Você está na página 1de 41

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUO DEPARTAMENTO DE QUMICA E AMBIENTAL PROCESSOS BIOQUMICOS

MANUAL DE PRTICAS DE PROCESSOS BIOQUMICOS

APOSTILA DAS AULAS PRTICAS

Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues Telma Temteo dos Santos

Agosto de 2011

ndice
1. 2. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRO .............................................................2 QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS ................................................................6 2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos...................................................8 2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas..................................................................................8 2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v)................................................................8 2.1.3. Turbidimetria ...............................................................................................................8 2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER ........................................................9 2.1.5. Determinao do volume do centrifugado (% v/v) ......................................................10 2.1.6. Estudo Dirigido..........................................................................................................10 2.1.7. Relatrio da Prtica 1 .................................................................................................11 3. DOSAGEM DE ACARES ..................................................................................................12 3.1 Mtodo do DNS (3,5 dinitro salicilato)...............................................................................13 3.2 Roteiro da Prtica 2 - Curva Padro do Mtodo DNS .........................................................14 3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL ..................................................14 3.2.2. Construo da Curva Padro ......................................................................................14 3.2.3. Estudo Dirigido..........................................................................................................15 3.2.4. Relatrio da Prtica 2 .................................................................................................16 4. ACCARES REDUTORES (AR) E ACARES REDUTORES TOTAIS (ART) ..................17 4.1 Roteiro da Prtica 3 - Determinao de Acares Redutores (AR) e Acares Redutores Totais (ART) ...........................................................................................................................20 4.1.1. Determinao de Acares Redutores (AR)................................................................20 4.1.2. Determinao de Acares Redutores Totais (ART) ...................................................20 4.1.3. Dosagem de acares pelo mtodo do DNS................................................................21 4.1.4 Relatrio da Prtica 3..................................................................................................22 5. Grau Brix.................................................................................................................................23 5.1 Roteiro da Prtica 4 - Determinao do BRIX ....................................................................24 5.1.1. Procedimento.............................................................................................................24 5.1.2. Relatrio da Prtica 4 .................................................................................................25 5. Cintica do Crescimento Microbiano........................................................................................26 5.1 Roteiro da Prtica 5 - Cintica do Crescimento de Clulas de Leveduras ............................29 5.1.1. Preparo da soluo de YED 2% e inoculao das clulas ............................................29 5.1.2. Determinao da concentrao de biomassa (X) .........................................................29 5.1.3. Relatrio DA Prtica 5 ...............................................................................................30 6. Produo de Etanol ..................................................................................................................31 6.1 Roteiro da Prtica 6 - Produo de Etanol em caldo de cana-de-acar ...............................32 6.1.1. Fermentao ..............................................................................................................32 6.1.2. Inibio da fermentao por NaF (inibidor da enolase) ...............................................32 6.1.3. Relatrio da Prtica 6 .................................................................................................33 6.2 Roteiro da Prtica 7 - Produo de Etanol em YED a 2% ...................................................34 6.2.1. Preparo da soluo de YED 2%..................................................................................34 6.2.2. Produo de clulas e de etanol e consumo de glicose ................................................34 6.2.3. Determinao do lcool pelo mtodo do dicromato.....................................................35 6.3.4. Relatrio da Prtica 7 .................................................................................................36 7. Acidez de vinhos......................................................................................................................37 7.1. Roteiro da Prtica 8 - Determinao da acidez total de vinhos ...........................................38 7.1.1. Procedimento.............................................................................................................38 7.1.2.Relatrio da Prtica 8..................................................................................................39 8. Preparo de Solues e Indicadores............................................................................................40

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRO
O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao atravessar um prisma, dividida em vrias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro visvel apenas uma pequena parte do espectro eletromagntico. A luz , portanto, definida como uma forma de energia eletromagntica, formada por ondas que apresentam comprimentos diferentes. O comprimento de onda medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10 -9m. A tabela 1.1 mostra as regies do espectro em relao ao comprimento de onda.
Tabela 1. 1: Regies do espectro em funo do comprimento de onda

Regio Raios X Ultravioleta Visvel Infravermelho Mico-onda

Comprimento de onda (nm) 0,1 a 100 100 a 400 400 a 800 800 a 5.000 5.000 a 30.000

A capacidade que as diversas substncias qumicas tm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinao quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absoro caracterstico para uma determinada substncia e a quantidade de absoro (intensidade) dependente da concentrao do composto. Os mtodos instrumentais esto sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as mais diversas anlises nas inmeras reas de atuao na industria qumica destacando-se os mtodos espectrofotomtricos. A espectrofotometria medida de absoro ou transmisso de luz uma das mais valiosas tcnicas analticas amplamente utilizadas em laboratrios de rea bsica, bem como em anlises clnicas e biolgicas. Alguns exemplos de aplicao incluem: determinao de atividade enzimtica ou nas dosagens de compostos orgnicos em fluidos biolgicos, como glicose, uria, protenas, etc, em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reao qumica, ou um produto incolor que absorva na regio do UV ou do IV. A tcnica baseia-se no fato de que quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma soluo com molculas absorventes, parte da luz absorvida pela soluo e o restante transmitido. A absoro de luz depende basicamente da concentrao das molculas absorventes
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

e da espessura da soluo caminho ptico (Figura 1.1). Deve-se utilizar um feixe de luz monocromtica de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado. Beer em 1852 observou a relao existente entre a transmisso e a concentrao do meio onde passa o feixe de luz. Uma determinada soluo absorve a luz proporcionalmente concentrao molecular do soluto, isto , " A intensidade de um feixe de luz monocromtico decresce exponencialmente medida que a concentrao da substncia absorvente aumenta aritmeticamente ".

Figura 1. 1: Esquema de Absoro da Luz Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

A anlise quantitativa em espectrofotometria realizada atravs da medida da absorbncia, a qual se relaciona linearmente com a concentrao dentro de uma faixa de concentrao, seguindo a lei de Lambert- beer. Para medidas de absoro de luz visvel e ultravioleta na pesquisa bioqumica a indstria especializada fabrica vrios tipos de aparelhos, comumente chamados de espectrofotmetros (Figura 1.2). Nos espectrofotmetros a luz, fornecida por uma lmpada, fracionada pelo prisma ou rede de difrao (monocromador) nos comprimentos de onda que a compem (luzes monocromticas). O comprimento de onda selecionado dirigido para a soluo contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz absorvida e parte transmitida. A reduo da intensidade luminosa medida pelo detector (clula fotoeltrica) porque o sinal eltrico de sada do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal eltrico amplificado e visualizado no galvanmetro em nmeros lido como uma absorbncia e proporcional concentrao da substncia absorvente existente na cubeta.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

Figura 1. 2: Esquema ptico dos principais componentes do espectrofotmetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difrao, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo soluo, (f) clula foteltrica, (g) amplificador.

Se houver proporcionalidade entre a absorbncia e a concentrao da substncia, pode-se determinar a concentrao da substncia em amostras de concentrao no conhecida com base numa curva de calibrao, que relaciona absorbncia e concentrao. Na Figura 1.3 apresentada uma curva de calibrao, que corresponde relao grfica entre os valores de absorbncia e os de concentrao.

Figura 1. 3: Curva de Calibrao: Absorbncia em funo da Concentrao

Para se plotar uma curva padro necessria a leitura de pelo menos quatro pontos, se esta estiver na faixa de linearidade ou de dez pontos, caso no esteja. Alm disso, preciso trabalhar, ao menos em triplicata para cada ponto. A curva obtida a partir da insero de uma linha de tendncia que passe pelos pontos experimentais. No exemplo da Figura 1.3 observa-se que o ajuste dos pontos experimentais foi feito com uma reta. A qualidade do ajuste avaliada pelo valor do R2, no mostrado neste exemplo.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

Com base na anlise grfica da Figura 1.3 possvel verificar a linearidade da reao e calcular um fator de converso de valores de absorbncia em concentrao. FC = Mdia (Cp/Ap) C = A.FC Onde: FC - fator de converso ou fator da curva Ap - absorbncia do padro Cp - concentrao do padro C - concentrao da amostra A - absorbncia da amostra

Observao: Pode-se trabalhar com a Absorbncia (A), como mostrado no texto, ou com a Transmitncia (T). Na prtica, a transmitncia, que medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz), pouco utilizada, pois substituda pelo valor de densidade ptica (D.O.) ou absorvncia, termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitncia: A = log 1/T Referncias: BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Mtodos de Laboratrio em Bioqumica. So Paulo: Manole, 2003. http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

2. QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado ambiente de forma rpida. A partir da proliferao, os micro-organismos tambm excretam enzimas que modificam reagentes para a formao de novos produtos. Diante disso, a quantificao microbiana um importante acompanhamento em processos industriais que envolvam micro-organismos diretamente, exemplo da fermentao alcolica, ou para se verificar a minimizao dos mesmos quando estes no so desejveis, como o caso das salas de preparo de injetveis nas indstrias farmacuticas. Como exemplo de quantificao microbiana na industria tm-se a Portaria n 518/04, que estabelece que a quantidade de bactrias heterotrficas presentes na gua no pode ultrapassar 500 UFC/ml seno h a necessidade de reteste,inspeo da fonte ou outras providncias cabveis. Uma situao oposta, ao se considerar alimentos com atividade prbitica, a contagem mnima deve ser de 108 a 10 9 UFC na dose diria recomendada ou a empresa deve comprovar a eficcia do produto como probitico. O crescimento dos micro-organismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas, tais como pelo acompanhamento da variao no nmero ou peso de clulas, por exemplo. A escolha do mtodo funo do Micro-organismo e das caractersticas do meio de fermentao (cor, slidos presentes, etc.). No existe um mtodo absoluto para a quantificao microbiana ou determinao da viabilidade celular de uma populao de clulas. Para estimar a proporo de clulas viveis em uma cultura ou processo fermentativo, mtodos baseados no plaqueamento ou observao microscpica tm sido utilizados. Os mtodos de contagem direta so rpidos e simples, exigindo um mnimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a morfologia celular. Outros mtodos amplamente empregados so densidade tica (ou absorbncia), peso seco de clulas, volume de centrifugado, nmero mais provvel, dentre outros. Alguns destes mtodos sero vistos na prtica 1.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

Referncias: Brasil, Portaria n 518, de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade, e d outras providncias. D.O.U. - Dirio Oficial da Unio; Poder Executivo, de 26 de maro de 2004. Disponvel online em: <http://elegis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=22322&word=>. Acesso em: 31/07/2008. FDA, Bacteriological Analytical Methods, 2001. Disponvel online em:

<http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html>. Ultimo acesso em: 29/07/2008.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos


Material 1 balo volumtrico de 100 mL 6 bales volumtricos de 250 mL 2 bales volumtricos de 1000 mL 1 Becher de 100 mL 1 Basto de vidro 1 tubo de centrfuga pipetas volumtricas de 2, 3, 5, 10 e 15 mL 1 pesa-filtro Equipamentos Reagentes estufa Fermento Biolgico espectrofotmetro UV-Visvel gua centrfuga balana dessecador cmara de Neubauer microscpio

Objetivo: Determinar a concentrao de clulas de levedura em uma suspenso, usando 4 diferentes tcnicas de quantificao.

2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas Pesar cerca de 1 g de fermento biolgico em um becher de 100 mL Dissolver em gua destilada e diluir em balo volumtrico de 100 mL

2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v) Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e transferir para pesa-filtro de tara conhecida. Secar em estufa entre 100 e 120C at peso constante. Determinar, por diferena de massa, o peso seco de clulas e expressar o resultado em termos de massa seca de clulas (g) / 100 mL de suspenso.

2.1.3. Turbidimetria Diluir alquotas de 2, 3 e 5 mL da suspenso de clulas em bales volumtricos de 250 mL e alquota de 15 mL em balo volumtrico de 1.000 mL (fazer em duplicata). Ler a absorbncia das suspenses diludas em espectrofotmetro (=570 nm), usando gua destilada como branco.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER Diluir a suspenso 50 vezes. Gotejar a suspenso diluda em cmara de NEUBAUER e cobrir com a lamnula. Efetuar a contagem de 5 dos 25 quadrados da cmara (Figura 2.1). Expressar o resultado em termos do nmero de clulas / mL da suspenso original, com base no seguinte clculo: ( 5 quadrados) x (5x10 4) x diluio

Figura 2. 1: Cmara de Neubauer. A. O crculo indica a rea aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes ao microscpio (10X ocular e 10X objetiva) de uma cmara de contagem padro. B. Aspecto de um quadrado integrante do quadrado mdio, mostrando que devem ser contadas as clulas que tocam as linhas do topo e da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

2.1.5. Determinao do volume do centrifugado (% v/v) Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e transferir para tubo de centrfuga graduado. Centrifugar por 15 minutos. Anotar o volume de clulas. Expressar o resultado em termos de volume de clulas / 100 mL da suspenso.

2.1.6. Estudo Dirigido 1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de micro-organismos e para controle de qualidade. 2) Quais as possveis fontes de erro das tcnicas utilizadas nesta prtica? 3) Discutir a aplicabilidade de cada tcnica utilizada nesta prtica.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

10

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

2.1.7. Relatrio da Prtica 1 Componentes do Grupo:

1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios: Determinao do volume do - Determinao do peso seco de clulas (%p/v) volume da suspenso: tara do pesa-filtro: pesa-filtro + clulas secas: peso das clulas secas: Peso seco (g/100 mL): __________ __________ __________ __________ __________

centrifugado (% v/v) volume da suspenso: __________ volume de clulas: % v/v: __________ __________

- Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER Contagem quadrados: A = _____ , B = _____, C = _____, D = _____, E = _____ 5 quadrados (A+B+C+D+E) = _______ [clulas] da suspenso diluda 50 vezes = ( 5 quadrados) x (5x104) x (diluio) [clulas] da suspenso original = _______ (n clulas / mL) - Turbidimetria Diluio Vol. Susp. (mL) Vol. balo (mL) ABS 570nm ABS mdia N clulas clulas/mL Peso seco (g/100 mL)

2) Construir os seguintes grficos, determinando a reta de calibrao e o fator da curva: Absorbncia 570 nm x peso seco das suspenses diludas Absorbncia 570 nm x n clulas/mL das suspenses diludas

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

11

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

3. DOSAGEM DE ACARES
Os carboidratos, ou acares, com frmula emprica (CH2O)n so um dos maiores grupos de compostos orgnicos conhecidos na natureza, e juntamente com as protenas formam os principais constituintes dos organismos vivos. Os carboidratos simples mais abundantes so as pentoses e hexoses. Os acares possuem um ou mais tomos assimtricos de carbono, portanto podem existir na forma de estereoismeros. Os carboidratos tm diversas classificaes, de acordo com seu tamanho, com o grupo funcional que derivado, entre outras. As classificaes podem ser: monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. Os monossacardios so carboidratos simples que no podem ser hidrolisados a acares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdedos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o nmero de carbonos na cadeia. Os oligossacardios so polmeros compostos de resduos de monossacrdios unidos por ligaes hemiacetlicas, neste caso denominadas ligaes glicosdicas, em nmero que variam de duas, at, aproximadamente, dez unidades. So compostos importantes na determinao de estruturas de polissacardios. Na indstria existem diversas reaes tanto de degradao como de formao de aucares que so determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos. Um acar redutor um acar no qual o carbono da carbonila no est envolvido em uma ligao glicosdica e, portanto, pode sofrer oxidao. Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os ons frrico e cprico. O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico. Todos os monossacardeos so potencialmente redutores, devido a presena da carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

12

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

3.1 Mtodo do DNS (3,5 dinitro salicilato)


Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o mtodo do DNS. um mtodo rpido e prtico na determinao de acares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicao temos: controle de qualidade na caracterizao das matrias primas para fins de processamento, e verificao se determinado produto est dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao; indstria aucareira, no acompanhamento do processo de fermentao, que permite verificar as taxas de consumo de acar pelo micro-organismo. A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se na reduo, em meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (colorao amarela). O produto formado estvel, com colorao laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na proporo estequiomtrica e mxima absoro da luz visvel no comprimento de onda de 535 nm. Neste mtodo ocorre a seguinte reao de oxidao (Figura 3.1):

Figura 3. 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS.

Para se aplicar o mtodo necessrio se fazer inicialmente uma curva-padro do acar que se deseja quantificar, como ser realizado na prtica 2 deste manual. Referncias: MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., n. 31, p.426, 1959.

WANG, Nam Sun. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Disponvel em: http://terpconnect.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm. Acesso em: 10 ago 2011.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

13

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

3.2 Roteiro da Prtica 2 - Curva Padro do Mtodo DNS


Material 1 balo volumtrico de 100 mL 1 Becher de 50 e de 100 mL 1 Basto de vidro Buretas de 10 e 50 mL 7 tubos de ensaio com tampa de rosca Pipeta volumtrica de 1 mL Equipamentos espectrofotmetro UV-Vis balana termmetro banho-maria Reagentes Glicose Reagente DNS

Objetivo: Construir uma curva padro para determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS, empregando a glicose como padro. Sensibilidade do mtodo: 1-20 mols glicose

3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL Pesar, em um becher de 100 mL, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os clculos. Solubilizar com gua destilada e transferir para balo volumtrico de 100 mL. Avolumar o balo. 3.2.2. Construo da Curva Padro Em tubos de ensaio com tampa, e com auxlio da bureta de 10 mL, preparar os seguintes pontos da curva, em duplicata com exceo do branco: gua destilada (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Soluo Padro (mL) 0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 0,8 mL 1,0 mL

branco 1 2 3 4 5

Adicionar 1 mL de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer 100C em banho-Maria durante 5 min.

Resfriar e acrescentar 13 mL de gua destilada em cada tubo, com auxlio da bureta de 50 mL. Tampar os tubos e homogeneizar (volume final = 15 mL).

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

14

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

Proceder a leitura da absorbncia em espectrofotmetro em: = 540 nm.

3.2.3. Estudo Dirigido 1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de acares. 2) Ler o artigo Comparao de Mtodos para Determinao de Acares Redutores e Totais em Mel, disponvel na pasta da Disciplina de Processos Bioqumicos ou no link http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf 3) Quais as possveis fontes de erro na prtica em questo?

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

15

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

3.2.4. Relatrio da Prtica 2 Componentes do Grupo:

1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios: Tubo 1 ABS (540 nm) ABS mdia [glicose] (g/mL)

2) Construir a curva padro de glicose: Abs x [glicose] g/mL, determinando o coeficiente angular e o fator da reta obtida.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

16

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

4. ACCARES REDUTORES (AR) E ACARES REDUTORES TOTAIS (ART)


A qualidade da cana-de-acar era determinada exclusivamente pela sacarose aparente (POL). Atualmente, englobam-se caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas dessa matria-prima, que podem afetar, significativamente, a recuperao deste acar na fbrica e a qualidade do produto final. Dois tipos de fatores afetam a qualidade da matria-prima destinada indstria:

fatores intrnsecos: relacionados composio da cana (teores de sacarose, acares redutores, fibras, compostos fenlicos, amido, cido acontico e minerais), sendo estes afetados de acordo com a variedade da cana, variaes de clima (temperatura, umidade relativa do ar, chuva), solo e tratos culturais;

fatores extrnsecos: relacionados a materiais estranhos ao colmo (terra, pedra, restos de cultura, plantas invasoras) ou compostos produzidos por microrganismos devido sua ao sobre os acares do colmo.

Desta forma, existem indicadores que permitem avaliar tanto a riqueza da cana como a

qualidade da mesma para a recuperao dos acares. A Figura 4.1 ilustra a coleta de amostras de cana para avaliao da sua qualidade. A Tabela 4.1 apresenta os principais indicadores da qualidade da cana.

Figura 4. 1: Coleta de amostras de cana no caminho na entrada da empresa. Fonte: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-cucar/arvore/ CONTAG01_138_22122006154842.html Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

17

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos Tabela 4. 1: Indicadores da qualidade e valores recomendados para a cana-de-acar.

Fonte: Ripoli e Ripoli (2004).

Abaixo, seguem as definies de alguns destes indicadores: POL: teor de sacarose aparente na cana. Para a indstria canavieira, quanto mais elevados os teores de sacarose, melhor. Pureza: determinada pela relao POL/Brix x 100. Quanto maior a pureza da cana, melhor a qualidade da matria-prima para se recuperar acar. Todas as substncias que apresentam atividade ptica podem interferir na POL, como acares redutores (glicose e frutose), polissacardeos e algumas protenas. ATR ou ART (Acares Redutores Totais): indicador que representa a quantidade total de acares da cana (sacarose, glicose e frutose). O ART determinado pela relao POL/0,95 mais o teor de acares redutores. A concentrao de acares na cana varia, em geral, dentro da faixa de 13 a 17,5%. Entretanto, importante lembrar que canas muito ricas e com baixa percentagem de fibras esto mais sujeitas a danos fsicos e ataque de pragas e microrganismos. Os estudos mostram que nas primeiras 14 horas de deteriorao da cana, 93% das perdas de sacarose foram
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

18

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

devidas ao de microrganismos, 5,7% por reaes enzimticas e 1,3% por reaes qumicas, resultantes da acidez. Acares redutores: a quantidade de glicose e de frutose presentes na cana, que afetam diretamente a sua pureza, j que refletem em uma menor eficincia na recuperao da sacarose pela fbrica. A determinao de acares redutores pode ser realizada pelo mtodo de DNS, utilizando-se como padro a glicose. Na determinao de acares redutores totais, promove-se preliminarmente a hidrlise da sacarose com cido clordrico quente, como ser realizado na prtica 3.

Referncias: RIPOLI, T. C. C.; RIPOLI, M. L. C. Biomassa de cana-de-acar: colheita, energia e ambiente. Piracicaba: Barros & Marques Ed. Eletrnica, 2004. 302 p. VIAN, Carlos Eduardo Freitas. Qualidade de http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-deacucar/arvore/CONTAG01_138_22122006154842.html. matria-prima. Acesso em: Disponvel 10 Jul em: 2011.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

19

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

4.1 Roteiro da Prtica 3 - Determinao de Acares Redutores (AR) e Acares Redutores Totais (ART)
Material Equipamentos balo volumtrico de 500 mL espectrofotmetro UVVis 6 bales volumtricos de 100 mL pipetas volumtricas de 1, 2, 5, 10, 25 e banho-maria 50 mL termmetro provetas de 25 e 100 mL 8 tubos de ensaio com tampa de rosca Buretas de 10 e 50 mL Becher de 100 mL Reagentes 100 mL de Caldo de cana HCl 1:1 NaOH 0,1 mol/L Reagente DNS Padro de glicose (aula anterior)

Objetivo: Determinar a concentrao de sacarose, glicose e frutose presentes no caldo de cana.

4.1.1. Determinao de Acares Redutores (AR) Diluir 1, 5 e 10 mL de caldo de cana in natura, ou melao, em bales volumtricos de 100 mL. Pipetar 1 mL do caldo de cana, ou melao, diludo e transferir para tubo de ensaio com tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

4.1.2. Determinao de Acares Redutores Totais (ART) Diluir 50,00 mL de caldo de cana in natura, ou melao, em balo volumtrico de 500 mL. Adicionar a seguir 70 mL de gua destilada. Inserir um termmetro no balo e levar o conjunto para banho-maria (~70C) Quando a temperatura da soluo atingir 65C, retirar o balo do banho-maria e adicionar imediatamente 25 mL de HCl 1:1. Homogenizar e deixar em repouso, temperatura ambiente, por 30 minutos. Aps este tempo, avolumar o balo at volume final. Transferir 2, 10 e 25 mL do hidrolisado diludo para bales volumtricos de 100 mL. Adicionar NaOH 0,1 mol/L at completar o volume do balo. Pipetar 1 mL de cada soluo acima para tubo de ensaio com tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

20

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

4.1.3. Dosagem de acares pelo mtodo do DNS Preparar um padro de glicose, como na prtica anterior, para ler a absorbncia junto com as amostras. Proceder a dosagem de acares redutores (amostras do item 4.1) e redutores totais (amostras do item 4.2) pelo mtodo do DNS: adicionar 1 mL de DNS s amostras j colocadas nos tubos e levar ao banho-maria por 5 min. Deixar esfriar e completar com 13 mL de gua destilada. Preparar amostra em branco (1 mL de gua + 1 mL de DNS). Proceder a leitura da absorbncia em espectrofotmetro em: = 540 nm. Se a absorbncia da amostra estiver fora da curva de calibrao, repetir o procedimento variando a diluio do hidrolisado.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

21

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

4.1.4 Relatrio da Prtica 3 Componentes do Grupo:

1) Dados obtidos na Prtica: Diluio (AR) ABS (AR)

Diliuo (ART)

ABS (ART)

Concentrao do Padro de Glicose (g/mL) = _____ ABS do padro de glicose = _____

2) Calcular o teor de sacarose e de acares redutores no caldo de cana (g/100mL) usando as seguintes equaes: % AR = (C x B x F x 10-4) / P % ART = (A x B x F x 10 ) / P % sacarose = [%ART - %AR] x 0,95 onde: A = absorbncia da amostra processada conforme item 2. B = concentrao do padro de glicose em g/mL (ponto da curva de calibrao) C = absorbncia da amostra processada conforme item 1. P = absorbncia do padro de glicose (ponto da curva de calibrao) F = fator de diluio
-4

________ (g/100 mL) ________ (g/100 mL) ________ (g/100 mL)

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

22

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

5. Grau Brix
Uma das variveis agroindustriais mais facilmente determinadas em laboratrio ou mesmo em campo, o Brix. Quando se trata de cana madura existe estreita relao entre essa porcentagem e o contedo de sacarose na soluo. A cana considerada madura com Brix mnimo
de 18 entre outros fatores. Por consenso, admite-se o Brix como sendo a porcentagem de slidos

solveis contidos em uma soluo aucarada, ou seja: 1 BRIX corresponde a 1 g de slidos dissolvidos em 100 g de soluo 20C Sendo a sacarose um dos slidos do caldo (80-90%), o aumento do seu contedo acaba por resultar em aumento do Brix do caldo. Portanto, em solues com alto teor de acares, como por exemplo o melao, o valor do Brix uma medida aproximada do teor de acares presentes no meio. A medida do Brix pode ser feita atravs de refratmetro ou pelo Sacarmetro de Brix, que que ser utilizado na prtica 4. A escala do Sacarmetro de Brix varia de 0 a 90 Brix com divises de 0,1 / 0,2 / 0,5 e 1 Brix.

Referncias: DOUMER, M. E.; MARTINS, G. A.; MOREIRA, A. da S.; SILVA, S. D. dos A.. Avaliao de graus brix de cana-de-acar (Saccharum spp.) da parte inferior e superior de colmos. Disponvel em:

http://www.ucpel.tche.br/cic/cdcic2009/pdfs/1464.pdf Acessado em: mai 2011. INCOTERM. Instrues de Uso do sacarmetro de Brix. Disponvel em: http://www.incoterm.com.br/download_anexo/5733_MANUAL.pdf. Acesso em mai 2011.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

23

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

5.1 Roteiro da Prtica 4 - Determinao do BRIX


Material proveta de 500 mL Equipamentos sacarmetro de Brix termmetro Reagentes 500 mL de Caldo de cana

Objetivo: Determinar o teor de slidos dissolvidos em uma soluo, atravs da medida da densidade utilizando o sacarmetro de BRIX. 5.1.1. Procedimento Transferir o caldo de cana ou melao para a proveta de 500 mL Mergulhar o sacarmetro de BRIX cuidadosamente, de modo a no umedecer a haste acima do lquido. Deixar o instrumento flutuar livremente e no deixar tocar nas paredes ou no fundo da proveta. Aguardar 5 minutos. Proceder a leitura olhando em nvel com a superfcie da soluo, anotando o valor do BRIX. Verificar a temperatura da soluo. Efetuar as correes, utilizando a tabela 5.1. A correo aditiva quando a temperatura da soluo for maior do que a temperatura padro (20C) e subtrativa quando a temperatura da soluo for menor do que a temperatura padro.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

24

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

5.1.2. Relatrio da Prtica 4 Componentes do Grupo:

Leitura no sacarmetro (BRIX): _____ B temperatura padro 20C Temperatura da soluo: _____C Fator de correo: ______ BRIX = leitura no sacarmetro +/- fator de correo: ______ B
Tabela 5. 1: Tabela de Correo para Grau Brix

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

25

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

5. Cintica do Crescimento Microbiano


Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e no ao aumento das dimenses celulares. Quando se estuda a cintica de crescimento a escolha da tcnica de quantificao microbiana um parmetro importante, pois dela depende os clculos que sero realizados. importante tambm se determinar a taxa de crescimento microbiano e o tempo de gerao do micro-organismo em estudo, nas condies de processo utilizadas. A Taxa de crescimento (velocidade especfica de crescimento) a variao no nmero ou massa de microrganismos por unidade de tempo. Define-se Tempo de gerao como o intervalo de tempo necessrio para que uma clula se duplique. O tempo de gerao varivel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos at dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de gerao no corresponde a um parmetro absoluto, uma vez que dependente de fatores genticos e nutricionais, indicando o estado fisiolgico da cultura. O conhecimento da cintica de um processo ou da cintica de crescimento microbiano importante industrialmente, pois permite a anlise de perigos e pontos crticos do processo (APPCC); previso de eventos fora do processo; determinao de vida-de-prateleira; anlise de Risco. Na Figura 5.1 mostrada uma curva tpica de crescimento microbiano. O crescimento microbiano pode apresentar quatro fases distintas, a saber: Fase Lag ou de Adaptao - fase de adaptao metablica ao novo ambiente, onde ocorre rearranjo do sistema enzimtico (sntese de enzimas), traumas fsicos (choque trmico, radiao, entre outros) e traumas qumicos (produtos txicos, meio de cultura). O nmero de indivduos no aumenta nesta fase, podendo at mesmo decrescer. A durao dessa fase depende das condies ambientais nas quais as clulas se encontravam anteriormente. Fase Log ou Exponencial - Nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Fase na qual o nmero de clulas da populao dobra a cada gerao. A taxa de

crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em


Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

26

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Esta taxa de crescimento no pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Aps um determinado perodo de crescimento exponencial, as condies ambientais tornam-se desfavorveis pela escassez de nutrientes essenciais, acmulo de metablitos txicos e limitao de espao. A taxa de crescimento da populao diminui e segue-se a fase estacionria. Fase Estacionria - Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido s condies limitantes do meio. As clulas continuam metabolizando e se dividindo, mas parte das clulas torna-se invivel e a taxa de diviso celular muito prxima da taxa de morte celular, o que mantm constante o nmero de clulas viveis na populao. A curva de crescimento atinge um plat. A durao da fase estacionria depende do balano entre a taxa de diviso celular e o nmero de clulas que vo se tornando inviveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido s condies ambientais tornarem-se progressivamente desfavorveis. na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias. Fase de Declnio ou de Morte - Fase de declnio exponencial do nmero de clulas viveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de diviso. O nmero de clulas viveis entra em declnio progressivo at a completa extino da populao.

Figura 5. 1: Curva caracterstica do crescimento celular de um micro-organismo

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

27

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

Leitura Complementar: STREMEL, D. S., VIDAURRE, T.C., SILVA, F.S., KELLER, L.E. Estudo da cintica de crescimento microbiano do Bacillus subtilis em meio alternativo na produo de Biocontrolador de fungos fitopatognicos. XVIII Congresso Regional De Iniciao Cientfica e Tecnolgica.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

28

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

5.1 Roteiro da Prtica 5 - Cintica do Crescimento de Clulas de Leveduras


Material pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 5 mL pipetas graduadas de 5, 10 e 25 mL proveta de 100 mL 5 Becher de 50 ou 100 mL 8 tubos com tampa de rosca 1 Erlenmeyer de 250 mL Basto de vidro Equipamentos espectrofotmetro UV-Vis agitador tipo shaker balana Reagentes fermento biolgico extrato de lvedo glicose KH2PO 4 (NH2)2SO4

Objetivo: Determinar a taxa especfica de crescimento de clulas de levedura em meio sinttico (YED 2%). 5.1.1. Preparo da soluo de YED 2% e inoculao das clulas Preparar a soluo de YED em erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de gua destilada e solubilizar todos os reagentes. Pesar entre 90 e 100 mg de fermento biolgico. Anotar a massa. Inocular o meio sinttico transferindo o fermento para a soluo de YED 2%, com o auxlio da prpria soluo. Colocar o erlenmeyer em agitador tipo shaker e iniciar agitao contnua.

5.1.2. Determinao da concentrao de biomassa (X) Aps inocular as clulas, retirar uma alquota de 3 mL. Transferir um pouco da amostra para a cubeta e proceder a determinao de biomassa em 570 nm, utilizando a curva de quantificao de micro-organismos. Se a absorbncia for maior do que o ltimo ponto da curva, proceder diluio da mesma. Repetir o procedimento, retirando alquotas a intervalos de 30 min, aumentando a diluio, se necessrio.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

29

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

5.1.3. Relatrio DA Prtica 5 Componentes do Grupo:

1) Determinao da concentrao de biomassa (X) Tempo (h) 0 1 2 3 4 Absorbncia (570 nm) diluio [biomassa] (g/ mL)

2) Construir a curva de crescimento: (i) [biomassa] x tempo, (ii) Ln [biomassa] x tempo. 3) Determinar a taxa especfica de crescimento (X) das clulas de levedura em meio YED.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

30

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

6. Produo de Etanol
O lcool (etanol) pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a canade-acar a realidade econmica atual. Investimentos portentosos esto sendo efetuados para viabilizar a produo de lcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhes de litros de lcool poderiam ser obtidos desta fonte, apenas nos EUA. O benefcio ambiental associado ao uso de lcool enorme, pois cerca de 2,3 t de CO2 deixam de ser emitidas para cada tonelada de lcool combustvel utilizado, sem considerar outras emisses, como o SO2. A cana-de-acar a segunda maior fonte de energia renovvel do Brasil com 12,6% de participao na matriz energtica atual, considerando-se o lcool combustvel e a co-gerao de eletricidade, a partir do bagao. Dos 6 milhes de hectares, cerca de 85% da cana-de-acar produzida no Brasil est na Regio Centro-Sul (concentrada em So Paulo, com 60% da produo) e os 15% restantes na regio Norte-Nordeste. Na safra 2004, das cerca de 380 milhes de toneladas modas, aproximadamente 48% foram destinadas produo de etanol. O bagao remanescente da moagem queimado nas caldeiras das usinas, tornando-as auto-suficientes em energia e, em muitos casos, superavitrias em energia eltrica que pode ser comercializada. No total foram produzidos 15,2 bilhes de litros de etanol e uma gerao de energia eltrica superior a 4 GWh durante a safra, o que representa aproximadamente 3% da nossa gerao anual. O etanol um produto da fermentao do acar, mais freqente entre os microorganismos. As principais produtoras de lcool so as leveduras principalmente linhagens de Saccharomyces cerevisae. As leveduras so, como na maioria dos fungos, organismos aerbicos. No entanto, sob condies de anaerobiose fermentam carboidratos etano e gs carbnico. C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 A fermentao da glicose etanol e gs carbnico pela levedura Saccharomyces cerevisae segue o caminho da frutose bifosfato. A transformao de piruvato etanol resume-se em duas etapas. Primeiro, o piruvato descarboxilado a acetaldedo sob ao da piruvatodescarboxilase (e cooperao da tiaminopirofosfato). O acetaldedo , em seguida, reduzido a etanol pela lcool-desidrogenase com NADH2. Referncias: http://www.biodieselbr.com/energia/alcool/etanol.htm
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

31

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

6.1 Roteiro da Prtica 6 - Produo de Etanol em caldo de cana-deacar


Material 2 Erlenmeyer de 500 mL Proveta de 200 mL 2 Becher de 50 mL Becher de 100 mL Basto de vidro Fermentmetro Equipamentos balana Reagentes 350 mL de Caldo de cana 60 g de fermento biolgico NaF

Objetivo: Produzir etanol utilizando caldo de cana como matria prima e observar as fases da fermentao alcolica. 6.1.1. Fermentao Pesar cerca de 25 g de fermento biolgico em becher. Transferir 150 mL de caldo de cana para o erlenmeyer de 500 mL. Acrescentar o fermento biolgico previamente pesado e adaptar o fermentmetro. Anotar a massa total do conjunto (m). Deixar que a fermentao se processe, pesando e anotando a massa do conjunto a cada 30 min. 6.1.2. Inibio da fermentao por NaF (inibidor da enolase) Repetir o procedimento do item 6.1, acrescentando-se ao caldo de cana 0,315 g de NaF.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

32

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

6.1.3. Relatrio da Prtica 6 Componentes do Grupo:

1) Para os procedimentos 6.1 e 6.2, responda: a) Qual a quantidade de gs carbnico produzido? b) Qual a quantidade de etanol produzido? c) Qual a quantidade de glicose consumida? 2) Calcule o grau de inibio provocado pelo NaF. 3) Calcule o rendimento e a eficincia da fermentao. Dado: rendimento terico = 0,511 4) Construa o grfico SCO2 x t, Setanol x t. 5) Pesquise a funo da enzima enolase.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

33

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

6.2 Roteiro da Prtica 7 - Produo de Etanol em YED a 2%


Material Parte 1: Erlenmeyer de 250 mL Provetas de 50 e 100 mL Pipeta volumtrica de 1 mL 2 Becher de 50 e 100 mL 10 tubos com tampa de rosca 3 tubos de centrfuga 4 bales volumtricos de 250 mL 2 bales volumtricos de 100 mL Basto de vidro Pipeta graduada de 5 mL Bureta de 25 mL Parte 2: Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL 3 Erlenmeyer com tampa de borracha Proveta de 200 ou 250 mL Proveta de 25 mL ou pipeta graduada de 20 mL Bureta de 25 mL Equipamentos

Parte 1:

Reagentes Parte 1: 60 g de fermento Balana biolgico Espectrofotmetro Glicose Destilador Padro de glicose de centrfuga 10 mol/mL DNS Extrato de lvedo KH2PO4 (NH4)2SO4 NaOH 0,1 N Parte 2: Padro de dicromato de potssio H2SO4 concentrado H3PO4 85 % Indicador Sulfato ferroso amoniacal

Objetivo: Calcular a eficincia de uma fermentao de glicose por clulas de leveduras atravs da medida da produo de etanol e do consumo de glicose. 6.2.1. Preparo da soluo de YED 2% Colocar em um erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de gua destilada e solubilizar todos os reagentes. Retirar uma alquota de 3 mL para a dosagem de acar pelo mtodo do DNS. 6.2.2. Produo de clulas e de etanol e consumo de glicose Inocular o erlenmeyer de 250 ml, contendo YED com 20 % (pu/v) de clulas. Agitar e imediatamente retirar uma alquota de 1,0 ml (tempo 0) e verter para balo volumtrico de 250 mL, completando com gua destilada. Fazer a leitura da ABS a 570 nm (dosagem de clulas). Manter o mosto inoculado agitando periodicamente por 1 h.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

34

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

Aps 1 h de fermentao, retirar alquota de 3 ml para determinao da concentrao celular. Diluir a amostra 1:250 e ler a ABS a 570 nm. Centrifugar cerca de 30 ml do meio fermentado. Recolher o sobrenadante (tempo 1 h). Do sobrenadante, guardar 5 ml para determinao do teor de acar e colocar 10 ml no compartimento do destilador. No destilador, adicionar em seguida 10 ml de H2O e 0,5 ml de NaOH 0,1 N. Fechar o sistema e recolher os 8 ml iniciais do destilado. Completar este volume a 10 ml com exatido. Congelar a amostra para posterior determinao do teor de etanol pelo mtodo do dicromato. Diluir 100 vezes uma alquota dos sobrenadantes (tempos 0 e 1 h) e determinar a quantidade de glicose pelo mtodo do DNS. 6.2.3. Determinao do lcool pelo mtodo do dicromato Colocar 10 ml de soluo de dicromato em 3 frascos cnicos e adicionar, em seguida, 5 ml de H2SO4 concentrado, resfriando-se em gua da torneira. Colocar em cada frasco 5,0, 2,5 e 1,0 ml do destilado e completar o volume a 5,0 ml de gua, quando for o caso. Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 min para o etanol ser quantitativamente levado a cido actico. Aps 15 min, adicionar 165 ml de gua destilada, 18 ml de cido fosfrico e 0,5 ml de indicador. Titular com sulfato ferroso amoniacal at a cor da soluo mudar de prpura para verde e anotar o volume consumido (n). Para o ensaio em branco adicionar 5 ml de gua destilada no lugar da amostra e repetir o procedimento. Anotar o volume consumido (N). Clculos: Alquota de 5 ml do destilado Alquota de 2,5 ml do destilado Alquota de 5 ml do destilado A = 2 (1 n/N) A = 4 (1 n/N) A = 10 (1 n/N)

Onde A = concentrao de etanol na amostra original (%)


Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

35

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

6.3.4. Relatrio da Prtica 7 Componentes do Grupo:

1) Calcular as concentraes de glicose e de clulas para os tempos 0 e 1 h. 2) Calcular a massa de etanol formado. 3) Calcular o rendimento e a eficincia da fermentao a partir dos resultados.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

36

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

7. Acidez de vinhos
Sabe-se que a acidez dos vinhos se deve a presena de cidos como o tartrico, mlico e ctrico, entre os mais importantes. Estes cidos garantem a conservao do vinho bem como outras caractersticas de suma importncia. O grau de acidez est tambm relacionado com a acidez total titulvel, o pH, a quantidade de cidos dissociados e no dissociados, e a quantidade relativa de cada um dos cidos presentes. Dentro dos padres comerciais, a acidez do sumo fica no intervalo de 0,6 a 0,9 % (expresso como a quantidade de cido tartrico por 100ml de sumo ou vinho). Os vinhos doces tm acidez no intervalo de 0,4 a 0,65%. Na fabricao do vinho importante saber a acidez titulvel do mostro para poder determinar a quantidade correta de dixido de enxofre que ser adicionada e tambm decidir se ou no necessria uma correo da acidez. A acidez titulvel do vinho normalmente expressa em cido tartrico % (m/v); massa molar do C2H4O2(COOH)2 = 150,09g/mol. Lembrar que o cido tartrico tem dois hidrognios titulveis ate a viragem da fenolftalena. cido tartrico ( g/100mL) = (Vb).(C NaOH).( 150,09).(100) (1000).2.(Vam) onde: Vb o volume, em mL, da soluo de NaOH usada na titulao. C NaOH a concentrao da soluo de NaOH, em mol/L. Vam o volume, em mL, da amostra titulada. Esta determinao est sujeita interferncia do CO2 dissolvido. Este erro pode ser minimizado diluindo o vinho com gua quente, prximo da fervura, e depois deixando esfriar at a temperatura ambiente antes de titular. Geralmente esse erro pequeno.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

37

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

7.1. Roteiro da Prtica 8 - Determinao da acidez total de vinhos


Material 2 Erlenmeyers de 250 mL 1 Becher de 100 mL Pipeta volumtrica de 25 mL Reagentes Vinhos branco e tinto secos gua destilada Soluo alcolica de fenolftalena a 1% NaOH 0,1 M

Objetivo: determinar a acidez titulvel do vinho branco e tinto. O cido tartrico expressa a acidez titulvel do vinho. Esta expresso pode ser obtida por meio de uma equao que determina a concentrao do cido tartrico em g/mL. 7.1.1. Procedimento Transferir 25 mL de vinho branco seco para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 100 mL de gua deionizada e 5 gotas de soluo alcolica de fenolftalena a 1%. Titular com uma soluo padro de NaOH 0,1M. O ponto final indicado pela permanncia de uma leve cor rsea por mais de 30 segundos. Repetir o procedimento acima para o vinho tinto, com o cuidado de que o ponto final evidenciado pelo aparecimento de uma cor cinza-esverdeada.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

38

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

7.1.2.Relatrio da Prtica 8

Componentes do Grupo:

1) Calcule a acidez do vinho analisado. 2) Determine o erro da anlise, comparando o valor obtido com o contido no rtulo. 3) Compare com os valores comerciais.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

39

Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

8. Preparo de Solues e Indicadores


Reagente DNS Preparar separadamente, por dissoluo quente e a agitao, as solues abaixo: - 10g cido 3,5-dinitro saliclico em 200 mL NaOH 2 mol/L (fica uma massa pastosa) - 300 g tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL gua destilada Misturar as duas solues e completar o volume a 1000 mL com gua destilada aquecida.

Meio sinttico YED 2%

Solubilizar em gua destilada o extrato de lvedo (1%), glicose (2%), KH2PO4 (0,2%) e (NH4)2SO4 (0,2%)

Indicador: 0,25 g de sal de brio do cido 4-difenilalanina-sulfnico dissolvido, com leve aquecimento, em 50 ml de gua. Filtrar em papel de filtro faixa azul. Lquido sobrenadante usado.

Soluo padro de dicromato de potssio: 8,454 g K2Cr2O7 dissolvidos em gua, completado a 250 mL.

Soluo de sulfato ferroso amoniacal: 67,55 de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, dissolvido em 300 mL de gua e 10 mL de H2SO4 concentrado. Filtrar em papel faixa azul para balo de 500 mL e completar o volume com gua destilada.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

40