en sus primeras ramas, que agrupan a un nmero grande de especies, por lo que no pueden tomarse en cuenta. Los valores bootstrap del rbol creado por el mtodo de NJ tambin muestra muchos valores bajos en muchas de sus ramas pero en las primeras presenta valores ms grandes que el de MV. An as, cercana relacin entre dos tres especies est muy clara en algunos casos para ambos rboles, como E. australis con E. japonica y B. mysticetus, y Balaenoptera acutorostrata con B. edeni (figura 3). Similar a los dos rboles de NJ anteriores, los tiempos de divergencia ms recientes se observan entre E. australis y E. japonica por un lado, pero difiere en que entre los balaenopteridos muestra una

cercana mayor entre B. edeni y Balaenoptera borealis que entre B. edeni y B. brydei (aunque esto se corrige con un valor relativamente bajo de bootstrap de 56). Tambin excluye a C. marginata como la ms diversificada de todas las dems pero con un bootstrap de solo 56 (figura 3, izq.).

Figura 3. rbol filogentico realizado a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo B mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el mtodo de MV (izquierda) NJ (derecha). El nmero indicado en cada rama es nmero de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabal Sus Scrofa. En un caso ms particular, ambos rboles creados mediante la regin control presentan valores bootsrap bajos para la mayora de sus ramas, en su gran mayora menores a 60. Un caso notorio es el de E. australis y E. japonica que siempre se mantuvieron juntas en los anteriores anlisis con un buen calor bootstrap (76, 89 y 100) slo se mantienen as en el rbol de MV con un valor bootstrap ms bajo, 72 (figura 4). En este ltimo rbol de NJ no se observa divergencia gnica contundente porque todas las ramas son demasiado cortas a excepcin de la del grupo fuera (figura 4, izq.).

Figura 4. rbol filogentico realizado a partir de la secuencia de la regin control mitocondrial mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el mtodo de MV (izquierda) y NJ (derecha). El nmero indicado en cada rama es nmero de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabal Sus Scrofa. DISCUSIN Las relaciones filogenticas entre las especies de misticetos difirieron en cierto grado segn modelos utilizados, mtodos aplicados y genes analizados. El modelo de sustitucin nucleotdica que ms cerca estuvo de explicar los diferentes cambios en las secuencias de todas regiones mitocondriales analizadas fue Hasegawa-Kishino-Yano pero la imposibilidad de aplicarlo para construir los rboles filogenticos mediante los mtodos de MV y NJ result en el desuso del mismo. Tamura-Nei fue aplicado en su lugar, obteniendo dos rboles filogenticos para cada regin mitocondrial. Se observa que el anlisis de la regin control mitocondrial presenta notable una menor confianza de emparentar las especies, pues presenta los valores bootstrap bastante bajos y una elevada sustitucin gama (+G), tanto al comparar grupos de varios organismos as como parejas de ellos. Esto puede

ser el resultado de que el D-loop presenta una elevada tasa de mutacin (Scotto, 2006) y estas mutaciones, al no ser codificantes, son heredadas lo que explica la gran variedad del segmento y los valores bajos obtenidos en nuestros resultados (Gardner et al., 2002). Tambin cabe la posibilidad que al tomar la secuencia completa se hayan establecido relaciones de bloques de secuencias conservadas o repetidas que relacionan a organismos distancialmente emparentados en lugar de relacionar organismos cercanamente emparentados, por lo que se le considera un mal marcador filogentico (Larizzaet al., 2001). Lo que se ha hecho en otros anlisis con el D-loop es tomar fragmentos que no contienen demasiadas variaciones o demasiadas replicaciones y as se establecen relaciones ms certeras (rnason y Gullberg, 1994; Larizzaet al., 2001), pero en el presente estudio se tom en cuenta la totalidad de la secuencia de la regin control. Sin embargo tambin se han realizado trabajos filogenticos con la regin control que emparentan muy bien a las especies de una familia; quiz la diferencia es sus resultados con los nuestros est en que ellos solo se enfocaron a una familia de misticetos mientras que nuestro trabajo abarc a todas las especies de misticetos (Wadaet al., 2003). Los genes mitocondriales, a pesar de mostrar algunos nodos dbiles, tienen muchas ramificaciones muy fuertes y constantes. Por ejemplo, el caso del grupo formado por B. mysticetus, E. australis y E. japonica es muy notorio pues est presente en todos los anlisis realizados tanto por MV como por NJ (Arnason y Gullberg, 1994, Arnason y Gullberg, 1996; Milinkovitch, et al., 1993). Esta similitud gentica se ve reflejada en la morfologa de estas especies como en la cabeza y boca arqueada, el cuerpo robusto, la ausencia de aleta dorsal, etc. Y en el mismo tema es interesante notar que a pesar de su nombre comn, la ballena franca pigmea (C. marginata) no es incluida en la mayora de los anlisis dentro del grupo de balaenidos, salvo en el realizado con Cyt b por MV. Segn Sasaki y colaboradores (2005), C. marginata presenta una divergencia en un tiempo intermedio entre los (eu) balaenidos y los balaenoptridos, emparentndolo igualmente con los dos grupos. El anlisis mostrado en el trabajo refleja un emparentado al 95 con los balenoptridos (similar a los

mostrados por Arnason y Gullberg en 1994 y 1996, con una resolucin de 35 y 54, respectivamente) y menciona que slo caracteres morfolgicos

emparentaban antes a la ballena franca pigmea con las dems ballenas francas. Otro grupo bien diferenciado en el anlisis de los tres genes mitocondriales fue el formado por B. edeni, B. brydei y B. borealis. Estas especies (y Baleanoptera omurai, que casi siempre se encuentra cerca) muestran un cierto grado de separacin de caracteres y de distancia gnica muy corta. Incluso en aos anteriores se pensaba que B. edeni y B. brydei eran la misma especie, por similitudes morfolgicas (Best, 2001) y no fue hasta el descubrimiento de B. omurai que se separaron definitivamente como dos especies mediante anlisis filogenticos (Wada et al., 2003). As mismo todos los anlisis moleculares muestran la relacin entre las dos formas de ballena Minke, la comn que vive en el Hemisferio Norte (B. acutorostrata) y la forma del Antrtico (B. bonaerensis), remarcando as su cercano parentesco. Una asociacin muy interesante fue la de M.

novaeangliae y B. physalus pues se observa que estn ms emparentadas entre ellas que entre las dems especies de su propio gnero (en el caso deB. physalus). Incluso, se sabe de la existencia de hbridos entre sta y B. musculus, pero no con M. novaeangliae (Brub y Aguilar, 1998). Esto nos lleva a creer que M. novaeangliae podra estar ms relacionada al gnero Balaenoptera de lo que se pensaba y una reclasificacin podra ser necesaria. As mismo, E. robustus apareci ms relacionado con los rorcuales que con las ballenas verdaderas, aunque su forma de alimentacin y su falta de numerosos pliegues gulares sugieren lo contrario, lo que indica que podra ser un espcimen intermedio entre ambos linajes de misticetos. En retrospectiva se observa que el gen que aparenta ser ms confiable (mltiples altas resoluciones de bootstrap) es el Cyt b, y tambin es uno de los ms usados en filogenias para cetceos. Por otro lado los dos genes del CO contienen menos resoluciones altas y aunque en este trabajo salieron acertados, no se usan para hacer filogenias. Esto se puede deber a que, cuando se trata de

separar especies muy cercanas, el Cyt b consistentemente funciona mejor que las CO y por tanto investigadores prefieren usar lo que se ha probado ser ms seguro (Amaral et al., 2007). A diferencia de los anteriores los rboles del D-loop salieron con resoluciones muy bajas, muchas por debajo del nivel aceptable (60). Esto pudiera deberse a que como muta muy rpido es apropiado para hacer distinciones inter-especficos o inter-gnicos pero cuando se trata de anlisis de taxones mayores pierde resolucin (Larizza et al., 2001). Finalmente se observ que los dos rboles de cada gen se asemejaban mucho entre s, indicando la validez de los dos mtodos de reconstruccin filogentica. REFERENCIAS Amaral, A., M. Sequeira, y M. Coelho. 2007. A first approach to the usefulness of cytochrome c oxidase I retacean barcodes species. in Marine

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