TSH NEONATAL RESUMEN Y EXPLICACIN DE LA PRUEBA La determinacin de hipotiroidismo dentro de los primeros das del nacimiento ha sido reconocido

con una prueba particularmente importante en el diagnostico en neonatales por la Asociacin Americana Tiroidea. La necesidad para su deteccin temprana y su tratamiento ha resultado en el establecimiento de centros de monitoreo por los departamentos de salud federales y estatales. Un programa de monitoreo temprano de neonatales para el hipotiroidismo congnito fue comenzado en Qubec, Canad a principio de los setentas. Ellos usaron manchas de sangre seca sobre filtros de papel como dispositivo de muestra. Muy pronto el programa fue seguido por otras instituciones mayores de salud pblica en Canad y los Estados Unidos. Por 1978, al menos un milln de infantes han sido monitoreados y un rango de incidencia de hipotiroidismo congnito fue establecido para aproximadamente 1 en 7000 nacimientos. El hipotiroidismo congnito es probablemente la causa previsible ms comn de retraso mental. El diagnstico y el tratamiento de hipotiroidismo congnito dentro de los primeros 12 meses despus del nacimiento parece ser necesario para prevenir retraso mental severo. La medicin de tirotropina (TSH) en la concentracin de suero, una glicoprotena con un peso molecular de 28,000 daltons y secretada de la pituitaria anterior, es generalmente observada como el mas sensible indicador disponible para diagnostico primario y secundario (pituitaria) hipotiroidismo (1,2). El Incremento de concentraciones de TSH en el suero, el cual es primariamente responsable de las sntesis y liberacin de hormonas tiroideas, es una temprana y sensible indicadora del decremento de la reservas tiroideas y una conjuncin con el decremento de concentraciones de tiroxina (T4) es diagnostico de hipotiroidismo primario. El crecimiento esperado de concentraciones de TSH demuestra el sistema de retroalimentacin negativo clsico entre la pituitaria y la glndula tiroidea. Esto es, cuando falla la glndula tiroidea primaria reduce la secrecin de las hormonas tiroideas, la cuales alternadamente estimula la liberacin de TSH de la pituitaria. En este mtodo, el calibrador de TSH en sangre entera deshidratada, el espcimen paciente o el control se agregan primero a un pozo cubierto de streptavidin. La solucin de la Elusin contiene anticuerpos de monoclonal biotinilado que son aadidos a los pozos y mezclados. La reaccin entre el x-TSH biotinilado y el TSH en puntos de sangre deshidratada forman un complejo que se ata con el streptavidin cubierto en el pozo. Despus de la terminacin del perodo requerido de incubacin/elusin la enzima conjugada es aadida al complejo Ag-Ab depositado sobre la superficie de plstico. La enzima etiqueta de anticuerpo x-TSH se ata al TSH produciendo un complejo de sndwich con dos anticuerpos atados al antgeno durante la segunda incubacin. El microplato es lavado para remover la enzima sin reaccin. Finalmente, la actividad de la enzima presente sobre la superficie del pozo es cuantificada por la reaccin con un sustrato adecuado para producir color.

PRINCIPIO El procedimiento es un enzimo-inmnoensayo. La TSH es eludida por el spot de sangre y, al mismo tiempo se ata al Anticuerpo Anti-TSH presente en el pocillo. El antgeno de la muestra se ata se a al primer anticuerpo unido a las paredes del pocillo, sea al anticuerpo biotinilado del reactivo (tcnica sndwich). Se efecta un lavado de lo pocillos para quitar cualquier material no atado. Se aade la estreptavidina peroxidasa (reactivo amplificador) que forma enlaces mltiples con los anticuerpos biotinilados. Despus del lavado, la solucin de substrato reacciona con cualquiera peroxidasa atada produciendo color en proporcin directa con la cantidad de antgeno presente en la muestra. La cantidad de antgeno puede ser calculada de la curva de calibrado. REACTIVOS Tamao del kit-480 test y 2400 test. El kit y todos sus componentes deben almacenarse a 28C hasta la fecha de caducidad indicada. Pocillos recubiertos 1 x 96 pozos Ref # TNA96 5 x 96 pozos Ref # TNA5 (25 x 96 pozos Ref # TNA25) Placa que contiene pocillos recubiertos anti-TSH. Lista para usar. Reactivo anticuerpo 1 ampolla Ref # TNB480 (1 ampolla Ref # TNB25) 50 (250) ml de anticuerpo biotinilado anti-TSH en una solucin tampn que contiene albumina de sueron bovino, suero animal son inmunes y un colorante azul. Contiene azida de sodio, 0.2% p/v y thiomersal, 0.01% p/v listo para usar. Reactivo amplificador 1 ampolla Ref # TNP480 (1 ampolla Ref # TNP25) 50 (250) ml de estreptavidina peroxidasa (estreptavidina de S. avidinii) en una solucin tampn que contiene albumina de suero bovino y un colorante violeta. Contiene bronidox L, 0.2 % v/v thiomersal, 0,02% p/v. listo para usar. Concentrado de lavado 1 ampolla Ref # EWC 5 (2 ampollas Ref # EWC 25) 250 (500) ml de solucin de lavado 15 x concentrada. Contiene thiomersal, 0.09% p/v. diluir antes de utilizar. Tampn de elucin 1 ampolla Ref # EEB 5 (1 ampolla Ref # EEB 25) 50 (250) ml de solucin. Tampn que contiene albumina de suero bovino. Contiene azida de sodio, 0.1 % p/v. lista para usar.

Solucin sustrato TMB H 1 ampolla Ref # ETMB 5 (1 ampolla Ref # ETMB 25) 50 (250) ml 3.3, 5.5-tetramethylbenzidime y perxido de hidrogeno en solucin estabilizadora. Lista para usar. Solucin de para 1 ampolla Ref # ESS 5 (1 ampolla Ref # ESS 25) 30 (124) ml 1 M H2SO4. Listo para usar. Calibradores y controles de los spot de sangre. 1set Ref # ETNS6 (4set Ref # ETNS7) Spot secos de TSH humano con 6 calibradores (A-F) y 2controles (1-2) en papel de filtro listos para usar. RECOGIDA Y MANEJO DE LOS ESPECIMENES El kit ha sido creado para ser utilizado con muestras de sangre neonatal recogidas mediante toma capilar por puncin del taln y secada sobre papel de filtro segn las instrucciones NCCLS LA4A, donde aplicables. Sin embargo la sangre del cordn se puede utilizar tras al validacin del proceso. El papel de filtro debe ser Schleicher and Schuell Grade 903 de manera que las muestras sean equivalentes a los calibradores proporcionados. La sangre de un prick test neonatal del taln se recoge 3-5 das despus del nacimiento. Con una aplicacin del papel de filtro sobre una gota de sangre fluyente del taln pinchado del nio, se obtiene una mancha de sangre que cubre un rea circular testigo en el papel de filtro. El rea testigo en el papel de filtro debe ser cubierta enteramente y completamente impregnada de sangre. Despus de recoger las muestras para el test hay que secar los papeles de filtro horizontalmente (2 horas o ms). Los especmenes secos pueden almacenarse a 2-8C. Se debe analizar solo los spot de sangre preparada en el modo descrito arriba. Los papeles de filtro inutilizables se deben secar a temperatura ambiente (20-25C). MATERIALES Y EQUIPOS NO PROPORCIONABLES Agua destilada o desionizada Cortadora mecnica de disco (3mm) Pinzas Pipetas repetidoras Tubo graduado 11 Tejido absorbente (sin hilachas) Timer Agitador para microplacas Lavador de microplacas Sistema de lectura de microplacas

Preparacin de los reactivos Solucin de lavado Diluir 1:14 el concentrado de lavado con agua desionizada. La solucin de lavado puede conservarse a temperatura ambiente (20-25C) por 12 semanas. Calibradores y controles Las concentraciones exactas determinadas para cada lote estn declaradas en una etiqueta separada por cada set de spot de sangre. Para evitar la condensacin, no abrir los spot test de sangre antes del reequilibrio de la temperatura. Volver a cerrar hermticamente en la bolsa del plstico las tiras impregnadas inutilizadas y almacenarlas a 2-8C.

PROTOCOLO 1. Montar en la placa el nmero de pocillos necesitados en base al nmero de test a efectuar. Recuperar en su bolsa los pocillos inutilizados y volver a graduarlos a 2-8C. 2. Por duplicado, poner discos de 3 mm de (los calibradores, los controles y especmenes) en los pocillos apropiados. Al cortar los discos de la muestra mantenerse en el centro de la mancha evitando los bordes. 3. Pipetear 10 Ul de tampn de elucin (transparente) en todos los pozos. 4. Cubrir los pocillos con la tapa e incubar durante 60 minutos en un agitador de placa a temperatura ambiente (20-25C). 5. Pipetear 100Ul reactivo anticuerpo anti-TSH neonatal (azul) en todos los pocillos. 6. Cubrir los pocillos con la tapa e incubar durante 60 minutos en un agitador de placa a temperatura ambiente (20-25C). 7. Despus de incubacin quitar los discos. 8. Lavar los pocillos. Aspirar el lquido y enjuagar cada pozo 4 veces con 250Ul de solucin de lavado. Despus del lavado final, volcar los pocillos sobre el tejido absorbente y sacudir finalmente para quitar cualquier resto de solucin de lavado. Asegurarse que no queden burbujas de aire en los pocillos. 9. Pipetear 100Ul de reactivo amplificador TSH neonatal (violeta) en cada pozo. 10. Cubrir los pocillos con la tapa e incubar durante 10 minutos en un agitador de placa a temperatura ambiente (20-25C). 11. Despus de la incubacin repetir la etapa de lavado. 12. Pipetear 100Ul de solucin de substrato en todos los pozos. el clculo del tiempo de la etapa de incubacin se mide a partir de la adicin de la solucin de substrato del primer pozo. 13. Cubrir los pocillos con la tapa e incubar durante 10 minutos sin agitacin a temperatura ambiente (20-25C). 14. Pipetear 50Ul de solucin de para en todos los pozos, en el mismo tiempo y secuencia determinados para la adicin de la solucin de substrato.

15. Realizar una lectura a punto final (end-point) a 450 nm y procesar los datos como descrito en el manual del usuario del lector de microplacas. Este paso de lectura debe realizarse dentro de los siguientes 5 minutos desde la parada de la reaccin.