Cultivos in vitro. Produccin y mejoramiento de plantas.

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES O CULTIVOS IN VITRO El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las tcnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagacin de grandes volmenes de plantas en menor tiempo; as como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la tcnica es de gran utilidad en la obtencin de plantas libres de patgenos; plantas homocigotas, en la produccin de plantas en peligro de extincin, en estudios de ingeniera gentica, etc. Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado. El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperiodo e irradiacin controlados. La manipulacin se realiza en cabinas de flujo laminar Esta tcnica es importante en la propagacin de especies de inters agroforestal: micropropagacin. Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacutica, cosmtica y alimentaria, como alcaloides, compuestos aromticos o pigmentos. Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geogrficas, climticas y de tiempo de produccin. El cultivo de tejidos comprende la micropropagacin, el aislamiento y cultivo de embriones, la regeneracin a partir de callo y de suspensiones celulares y el cultivo de protoplastos, anteras y microsporas. Estas tcnicas se estn utilizando en particular para la multiplicacin de plantas en gran escala. La micropropagacin ha resultado especialmente til en la produccin de material de plantacin de gran calidad y libre de enfermedades de un amplia variedad de cultivos.

MICROPROPAGACIN

Es el proceso de multiplicar plantas in vitro. A travs de la micropropagacin, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia. Este proceso incluye varias fases: 0) Preparacin de la planta madre 1) Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia 2) Multiplicacin de brotes 3) Enraizamiento 4) Aclimatacin El cultivo in vitro de plantas superiores es una tcnica que exige un control absoluto del ambiente, tanto fsico como qumico, en el que se sita al explanto. Los principales factores no biolgicos que afectarn al desarrollo del cultivo in vitro como: AMBIENTE QUMICO Composicin del medio Ph AMBIENTE FSICO Temperatura Luz y fotoperodo

El fundamento terico del cultivo in vitro es el concepto de la Totipotencialidad celular. Totipotencialidad Es la capacidad de una clula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa Las clulas totipotentes son clulas somticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.

Schleiden y Schwan (1887) describen en su teora celular, que la clula es capaz de subsistir por si sola si las condiciones externas le son favorables. A Morgan (1901) se le atribuye el trmino de la Totipotencialidad celular propiamente dicho, que dice que una clula es capaz de desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y si se le aplican los estmulos adecuados. Haberlandt (1902) con la idea de la Totipotencialidad celular desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales. Desafortunadamente sus trabajos resultaron sin xito debido a que utiliz un medio de cultivo relativamente simple y por otra parte, tejidos vegetales demasiado diferenciados. White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos pices de races de jitomate. Los tejidos meristemticos del pice radical propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debi, como lo menciona White, a la mala eleccin del material vegetativo y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen impulso al desarrollo de las tcnicas de cultivo in vitro; sin embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferacin celular en forma, los pices de raz solo crecen en longitud como lo haran normalmente como parte de la raz de la planta intacta. No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferacin celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultneamente la formacin de una masa de clulas parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en s el despegue de las tcnicas de cultivo in vitro. Un factor importante en el desarrollo de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la divisin celular (efecto citocinnico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenia un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952). Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado por calor, tena un efecto muy marcado en la formacin de brotes a partir de tejidos de tabaco. De este cido desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores (1955) aislaron un compuesto de naturaleza purnica enominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina.

En 1926 dos cientficos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudricin en plntulas de arroz. El efecto que produca dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la induccin de germinacin en semillas, brotacin en algunos tubrculos como la papa etc.

Cultivo de clulas vegetales Definicin Cultivo asptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo. Tipos de cultivos: cultivo de clulas cultivo de tejidos cultivos de rganos

Cultivos vegetales Cultivos agronmicos Cultivos in vitro 1. Cultivos diferenciados ( races, tallos, embriones, races y tallos transformados) 2. Cultivos indiferenciados ( callos, suspensiones)

Cultivos indiferenciados Callos : en medio slido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular, Cultivos en suspensin: derivan de los anteriores, en medio lquido de composicin adecuada, crecimiento ms rpido y homogneo. Composicin del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas)

Callos Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en divisin activa. Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas.

Medio de cultivo Es la combinacin slida o lquida de nutrientes y agua. Incluye sales inorgnicas, carbohidratos, vitaminas y aa. Se le denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algn regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias. Tipos: Medio slido: es todo aquel que contiene un agente gelificante. Medio lquido: no se adiciona ningn gelificante. Mezcla de sustancias en los que las clulas, tejidos y rganos pueden desarrollarse. Sustancias inorgnicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I Suplementos orgnicos complejos: leche de coco, extracto de levadura. Reguladores de crecimiento : hormonas. Fuente de carbono: sacarosa Con o sin agar: medio semi -slido o lquido.

Reguladores de crecimiento

Hormonas/ Fitohormonas: Auxinas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintticas) que inducen la elongacin, o en algunos casos la divisin celular. Frecuentemente inducen races adventicias e inhiben la formacin de tallos adventicios. Cytokininas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintticas) que inducen divisin celular y frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formacin de races adventicias.

Reglas generales para la accin hormonal: Auxina : Cytokinina = ~1 Auxina : Cytokinina < 1 Auxina : Cytokinina > 1 Callo Tallo Races

Terminologa y tcnicas 1. Explanto: porcin de tejido u rgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo. 2. Esterilizacin: procedimiento para la eliminacin de microorganismos. Autoclave: aparato en el que el medio, material d vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presin (121oC, 15 psi, 10-20 min.). Requerimientos de asepsia: desinfeccin de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos. Cabina de flujo laminar: rea de trabajo, mantenida estril por el flujo continuo, no turbulento de aire estril. Subcultivo: pasaje de clulas, tejidos, rganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco. Micropropagacin: propagacin vegetativa in vitro de plantas.

Diferenciacin: desarrollo de clulas o tejidos con una funcin especfica y/o regeneracin de rganos, estructuras tipo rganos (races, tallos) o embriones. Adventicios: desarrollo de rganos (races, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.

Organognesis (formacin de rganos)

Aplicaciones prcticas del cultivo in vitro: Propagacin vegetativa. Esto es lo ms de prctico. Dos tcnicas: estaquillas

Micropropagacin - Organognesis de callos Produccin de plantas Cultivo libres de virus de

mediante

dos

tcnicas: meristemos

- Microinjerto in vitro

Permite hacer germinar semillas que son muy difcil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orqudeas tienen en los campos unos parsitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parsitos o in vitro. Eliminar la inhibicin de germinacin de las semillas. El cultivo in vitro es lo ms eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrin. Prevencin del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de inters cientfico o intergenticos, sobre todo en plantas herbceas. Los cruces incompatibles dan abortos. Aplicacin en mejora gentica para obtener hbridos, para introducir material gentico, etc. Acortar los ciclos de mejora gentica. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del rbol para ver resultados. Produccin de haploides. Cruzamientos o rpida cultivo de polen (anteras). Ventajas: de homocigotos.

Obtencin - Produccin de hbridos (frutos puros).

Equipo necesario para el cultivo in vitro

Autoclave Cmara Medio - Cmara de cultivo.

de de

flujo

laminar cultivo Planta

Autoclave Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter protenas. Es como una olla a presin, pero de mayor tamao, donde se controla la presin y la temperatura (hasta 120).

Cmara de flujo laminar Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitculo con un operario en un ambiente estril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

Medio de cultivo Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapn. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

Planta El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminacin, aunque se lave mucho y bien. Lo ms corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones.

Cmara de cultivo La cmara de cultivo es una habitacin de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variacin da-noche, etc..

Condiciones del cultivo in vitro En la cmara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema ms importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones. En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibiticos, cido giberlico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas. El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias. Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo. El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Se necesita agar y medio slido 0,6-0,9%. El medio de cultivo realmente slo tiene que llevar agua, fuente de energa (azcares) y reguladores de crecimiento. El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos aos en prepararlo. En la cmara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). Tambin existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas tambin varan. Lo normal son 22-26C, aunque en ocasiones se exigen fros de 4C y tambin 28-30C para plantas tropicales.

Igualmente, en el xito de esta tcnica de propagacin tambin influyen determinadas caractersticas de la planta, como el tipo, gentica e incluso el tipo de implante, parte ms juvenil o ms adulta. En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la prdida de agua, lo que provocara un aumento de la concentracin de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ah la importancia del cierre. Subcultivos o replicado Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan races ni hojas, sino que se produzca una proliferacin (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos. No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan slo se hace 8-10 veces. Ocurre entonces lo siguiente: El medio nutritivo se agota y se El material vegetal ocupa todo el - Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias - El medio se hace lquido. seca. tubo. txicas).

Fases del cultivo de meristemos 1. Toma 2. 3. 4. Fase Fase un Siembra de pice en proliferacin: de meristemtico el crecimiento medio de (0,2-1 del brotes. el mm). tubo. Subcultivos. medio).

enraizamiento

(cambiar

5. Primera fase de aclimatacin. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plstico, bandejas de vidrio, etc.. 6. Segunda fase de aclimatacin. Siempre en invernadero.

7. Plantacin en el campo.

1.

Fases del cultivo de embriones Se utiliza mucho en manzano. Se desinfecta el 2. 3. 4. A las Se Se 1-2 semanas, coge el

fruto

en embrin en

alcohol. de el ms o

Se la

flamea. semilla. tubo. reconocible.

inocula la planta

est

menos

5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatacin. Micropropagacin Se parte de una yema, de brctea o axilar. Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo. Entre la fase de proliferacin y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener ms plantas). El nmero de subcultivos depende del material vegetal.

Ejemplo de micropropagacin de Kiwi: Se Al En cabo la fase parte de de 4 de semanas proliferacin se un obtiene una trozo yema gran y de crece cantidad un de tallo. brote. brotes.

intentamos

obtener

- Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio. Al aumentar la concentracin de auxinas se obtienen plantas enraizadas.

- Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo. Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio. Al aumentar la concentracin de auxinas se obtienen plantas enraizadas.

- Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.

Cultivo de callo in vitro Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser slido o lquido. Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o tambin proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrin. A partir de entonces se desarrolla normalmente.

Obtencin de plantas haploides Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriognesis u organognesis. Embriognesis: se forman clulas (poliembriones). Organognesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide). No se riega nunca por aspersin (riesgo de patgenos), siempre con regadera.

Problemas en el cultivo in vitro * Contaminacin: es grave.

* Vitrificacin: es una reaccin de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La nica solucin es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estn bien.

Marcadores genticos en la mejora vegetal. Tradicionalmente, los mtodos para identificar genotipos de plantas, as como para estimar las relaciones filogenticas existentes entre ellas, se han basado en el estudio de caractersticas morfolgicas. Sin embargo, estas caractersticas pueden ser alteradas por enfermedades, variar en funcin de la etapa del crecimiento o el ambiente agroclimtico. En numerosas ocasiones existen genotipos mal indexados, especialmente cuando se trata de cultivares que presentan fenotipos muy similares. Por otra parte, la identidad gentica de un cultivar puede modificarse, debido a mutaciones somticas mantenidas durante su reproduccin vegetativa . Gracias a los avances en la biologa molecular, se han desarrollado mtodos de identificacin y caracterizacin basados en el uso de marcadores moleculares que superan, en la gran mayora de los casos, las limitaciones de los mtodos tradicionales. Estos marcadores moleculares son fenotpicamente neutros, presentan mayor segregacin o polimorfismo que los morfolgicos, pueden ser evaluados desde los primeros estados de desarrollo de las plntulas, son aplicables a cualquier tipo de material vegetal, son independientes de la poca del ao en que se realiza el anlisis, permiten la identificacin correcta de la variedad sin necesidad de muchos caracteres y estn libre de los efectos epistticos . Los marcadores polimrficos del cido desoxirribonucleico (ADN) o marcadores moleculares, son herramientas valiosas para los estudios genticos de las plantas. Marcadores moleculares. Los marcadores moleculares son una herramienta en los estudios de diversidad gentica, filogenia, seleccin asistida por marcadores - SAM entre otros, y pueden ser clasificados en tres grupos: Marcadores basados en la hibridacin del ADN, dentro de los cuales los ms utilizados en plantas son los Restriction Fragment Length Polymorphisms - RFLP. En el proceso se utiliza una sonda que hbrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en una membrana. Los RFLP son altamente reproducibles, codominantes y multiallicos, pero tiene la desventaja de no ser automatizables, son muy dispendiosos y exigen unas condiciones especficas de infraestructura. Los Variable Number of Tandem Repeats VNTR son secuencias altamente repetidas en el genoma y son detectables de manera similar a los RFLP pero difieren de stos en el tipo de sonda utilizada. Marcadores basados en la amplificacin del ADN. Estos marcadores utilizan el principio de la Polymerase Chain Reaction PCR, tcnica basada en la amplificacin de secuencias de ADN utilizando iniciadores y una polimerasa para la elongacin de la cadena. Se conocen varios tipos:

Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD que utilizan iniciadores al azar y no exigen un conocimiento del genoma. DNA amplification fingerprinting DAF y Arbitrary Primer PCR APPCR son tcnicas similares a los RADP pero su visualizacin se realiza en geles de poliacrilamida. Estas tcnicas son relativamente rpidas, sencillas, automatizables y no exigen marcadores radioactivos. La disminucin en los costos de secuenciacin y PCR junto a la creciente informacin sobre los genomas han permitido el desarrollo de otros marcadores basados en PCR con diferentes caractersticas, entre ellos los ms utilizados en plantas son los Simple Sequencese Repeats - SSR o microsatlites y los Amplified Fragment Lenght Polymorphisms AFLP, estos ltimos considerados como marcadores mixtos porque contempla algunos de los principios de los RFLP y de los RAPD. Existen distintas estrategias para convertir estos marcadores en marcadores PCR aleloespecficos conocidos como Sequence-Tagged - STS. Los Sequence Characterzed Amplified Region -SCAR, Clivage Amplified Polymorphyms Sequenced - CAPS, Single Nucleotide Polymorphyms - SNP y Single Strand Conformational Polymorphyns - SSCP son otro tipo de marcadores que han sido actualmente desarrollados como variantes de los descritos anteriormente y tienen la ventaja de que aumentan la precisin y el nivel de informacin. Aplicaciones Entre las numerosas aplicaciones de estos marcadores moleculares figuran la identificacin varietal y la comprobacin de su pureza (Gorg et al (1992)). Marcadores moleculares se han empleado en el gnero Solanum para el anlisis de la biodiversidad y para estudios filogenticos. Muchos han aplicado los marcadores moleculares en diversas especies frutales del trpico y han obtenido relevantes resultados. As, por ejemplo para determinar la aplicacin del anlisis de conglomerados, con el objetivo de complementar el estudio de patrones electroforticos en la especie Psidium spp, se utiliz la tcnica de isoenzimas, el anlisis de conglomerado complement el estudio de zimograma y permiti diferenciar entre especies de P. guajava y P. friedrichsthalianum . En el valioso frutal del maran, otros aplicaron los marcadores: Amplificacin Aleatoria del ADN Polimrfico (RAPD), Inter Secuencias Simples Repetidas (ISSR) y Polimorfismo en la Amplitud de los Fragmentos Amplificados (AFLP), para comparar las diferentes accesiones del banco de germoplasma y estudiaron la eficiencia y utilidad de las tres tcnicas en la deteccin de variaciones entre plantas. Las tcnicas pudieron discernir entre los distintos materiales. Pero los AFLP exhibieron el mayor poder de discriminacin, de aqu que se recomienda para realizar los anlisis genticos

El marcador RAPD tambin ha sido empleado en la especie Pasiflora spp., para evaluar la variabilidad gentica y estimar las tasas de similitud entre las diferentes especies, detectndose dentro de P. edulis una alta variabilidad gentica . Adems, para la identificacin de genotipos de mango (Mangifera indica L) se ha empleado el marcador Microsatlite o Secuencias Simples Repetidas (SSR), porque resulta de gran utilidad en estudios de identificacin, variabilidad y manejo de germoplasma y domesticacin . En otros estudios con el uso de la tcnica RAPD, se determin la variabilidad gentica entre materiales de guanbana (Annona muricata L.) y se identificaron 14 fragmentos RAPD polimrficos. Con su empleo se determin una alta variabilidad gentica y, adems, se identificaron dos grupos de materiales: los de origen venezolano y los de Brasil. La aplicacin de marcadores moleculares para la caracterizacin e identificacin de las variedades de frutales contribuye a la multiplicacin y el mejoramiento gentico. Otra posibilidad de gran inters es la construccin de mapas genticos basados en marcadores moleculares (Gebhardt et al ( 1989. En estos mapas de pueden integrar marcadores para genes cualitativos. De esta forma se han obtenido marcadores para resistencias monognicas a PVY, PVX (Rx1 , Rx2; Ritter et al (1991)), nematodos (Grol (Barone et al 1990), Hl (Gebhardt et al 1993), Gpal, Gpa2) y Phytophthora infestans (R1, RJ, R6, R7) (Leonards-Schippers 1992). Por otra parte, se pueden integrar tambin marcadores para caracteres cuantitativos (anlisis QTL). Estudios realizados en patata incluyen anlisis QTL para resistencia a P. infestans (Leonards-Schippers (1994)) y Globodera pallida (Kreike et al (1993)), para la produccin y sus parmetros, y para el contenido en azucares y almidn (Schafer-Pregl et al (1998)). Estos marcadores permiten la "seleccin asistida por marcadores" (MAS) en la mejora gentica. Se pueden observar QTLs esparcidos por todo el genoma. Algunos coinciden en diferentes aos, mientras que otros reflejan la interaccin genotipo medioambiente. Tambin se pueden observar en ciertos casos que componentes influyen en la produccin. La integracin de genes (cDNA) conocidos, incluyendo genes "candidatos" para caracteres de inters (por ejemplo protenas PR y secuencias RGL) y genes homlogos de otras especies, nos lleva al concepto del "mapa funcionar' (Gebhardt et al (1989)). La alineacin de diferentes mapas mediante RFLP (Gebhardt et al (1991)), AFLP comigrantes y SSR, ha incrementado el nmero de diferentes marcadores disponibles adems de permitir estudios comparativos entre genomas dentro del gnero Solanum y entre diferentes especies como patata y tomate (Fig. 2).

Fig. 2. Aplicaciones y conceptos de mapas genticos.

GENES MARCADORES DE RESISTENCIA A ANTIBITICOS Canamicina / Neomicina Estreptomicina Ampicilina Amicacina I. Marcadores utilizados para el estudio de la variabilidad gentica en los bancos de germoplasma La evaluacin de los recursos genticos es importante para identificar rasgos potencialmente valiosos de las muestras, as como las variedades locales que podran utilizar directamente los agricultores (Cote et al.,1993). La diversidad se puede analizar a nivel intraespecfico o interespecfico y se puede estudiar en otros niveles de organizacin, desde los ecosistemas hasta los niveles celular, subcelular y molecular. Son numerosos los mtodos existentes para determinar el grado de variacin gentica entre distintas plantas o poblaciones (Jarret, 1990). Los mtodos basados en la morfologa permiten analizar las diferencias de rasgos observables (fenotipos) entre las distintas plantas. Estos mtodos son relativamente econmicos y constituyen la base de la caracterizacin de las muestras de plantas en los bancos de germoplasma (Siquiera et al., 1988; Makumbi y Rubaihayo, 1995; De O et al., 1997).

Los mtodos citogenticos y moleculares o gentico-bioqumicos permiten analizar las diferencias entre los cromosomas, las protenas o el ADN de las plantas (Avise, 1994). El anlisis citogentico caracteriza y diferencia a los genotipos mediante el estudio del cariotipo y la meiosis (Lacadena, 1995), mientras que el anlisis isoenzimtico proporciona un estimado de la diversidad gentica, basndose en la presencia de genes comunes (Brown y Clegg, 1983), por lo cual ambos estudios ofrecen nuevas posibilidades para el manejo de una coleccin. I.1 Evaluacin morfoagronmica La clasificacin mediante descriptores cualitativos y cuantitativos y el establecimiento de las relaciones entre y dentro de un grupo taxonmico de Musa, se convertirn en herramientas importantes para el mejoramiento de bananos y pltanos, la identificacin de duplicados y determinacin de los principales caracteres para diferenciar el material gentico (Osuji et al., 1997; Ortiz et al.,1998). La evaluacin sistemtica del material experimental permite realizar la seleccin de clones prometedores, que pueden ser empleados como nuevos cultivares en la zona agroecolgica escogida (Ortiz et al., 1998). Los datos de caracterizacin son descriptores morfolgicos, que se pueden observar fcilmente a simple vista y se expresan en todos los ambientes. Tales datos describen los atributos de la especie objeto de muestreo, como la altura de las plantas, la morfologa de las hojas, el color de las flores, entre otros. Los caracteres morfolgicos resultan de gran inters dentro de este contexto. Algunos ejemplos de la importancia de tales caracteres han sido expuestos por Jain et al. (1975). Evidencias convincentes de su aplicacin lo constituyen la posibilidad de distinguir el nivel de ploida, mediante mediciones del grano de polen en diversos cultivares (Garca et al., 1996), la utilizacin del grano de polen como indicadores de tolerancia al estrs de temperatura y humedad, as como evaluar caracteres relacionados con la entrada de patgenos y caracterizacin de variedades (Morales et al., 1996). La deteccin de diferencias en los patrones radiculares y la arquitectura entre los genotipos, pueden ofrecer un criterio de seleccin para la tolerancia a enfermedades, plagas y estrs de temperatura (Leskovar y Staffella, 1995). Es ms fcil llegar a medir la variacin gentica de caracteres, como produccin y rango de adaptacin de variedades, pero resulta imposible reconocer y enumerar en una poblacin los genotipos y los loci que afectan esos caracteres bsicos, dado que tal variacin se manifiesta generalmente como diferencias sutiles, las que se confunden tras el rango experimental de deteccin por variacin inducida por el ambiente. Muchas caractersticas agronmicas que necesitan los mejoradores tienen una complejidad gentica excesiva, para poder distinguir en la caracterizacin preliminar de las muestras de germoplasma. Estos datos se suelen poner de manifiesto en la fase de evaluacin del germoplasma, para conocer los rasgos agronmicos tiles, muchos de los cuales pueden estar sometidos a las interacciones entre el genotipo y el medio ambiente (G x M), siendo en consecuencia especficos de un lugar (Hayword et al., 1994; Iglesias, 1994).

Los marcadores clsicos son de uso simple, ellos pueden permitir consideraciones ambiguas e interferencias entre el marcador y el fenotipo que ser evaluado, porque se distinguen solo a nivel de plantas en un rgano y estado de desarrollo (Florido, 1999); de ah que en la mayora de los casos, como parte de la variabilidad de un cultivo, se busquen estudios ms directos del genoma a travs del anlisis citogentico e isoenzimtico (Tanskley y Orton, 1983). En Cuba, las ventajas de los estudios morfoagronmicos se han utilizado para la caracterizacin y diferenciacin de clones de cultivos como tomate (Lycopersicon esculentum Mill) (Florido, 1999), pltano (Musa spp)(Romn, 1996; Acosta, 1999; Alonso 2000; Cazaas, 2001) y yuca (Manihot esculenta Crantz) ( Fernndez, 1999), entre otros. I.2 Estudios citogenticos. La citogentica es la ciencia que estudia el cromosoma bajo cualquier nivel o dimensin (Lacadena, 1996). Su objetivo fundamental es analizar y explicar cmo la estructura y el comportamiento de los cromosomas garantizan la triple funcin de conservar la informacin gentica entre las clulas de un organismo pluricelular, transmitirla de padres a hijos y liberarla de forma ordenada para controlar las funciones celulares y el desarrollo del organismo, estudiando asimismo los controles y variaciones, sus consecuencias genticas e implicaciones evolutivas as como las aplicaciones en la mejora gentica de las plantas y animales o en la medicina. En las plantas, se emplean diversas metodologas para el estudio de los cromosomas, que van desde los mtodos clsicos hasta el empleo de tcnicas moleculares. La estimacin de ploida se realiza generalmente mediante el conteo de cromosomas, en cortes microscpicos preparados a partir de las puntas de las races en crecimiento activo (Osuji et al., 1996). Este mtodo junto con el aplastado son los que generalmente se utilizan para contar los cromosomas en Musa (Sandoval et al., 1997). I.3 Caracterizacin isoenzimtica La definicin de isozimas fue propuesto por Marker y Moller en 1959, para designar a cada una de las mltiples formas enzimticas que catalizan la misma reaccin, con similar o idntica especialidad de sustrato y que estn presentes dentro del mismo organismo. Posteriormente, fue introducido el trmino de isoenzimas, el cual algunos investigadores plantean que debe ser restringido a formas moleculares mltiples de enzimas, que se derivan de un mismo tejido u rgano, que tienen orgenes genticos similares y que poseen actividades catalticas muy semejantes, no exactamente superpuestas. Actualmente se utilizan indistintamente ambos trminos (Markert y Moller,1959; Brewer y Singh, 1971). Dado que las enzimas constituyen una expresin de la diferenciacin de las clulas, el anlisis de las propiedades y patrones cambiantes durante el desarrollo, puede llegar al entendimiento de los mecanismos metbolicos y genticos bsicos, sobre el cual descansa la diferenciacin celular (Iglesias, 1994).

Las enzimas generalmente estn constituidas por una o varias cadenas polipeptdicas y su expresin est determinada casi siempre por genes mendelianos simples con alelos codominantes, que en condiciones de laboratorio bien controladas, presentan alta heredabilidad (Wendel y Weeden, 1989). Los genetistas vegetales han empleado las isoenzimas con diferentes objetivos: anlisis de la diversidad gentica, estudios sistemticos y evolutivos, caracterizacin de colecciones ncleo, identificacin de genotipos y prediccin de heterosis, as como el marcaje e introgresin de genes de inters agronmico (Gonzlez, 1989; Romn, 1996; Florido, 1999). El potencial de las isoenzimas para diferenciar y desarrollar nuevas funciones, depende en gran medida de la manera por la cual ellas fueron generadas (Weenden, 1983) y la multiplicidad isoenzimtica puede ser el resultado de diferencias en las secuencias de aminocidos o producto de modificaciones posttraduccionales. Las isoenzimas pueden ser codificadas por diferentes alelos del mismo locus (aloenzimas o aleloenzimas) (Prakash et al., 1969) o por diferentes loci (isoenzimas no allicas ), as como pueden haber ocurrido cambios conformacionales o de dobleces en la estructura terciaria o cuaternaria por mecanismos epigenticos (isoenzimas conformacionales) (Scandalios,1974). El hecho de que el locus o los loci que codifican para las isoenzimas pueden ser multiallicos, suministra grandes fuentes de variacin, provocando una multiplicidad de formas isoenzimticas (Iglesias, 1986). Las protenas e isoenzimas existen en una variedad de formas moleculares mltiples y ellas pueden ser separadas por su movimiento relativo, a travs de un medio polarizado. Se colocan extractos de tejidos en un medio y aplicando un campo elctrico, las molculas de protenas migrarn a una velocidad determinada basndose en su carga neta, su peso molecular y el pH del medio. Las protenas y las enzimas separadas de esta forma en bandas, pueden ser visualizadas mediante tcnicas histoqumicas apropiadas (Iglesias, 1986).

Mtodos de deteccin de organismos genticamente modificados 1.-) Bioensayos para la evaluacin directa del fenotipo del Organismo Vivo Modificado: Mtodo ms sencillo y prctico, consiste en la evaluacin del propio fenotipo modificado de la planta, evidenciando la diferencia fisiolgica entre los individuos genticamente modificados y los no. Por ejemplo, si las plantas son resistentes a un herbicida particular, es muy sencillo hacer ensayos tanto en el laboratorio como en el campo. Las semillas o granos se colocan a germinar en presencia y ausencia del herbicida y luego se cuenta directamente el nmero de plntulas resistentes versus las no resistentes ( comparndolas contra el total crecidas sin herbicida). En el campo, se pueden revisar los lotes sembrados haciendo aplicaciones del herbicida en pequeas parcelas que representen de manera significativa el lote sembrado, se cuenta el nmero de plantas sobrevivientes y se establece el porcentaje en relacin al total de plantas en las parcelas, y de all se extrapola el porcentaje de plantas genticamente modificadas sembradas en todo el lote. Este mtodo puede ser utilizado para determinar la presencia de soya, maz, algodn y ajonjol tolerantes a herbicidas como el glifosato. Esta metodologa resulta precisa, barata y muy prctica, requiere de al menos una semana para poder observar los resultados. A futuro pudieran realizarse otros bioensayos para determinar resistencia e insectos u otras caractersticas, en la actualidad son muy costosos, complicados de realizar y de muy larga duracin 2.-) Mtodos basados en protenas: La deteccin especfica de las protenas producto de la introduccin de nuevos genes en individuos transgnicos constituye una alternativa vlida cuando se utilizan anticuerpos desarrollados especficamente contra esas protenas. La modificacin gentica no siempre est dirigida a la produccin de una nueva protena o muchas veces su expresin es tan baja que no permite detectarla. Su expresin pudiera estar limitada a algunos tejidos de la planta o durante ciertas fases de su desarrollo. Los mtodos de deteccin basados en inmunoensayos, cimentado en el reconocimiento antgeno-anticuerpo, hacen uso de anticuerpos muy especficos acoplados a sistemas enzimticos que amplifican la seal positiva para incrementar la sensibilidad de la prueba. Este tipo de anlisis tiene utilidad prctica cuando se aplica sobre tejidos en los cuales se expresa la protena genticamente modificada. Es un mtodo sencillo de realizar, que no necesita alta capacitacin del personal ni materiales ni equipos sofisticados. Entre los inconvenientes que presenta, no permite la identificacin entre cultivos distintos que presentan la misma protena genticamente modficada ( ya sea en cuanto a especie o con relacin a la construccin introducida).

2.1.-) Inmunoblotting Western blot: Es muy especfico. Permite detectar de manera cualitativa y semicuantitativa la presencia de una protena en particular, luego de separar electroforticamente las protenas de la muestra ( Lipton et al.,2000). 2.1.-) Inmunoblotting Western blot: Es una tcnica inmunoenzimtica que se utiliza en la deteccin de protenas. Se basa en la separacin de las protenas de una muestra en funcin del tamao mediante una electroforesis en condiciones desnaturalizantes y una deteccin posterior con anticuerpos especficos contra la protena que se desea detectar. Permite determinar el contenido relativo de protenas presente en diferentes muestras. Fases: Separacin mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS de las protenas. El SDS de las protenas. El SDS es un agente desnaturalizante de protenas que provoca la ruptura de los enlaces que mantienen la estructura de las mismas, de modo que adquieren todas la misma forma.

Adems les proporciona carga neta negativa, de modo que la separacin se realiza en funcin del tamao. Transferencia de las protenas a una membrana de nitrocelulosa. Incubacin de la membrana con protenas inespecficas para bloquear los sitios de unin de anticuerpos a la membrana. Adicin de un anticuerpo primario contra las protenas que se quieren detectar. Adicin de un anticuerpo secundario conjugado con una enzima, que reconoce al anticuerpo primario.

Revelado. 2.2.-) Southern blot: Es una tcnica de hibridacin que se utiliza para la deteccin de secuencias de ADN concretas dentro de una mezcla compleja. Consiste en la separacin de fragmentos de ADN en funcin del tamao mediante una electroforesis en geles de agarosa, su transferencia a membranas de nitrocelulosa o nylon y posterior incubacin con sondas de ADN complementarias a las regiones que se desea detectar. Estas sondas en caso de que existan fragmentos complementarios hibridarn con ellos pudindose detectar marcaje. Etapas: Fragmentacin del ADN problema mediante endonucleasas de restriccin. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes con urea o formaldehdo para obtener ADN de cadena sencilla.

Etapas: Transferencia a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Una vez las bandas se han transferido a las membranas es necesario fijarlas de manera irreversible mediante tratamiento a 80-85C en el caso de las membranas de nitrocelulosa o con luz ultravioleta en el caso de las membranas de nylon. Prehibridacin de la membrana con ADN heterlogo para bloquear los sitios de unin que han quedado libres y evitar uniones inespecficas de las sondas. Hibridacin con la sonda y revelado del filtro para detectar con qu bandas ha hibridado la sonda.

2.3.-) Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR): Es un mtodo de anlisis rpido y sencillo que permite la deteccin y amplificacin de fragmentos especficos de ADN. La polimerasa es una enzima cuya actividad es la sntesis de una cadena de ADN complementaria a una de cadena sencilla. 2.3.-) Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR): Para ello necesita de pequeas secuencias de ADN denominadas cebadores que deben ser complementarias de los extremos de la secuencia que se desea ampliar. La PCR consta de tres pasos que se repiten un nmero determinado de ciclos: 1.-) Separacin del ADN para que se encuentre en forma de cadena sencilla. 2.-) Unin de los cebadores al ADN de cadena sencilla. 3.-) Sntesis de la cadena complementaria de ADN a partir de los cebadores. La repeticin de estos ciclos hace que la cantidad del fragmento de ADN que se est amplificando aumente de manera exponencial, de modo aunque se parta de una cantidad muy pequea al final de un nmero determinado de ciclos se obtendr una cantidad muy importante. 2.3.-) Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR): El diseo de los cebadores es muy importante y su especificidad depender del tipo de amplificacin que se desee hacer, pudiendo utilizarse cebadores especficos, semiespecficos o arbitrarios. 2.3.1.-) Anlisis de polimorfismos de los fragmentos de restriccin (RFLP): Es un mtodo rpido de identificacin basado en la aplicacin de enzimas de restriccin, que son enzimas que cortan la molcula de ADN en determinados puntos denominados dianas. Dependiendo de la secuencia de nucletidos de una molcula de ADN aparecern distintas dianas y al tratarla con enzima de restriccin se originarn fragmentos de restriccin de distintas longitud. Estos fragmentos pueden analizarse mediante tcnicas de hibridacin marcadas con sondas en membranas, permitiendo la deteccin de mezclas de especies.

2.3.2.-) Anlisis de polimorfismos de los fragmentos de restriccin de satlites (SFLP): Es una variacin de RFLP en la que se analizan los polimorfismos de los fragmentos de restriccin de satlites. El ADN satlite se encuentra en los centrmeros de los cromosomas y se caracteriza por contener un nmero repetido de secuencias de longitud variable. Se utilizan para la identificacin de especies hbridas o con una gran homologa. 2.3.3.-) Anlisis de conformacin de polimorfismos de cadena sencilla (PCR-SSCP): Esta tcnica permite detectar diferencias puntuales en la secuencia de bases de una hebra de ADN. La tcnica consiste en la amplificacin mediante PCR de secuencia concreta de una mezcla de ADN. Los productos de esta amplificacin se desnaturalizan y se permite que vuelvan a renaturalizar rpidamente, favoreciendo la formacin de apareamientos intracatenarios, que son dependientes de la secuencia de bases de la hebra de ADN y provocarn que sta adquiera una conformacin especfica. Mediante una electroforesis en condiciones no desnaturalizantes un gel de poliacrilamida, se realiza la separacin de estas molculas en funcin de la forma, ya que todas tienen el mismo tamao. De este modo se obtiene un patrn electrofortico que puede compararse con patrones conocidos. 2.3.4.-) Anlisis de perfiles de ADN por amplificacin aleatoria (RAPD): Se utilizan cebadores de tamao pequeo y secuencia arbitraria con una especificidad de unin menor, lo que permite una amplificacin de secuencias al azar. El resultado de la amplificacin mediante estos cebadores es un conjunto de fragmentos de distinta longitud en funcin de en qu lugares se encuentren las secuencias complementarias de los cebadores empleados. Estos fragmentos pueden ser empleados para construir mapas genticos de gran variedad de especies. Es una tcnica muy empleada cuando se dispone de alta variedad de muestras con el fin de diferenciar especies sin informacin previa de su secuencia. La ventaja que presenta es que los cebadores son universales y no es necesario disponer de grandes cantidades de ADN, no es necesario utilizar sondas ni hibridaciones, y son mtodos relativamente sencillos y rpidos. Cmo inconvenientes presentan problemas de reproductibilidad. 2.3.5.-) Amplificacin multiplexada: Permite la amplificacin de mas de una secuencia de una muestra de ADN. La deteccin e identificacin de varias secuencias disminuye los tiempos de manipulacin. 2.4.-) Anlisis cuantitativo de ADN mediante PCR: Permite cuantificar la cantidad total de una o varias secuencias de ADN presentes en una muestra. Es importante la utilizacin de este tipo de mtodos, pro ejemplo para el etiquetado de los alimentos. 2.4.1.-) PCR anidada:

Se trata de una modificacin de la PCR en la que en lugar de dos cebadores se utilizan cuatro, dos externos y dos internos. La amplificacin se realiza en dos tandas. En la primera se utilizan los cebadores externos y se amplifica una secuencia de ADN, a partir de la cual se realiza una segunda ronda de amplificacin con los cebadores interiores. Este mtodo confiere una mayor especificidad y una mayor sensibilidad, por lo que es til en los casos en los que se presupone que existe un bajo porcentaje de OMGs. Adems no requiere el aislamiento previo del ADN. 2.4.2.-) PCR competitiva: Se utiliza un ADN competidor que tiene la misma secuencia complementaria al cebador, de modo que se amplifica el ADN diana de la muestra y el ADN competidor. A partir de las cantidades obtenidas de ambos productos amplificados se estima estadsticamente la proporcin real de ADN diana y de ADN competidor. 2.4.3.-) PCR en tiempo real: Este sistema se basa en la medicin de la fluorescencia emitida por una sonda especfica del ADN diana marcado con fluorocromo no reactivo, que se aade a la reaccin de PCR convencional y cuya emisin de fluorescencia depende directamente de la sntesis del nuevo ADN. La fluorescencia emitida es recogida a travs de una fibra ptica y leda por un lser. Mediante el registro del contenido de la emisin de fluorescencia en cada ciclo se puede monitorear de manera continua el incremento de los productos amplificados durante la reaccin de PCR. 2.4.4.-) Dilucin lmite de PCR: Consiste en la dilucin de la muestra de ADN a concentraciones conocidas hasta llegar al punto lmite de la dilucin, que se corresponde con el umbral de amplificacin del ADN, permitiendo establecer una correlacin con la cantidad de ADN presente en la muestra. 2.5.-) Secuenciacin: Se utiliza habitualmente como tcnica de comprobacin o confirmacin positiva de la presencia de un ADN determinado, tras su deteccin por PCR. Por tanto el material a detectar suele ser ADN amplificado producto de PCR. Se usa regularmente en estudios de autenticacin gentica de alimentos, ya sea para autenticacin de especies deteccin de componentes de origen vegetal o animal no deseados. Los diferentes tipos de secuenciacin aplicados se basan en la tcnica desarrollada por Sanger en 1974, basado en la utilizacin de anlogos de base (dideoxy) marcados que provocan la finalizacin de la cadena. La principal diferencia entre el mtodo enzimtico de terminacin de cadena y el mtodo automtico de secuenciacin radica en primer lugar en el tipo de marcaje. En el mtodo automtico en vez de radioactividad se utiliza inflorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con

fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin. La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los fragmentos de ADN. La deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamao que ya han sido detectados se dejan escapar del gel. Este sistema permite aumentar el nmero de nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis, y por consiguiente, en cada secuenciacin. La secuenciacin de cadena simple consiste en la secuenciacin de un fragmento de ADN, mediante una sola reaccin. La secuenciacin de cadena simple proporciona una excelente calidad de lectura, que en la mayora de los casos alcanza una fiabilidad superior al 98%. El tamao medio de las lecturas que se obtiene oscila entre las 650-700 pares de bases, y se realiza generalmente a partir de cebadores especficos utilizados durante la PCR. La secuenciacin analtica consiste en la secuenciacin completa de una de las cadenas del ADN de la muestra. Se recomienda esta modalidad de secuenciacin cuando se desea obtener la secuencia completa de un producto de PCR o de un ADN clonado cuando el tamao del amplificado o del inserto sea superior a 1 kilobase. Existen diversas tcnicas emergentes de secuenciacin de ADN con diversas aplicaciones: secuenciacin por hibridacin (SBH), visualizacin directa por microscopa de fuerza atmica (AFM), secuenciacin de molcula sencilla y secuenciacin de nucletido simple mediante suspensin en vaco. Dentro de ellas destacamos el FINS (Forensically Informative Nucleotide Sequencing). Es una tcnica de secuenciacin de ADN de muestras biolgicas mediante la amplificacin con marcadores fluorescentes de diferente color que permiten identificar la secuencia de nucletidos. Se trata de un mtodo indirecto por el que las secuencias obtenidas se comparan con secuencias pertenecientes a otras especies, lo que permite el anlisis filogentico de las mismas. Se utiliza para la identificacin de especies pesqueras de inters comercial, normalmente como mtodo de confirmacin tras la utilizacin de otras tcnicas cualitativas de PCR. 2.6.-) Biosensores: Son dispositivos de anlisis compactos, que incorporan un elemento de reconocimiento biolgico o biomimtico asociado a un sistema de transduccin que permite amplificar, almacenar y registrar la seal producida por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito. Como consecuencia de la interaccin especfica entre el elemento de reconocimiento y el analito se produce una variacin en las propiedades fisico-qumicas que pueden ser variaciones de pH, transferencia de electrones, generacin de calor, cambios de masa, cambios en las propiedades pticas, etc. Estas variaciones dependen del tipo de elemento de reconocimiento que incorpora el biosensor.

2.7.-) Otras tcnicas: Tcnicas no biotecnolgicas que sirven de complemento a las tcnicas biotecnolgicas. Por ejemplo, la identificacin de protenas mediante huella peptdica a travs de la espectrometra de masas MALDI-TOF o mediante espectrometra de masas en tndem MS/MS y sus aplicaciones a la secuenciacin de pptidos han permitido la identificacin y caracterizacin de determinadas protenas de carcter txico y/o alergnico. La espectroscopia infrarroja cercana (NIR) y la no dispersiva (NDIR) permiten el anlisis de biomolculas de forma no destructiva y en un tiempo muy corto, generalmente inferior al minuto. Se utiliza para la identificacin de molculas orgnicas y organometlicas, as como para la deteccin de pesticidas y biotoxinas. La alta selectividad del mtodo hace posible la estimacin de un analito en una matriz compleja. Este mtodo implica el anlisis de los movimientos de torsin, rotatorios y de vibracin de los tomos en una molcula, de forma que mediante comparacin con patrones establecidos permite la deteccin de determinados compuestos. Se ha utilizado recientemente con xito en la deteccin de transgnicos en los que los contenidos de determinadas biomolculas se ven alterados por efecto del ADN exgeno. Por ltimo las SNIF-NMR (Site-Specific Natural Isotopic Fractionation) se basa igualmente en el anlisis de la estructura molecular a escala atmica mediante resonancia magntica nuclear. Cada biomolcula o sustancia en general presenta un patrn atmico especfico identificable a partir de su comparacin con los patrones almacenados en bases de datos. 2.2.-) ELISA (Enzime Linked Inmunoassay):: El Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a una Enzima ( siglas en ingls corresponden a ELISA) es muy popular por la sencillez con la cual se puede evaluar un gran nmero de muestras de manera simultnea. Si bien los esquemas experimentales para el ELISA son mltiples y variados, dos son los formatos ampliamente utilizados: las placas de ELISA y las tiras reactivas o inmunostrips. Es un mtodo de deteccin basado en la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo. Permite la deteccin de distintas sustancias antignicas mediante la unin de anticuerpos especficos que directa o indirectamente producen una reaccin cuyo producto es visible y puede ser medido. Esta reaccin se produce debido a que el anticuerpo lleva unida (conjugada) una enzima, que suele ser peroxidasa de rbano o fosfatasa alcalina, que en presencia del sustrato adecuado genera un producto coloreado. Los anticuerpos son protenas sintetizadas por el sistema inmunolgico como respuesta a la presencia de una sustancia extraa o antgeno, que se unen de manera selectiva a esta sustancia. Pueden ser monoclonales, que son aquellos que reconocen una regin concreta de un antgeno, o policlonales que son aquellas que reconocen distintas regiones del antgeno.

De manera general el mtodo que se utiliza es la inmovilizacin del antgeno sobre un sustrato generalmente plstico. Lo ms frecuente es utilizar placas multipocillo, que contienen distinto nmero de pocillos y pueden leerse de manera automtica con lectores de placas, aunque pueden utilizarse otros soportes como tubos, tiras de nitrocelulosa o paletas. Etapas: Inmovilizacin del antgeno. Se deposita la muestra en un pocillo y se incuba de modo que los antgenos tapicen la superficie del mismo. Tapizado con una protena no especfica para bloquear los huecos que queden sin tapizar por el antgeno con el fin de evitar la unin inespecfica de los anticuerpos.

Etapas: Adicin de los anticuerpos. Estos anticuerpos se unirn a aquellos antgenos especficos que se encuentren unidos en la superficie del pocillo. Tras varios lavados para eliminar aquellos anticuerpos que no se hayan unido, se procede a aadir el sustrato especfico de la enzima conjugada al anticuerpo. Por la accin de esta enzima sobre el sustrato se produce la aparicin de un producto coloreado cuya concentracin puede medirse y se dispone de una recta patrn para relacionarse con una concentracin determinada.