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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA UFBA Instituto de Cincias Ambientais e Desenvolvimento Sustentvel

RAYARA RIBEIRO DE SOUSA

VALIDAO EM MTODOS CROMATOGRFICOS

Barreiras/BA Outubro de 2012

1.

Introduo
O desenvolvimento de um mtodo analtico, a adaptao ou implementao de

mtodo conhecido, envolve processo de avaliao que estime sua eficincia na rotina do laboratrio. Esse processo costuma ser denominado de validao. Vrias definies esto descritas na literatura para validao, tratando-se portanto de termo no-especfico. Determinado mtodo considerado validado se suas caractersticas estiverem de acordo com os pr-requisitos estabelecidos. Portanto, existe diferena entre a execuo de experimentos que determinam os diversos parmetros (coleta dos dados experimentais) e a validao. Essa deve avaliar a relao entre os resultados experimentais e as questes que o mtodo se prope a responder. O objetivo da validao consiste em demonstrar que o mtodo analtico adequado para o seu propsito (1). A validao deve ser considerada quando se desenvolve ou efetua adaptaes em metodologias j validadas, incluso de novas tcnicas ou uso de diferentes equipamentos. A literatura dispe de vrios trabalhos que relatam a validao de mtodos analticos (2-7) e definem os critrios que devem ser seguidos durante seu desenvolvimento. Dentre esses, muitos so das reas biolgica (2-3), farmacutica (4-5) e qumica (6-7). Tais artigos abordam os critrios de validao de acordo com sua rea especfica, enfatizando a exatido, a preciso e os limites de deteco e quantificao. Este trabalho tem como objetivo apresentar as definies dos parmetros requeridos para a validao de mtodos analticos.

2.

Parmetros Analticos para Validao de Mtodos:


Os parmetros de validao de mtodos analticos envolvem

Especificidade/Seletividade, Funo da Resposta (grfico analtico), Intervalo de Trabalho, Linearidade, Sensibilidade, Exatido, Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutividade), Limite de Deteco (LD), Limite de Quantificao (LQ) e Robustez. Os parmetros envolvidos esto descritos abaixo.

2.1 Especificidade/Seletividade
O termo especificidade, muitas vezes utilizado como sinnimo de seletividade define a capacidade do mtodo em detectar o analito de interesse na presena de outros componentes da matriz. J a seletividade refere-se capacidade de deteco de substncias (4). O processo para demonstrar a especificidade do mtodo depende do seu objetivo. Em diversas tcnicas analticas (como nas anlises cromatogrficas, por exemplo) esse parmetro pode ser estabelecido pela comparao do resultado obtido com a combinao de vrios fatores. Como substncias diferentes podem apresentar respostas similares em dadas condies deve-se proceder anlise, seguida por outras tcnicas comprobatrias (como cromatografia ou eletroforese acoplada espectrometria de massas). Outra maneira de avaliar a especificidade envolve a adio de padro analtico (muito empregada em anlises por espectrometria de absoro ou de emisso atmica) ou a comparao com padro externo (4).

2.1.1 Linearidade

A linearidade refere-se capacidade do mtodo de gerar resultados linearmente proporcionais concentrao do analito, enquadrados em faixa analtica especificada. Esse parmetro pode ser demonstrado pelo coeficiente de correlao do grfico analtico (8-9), que no deve ser estatisticamente diferente de 1 (avaliado pelo teste t de Student), observando-se que a inclinao da reta seja diferente de zero. Assim, necessrio obter coeficiente de correlao estatisticamente igual a um e coeficiente angular diferente de zero. A linearidade pode ser avaliada por meio da anlise de varincia ponderada (ANOVA ponderada). Considera-se que o grfico analtico satisfaz o critrio de linearidade quando quatro grficos mostrarem resultado positivo para esse teste ou quando trs forem lineares (9) e aquele que no satisfizer as condies no nvel de significncia de 0,05 as satisfaa no nvel de 0,01 (Fa 0,05<Fobtido<Fa 0,01). Outra forma de avaliar a linearidade por meio da relao entre a concentrao recuperada e a de fortificao, que deve ser linear (2). Assim, estima-se a capacidade do mtodo em desviar-se linearmente da recuperao ideal (100%) (9).

2.1.2 Preciso
O parmetro que avalia a proximidade entre vrias medidas efetuadas na mesma amostra a preciso do processo analtico. Usualmente, expressa como o desvio-padro, varincia ou coeficiente de variao (CV) de diversas medidas (2, 17). O CV dado pela seguinte equao:

Na qual: s = desvio-padro das recuperaes e M = mdia das recuperaes. A preciso pode ser considerada no nvel de repetitividade, de preciso intermediria e de reprodutividade (2,8). A repetitividade expressa preciso nas mesmas condies de operao (equipamento, analista, reagentes, dia e mesmas condies ambientais) em pequeno espao de tempo. Repetitividade, tambm conhecida como preciso intra-ensaios (9), pode ser avaliada com no mnimo nove determinaes dentro do intervalo de trs diferentes concentraes e trs replicatas cada, ou com no mnimo seis determinaes para uma nica concentrao-teste. A preciso intermediria expressa as variaes no mesmo laboratrio que envolvem diferentes dias, diferentes analistas e diferentes equipamentos, entre outros (10). Tal termo tem sido pouco empregado e esses testes no so comumente citados na literatura. A reprodutividade expressa a preciso entre laboratrios, mediante estudos colaborativos usualmente aplicados para padronizao de metodologias. O mtodo ser considerado preciso quando apresentar nveis de variaes dentro do aceitvel para cada nvel de concentrao.

2.1.3 Exatido
A exatido, definida como a concordncia entre o valor real do analito na amostra e o estimado pelo processo analtico, constitui a chave para o propsito da validao. Os quatro mtodos principais, propostos para o estudo da exatido, so baseados no uso de material de referncia certificado (MRC), na comparao do mtodo proposto com um mtodo de referncia, no uso de ensaios de recuperao na matriz e em estudos colaborativos (10). Os MRC (quando disponveis) so os materiais de controle preferidos, pois esto diretamente relacionados com padres internacionais. O processo de avaliao por meio de MRC consiste em analisar nmero suficiente de replicatas desse material e comparar os resultados obtidos com o valor certificado.

Entretanto, o alto custo do MRC e a abrangncia limitada de matrizes e analitos restringem seu uso. A exatido tambm pode ser estabelecida mediante comparao entre os valores obtidos pelo mtodo proposto com os valores obtidos para as mesmas amostras com outro mtodo validado (mtodo com preciso e exatido avaliadas). Aps anlise de diferentes amostras com ambos os mtodos, as diferenas obtidas para cada amostra so calculadas e comparadas com o valor desejado (nesse caso, zero). Estabelece-se, ento, o nvel de confiana de acordo com o intervalo de concentrao (menores valores de concentrao causam maior disperso dos dados aumentando o limite de confiana) (8). Entretanto, nem sempre se encontra mtodo de referncia preexistente, impossibilitando a utilizao desse tipo de proposta. Estudos colaborativos implicam na aceitao de pelo menos oito laboratrios (nmero mnimo) em desenvolver determinado mtodo. Somente quando for impossvel reunir tal nmero de laboratrios, o estudo poder ser conduzido com o mnimo absoluto de cinco participantes. A maior dificuldade freqentemente encontrada quando se tenta estabelecer a exatido do mtodo por meio de estudos colaborativos envolve a garantia de estabilidade do analito (assegurar que a concentrao do analito, a ser determinada na amostra, permanea estvel durante o decorrer do estudo). Isso torna-se particularmente difcil com compostos lbeis (6). O ensaio de recuperao constitui o mtodo mais utilizado para validao de processos analticos. A recuperao est relacionada com a exatido, pois reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no processo, em relao quantidade real presente na amostra. A exatido expressa como erro sistemtico percentual, inerente ao processo (10). O erro sistemtico ocorre pela perda da substncia devido baixa recuperao da extrao, medidas volumtricas imprecisas ou substncias interferentes na amostra (entre outros). O estudo da recuperao consiste na "fortificao" da amostra (Figura 1), ou seja, na adio de solues com diferentes concentraes do analito de interesse seguida pela determinao da concentrao do analito adicionado. Calcula-se a quantidade percentual recuperada pelo processo (3) usando a frmula:

No estudo da recuperao so realizados testes de significncia, utilizando o teste "t" de Student de acordo com a seguinte frmula:

Na qual: Rec = a mdia das recuperaes obtidas para n repeties; 100 = a recuperao percentual desejada; n = o nmero de determinaes (trabalha-se com no mnimo 5 repeties); SRec = o desvio-padro das recuperaes. Se o valor de t obtido estiver enquadrado no intervalo estabelecido pelo valor tabelado, para n -1 graus de liberdade em dado nvel de significncia, ento o mtodo ser considerado exato.

2.2 Limite de Deteco


A menor concentrao do analito que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada, sob condies experimentais estabelecidas constitui o limite de deteco (9,10).

Analistas, quando desenvolvem mtodos novos ou modificados para anlise de traos, freqentemente definem Limites de Deteco (LD) em termos do desvio-padro de medidas do branco. Entretanto, sendo o branco constitudo de todos os reagentes, com exceo da amostra e do analito, no reproduz as mesmas condies a que o analito estar sujeito durante a anlise. O LD determinado dessa forma pode avaliar mudanas ocorridas durante o desenvolvimento do mtodo, ou para comparao de instrumentos. Entretanto, em relao anlise prtica, esses valores so extremamente baixos e no representam a realidade. O limite de deteco pode ser determinado mediante o sinal/rudo, o desviopadro da resposta e do coeficiente angular e por processos estatsticos. O sinal/rudo pode ser aplicado somente para processos analticos que exibem linha de base. A determinao da razo sinal/rudo realizada por meio da comparao dos sinais medidos da amostra com baixas concentraes conhecidas do analito com as do branco, estabelecendo-se a concentrao mnima na qual o analito pode ser detectado. A razo sinal/rudo com valor 3 geralmente considerada aceitvel para estimar o limite de deteco (10). O limite de deteco pode ser expresso pela equao abaixo:

Na qual: s = desvio-padro da resposta; S = o coeficiente angular do grfico de calibrao (sensibilidade do aparelho). No caso dos processos estatsticos, utiliza-se o "teste de hiptese" para estimar o LD com valores obtidos de vrias medidas do branco pela seguinte equao:

Na qual: tn, 95% = valor tabelado em funo de n (nmero de anlises); sB = desviopadro do branco; S = sensibilidade do aparelho. Quando se obtm poucos valores de medidas do branco ou quando tais valores se apresentam como linha de base, esse tipo de estimativa pode no ser adequado. O LD pode ser estimado pelos experimentos de recuperao mediante o desvio-padro (SA) do menor nvel de fortificao, calculando-se com a partir de sA e SB :

Na qual: m = o nmero de determinaes do menor nvel de fortificao; n = o nmero de determinaes do branco; SA = desvio-padro da amostra do menor nvel de fortificao; SB = desvio-padro do branco. A partir desse valor estima-se o limite de deteco pela equao:

No processo estatstico so considerados todos os efeitos a que o mtodo est sujeito (variaes do branco e variaes da amostra fortificada no menor nvel).

2.3 Limite de Quantificao


O limite de quantificao definido como a menor concentrao do analito, que pode ser quantificada na amostra, com exatido e preciso aceitveis, sob as condies experimentais adotadas (10). Pode ser estimado por meio do sinal/rudo, do desvio-padro e por processos estatsticos. O procedimento sinal/rudo pode ser aplicado somente para processos analticos que exibem linha de base. Efetua-se a determinao da razo sinal/rudo por meio da comparao dos sinais medidos da amostra com baixas concentraes conhecidas do analito com as do branco, estabelecendo-se a concentrao mnima na qual o analito pode ser quantificado. Exemplo de razo sinal/rudo tpica 10:1. O limite de quantificao (LQ) pode ser expresso pela equao abaixo:

Na qual: s = desvio-padro da resposta; S = o coeficiente angular do grfico de calibrao (sensibilidade do mtodo). De acordo com o procedimento estatstico utilizado para anlise de resduos de pesticidas, o LQ corresponde ao menor nvel de fortificao

estudado. A recuperao pode variar entre 70 e 120%, com coeficiente de variao de at 20%.

2.4 Robustez
Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH), a robustez do mtodo a medida da sua capacidade de permanecer inalterado sob pequenas, mas estudadas variaes nos parmetros do mtodo e prover indicao da sua dependncia durante o uso normal. A avaliao da robustez pode ser considerada durante a fase de desenvolvimento e depende do tipo de processo em estudo. Nos testes de robustez so aplicados experimentos estatsticos que examinam, simultaneamente, os efeitos de alteraes em diferentes variveis do mtodo. No caso de mtodos cromatogrficos, as variaes referem-se a diferentes tipos de colunas, temperatura e fluxo, entre outras . Os testes de robustez, em geral, servem para indicar os fatores que podem influenciar, significantemente, a resposta do mtodo estudado. Tal fato fornece a dimenso do problema que ocorre quando o mtodo repetido em diferentes condies ou transferido, por exemplo, para outro laboratrio.

2.5 Estratgia de Validao em Funo da Natureza e do Propsito do Mtodo


A estratgia a ser seguida na validao do mtodo analtico, semelhante a uma corrente de decises, aes e procedimentos. Caso o ltimo passo da validao (interpretao dos resultados da anlise) no fornea resposta satisfatria, o ciclo da anlise poder ser refeito depois da adaptao de um ou mais passos. Para que os resultados sejam confiveis necessrio que as variaes analticas sejam mantidas dentro de limites preestabelecidos por critrios baseados na finalidade de anlise, sistemas analticos e estudos estatsticos (10). Os critrios a serem aplicados para validao de determinado mtodo depende da sua natureza e propsito. Usa-se a distino entre mtodo "novo", "padro" e "modificado" para caraterizar sua natureza. Mtodo padro, nessa definio, o mtodo completamente validado (com todos os parmetros estabelecidos). Por outro lado, os mtodos so tambm classificados de acordo com o seu propsito, por exemplo, qualitativo/quantitativo ou anlise traos versus componente majoritrio.

Os parmetros exatido e preciso constituem a chave para o processo de validao. So requeridos para todos os estudos de validao de mtodos, exceto para aqueles com propsito qualitativo, que se destinam apenas a acusar a presena de um analito. Para a anlise quantitativa de elementos traos necessrio validar os limites de deteco e de quantificao. J para anlises qualitativas obrigatrio validar apenas o limite de deteco. A avaliao do parmetro da linearidade obrigatria para mtodos novos e anlises qualitativas de componentes majoritrios.

3.

Concluso
Os conceitos de validade de mtodos continuam a evoluir e esto sempre sob

considerao. As tcnicas cromatogrficas alvo primordial dos procedimentos de validao, pois envolve monitoramento que dizem respeito a aspectos como sade pblica, monitoramento ambiental, comrcio externo e controle de qualidade de produo. Para que um estudo de validao seja conduzido com sucesso, necessrio que se tenha amplo conhecimento da legislao referente s substncias em estudo (pesticidas, frmacos) e das diretrizes propostas pelas agncias reguladoras que atuam nas reas em questo. O ideal que se faa uma opo por uma linha a ser seguida e que a utilize durante todo o processo. Finalmente, importante esclarecer que a validao de mtodos deve ser planejada antes de seu desenvolvimento e execuo. Sendo assim, correlacionando o

desenvolvimento, otimizao e validao de mtodos de uma maneira lgica e organizada, os laboratrios podem gear resultar bastante eficientes e produtivos.

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