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O emprego de tcnicas hifenadas no estudo de plantas medicinais

Marili Villa Nova Rodrigues, Vera Lcia Garcia Rehder, Adilson Sartoratto, Sinsio Boaventura Jnior, Adriana da Silva Santos
Universidade Estadual de Campinas CPQBA-UNICAMP Diviso de Qumica Orgnica e Farmacutica Caixa Postal 6171, CEP 13083-970, Campinas, SP. E-mail: marili@cpqba.unicamp.br

Resumo O extrato vegetal bruto constitui uma matriz bem complexa contendo centenas ou milhares de metablitos, que diferem consideravelmente em seus parmetros fsico-qumicos e espectroscpicos. Por isso, uma eficiente deteco e rpida caracterizao tm papel fundamental na pesquisa de produtos naturais biologicamente ativos. Uma eficiente triagem dos extratos alcanada atravs do monitoramento biolgico e qumico, realizados concomitantemente. Para isso, a utilizao de tcnicas hifenadas de grande valia, pois fornece numerosas informaes estruturais dos metablitos antes mesmo do seu isolamento. A hifenao de um mtodo eficiente de separao com detetor espectromtrico constitui a principal ferramenta utilizada no estudo de plantas medicinais, onde a cromatografia gasosa e a cromatografia lquida ocupam posies de destaque entre os mtodos de separao. Para compostos que apresentam grupos cromforos, o detetor de arranjo de diiodos (DAD) normalmente empregado; caso contrrio, a deteco feita pelo detetor seletivo de massas, por causa do grande nmero de informaes geradas. No estudo de plantas medicinais, na maioria das vezes, torna-se necessrio o uso de tcnicas complementares para a identificao dos componentes ativos, como o caso da combinao entre LC-NMR (cromatografia lquida com detetor de ressonncia magntica nuclear), LC-DAD (cromatografia lquida com detetor de arranjo de diiodos) e LC-MS-MS (cromatografia lquida com detetor seletivo de massas tandem), graas complexidade do problema. Com os recentes avanos da tecnologia, os pesquisadores podem contar com ferramentas poderosas na busca de novos compostos bioativos.

Palavras chaves: controle de qualidade, fitoterpicos, planta medicinal, tcnicas hifenadas.

Introduo

As plantas representam uma extraordinria fonte de novos compostos com atividade teraputica; da o crescente interesse no estudo de plantas medicinais. Para o estudo de novas molculas bioativas de origem vegetal, o extrato deve ser submetido, concomitantemente, a uma triagem qumica e biolgica. O perfil metablico de extratos brutos no uma tarefa fcil de ser realizada em razo da diversidade de estruturas qumicas presentes na planta. Porm, o avano tecnolgico de tcnicas analticas, sobretudo das tcnicas hifenadas, proporcionou um papel importante na elucidao de composies qumicas complexas dos produtos de origem vegetal, com nveis de sensibilidade e seletividade impensveis at poucos anos atrs. Isso possibilitou o estudo do extrato vegetal bruto, sem a necessidade do exaustivo trabalho de isolamento que, muitas vezes, leva a compostos j conhecidos. Sendo assim, estratgias de triagem qumica tm sido desenvolvidas atravs do uso de tcnicas hifenadas. O termo tcnicas hifenadas refere-se ao acoplamento entre duas ou mais tcnicas analticas com o objetivo de obter uma ferramenta analtica mais eficiente e rpida que as tcnicas convencionais. As tcnicas analticas qumicas mais empregadas na anlise de produtos base de plantas medicinais so a cromatografia e a espectroscopia. As tcnicas a serem acopladas devero gerar informaes diferentes, ou seja, ser ortogonais. Um exemplo tpico o acoplamento de mtodos eficientes de separao como a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) e a cromatografia gasosa (GC), com tcnicas espectromtricas como espectrofotmetro de UV-Vis (DAD), espectrmetro de massas (MS e MS-MS) e ressonncia magntica nuclear (NMR), que fornecem informaes adicionais sobre a estrutura qumica dos componentes da amostra, funcionando como detetores. A escolha do detetor torna-se fundamental quando o analito se encontra em nvel de traos, necessitando de baixos limites de deteco. O nmero de informaes obtidas muito grande, tornando-se necessria a utilizao de computadores para obteno e tratamento dos dados e, freqentemente, o uso da quimiometria para sua interpretao. A principal vantagem das tcnicas hifenadas em comparao com as tcnicas espectroscpicas sem hifenao deve-se ao fato de no necessitar de uma grande quantidade (miligrama) do analito na sua forma purificada, o que acontece com as tcnicas sem hifenao, que s so vlidas aps um tedioso protocolo de purificao.

A tabela 01 apresenta as principais caractersticas e usos das tcnicas hifenadas na anlise de plantas.

Tabela 01: Aplicaes de tcnicas hifenadas na rea de plantas medicinais. Tcnicas hifenadas GC-MS Caractersticas Identificao de compostos. Fornece informao estrutural da molcula. Permite comparao com bibliotecas espectrais. Confirmao estrutural de molculas. Identificao de compostos conhecidos, atravs da comparao do tempo de reteno e espectro UV com o padro analtico. No fornece informao estrutural. Raramente resulta na identificao definitiva. Muitas vezes acoplado com LC-DAD para fornecer informaes estruturais complementares. Exemplos de aplicao na rea de plantas medicinais Estudo da sazonalidade de algumas classes de metablitos secundrios, caracterizao de aromas, identificao de terpenides (1) Anlise de flavonides (2) Anlise de fragrncias (3) Anlise de flavonides (4) Controle de qualidade de plantas medicinais, busca de metablitos ativos, estudos de ecologia qumica e quimiossistemticos (1) Anlise de antocianinas (5)

GC-MS-MS LC-DAD

LC-MS

LC-MS-MS

Determinao de novos compostos, Determinao de flavonides, com a incrvel vantagem da saponinas (6) simplicidade no preparo da amostra e rapidez na obteno dos resultados. Fornece informaes estruturais (espectro 1H-NMR). Constitui-se a tcnica mais poderosa na determinao estrutural de substncias inditas com novos esqueletos e em misturas biologicamente ativas (1) Determinao de alcalides (7), flavonides (8)

LC-NMR

Para anlise de compostos volteis e termicamente estveis, o mtodo mais utilizado a cromatografia gasosa acoplada ao detetor seletivo de massas. A seguir, esto apresentadas algumas das hifenaes mais utilizadas no estudo de plantas medicinais.

GC-MS e GC-MS-MS A cromatografia gasosa foi a primeira tcnica a ser interfaceada com o detetor de massas, por causa da facilidade do manuseio do efluente gasoso do cromatgrafo. uma ferramenta muito til na identificao de compostos de origem vegetal graas disponibilidade de bibliotecas espectrais, com detetor de massas operando sob condies de impacto de eltrons. Atualmente, a cromatografia gasosa com detetor de massas sob condies de impacto de eltrons o mtodo mais aplicado em laboratrios de pesquisa, uma vez que os espectros obtidos so bem documentados em bibliotecas. A quantificao possvel com o uso de padro interno, que compensa uma possvel baixa recuperao durante o processo de extrao e a variao na resposta instrumental. A principal dificuldade de acoplamento entre GC e MS foi em conseqncia da introduo de um composto presso atmosfrica (proveniente da separao cromatogrfica) dentro de um sistema a alto vcuo. Para contornar esse problema, diferentes interfaces foram desenvolvidas (9). Os principais requisitos para o desenvolvimento de interfaces para GC-MS levaram em considerao a reduo do fluxo da coluna cromatogrfica para manuteno do vcuo, a separao seletiva do analito do gs de arraste e a manuteno da separao cromatogrfica. Dessa forma, o desenvolvimento das colunas capilares para GC foi em parte responsvel pelo sucesso da hifenao GC-MS, em razo da reduo significativa do fluxo (1 2 mL/min) em relao s colunas empacotadas (30 60 mL/min), alm do aumento significativo do poder de resoluo da cromatografia gasosa em relao lquida. Embora existam vrias tcnicas de ionizao, as mais utilizadas em GC-MS so o impacto de eltrons (EI) e a ionizao qumica (CI). Na ionizao por impacto de eltrons, as molculas da amostra, vindas do sistema cromatogrfico, entram na fonte de ons e so ionizadas pela coliso com os eltrons gerados num filamento de tungstnio ou rnio. Essa coliso leva fragmentao e ionizao das molculas da amostra. Na ionizao qumica, as molculas do analito so ionizadas indiretamente, atravs de reaes com os ons de um gs reagente (metano, isobutano, amnia ou gua). Essa tcnica representa uma ionizao mais branda, j que a energia envolvida na coliso pequena (9). Conseqentemente, ocorre uma menor fragmentao do analito e uma maior abundncia dos ons moleculares.

Uma caracterstica importante da ionizao qumica a influncia do gs reagente na seletividade; por exemplo, quando a amnia utilizada, somente os compostos fortemente bsicos so protonados e podem ser detectados. Essa dependncia das condies experimentais diferencia os espectros de CI de diferentes instrumentos, dificultando a pesquisa por bibliotecas espectrais. A Tabela 02 apresenta os principais analisadores de massas e as principais diferenas entre eles.

Tabela 02: Vantagens e desvantagens dos analisadores de massa utilizados em GC-MS. Analisadores de massa Quadrupolo Mais utilizado no acoplamento com GC. Robustos, baixo custo e compactos. Deteco de ons positivos e negativos. Setor magntico Alta resoluo, alta sensibilidade, til para Custo mais elevado, difcil compostos de alta massa molecular. Ion trap operao e manuteno. Menos sensvel que os instrumentos de setor magntico. Vantagens Desvantagens

Compacto, baixo custo, simples de operar, Baixa resoluo em varredura possibilidade de usar EI ou CI. rpida.

Fonte: adaptado de KELLNER et al., 1998. O detetor de massas pode operar no modo scan funcionando como um detetor universal, ou no modo SIM (selected ion monitoring) como um detetor seletivo altamente sensvel. Quando os compostos a serem analisados tm baixa volatilidade ou so muito polares para anlise por GC, o mtodo de escolha a cromatografia lquida de alta eficincia. As hifenaes mais utilizadas com esta ferramenta so:

LC-DAD A cromatografia lquida com o detetor de arranjo de diiodos (LC-DAD) uma tcnica amplamente utilizada na anlise de produtos naturais desde que o analito apresente grupos cromforos que propiciem a absoro de luz na regio de UV-visvel. uma tcnica muito aplicada no controle de qualidade de produtos de origem vegetal; porm, sua utilizao na identificao de compostos bioativos limitada, pois o LC-DAD

fornece apenas o espectro UV-Vis de cada substncia como informao estrutural, o que no suficiente para a caracterizao, pois vrios compostos de um mesmo grupo qumico apresentam espectros similares, impossibilitando sua distino. As informaes obtidas com esta tcnica so complementares a outras tcnicas hifenadas em cromatografia lquida (LCMS, LC-NMR). Um exemplo desta aplicao anlise de compostos fenlicos utilizando-se LC-DAD-MS (10). A busca por mais informaes sobre a estrutura de compostos levou ao desenvolvimento de novas tcnicas hifenadas como o LC-MS e LC-NMR.

LC-MS e LC-MS-MS Dentre os acoplamentos, o LC-MS muito mais seletivo e, em certas circunstncias, mais sensvel que o LC-DAD. J a identificao de compostos mais difcil e nem sempre vivel, por causa da menor resoluo cromatogrfica (em comparao com GC) e a possvel coeluio de compostos. Uma dificuldade encontrada para acoplamento da LC com o MS era a manuteno do vcuo no detetor de massas, o que foi resolvido em parte pela introduo da fase mvel de HPLC na forma de spray dentro da fonte de ons do MS, onde apenas uma pequena frao do solvente entra no analisador de massas (11). O principal problema do uso da LC-MS na qumica de produtos naturais a ionizao de uma grande variedade de compostos existentes no extrato bruto. Embora existam vrios tipos de interfaces disponveis no mercado, nenhuma delas permite a deteco universal de todos os constituintes da matriz vegetal. Cada interface tem suas prprias caractersticas e sua faixa de aplicao (6). Inicialmente a LC-MS foi desenvolvida para aplicao na confirmao da identidade de compostos, mas sua preciso suficientemente alta para permitir a quantificao de analitos por calibrao interna e externa. O desenvolvimento de tcnicas de ionizao presso atmosfrica, tais como a ionizao qumica presso atmosfrica (APCI) e a ionizao por eletronebulizao ou eletrospray (ESI) tornaram a tcnica de LC-MS aplicvel para uma grande variedade de matrizes. Mais recentemente a disponibilidade do equipamento com fotoionizao (APPI) conferiu universalidade tcnica de LC-MS, permitindo a anlise de compostos com baixa massa molecular at protenas (12).

A Tabela 03 sumariza algumas das principais caractersticas das interfaces utilizadas em LC-MS.

Tabela 03: Interfaces para LC-MS. Interface/ Fluxo Ionizao Feixe de 0,11 partculas mL/min Tipo de ionizao Compostos Vantagens e desvantagens

EI, CI+, . apolares ou moderadamente polares CI. termicamente estveis . massa molecular de 100-1400 CI+, CI-

TSP

0,12 mL/min

APCI

0,22 mL/min

CI+, CI-

ESI

1L/min CI+, CI2mL/min

ESI20nL/min - CI+, CInanospray 5L/min

FAB dinmica

1 - 5L/min CI+, CI-

. resposta no linear . variao na resposta . menos sensvel . necessita usar tampes volteis . bibliotecas para EI . pouco polares a polares . fragmentao limitada e . massa molecular de dificilmente reprodutvel 100-2000 . nenhum espectro de referncia . instabilidade da intensidade do sinal . condies para LC limitadas . pouco polares a polares . fragmentao limitada . massa molecular de . nenhum espectro de 100-1200 referncia . altamente sensvel . possibilidade de degradar certos compostos termolbeis . pouco polares a . fragmentao limitada altamente polares . nenhum espectro de . massa molecular baixa referncia a elevada (formao de . altamente sensvel ons com cargas mltiplas) . pouco polares a . fragmentao limitada altamente polares . nenhum espectro de . massa molecular baixa referncia a elevada (formao de . utilizvel com colunas ons com cargas capilares mltiplas) . polares e altamente . fragmentao limitada polares . nenhum espectro de . massa molecular at referncia milhares de daltons . baixo fluxo da fase mvel

Fonte: ENSMINGER, 1998. Legenda: TSP termospray; EI ionizao eletrnica; CI+ ionizao qumica positiva; CIionizao qumica negativa; FAB fast atom bombardeament

As interfaces de LC-MS normalmente produzem uma ionizao branda dos metablitos, gerando informao apenas da massa molecular do composto. Algumas informaes como a perda de uma molcula de acar so obtidas utilizando a interface termospray, mas esse nmero relativamente pequeno. Para obter um nmero maior de fragmentos caractersticos, o espectro de dissociao induzido por coliso pode ser gerado utilizando-se os sistemas MS-MS ou on-trap MS. (6).

LC-NMR O uso do LC-DAD e LC-MS nem sempre suficiente para a identificao on-line de produtos naturais pois, muitas vezes, faltam informaes estruturais conferidas pela LCNMR. Os requerimentos bsicos para o acoplamento dessas duas tcnicas so: Substituio dos tubos convencionais de amostra por cela em fluxo. Supresso do solvente. O uso de solventes protonados promove um sinal intenso em relao ao sinal dos analitos impossibilitando a deteco. Em princpio, isso pode ser superado utilizando-se solventes deuterados, porm o custo elevado e outros mtodos de supresso de solvente so indicados. Entretanto, a supresso mltipla do solvente mais fcil se ao invs de H2O utilizar D2O na fase mvel. O acoplamento da HPLC com NMR pode ser encontrado em 3 mdulos: Fluxo parado: o processo cromatogrfico alterado depois de definir o tempo de transferncia do centro do pico obtido na HPLC para a cela de determinao do NMR. Depois disso, experimentos uni ou bidimensionais podem ser realizados durante horas. Transferncia de vrias fraes (picos cromatogrficos) para loops sem interrupo da anlise cromatogrfica. Os picos so estocados e subseqentemente transferidos para a cela de medida do NMR. No mdulo em fluxo, o eluente continuamente transferido para a cela do NMR. Enquanto a fase mvel com os analitos atravessa a cela, o NMR registra espectros unidimensionais. Nos ltimos anos, o LC-NMR on-line tem atrado a ateno de muitos pesquisadores do ramo dos produtos naturais. Este sistema de deteco uma ferramenta poderosa na diferenciao entre ismeros, configuraes de acar e substituies no anel aromtico, alm do que, seu acoplamento simultneo com o detetor seletivo de massas

permite a aquisio de informaes adicionais sobre grupos funcionais e massa molecular (14). A alta resoluo de informao de mtodos NMR permite a identificao de muitos analitos num s espectro. Compostos de ampla faixa de polaridade podem ser analisados por LC-NMR incluindo aqueles que no podem ser analisados por GC-MS. Mesmo assim, para uma elucidao estrutural mais exata de novas molculas provenientes de produtos naturais, muitas vezes torna-se necessrio o isolamento preparativo, pois normalmente parte da regio do espectro de 1H perdida e o espectro de indispensvel para a identificao, no fornecido (15). A resposta obtida por LC-NMR reflete diretamente a concentrao do analito, enquanto que, em LC-MS, a resposta depende da eficincia de ionizao, ou seja, das propriedades qumicas do analito. A principal desvantagem da LC-NMR sua baixa sensibilidade, que em geral de 3 ordens de magnitude menor do que para LC-MS e, portanto, no indicada para a determinao de baixos nveis de concentrao (11). As principais dificuldades encontradas no emprego da LC-NMR so: Dificuldade em observar a ressonncia do analito na presena de grande quantidade de fase mvel. Utilizao de mais de um solvente protonado na fase reversa. Mudana na freqncia de ressonncia com o gradiente. Para LC-NMR, a quantificao realizada no modo em fluxo, atravs do uso de um padro interno, dispensando o uso de um padro de referncia e de curva de calibrao. Informaes mais precisas so obtidas quando o NMR acoplado on-line com HPLC. O uso de colunas pequenas (75 x 4,5 mm 5 m) que operam a baixo fluxo (0,017 mL/min) permite o acmulo de um grande nmero de espectros. Por razes de sensibilidade, as determinaes por LC-NMR se restringem ao 1H NMR. A Tabela 04 ilustra aplicaes do LC-NMR na anlise de flavonides, onde a maioria das citaes utiliza o modo stopped-flow, dispensando longo tempo para registro do espectro. O tempo de varredura do espectro pode variar de 1h at vrios dias por pico cromatogrfico.
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C,

Tabela 04: Estudo de flavonides por LC-NMR em plantas Amostra Gentiana ottonis Hypericum perforatum Erytrhina vogelii (raiz) Flavonides encontrados Swertisina, iso-orientina Quercetina-galacturonideo, hiperosdeo, 13-118biapigenina Isoflavonas preniladas, isoflavanonas Referncia bibliogrfica 156 89 199 44

Trifolium pratense (folhas) 2 formononetina-glucosideo-malonatos (ismeros), 2 biochanina A-glucosideo-malonatos (ismeros) Lycopersicon esculentum 2 campferol-diglicosideos, 2 dihidrocampferolhexosdeos, 2 campferol-glicosdeos, rutina, naringenina-7-O-glucosdeo, naringenina, chalcona

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Fonte: Rijke et al., 2006.

A tcnica de LC-NMR ainda no foi aceita amplamente pelos cientistas, por causa da falta de sensibilidade, onde a maior dificuldade a de observar as ressonncias do analito na presena de uma grande quantidade de fase mvel. Porm, constitui uma poderosa ferramenta na identificao de compostos bioativos quando utilizada em combinao com outras tcnicas hifenadas. At o momento no temos registro do uso desta tcnica no Brasil.

Algumas aplicaes das tcnicas hifenadas no estudo de plantas medicinais So indiscutveis os benefcios trazidos pela utilizao de tcnicas hifenadas, sobretudo em estudos complexos como o caso de extratos vegetais. As tcnicas mais utilizadas na triagem qumica de metablitos de plantas so GC-MS, principalmente no estudo de leos essenciais e das tcnicas de LC-DAD-MS e LC-MS-MS, no estudo de compostos mais polares. A tcnica de GC-MS aplicada rotineiramente na caracterizao qumica dos constituintes de leos essenciais, matria-prima empregada principalmente nas indstrias do ramo farmacutico, alimentcio e cosmtico. O grande nmero de constituintes presentes no leo essencial exige a utilizao desta tcnica, que permite assegurar a qualidade e autenticidade deste material. Um exemplo o emprego no controle analtico do leo essencial de Cordia verbencea, empregado na produo de um antiinflamatrio tpico disponvel no mercado brasileiro (16).

Outra aplicao da tcnica de GC-MS a ser ressaltada na anlise de contaminantes em plantas medicinais. Estas plantas podem veicular contaminantes ambientais altamente txicos, como no caso dos pesticidas organoclorados, compostos altamente persistentes no meio ambiente (17). Na anlise de compostos polares presentes em produtos vegetais, as hifenaes com a cromatografia lquida de alta eficincia so as mais utilizadas, principalmente a LC-MS-MS pelo grande nmero de informaes geradas e sua alta seletividade. Dentre estes, uma classe que tem merecido destaque no estudo de plantas medicinais a dos flavonides, graas grande variedade de compostos e diversas aplicaes teraputicas. Nesse campo importante distinguir entre a simples determinao de agliconas (tipo mais freqente de anlise com um nmero mais limitado de compostos presente em concentraes relativamente altas na amostra), com a anlise de seus conjugados dentro da aglicona correspondente, muitas vezes presentes em baixas concentraes (traos) na matriz vegetal. O emprego da LC-MS-MS no somente permite a formao de fragmentos de estrutura especfica, mas tambm reduz a interferncia da coeluio de compostos e da matriz. A tendncia futura de que novas tcnicas hifenadas surgiro devido ao avano tecnolgico, permitindo acoplamentos mais sofisticados, atravs de interfaces modernas e otimizadas, aliando mtodos de separao altamente eficientes e de amplo domnio, como a cromatografia, com um ou mais detetores espectroscpicos.

Concluso A exigncia cada vez maior na obteno de produtos de origem vegetal com qualidade requer o emprego de tcnicas analticas seletivas e eficientes, que possibilitem com segurana a identificao e quantificao de diferentes classes de compostos, o que pode ser obtido com a utilizao das tcnicas hifenadas.

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Endereo para Correspondncia Universidade Estadual de Campinas CPQBA-UNICAMP Diviso de Qumica Orgnica e Farmacutica Caixa Postal 6171, CEP 13083-970, Campinas, SP. E-mail: marili@cpqba.unicamp.br Data de Recebimento: 07/07/2006 Data de Aprovao: 28/07/2006

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