UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PER

ESCUELA DE POST GRADO

UNIDAD DE POST GRADO DE LA FACULTAD DE INGENIERIA QUMICA

EVALUACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES PARA AGUA POTABLE EN EL DISTRITO DE INGENIO HUANCAYO

Ctedra:Calidad de Agua, Efluentes Lquidos yContaminacin Catedrtico:M. Sc.Salvador Tedulo Ore Vidaln Alumnos : GuisellaLahura Romero Pedro Pablo Arteaga Llacza HUANCAYO PER 2012

EVALUACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES YFECALES PARA AGUA POTABLE

1. BASES TEORICAS Y CONCEPTUALES DEL ESTUDIO

1.1. MARCO TEORICO

1.1.1. Generalidades sobre la calidad del agua: El agua es un lquido incoloro, inodoro e inspido que est compuesto por dostomos de hidrgeno y uno de oxgeno (H2O).A la presin atmosfrica normal (760mm de mercurio), el punto decongelacin del agua es a los 0C y su punto de ebullicin, a los 100C. Suspropiedades fsicas se utilizan como patrones para definir, por ejemplo, escalas detemperatura.Puesto que todas las sustancias son de alguna manera solubles en agua, se le conoce frecuentemente como el disolvente universal. El agua se combina conciertas sales para formar hidratos, reacciona con los xidos de los metalesformando cidos y acta como catalizador en muchas reacciones qumicasimportantes. Es uno de los agentes ionizantes ms conocidos. El color del agua sedebe a la presencia de minerales como hierro, manganeso, materia orgnica yresiduos coloridos de la industria (Contreras 2008). Existe una gran presin sobre los recursos hdricos a nivel mundial. Segn la UNESCO(2003) el 69% del agua dulce disponible en el planeta se destina a la agricultura, representael 23% a la industria y el 8% al consumo domstico. Diversos aspectos como la maladistribucin temporal y espacial o la degradacin determinan la actual situacin que seresume en un gran desequilibrio entre la oferta existente y la creciente demanda de agua. En pases en desarrollo como el nuestro, enfrentaremos una mayor competencia por elacceso al agua en las prximas dcadas, debido al crecimiento demogrfico, nuevos hbitosde vida y el desarrollo urbano e industrial sin una adecuada planificacin. Es decir que

seprev un aumento en la demanda hacia las limitadas fuentes de agua (Delgadillo 2010). Segn la UNESCO (2003) el uso que se hace del agua va en aumento en relacin con la cantidad disponible. Los seis mil millones de habitantes del planeta ya se han adueado del 54% del agua dulce disponible en ros, lagos y acuferos subterrneos. En el 2025, el hombre consumir el 70% del agua disponible. Esta estimacin se ha realizado considerando nicamente el crecimiento demogrfico. Sin embargo, si el consumo de recursos hdricos percpita sigue creciendo al ritmo actual, dentro de 25 aos el hombre podra llegar a utilizar ms del 90% del agua dulce disponible, dejando slo un 10% para el resto de especies que pueblan el planeta. De otro lado Barkn (2006), en Mxico condujo el trabajo titulado: La Historia del acceso al Agua Urbana, en el cual analizo la gestin del agua, sealando que aunque las autoridades nos aseguran que ms de 90% de la poblacin tiene acceso al agua potable y que una parte un poco menor tiene conexiones al alcantarillado, la realidad es que el pas est sufriendo grandes estragos por su inadecuada disponibilidad en calidad y cantidad. Un factor que implica ello es la mala administracin del agua que se da en los hogares de la clase media y alta que impone una carga adicional sobre los pobres por su falta de su acceso regular o debido a la mala calidad y escasa agua que reciben. Por tanto, un agua contaminada es un vehculo eficaz de transmisin de la mayora de enfermedades de origen hdrico. Los microorganismos patgenos intestinales se hallan diseminados a lo largo y ancho del planeta.Aquellos, cuya presencia ha sido detectada en el agua para consumo humano, incluyen entre otros:salmonellas, shiguellas, Escherichiacoli, Vibrio cholerae, y

Yersiniaenterocolitica,

EntoamebaHistolitica,

Giardia

Balantidiumcoli, y Helicobacterpilori, esta ultima cuya presencia en el

sistema digestivo, produce ulceras y posteriormente cancer. (Cceres 2002) Esta contaminacin est relacionada con el vertido de agua de desecho de origen domstico e industrial a los cuerpos deagua. En el caso de los residuos de origen domstico, la carga contaminante est representada por altosporcentajes de materia orgnica y microorganismos de origen fecal. El control de la calidad

microbiolgicadel agua de consumo y de desecho, requiere de anlisis dirigidos a determinar la presencia de microrganismos patgenos; los agentes involucrados en la transmisin hdrica son las bacterias, virus y protozoos, que puedencausar enfermedades con diferentes niveles de gravedad, desde gastroenteritis simple hasta casos fatales dediarrea, disentera, hepatitis o fiebre tifoidea (Arcos 2005). Por su parte Solsona (2002), menciona que las guas microbiolgicas de la OMS han sido adoptadas en todo el mundo y estas recomiendan

como

indicadores

de

la

calidad

microbiolgica

lossiguientes parmetros:
Escherichiacoli o bacterias coliformes (fecales) termotolerantes: No se deben detectar en ninguna muestra de 100 ml de agua destinada al consumo humano. Bacterias coliformes totales: No deben ser detectables en ninguna muestra de 100 ml de agua tratada que ingrese al sistema de distribucin. Puede darse una tolerancia de hasta 5% para la ocurrencia ocasional de organismos coliformes en muestras del sistema de distribucin tomadas en un perodo de 12 meses, siempre que no haya presencia de E. coli.

1.1.2. La Problemtica de la Calidad del Agua:

En Amrica Latina y el Caribe el 43% de la poblacin rural no tiene acceso al abastecimiento de agua con una calidad apropiada para el consumo humano y para usos domsticos como la higiene personal.

Se considera que la diarrea es la primera causa de muerte en nios de entre menores de 5 aos de edad, ya que para el 2004, de las 1,8 millones de personas que mueren cada ao debido a enfermedades diarreicas (incluido el clera), un 90% de esas personas son nios de ese grupo de edad, y son procedentes principalmente de pases en desarrollo (OMS, 2004). Para el 2010 1'101,503 personas fallecieron a causa de enfermedades diarreicas (Guerra y La Fuente 2011). Los nios menores de 5 aos aun no tienen completo el sistema inmunolgico y en los pases en desarrollo, la mayor parte de ellos estn afectados por la desnutricin; ya que en general la diarrea es transitoria, en las personas bien alimentadas, y persistente en las mal nutridas. Adems la infeccin repetitiva puede aumentar la desnutricin que, a su vez, incrementa la vulnerabilidad ante nuevas infecciones. Las comunidades rurales se encuentran en permanente riesgo de contraer enfermedades hdricas porque comnmente viven sin acceso a agua segura y a servicios de saneamiento. Las poblaciones que se abastecen directamente de aguas de origen hdrico (ros, lagunas, lagos) se encuentran aun en mayor riesgo debido a que la fuente de agua est expuesta a la contaminacin fecal. Las razones para ello incluyen la carencia de una apropiada disposicin de excretas y factores como la defecacin a campo abierto, las letrinas mal diseadas y la presencia de animales domsticos y silvestres que actan como reservorios de agentes patgenos. Por tanto se piensa que un 88% de las enfermedades diarreicas son producto de un abastecimiento de agua insalubre y de un abastecimiento y una higiene deficientes. Esto quiere decir que una mejora del abastecimiento de agua reduce entre un 6% y un 21% la morbilidad por diarrea, si se contabilizan las consecuencias graves. La mejora del saneamiento reduce la morbilidad por diarrea en un 32%.

Las medidas de higiene, entre ellas la educacin sobre el tema y la insistencia en el hbito de lavarse las manos, pueden reducir el nmero de casos de diarrea en hasta un 45%. La mejora de la calidad del agua de bebida mediante el tratamiento del agua domstica, por ejemplo con la cloracin en el punto de consumo, puede reducir en un 35% a un 39% los episodios de diarrea (OMS 2004). En el Per, para el 2008, solo el 61% de la poblacin rural tena acceso a fuentes mejoradas de agua potable, frente al 90% de la poblacin urbana y 36% de la poblacin rural tena acceso a servicios de saneamiento mejorados frente al 81% de la poblacin urbana. Este se ve reflejado en la distribucin de las causas de muerte en menores de 5 aos, en donde las diarreas representa en 4% para el 2008 (OMS 2010). En el mes de diciembre del 2010, el agua potable producidapor 22 Empresas Prestadoras de Servicios de Saneamientoregistr 98 millones 857 mil 500 metros cbicos,representando en trminos porcentuales un incremento de0,3% comparado con el volumen alcanzado en el mismomes del 2009. Mientras que, aument en 5,5% respecto almes de noviembre del 2010.Asimismo, para el periodo enero-diciembre la produccinacumulada de agua potable totaliz 1 mil 150 millones137 mil 300 metros cbicos, cifra superior en 1,2%, respectoa igual periodo acumulado del 2009 (1 mil 136 millones 926 mil metros cbicos) (INEI 2011). La contaminacin del agua de los ros es causadaprincipalmente por el vertimiento de relaves mineros (partealta y media de la cuenca), aguas servidas urbanas ydesages industriales a lo largo de todo su cauce(generalmente en la parte media y baja de la cuenca).Dicha contaminacin es resultado de la presencia deelementos fsicos, qumicos y biolgicos, que en altasconcentraciones, son dainos para la salud humana y elecosistema. Cabe indicar, que la calidad de

agua tambin seve afectada por el uso de plaguicidas y pesticidas en la actividadagrcola. Todo ello, ocasiona un gasto adicional en el tratamientodel elemento, es decir, cuanto ms contaminada est el agua,mayor es el costo del proceso para reducir el

elementocontaminante, ya que se debe realizar el respectivo tratamientopara hacerla potable (INEI 2011). En el 2009 la EPS Mantaro SAC ha tenido una produccin de agua potable de 5 332 miles de metros cbicos con una cobertura del 99% y una produccin percpita de 313 Lt/hab/dia (INEI 2011). Los efectos en la salud de las enfermedades transmisibles por el agua varanen severidad desde una leve gastroenteritis hasta casos graves de disentera,hepatitis, clera, fiebre tifoidea y diarrea severa. La diarrea sola esresponsable de la muerte de 1,8 millones de personas por ao a nivel mundial.Se estima que el 88% de las muertes son atribuibles a la falta de higienesanitaria y agua potable y con especial incidencia en nios en pasesperifricos. Una gran cantidad de enfermedades podra ser prevenida a travsdel acceso al agua limpia, infraestructura sanitaria adecuada y mejoresprcticas de higiene(Greenpeace 2009). Por otro lado el CEDE (2012), sostiene que una vez que la persona ingiere agua contaminada, la mayora de los microorganismos se multiplican en el aparato digestivo y se excretan en las heces.Si no se dispone del saneamiento adecuado, dichos microorganismos pueden llegar a las corrientes de agua e infectar a otras personas. Los que corren mayor riesgo son los lactantes y nios pequeos, as como las personas que viven en condiciones insalubres, los enfermos y los ancianos. Los sntomas pueden variar, pero generalmente incluyen diarrea, que es una de las principales causas de muerte en nuestros das. A continuacin se mencionan algunas de las causas y sntomas de las enfermedades transmitidas por el agua ms comn en la Regin:

 Tifoidea

Esta enfermedad infecciosa se caracteriza por fiebre continua. Otros sntomas son diarrea o estreimiento, cefaleas, dolores musculares y fatiga. La tifoidea es transmitida por los alimentos o el agua contaminada por las heces de una personas que padezca la enfermedad o sea portadora de la misma. Los pescados y mariscos y la leche son tambin medios de transmisin importantes, Cualquiera puede contraer esta enfermedad.
La Hepatitis A

Se trata de una enfermedad vrica sumamente contagiosa que causa una infeccin heptica leve. Los sntomas pueden ser fiebre, nusea, dolores abdominales, prdida del apetito e ictericia. La transmisin quiz ocurra por contacto directo de persona a persona, por consumo de agua o hielo contaminados, o por pescados y mariscos cosechados en agua contaminada con aguas residuales, o por frutas, hortalizas u otros alimentos que se comen sin cocinar, si estos se han contaminado durante su manipulacin
Clera

Es una enfermedad diarreica aguda, causada por infeccin intestinal. Es probablemente la ms conocida de las enfermedades diarreicas, ya que la mayora de las personas han odo hablar de ella. La infeccin suele ser leve y sin sntomas, pero puede ser grave. Puede contraerse de casos activos de la enfermedad o de sus portadores, simplemente con ingerir alimentos o agua contaminados. Tambin se sabe que el clera se transmite por ingestin de pescados y mariscos crudos. Esta enfermedad no se propaga directamente de una persona a otra, por lo que no se corre riesgo de contraerla mediante el contacto social ordinario con una persona infectada.
Criptosporidiosis

El criptosporidio es un parsito que se encuentra comnmente en lagos, ros, arroyos y estanques, especialmente cuando el agua ha sido contaminada con aguas residuales y desechos de animales. La infeccin puede contraerse de varias maneras: al beber agua contaminada, o comer alimentos crudos o poco cocinados que hayan sido contaminados con oocistos (una especie de huevo que constituye la etapa infecciosa del parsito) de criptosporidio; por contacto directo con las heces animales o seres humanos infectados; o por transferencia mano-boca de los oocistos presentes en superficies que hayan sido contaminadas con pequeas cantidades de heces de una persona o animal infectados. Los sntomas son diarrea, nusea, retortijones y fiebre baja. Hasta la fecha no se conoce ninguna forma segura y eficaz de tratamiento para esta enfermedad. La calidad microbiolgica del agua puede variar muy rpidamente y en gran medida. Pueden producirse aumentos repentinos de la concentracin de agentes patgenos que pueden aumentar

considerablemente el riesgo de enfermedades y desencadenar brotes de enfermedades transmitidas por el agua. Los anlisis de la calidad microbiolgica del agua normalmente tardan demasiado para que sus resultados puedan ser tenidos en cuenta por los responsables de la adopcin de medidas para evitar el suministro de agua insalubre (OMS 2006).
1.1.3. Indicadores Microbiolgicos de la Calidad del Agua:

El diagnstico de estos microorganismos, requiere laboratorios especializados y representa varios das de anlisis y costos elevados. Como alternativa a estos inconvenientes, se ha propuesto el uso de indicadores microbianos que se puedan identificar mediante el uso de mtodos sencillos, rpidos y econmicos. El diagnostico y posterior recuperacin de las fuentes de agua naturales contaminadas, debe hacerse adems, teniendo en cuenta las

implicaciones que en trminos ecolgicos y sanitarios representa la degradacin del recurso. En este sentido, las microalgasperifiticas se constituyen como buenos indicadores del estado trfico de los ecosistemas y responden a los disturbios ocurridos modificando su estructura en cuanto a composicin y abundancia se refiere (Arcos 2005). Las coliformes fecales son un grupo grande de

microorganismos,habitantes usuales de los intestinos de los animales superiores. Estos microorganismos son defcil identificacin

comparados con los microorganismos patgenos, que normalmente seencuentran en mucho menor nmero y cuya identificacin es laboriosa. La presencia decoliformes en una muestra no siempre indica que el agua est contaminada conmicroorganismos

patgenos, sino que, en trminos estadsticos, su concentracin puede ydebe servir como parmetro para alertar sobre la existencia de contaminacin fecal y demicroorganismos patgenos (Guimares y Litter). En la presente tabla se incluyen los microorganismos ms representativos causantes de enfermedades de origen hdrico (Tabla N 01).
Tabla N 01: Patgenos y enfermedades de Origen Hdrico PATGENOS Bacterias: Compylobacterjejuni Escherichiacoli Legionellapneumophila Salmonella Shigella Vibrio Cholerae Yersiniaenterocoltica Protozoarios: Cryptosporidium Entamoebahystoltica Giardialamlia Noegleriafowleri Enterovirus: Diarrea Disentera amebiana Diarrea Meningitis Ceflica Gastroenteritis Gastroenteritis Enfermedades respiratorias agudas Salmonelosis, tifoidea, paratifoidea Disentera bacilar Clera Gastroenteritis ENFERMEDAD CAUSADA

Adenovirus

Enfermedades Infecciones gastroenteritis. en

respiratorias, los ojos,

Astrovirus Caicivirus Coxsacklevirus

Gastroenteritis Gastroenteritis Meningitis, enfermedades

respiratorias, miocarditis Echovirus Meningitis, diarrea, fiebre,

enfermedades respiratorias Hepatitis Viral A Norwalk virus Poliovirus Rotavirus Infecciones Hepticas Diarrea, Vmitos y fiebre Meningitis, parlisis Diarrea, Vmitos Fuente: Adaptado de Tomasini 2003

1.1.3.1.

Coliformes Totales

El grupo coliforme se define como todas las bacterias Gram negativas en forma bacilar que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37 C, produciendo cido y gas (CO2) en 24 horas, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimtico de la B-galactosidasa (Ministerio de salud, 1998). Entre ellos se encuentran los diferentes Escherichiacoli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. (OPS 1987) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008) La prueba mas relevante utilizada para la identificacin del grupo Coliformes, es la hidrlisis de la lactosa. El rompimiento de este disacrido es catalizado por la enzima B-DGalactosidasa. Ambos monosacridos (la galactosa despus es transformada en glucosa por reacciones bioqumicas) posteriormente son metabolizados a travs del ciclo glicoltico y ciclo del citrato. Los productos metablicos de estos ciclos son cidos y/o CO2. Para la determinacin de la BGalactosidasa se utilizan medios cromgenos tales como chromocult. (MANAFI, 1998) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008).
1.1.3.2. Enterobacteraerogenes

Genero de bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, de la familia de Enterobacterias, muchas son patgenas y son causa de infecciones oportunistas en huspedes

comprometidos generalmente hospitalizados, causa infeccin del tracto urinario y de tracto respiratorio. (Loessner M, et al. 1993) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008). Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque tambin libremente en el suelo y agua; sus colonias son grandes y mucosas, algunas cepas llegan a formar cpsula, como fuentede carbono pueden utilizar glucosa y lactosa, no forman sulfato de hidrogeno. (Shekhar N.C et al. 2007) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008). Carrillo y Lozano (2008) mencionan que la Escherichiacoli y Enterobacteraerogenes, son dos bacterias idnticas en muchas formas superficiales, ambas fermentan lactosa produciendo cido y gas, son bacilos Gram negativos pero en agar EMB, E.coli produce un subproducto del metabolismo de dicho azcar que reacciona produciendo un brillo metlico en la luz reflejada y Enterobacteraerogenes no lo hace, en cuanto a pruebas bioqumicas se presenta la siguiente comparacin:
Tabla N 02: Pruebas Bioqumicas de deteccin de E. Coli y E. Aerogenes

Prueba Bioqumica Produccin de Indol Rojo de Metilo VogesProskauer Citrato Lisina descarboxilasa Hidrlisis de la esculina Utilizacin de malonato Arginina deshidrolasa

E.coli EnterobacterAeroge nes

+ + + + + + + +

Fuente: Gamazo .C, et al. 2005 mencionado por (Carrillo y Lozano 2008).

1.1.3.3.

Coliformes Fecales

Los

coliformes

fecales

tambin

denominados

coliformestermotolerantes, llamados as porque soportan temperaturas hasta de 45C, comprenden un grupo muy reducido de microorganismos los cuales son indicadores de calidad, ya que son de origen fecal. En su mayora estn representados por el microorganismo E. coli pero se pueden encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacterfreundii y Klebsiellapneumoniae estos ltimos hacen parte de los coliformestermotolerantes, pero su origen se asocia

normalmente con la vegetacin y solo ocasionalmente aparecen en el intestino. (HAYES; 1993)mencionado por (Carrillo y Lozano 2008). Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes totales, pero se diferencian de los dems microorganismos que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su rango de temperatura ptima de crecimiento es muy amplio (hasta 45C) y son mejores indicadores de higiene en alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia de contaminacin fecal de origen humano o animal, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este porcentaje disminuye hasta un 59%. (GOMES; 1999) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008).
1.1.3.4. Escherichiacoli

Originalmente llamada Bacteriumcomune, fue aislada por primera vez en 1985 a partir de heces de nios; son bacilos estrechos de 1,1 a 1,5 m de dimetro y de 2 a 6 m de longitud, se encuentran solos o en parejas, Gram negativos, mviles por flagelos pertricos o inmviles, anoxignicos

facultativos, poseen metabolismo respiratorio y fermentativo. (LEMINOR, 1994). Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes capaces de producir indol a partir de triptfano, en 21 +/- 3 horas a 44 +/- 0.5C. Tambin poseen la enzima BGalactosidasa, que reacciona positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden descarboxilar el cido L- glutmico, pero no son capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio (KCN). (MILLIPORE; 2005). E. coli es la nica especie dentro de las Enterobacterias que presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil-p-D-glucornico (MUG), formando 4-metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta. (MANAFI, 1998). E.coli presenta caractersticas bioqumicas importantes que permiten la diferenciacin con otros coliformes, como ser positivo para la prueba de indol. El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovac's descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano (HOPKINS,K.L y HILTON, A.C. 2000)

Tabla 4. Caractersticas de Coliformes Totales y E. coli

COLIFORMES TOTALES Bacterias Gram Negativas No esporulados Anaerobios facultativos Fermentadores de la lactosa

E. COLI
Bacterias Gram negativas No esporulados Anaerobios facultativos con Fermentadoras de la lactosa con produccin de

produccin de cido y gas a 36+/- 1C en cido y gas a 36 +/- 1C en 24-48 horas y 44.5 24-48 horas Hbitat: Tracto gastrointestinal +/- 0.2C en 24 horas de Caractersticas de heces de animales

animales de sangre caliente (bacterias homeotermos entricas) son comunes en otros

ambientes (suelos, vegetales, agua)

Fuente: Memorias seminario internacional: El agua y los riesgos para la salud

1.1.3.5.

Salmonella spp.

Bacilo corto (1.2 m). Gram negativo, no esporulado y generalmente mvil con flagelos pertricos. El gnero

Salmonella contiene unas 2000 cepas distintas (denominadas serovares o serotipos) de acuerdo a sus antgenos O y H. Salmonella spp se caracteriza bioqumicamente por su capacidad de fermentar la glucosa con produccin de cido y gas y por su capacidad de hidrolizar la lactosa y la sacarosa. Su temperatura ptima de crecimiento, como la de la mayora de las bacterias causantes de toxiinfecciones alimentarias esta prxima a los 37C; son relativamente fotosensibles y se destruyen a 60C en unos 15 20 minutos, siendo incapaces de crecer por debajo de los 7 u 8C (Doyle; et al.; 1997)
1.1.4. Tcnica De Filtracin Por Membrana Para Deteccin De Coliformes Totales Y Fecales

Carrillo y Lozano (2008) mencionan que para la determinacin de coliformes totales y fecales en agua potable, la legislacin colombiana en la resolucin 2115 de 2007, recomienda entre otras tcnicas, la de filtracin por membrana.

La tcnica de filtracin por membrana utiliza un mecanismo mediante el cual se atrapan en la superficie de una membrana

microorganismos cuyo tamao es mayor que el tamao del poro (0.45 m); esto gracias a una bomba elctrica que ejerce una presin diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los microorganismos de tamao menor que el especfico del poro pasan la membrana o quedan retenidos en su interior, las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego esta es llevada a un medio enriquecido, selectivo o diferencial, quien a travs de intercambio metablico y una incubacin, evidencian el crecimiento de

microorganismos y Unidades Formadoras de Colonia. (APHA AWWA - WPCF, 2000). Esta tcnica es altamente reproducible y proporciona resultados numricos, es una manera rpida y simple de estimar las poblaciones bacterianas en el agua, y especialmente til al evaluar grandes volmenes o al realizar diariamente muchas pruebas de Coliformes (HACH, 2000). El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plstico resistente a autoclave, porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo, unido a una base por un artefacto de cierre que se mantiene en su lugar mediante una fuerza magntica. El diseo debe permitir que la membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa, sin que sufra dao mecnico, de manera que todo el lquido pase a travs de la membrana durante la filtracin. (APHA, 1992)
1.1.4.1. Filtros de membrana

Se deben utilizar filtros de membrana con un dimetro de poro que permita una completa retencin de las bacterias coliformes. Solo se emplean filtros en los que se haya comprobado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por garanta del fabricante, que permita una retencin de las bacterias coliformes. (APHA, 1992).

Se debe tener en cuenta, que dichos filtros deben ser libres de qumicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtracin

satisfactoria, ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de +/- 0.2 unidades) y que no produzcan un aumento en el nmero de colonias confluentes o expansivas, en comparacin con los filtros de membrana de control (APHA, 1992). Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen que la tcnica de esterilizacin no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades fsicas o qumicas de la membrana, si estas se esterilizan en el laboratorio se deben someter al autoclave por 10 minutos a 121C. (APHA, 1992). El mecanismo de accin es muy simple: retienen todas las partculas que posean un tamao mayor que los poros, estos poros quedan formados por los espacios que resultan de la superposicin de las fibras de las distintas capas que forman la membrana, as algunas partculas de menor tamao son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partculas retenidas previamente (PEARCE, 2007)
1.1.4.2. Tipos de filtro de membrana 1.1.4.2.1. Filtros de profundidad

Estn elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vas tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayora de los contaminantes presentes. Presenta ventajas como la alta capacidad de retencin de partculas sobre su superficie y a travs de toda su estructura y que permiten filtrar grandes volmenes. Presenta

desventajas en cuanto a que no presentan un tamao de poro uniforme y existe la liberacin, hacia el material filtrado, de partculas y microorganismos que hayan crecido dentro del filtro.(Carrillo y Lozano 2008).
1.1.4.2.2. Filtros de superficie o membrana

Elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa, contienen poros de tamao uniforme. Se pueden saturar rpidamente y la velocidad de filtracin a travs de ellos es lenta.(Carrillo y Lozano 2008).
1.1.4.2.3. Membrana de nitrato de celulosa

La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricacin de filtrosde membrana. Estas membranas son de naturaleza hidroflica, con una microestructuramuy uniforme lo que permite excelentes niveles de retencin de partculas y uncomportamiento perfecto en pruebas

microbiolgicas.

(http://fanoia.com/filterlab/micro-8-

15.pdf)Tienen una estructura de poro muy uniforme,lo que asegura una excelente retencin y un ptimo crecimiento microbiolgico en muestras de agua, bebidas,

frmacos(PEARCE, 2007).
1.1.4.2.4. Membrana de acetato de celulosa

Son

de

naturaleza

hidrofilia,

presentan

una

excelente

estabilidad trmica, permiten gran capacidad de carga y altasvelocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para la esterilizacin y clarificacin de soluciones acuosas, alcohlicas y aceites. Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazados por la superficie de la membrana y el remanente permanecen o se concentra all. El volumen del fluido y otras partculas finas de menor tamao del poro pueden pasar a travs de la membrana al sitio de filtrado (PEARCE, 2007).

Tabla 6. Aplicaciones de los filtros de membrana Filtros de nitrato de celulosa Filtracin de aguas Anlisis microbiolgico Anlisis gravimtrico Anlisis cualitativos de partculas Esterilizacin de muestras Determinacin de protenas Identificacin de cidos nucleicos Pre filtracin de muestras Clarificacin de muestras Fuente. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf Filtros de acetato de celulosa Esterilizacin de muestras de protenas Esterilizacin de fluidos biolgicos Filtracin de alcoholes Filtracin de aceites Filtracin de muestras de aguas

1.1.5. Medios De Cultivo

Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en donde crecen, y se multiplican los microorganismos, con el objetivo de aislar diferentes especies de microorganismos que induzcan al desarrollo de estrategias complementarias de identificacin, cuantificacin, caracterizacin de la microflora (Tortora, G. 1993). De la inocuidad y de la capacidad de recuperacin del medio de cultivo, as como de su posterior manipulacin dependen en gran medida los resultados de una prueba microbiolgica. (Tortora, G. 1993). Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera: Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos Segn su finalidad: No selectivos: contienen los nutrientes suficientes para soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.
Selectivo: permite el crecimiento de solo un tipo de microrganismo. Enriquecido: son medios no selectivos a los que se le agregan sustancias como sangre, suero, albumina, etc., para

microorganismos exigentes. Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre diferentes tipos de microorganismos. (ISO\TS 11133-2: 2003)

La composicin qumica del medio de cultivo debe proveer losrequerimientos nutricionales bsicos para el crecimiento

demicroorganismos, sin embargo un medio de cultivo debe cumplir con dos caractersticas muy importantes. La selectividad y

laproductividad. Su productividad se refiere a la formulacin bsica del medio de tal forma con las que favorezca el crecimiento de y

microorganismos

caractersticas

macroscpicas

microscpicas esperadas. (Tortora, G. 1993). Adems de las caractersticas anteriormente mencionadas, existen otras pruebas de control de calidad que se realizan a los medios de cultivo, entre ellas podemos encontrar: propiedades bioqumicas (diferenciales y diagnosticas), propiedades fsicas (pH, volumen) y la especificidad (cuando se trate de medios con caractersticas de diferenciales) (ISO\TS 11133-2: 2003).
1.1.5.1. Medios cromgenos

Basados en sustancias qumicas que aadidas al medio dan un precipitado coloreado que demuestra la presencia de una enzima especifica, si el microorganismo posee el sistema enzimtico para utilizar el sustrato, se produce un cambio decolor visible en las colonias. Son medios rpidos, sencillos y fiables para detectar actividades enzimticas especificas de varios organismos. (Tortora, G. 1993).
1.1.5.1.1. Medio Chromocult para Coliformes

Es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en muestras de aguas y alimentos. Por la accin conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampn de fosfatos se garantiza un rpido crecimiento tambin de coliformes con daos sublaterales. El contenido de lauril sulfato inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de los coliformes. La formacin simultnea de coliformes totales y E. coli se hace posible por

la nueva formacin de dos sustratos cromgenos: el sustrato Salmon Gal es separado por la enzima p-D-

galactosidasacaracterstico de coliformes y provoca una coloracin roja de las colonias de coliformes. (MERCK, 1998). La formacin de la p-D-Glucoronidasa caracterstica para E. coli tiene lugar mediante el sustrato X- glucornido, que al ser cortado por la encima produce una coloracin azul para las colonias positivas. Ya que E. coli separa tanto Salmon-Gal como X- Glucornido, las colonias se tien de violeta - azul oscuro y debido a ellos se pueden diferenciar de los coliformes restantes que se presentan de color rojo. (MERCK, 1998). El contenido de triptfano mejora la reaccin de indol para la confirmacin adicional de E. coli que se d con el reactivo de kovac's y aumenta con ello la confirmacin de la reaccin Salmon -Gal y la reaccin X-Glucornido (MERCK, 1998).
1.1.5.2. Ventajas de los medios cromgenos frente a los convencionales.

La identificacin bacteriana se basa generalmente en una extensa batera de pruebas bioqumicas convencionales, que permiten determinar sus caractersticas de desarrollo y de metabolismo; estos mtodos requieren una colonia

bacterianapura, tomada de una placa de aislamiento primario, su siembra en diferentes medios y su posterior lectura e interpretacin. En la mayora de los casos el diagnstico lleva tiempo y varios pasos de manipulacin. Los sustratos enzimticos sintticos realizan la identificacin de microorganismos por medio de la formacin de color que ponen de manifiesto la presencia de enzimas especficas para cada especie. En general se distinguen grupos de compuestos cromognicos que han sido usado en reacciones bioqumicas para estudiar

la cintica de enzimas especificas, de acuerdo al principio, que el sustrato es hidrolizado por la enzima especifica, liberando un cromforo, permiten identificar un microorganismo

especfico en un tiempo, evitando una cantidad de pasos que hacen mas tedioso el trabajo de identificacin, logrando visualizar de forma rpida especies diferentes en una misma muestra analizada. (Moreno. C. 2004) 2.5. VALIDACIN Validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso especifico producir de forma consistente productos que reunirn las caractersticas de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA, 1987). Este proceso adems ofrece evidencia de que un mtodo es capaz de servir para su propsito planteado, para tal fin se deben reflejar las condiciones reales de ensayo, esto puede conseguirse usando productos contaminados o productos inoculados con un nmero conocido de microorganismos (ENAC, 2002; GTC 84, 2003). El proceso de validacin se inicia con las actividades de pre validacin, las cuales consisten en la recopilacin de la informacin relacionada con el proceso, en la revisin de las evaluaciones de riesgos, la calificacin tcnica a las instalaciones locativas y a los equipos, existencia de procedimientos para las tareas u operaciones y el

entrenamiento a los trabajadores. Posteriormente se procede a elaborar los protocolos en donde se define los objetivos especficos de las evaluaciones a efectuar, las

responsabilidades de cada una de las reas involucradas en la validacin, se establecen las variables de 17

inters que se quieren monitorear y el plan de monitoreo respectivo, adems de incluir los criterios de aceptacin que no son otra cosa que la comparacin de los resultados con los niveles permisibles o los resultados esperados. (Estrada C, 1999) A continuacin se desarrolla la validacin propiamente dicha en donde se realiza una evaluacin de una muestra representativa, en nmero de lotes de produccin si la produccin es por lotes o en tiempo si esta es continua. Durante esta fase se recopilan las muestras de las variables que se desean medir y se realizan los anlisis o clculos respectivos. Finalmente con los resultados arrojados por el proceso anterior se hacen las recomendaciones respectivas y conclusiones, que despus de cumplir un plan de accin se cierran y se procede a declarar el proceso como validado. (Estrada C, 1999) Para la recuperacin e identificacin microbiana, los anlisis microbiolgicos, son ajustables a veces, a mtodos alternativos a los descritos en la USP por diversas razones: econmicas, de produccin, y tiempo. Por tanto estos mtodos requieren ser validados. (USP 31, 2008) En Los mtodos microbiolgicos alternativos es importante tener en cuenta un cierto grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas microbiolgicas por conteo en placa convencional, se puede llegar a encontrar resultados con porcentajes de desviacin estndar relativa de 15 a 35 ya que muchos mtodos microbiolgicos convencionales estn

sujetos a errores de muestreo, de dilucin, de incubacin y del operador. (USP 31, 2008). Incluso cuando se haya realizado la validacin, el laboratorio tendr que verificar peridicamente que se cumplen los parmetros documentados, utilizando por ejemplo muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices ms representativas. (ENAC,

2002). 2.5.1. Parmetros de Desempeo de la Validacin Son las propiedades, caractersticas o capacidades del mtodo. 2.5.1.1. Especificidad Capacidad de un mtodo de determinar inequvocamente un analto/parmetro en presencia de los otros componentes de la muestra. La especificidad puede ser afectada por la presencia de interferentes (como precursores de sntesis, impurezas, productos de degradacin, entre otros). (OGA-016,2004).

2.5.1.2. Exactitud, es la cercana de un resultado al valor verdadero por comparacin con los valores de referencia de un material caracterizado (material de referencia). Los valores de referencia deberan ser trazables a las normas

internacionales; los materiales de referencia certificados (MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal que el material de referencia sea de matriz natural lo mas similar posible a las muestras de inters. (RODRGUEZ, 2004). Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje de recuperacin de los microorganismos mediante el mtodo de validacin. (USP 31, 2008). 2.5.1.3. Precisin Las dos medidas ms comunes de la precisin, que generalmente se define en trminos de desviacin estndar o el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa) son la repetibilidad y la reproducibilidad. La repetibilidad, da una idea de la variabilidad que se espera cuando un proceso es aplicado por un solo analista en un equipo durante un periodo corto (anlisis por duplicado). La reproducibilidad, es la que representa la variabilidad que se obtiene cuando un proceso es analizado por diferentes analistas, lo cual tiene un valor ms amplio. La precisin intermedia y ms til en casos especficos se obtiene

cuando se evala reproducibilidad entre analistas en un mismo laboratorio. (RODRGUEZ, 2004). 2.6. VALIDACIN Y SELECCIN DE MTODOS DE ENSAYO MICROBIOLGICO El anlisis microbiolgico tiene como fin proporcionar informacin confiable acerca de la inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es por ello que es indispensable la eleccin de un mtodo de ensayo adecuado. Para decidir si un mtodo es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese mtodo es aplicable a la muestra analizar a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el ensayo, si usando esta metodologa se puede evaluar el cumplimiento de las exigencias requeridas para el analto. El laboratorio debe elegir los mtodos que mejor se adecuen a sus objetivos y debe documentarlos debidamente.

(GUARNIZO, 2005). Existen tipos principales de determinaciones propias de las pruebas microbiolgicas, entre las que se incluyen: Pruebas para determinar si los microorganismos estn presentes en una muestra y pruebas para cuantificar el nmero de microorganismos. (USP 31, 2008) 2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o ausencia de microorganismos Este tipo de pruebas se caracteriza por el uso de turbidez en un medio lquido de crecimiento como evidencia de la presencia de

microorganismos viables en la muestra de la prueba. (USP 31, 2008) 2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos El mtodo de recuento en placa es el ejemplo ms comn de esta clase de pruebas que se emplean para estimar el nmero de microorganismos viables en la muestra. (USP 31, 2008)

Tabla 8. Parmetros de Validacin por tipo de prueba microbiolgica

Parmetro Exactitud Precisin Especificidad Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Linealidad Robustez Repetibilidad

Pruebas cualitativas No No Si Si No No Si Si

Pruebas cuantitativas Si Si Si Si Si Si Si Si

Un laboratorio debe validar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as como las ampliaciones y las modificaciones de los mtodos normalizados, para confirmar que son aptos para el fin previsto. La validacin debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicacin o del campo de aplicacin dados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto. (ENAC, 2002). 2.6.3. Mtodos normalizados Son mtodos que el laboratorio aplica como ya esta descrito en un procedimiento o en una norma, en este caso tambin es necesario anexar o volver a escribir bajo forma de procedimientos las especificaciones reconocidas que tengan suficiente informacin para realizar los ensayos (G-ENAC. 1997) . El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los mtodos normalizados antes de introducir los ensayos. Si el mtodo normalizado cambia se debe repetir la confirmacin. 2.6.4. Mtodos desarrollados por el laboratorio Elaborados en el laboratorio y no se encuentran en ningn documento oficial, debe ser una actividad planificada y debe ser asignada a personal calificado y proveer los recursos necesarios (G-ENAC. 1997) 2.6.5. Mtodos normalizados con

modificaciones Son mtodos tomados de una norma, pero con alguna modificacin, tal es el caso de una filtracin con membrana utilizando otro medio de cultivo diferente; aqu se debe realizar lo mismo a como si se estuviera

realizando la validacin de un mtodo desarrollado por el laboratorio, debido a que ya existe una modificacin sobre el mtodo normalizado (G-ENAC. 1997). 2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIN 2.7.1. Monitoreo ambiental La calidad microbiolgica del aire y las superficies de laboratorio son un indicador de la efectividad de las tareas realizadas segn el programa de limpieza y desinfeccin. El programa de muestreo para monitoreo ambiental incluye: Determinacin cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente (recuento total de determinado tipo de microorganismos, por ejemplo: hongos y levaduras, mesfilos). Determinacin cualitativa dependiendo de los ensayos que realiza el laboratorio (ejemplo: Enterobacterias, coliformes, Salmonella spp). El laboratorio debe definir los recuentos mximos de microorganismos que considere aceptable y disponer de un procedimiento documentado en el que se describan las acciones a tomar para corregir las situaciones en que sobrepasen estos lmites. Se recomienda realizar como mnimo los siguientes controles microbiolgicos, aunque es importante resaltar que existe variedad de mtodos para llevarlos a cabo: Monitoreo de la calidad del aire por exposicin de placas o equipos muestreadores Monitoreo de la calidad microbiolgica de las superficies de trabajo, por frotacin con hisopos o por placas rodac Control de dotacin y de personal (VILLOCH, C.A. 2002) Se debe limpiar y desinfectar el espacio de ambiente controlado, en el cual se desarrolla el procedimiento. Este permitir a la empresa mantener un nivel mnimo consistente de contaminacin, en pisos y mesn de muestras, es importante siempre tener en cuenta que en las cabinas se exige cero contaminacin. Un mtodo eficiente es la desinfeccin apropiada mediante un sistema de rotacin de desinfectantes, usando generalmente los de tipo fenlicos, amonios cuaternarios, aldehdos, perxidos y haluros. En el caso de algunos equipos que no se pueden esterilizar por los diversos mtodos como: Equipos elctricos y electrnicos, balanzas, bateras, etc.; la desinfeccin de estos equipos debe ser ms rigurosa debido a su potencial de contaminacin con un gran nmero de microorganismos. (CARLENTON, 1999)

2.7.2. Escala de Mc Farland La escala de Mc Farland, es utilizada como estndar de turbidez en la preparacin de suspensiones de microorganismos. Los estndares de turbidez son preparados por la mezcla de qumicos que se precipitan para formar una solucin de turbidez reproducible. Son realizados adicionando cido sulfrico a una solucin acuosa de cloruro de bario, del cual resulta la formacin de un precipitado de sulfato de bario (ZIMBRO Y POWER, 2003) Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2S04 0.6 M, la turbidez la da el BaCl2, el cual va en cantidad creciente mientras al cido sulfrico va disminuyendo la proporcin. (ESCOBAR, 2002) Cada uno de los tubos del patrn de acuerdo con la turbidez, representa un nmero de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por recuentos de colonias. De esta forma al comparar una emulsin de bacterias con el tubo del patrn de Mc farland que ms se asemeje se puede saber aproximadamente el numero de bacterias en la emulsin (ESCOBAR, 2002) 2.7.3. Medios de cultivo Los medios de cultivo seleccionados debern ser evaluados con la prueba de promocin de crecimiento de bacterias, mohos y levaduras. Las unidades de promocin de crecimiento deben ser inoculadas con un nmero menor de 100 UFC. Si las pruebas de promocin de crecimiento fallan, se debe investigar el origen de cualquier contaminacin encontrada durante la simulacin y repetir la prueba. (ROGANTI, 2004) 2.7.3.1. Esterilizacin del medio de cultivo El medio seleccionado debe ser esterilizado por uno de los dos mtodos primarios, filtracin o esterilizacin por vapor. La esterilizacin por filtracin requiere que el medio pase por un filtro de 0.22m a un contenedor previamente esterilizado; este mtodo presenta dificultad debido a que los medios de cultivo son mezcla de varios materiales naturales y una cantidad considerable de estos son slidos no solubles que se encuentran presentes en la mezcla acuosa. (CARLENTON, 1999) El proceso con vapor (autoclave) emplea la esterilizacin terminal del medio en un contenedor del cual ser dispensado para el envase, este procedimiento terminal reduce la necesidad de manipulacin post-esterilizacin que puede comprometer la esterilidad del medio. (CARLENTON, 1999) Despus de la esterilizacin del medio este debe ser manejado realizando las mismas practicas usadas para las operaciones de produccin rutinarias. Algunas empresas siguen algunos pasos adicionales como la preincubacin del medio antes de empezar la corrida de la prueba, para asegurarse de la esterilidad del medio antes del envase de este. (CARLENTON, 1999) 2.7.3.2. Incubacin Los medios se deben incubar en condiciones adecuadas de modo que se puedan evidenciar los microorganismos que podran de otra manera ser difciles de cultivar. Se deben establecer las condiciones de incubacin de acuerdo con las siguientes pautas generales: La temperatura y el tiempo de incubacin debe ser conveniente para la recuperacin de la carga microbiana, en ningn momento deben estar fuera del rango de 20-35; y se debe mantener dentro de +/- 2.5C de la temperatura requerida. (CARLENTON, 1999) 2.7.3.3. Control de autoclave Para verificar que el proceso de esterilizacin se realiza en forma adecuada, se realiza un control por cada ciclo introduciendo un vial que contiene esporas de Bacillus stearothermophilus en el autoclave. (I-DCM 008 USO Y MANEJO DE BIOINDICADOR EN PROCESO DE ESTERILIZACIN Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM de COLOMBIA Ltda.) Esta prueba consiste en introducir en el autoclave viales de Bacillus stearothermophilus en posiciones establecidas, junto con el material que se esta esterilizando en los parmetros normales, cuando finaliza el proceso se incuba y se determina el crecimiento o no por medio del cambio en el indicador de pH que se encuentra en la ampolleta. (NTC - 4543, 1998). Adicionalmente el autoclave debe estar calificado (se debe tener en cuenta la ultima fecha de la calificacin del autoclave), para de esta manera asegurar la adecuada distribucin de calor para cargas y volmenes definidos, usualmente se recomienda que se use un ciclo de autoclave de 121 durante 15 minutos (USP 31, 2008). Para llevar a cabo la calificacin del autoclave existen tres etapas fundamentales: certificacin de la instalacin (CI), certificacin operativa (CO) y certificacin funcional (CF). En el caso de la certificacin de la instalacin, se debe registrar toda la informacin de identificacin (nombre del equipo, descripcin, nmero de modelo e identificacin, certificados de compra), ubicacin, requisitos de servicios bsicos y cualquier caracterstica de seguridad del equipo (fcil acceso a todos los planos, manuales, listas de repuestos, direccin del vendedor y numero telefnico de contacto). En cuanto a la certificacin operativa: se debe describir toda la informacin necesaria en la que conste que todos los componentes del equipo (autoclave), funcionan segn lo especificado; esto se obtiene sometiendo a prueba todos los controles de operacin normal, todos los puntos de alarma, todos los interruptores y dispositivos visualizadores. Para finalizar el proceso de calificacin del autoclave, se realiza la certificacin funcional, en la

cual se describe el procedimiento necesario para demostrar que el sistema del equipo funciona uniformemente y cumple las especificaciones exigidas bajo la operacin cotidiana (OMS, 1998) 2.7.4. Documentacin Es esencial que el programa de validacin este documentado y que la documentacin sea mantenida correctamente. Es importante registrar los detalles del proceso (ej. tiempo, equipo usado) y registrar los cambios que hayan ocurrido. Un registro del mantenimiento puede ser til en la ejecucin de investigaciones de fallas referentes a un lote especfico de fabricacin. Los datos de la validacin (junto con datos de pruebas especficas) pueden tambin determinar la variacin prevista en las caractersticas del producto o el equipo (RODRGUEZ, 2004). 2.7.5 Desarrollo del protocolo de validacin El propsito del protocolo de validacin es demostrar que el proceso es reproducible y est normalizado de manera que los resultados que provee sern comparables a los de otro proceso en un lugar diferente y viceversa. (RODRGUEZ. 2004) El protocolo consta de: Identificacin del proceso que se va a validar Criterios objetivos y que se pueden medir para una validacin exitosa Duracin de la validacin Turnos, operadores, equipo que se va a usar en el proceso Identificacin de servicios para el equipo de proceso y la calidad de los servicios Consideracin del mantenimiento y reparaciones de equipo de fabricacin Identificacin de los operadores y calificacin del operador requerido Descripcin completa del proceso Cualquier control o condicin especial que se coloque en los procesos precedentes durante la validacin Parmetros de proceso que se van a monitorear, y mtodos para controlar y monitorear Caractersticas de producto o proceso que se van a monitorear y mtodos para monitorear Mtodos estadsticos para recoleccin y anlisis de datos Se deben tener en cuenta las causas de variacin controlables en un proceso de validacin como son: temperatura, humedad, variaciones de suministro elctrico, vibracin, contaminantes ambientales, pureza del agua usada en el proceso, luz, variabilidad de los materiales, desgaste del equipo, factores humanos (entrenamiento, factores econmicos, tensin, etc.) (RODRGUEZ. 2004) 2.7.6 Informe Final de Validacin Este informe resume y presenta todos los protocolos, resultados y deriva conclusiones relacionadas con el estado de validacin del proceso. Debe ser revisado y aprobado por el equipo de validacin y la administracin. (RODRGUEZ. 2004)

2.1 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION Antecedentes a nivel internacional Carrillo y Lozano (2008) realizaron una validacin utilizando el agar Chromocult, como mtodo alternativo en la deteccin de microorganismos indicadores de la calidad del agua potable, gracias a su fcil manejo y rpida recuperacin para reducir costos y desarrollar procedimientos con mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA Ltda, basados en la USP 31, realizando un anlisis que garantice resultados confiables y la disminucin de los riesgos de reanlisis que aumentan el tiempo de anlisis y los costos. En esta validacin Carrillo y Lozano verificaron que el programa de calibracin y mantenimiento de los equipos, estuviera vigente, para de esta

manera poder garantizar el procedimiento realizado y los resultados obtenidos. Luego realizaron pruebas preliminares en donde se llevo a cabo la estandarizacin de los inculos, realizando diluciones de un cultivo de 24 horas y comparando con el tubo 1 de la escala de Mac farland para E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacteraerogenes ATCC 13048, posteriormente se estandariz la tcnica filtracin por membrana con tres muestras de tres replicas cada una y despus de obtener los resultados esperados (30 UFC\ml aproximadamente) se realiz la metodologa para la validacin de la tcnica filtracin por membrana, analizando diez muestras de agua potable diferentes, con tres replicas para cada una, mediante las cuales se realizaron recuentos de cada uno de los microorganismos con los cuales fueron contaminadas las muestras de agua, bajo condiciones alternadas, variando los analistas y los das de anlisis; se llevo acabo el anlisis de una prueba estndar (agua estril para inyeccin, inoculada con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchiacoli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacteraerogenes ATCC 13048), una solucin de prueba (agua potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba: Escherchiacoli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacteraerogenes ATCC 13048), un control negativo (agua potable con tiosulfato de sodio al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de agua con los microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchiacoli ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028; agua potable + Escherichiacoli ATCC 8739 + Enterobacteraerogenes ATCC: 13048; agua potable + Escherichiacoli ATCC 8739 +

Enterobacteraerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtuvieron, 30 recuentos por da para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto se obtuvieron 600 datos en total, por los dos analistas, luego de obtener todos los datos, se procedi a realizar el anlisis y se determinaron los parmetros cuantitativos para la validacin del mtodo.

La metodologa se llevo a cabo con muestras de agua potable, provenientes del acueducto de Bogot que cumplen con las especificaciones descritas segn la resolucin 2115 de 2007 Finalmente se logro concluir que el mtodo es reproducible y repetible, tambin se logro establecer que el mtodo es especifico para la demostracin de coliformes Fecales, debido a que para este grupo de microorganismos indicadores se logro obtener un porcentaje de recuperacin superior al 96%, comparado con los otros microorganismos.. Por su parte Cote (2006),estudiola cloro resistencia de Coliformes en el agua proveniente de la redde distribucin de agua potable del Acueducto de Bogot. En este trabajo de investigacin, se aisl e identific las cepas nativas decoliformes totales y E. coli en el anlisis de agua potable de la red dedistribucin del Acueducto de Bogot durante los das de

muestreoprogramados por el laboratorio de aguas, durante los meses de Febrero aMayo del 2004 y se realizaron pruebas de clororesistencia, con el fin dedeterminar si los coliformes totales y E. coli aislados son Cloro Resistentes bajo las variables manejadas, es decir, que pueden soportarconcentraciones de Cloro Libre entre 0.2 y 1.0 mg/L, que son lasconcentraciones mnimas y mximas permitidas por el Decreto 475 de1998 para agua potable. Todo esto con el fin de poder abrir diferentesalternativas de desinfeccin, descartar contaminacin en la toma demuestras, verificar la incidencia de la biopelcula de las tuberas de la redde distribucin en la calidad del agua potable. Se aislaron e identificaron 5 cepas nativas de coliformes totales y E. coli y7 cepas nativas de Enterobacterias durante el anlisis del agua de la redde distribucin del Acueducto de Bogot. El 60% de estas bacteriasresistieron la accin oxidativa del cloro en todas las concentracionesprobadas con 10 minutos de contacto; bajo condiciones controladas en ellaboratorio. Asimismo, de las bacterias que fueron resistentes a laspruebas de 10 minutos de contacto, el 66% de stas presentaronresistencia a todas las

concentraciones probadas, con 15 minutos decontacto; bajo condiciones controladas en el laboratorio. Antecedentes a nivel nacional En el 2006, Schippne estudio la percepcin sobre el agua y hbitos de consumo en la poblacin residente y oyente de Radio Programas del Per en Lima, Piura, Arequipa e Iquitos. As mismo encontr que las personas cuentan con conocimientos bsicos sobre prcticas del cuidado del agua y podran hacer algo para evitar la contaminacin de las aguas, lo cual indica que existe una base de recepcin favorable. Sin embargo, la problemtica del agua en cuanto a su posible escasez, parece no ser un asunto que preocupa actualmente a las personas en el Per, slo el 36,6% considera que en el pas tenemos escasez de agua. Las personas no vinculan lo suficiente los problemas del calentamiento global y el cuidado del medio ambiente con los problemas del agua. En Meza (2009) se puede encontrar un estudio sobre la educacin ambiental en la educacin secundaria de chanchamayo y las actitudes de los alumnos hacia la conservacin del medio ambiente. Segn los resultados se estableci un nivel medio de incorporacin de la educacin ambiental en las programaciones y ejecuciones de las reas curriculares, pero una actitud indiferente hacia la conservacin del medio ambiente en los estudiantes, y una correlacin directa entre ambas variables.

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http://www.conagua.gob.mx/Contenido.aspx?id=Medicin de la Calidad del Agua| Unidades Autodidcticas|0|0| 10510|0