Prctica N10: Determinacin de urea

Objetivos:
a)

Conocimiento de la tcnica y sus aplicaciones

Teora.Al principio se not que la glutaminasa del rin era responsable de convertir el exceso de glutamina del hgado a amonio en la orina. Sin embargo, cerca del 80% del nitrgeno excretado est en forma de urea la cual es sintetizada en el hgado, en una serie de reacciones que estn distribuidas entre la matriz mitocondrial y el citosol. Esta serie de reacciones que forma urea es conocida como el Ciclo de la Urea o el Ciclo Krebs-Henseleit. Entonces, la urea es el producto final mayoritario del metabolismo del nitrgeno proteico en los seres humanos y constituye la fraccin ms abundante del nitrgeno no proteico. Su elevacin es producto de transtornos en la funcin renal o heptica, problemas dietticos, diabetes y otros. La enzima responsable de la descomposicin de la urea es la Ureasa, la cual contiene en su sitio activo dos tomos de Nquel unidos por un puente carbamato. Su pH ptimo es igual a siete. La descomposicin de la urea produce dos molculas, una de amoniaco y la otra de dixido de carbono las cuales son utilizados durante el metabolismo de nitrgeno. De hecho, el amoniaco producto de esta hidrlisis puede ser usado para la sntesis de protenas o en la transaminacin para la sntesis de aminocidos, mientras que el dixido de carbono formar parte del esqueleto carbonado de los compuestos nitrogenados. Fundamento del mtodo.- La urea presente en la muestra, es desdoblada a amonio por accin de la enzima ureasa segn la proposicin de Faucet y Scott
Ureasa

(NH2)2CO + 2H2O

2NH3 + CO2 + H2O

El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en ambiente alcalino formndose un complejo de color verde. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra y su absorbancia se lee a 600 nm (580 620) Material y Reactivos
1. 2. 3. 4. 5. 6.

Solucin de hipoclorito de sodio 10 mmol/lt en hidrxido de sodio 200 mmol/lt.. Suspensin de Ureasa 50 U/ml Solucin Salicilato: Ac. saliclico 5mM y Nitroprusiato 5mM Estndar de rea: 0,66 gr/lt (66mg/dl) Solucin de trabajo: 1ml de solucin salicilato con 50 ul de suspensin de ureasa. Muestra biolgica: suero, plasma u orina diluda 1:100

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Procedimiento Para la determinacin de rea se usa el mtodo de Berthelot modificado. En este mtodo la Ureasa descompone especficamente la rea produciendo dixido de carbono y amonaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol color verde. El procedimiento es el siguiente: Blanco Estndar Muestra Sol. Trabajo (Ureasa) __ __ 1 ml Estndar 10 ul __ 1 ml Muestra __ 10 ul 1 ml

Mezclar e incubar a 37 C x 3 min. o a T.Amb. (sobre 20C) x 5 min. y luego agregar: Solucin hipoclorito 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar e incubar a 37 C por 5 min. o a T.Amb. x 10 min. Leer la absorbancia a 600 nm, el color es estable por 2 horas. Clculos: FACTOR = _______66 mg/dL_________ Absorbancia Estndar Urea (mg/dL )= Factor x Absorbancia muestra. Rangos de Referencia: Suero o plasma: 10 a 50 mg/dl de urea Orina: 15 a 30g/24 hrs. Cuestionario a) Anote sus resultados y realice sus clculos b) Por qu el amoniaco es txico? c) Cmo se regula la sntesis de urea? Bibliografa Bidwell, R.G.S. 1993. Fisiologa Vegetal. Primera Edicin en espaol. A.G.T. Editor, S. A. Mxico Pp. 130-131. 216-218, 456. 2. Geza. D. 1965- Plant Biochemistry. Interscience publishers. Hungary. Pp. 226-230, 294297, 336-340, 426-429, 452-463. 3. Manunza B., Deiana S., Pintore M., Salinas V. y Gessa C. A Molecular modeling study of the Ureasa Active Site. 4. Wiener LAB. 1995. Vademcum. Edicin Revisada y Actualizada. Rosario-Argentina.
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