AGRADECIMIENTOS

En primer lugar mi ms profundo agradecimiento a esa persona que me fascin hace ahora 5 aos justos, que me hizo sentir el deseo de trabajar bajo su supervisin y que nunca en este largo periodo me ha defraudado. Esa persona es el director de este trabajo, el Dr. Carlos Herrero Latorre. Mi agradecimiento tambin a la directora de esta tesis, la Dra. Julia Barciela Garca, por su incansable apoyo y por su infinita paciencia, sin cuya ayuda nunca sera posible la culminacin de este proyecto. Mi reconocimiento a la Dra. Rosa Pea Crecente por ser esa ayuda incondicional a la que tantas veces he acudido y tanta atencin me ha prestado a lo largo de estos cinco aos. Tambin tengo que agradecer a todos esos compaeros de laboratorio que hicieran que mis das de investigacin fueran mucho ms amenos y a todas las alumnas que han realizado el proyecto fin de carrera bajo nuestra supervisin, especialmente a Sara Quintana y a Susana Fernndez. Asimismo quisiera hacer una especial mencin a mis compaeros de despacho, pero de un modo especial a Chus por ir marcando la senda que debera seguir, por su apoyo y por todos sus sabios consejos, sobre todo en los momentos ms bajos. Por supuesto mi agradecimiento a todos esos amigos que, fuera del mbito de la investigacin, hacen que la vida sea un poco menos seria, por lo menos los fines de semana. Agradecimiento especial a mis tres amigos incondicionales, confesores y espejos en los que reflejarme: Roberto, Ral y Beni. Un agradecimiento especial a mis protectores Julio y Lucita por toda la ayuda prestada a lo largo de tantos aos y sobre todo por la confianza que siempre han puesto en mi persona. Muchas gracias.

Por ltimo agradecer a mi familia todo el cario, todo el apoyo mostrado a lo largo de los aos y todo el esfuerzo realizado. A mi hijo, a Mara, a mis padres, a mi hermana, a Paco y Pili, a todos vosotros, muchas gracias.

 meu fillo Xan mia muller Mara s meus pais

Numquam aliud natura, aliud sapientia dicit.

(Decimo Junio Juvenal, 55-138 d.c.; Satiras 14,321)

NDICE

I.1.- LA MIEL COMO ALIMENTO.............................................................. 1 I.2.- LA MIEL COMO BIOINDICADOR ..................................................... 4 I.2.1.-Bioindicadores .................................................................................. 4 I.2.1.1.- Tipos de bioindicadores ............................................................ 5 I.2.1.1.1.- Indicadores acumulativos................................................... 5 I.2.1.1.2.- Indicadores de respuesta .................................................... 6 I.3.- ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS ACERCA DEL USO DE LA MIEL COMO BIOINDICADOR ............................. 7 I.4.- DETERMINACIN DE METALES EN MIEL................................... 11 I.5.- TCNICAS QUIMIOMTRICAS EMPLEADAS .............................. 17 I.5.1.- Diseo de experimentos ................................................................. 17 I.5.1.1.- Tipos de diseos...................................................................... 18 I.5.1.1.1.- Diseo factorial completo a dos niveles........................... 18 I.5.1.1.2.- Diseo factorial fraccionado ............................................ 19 I.5.1.2.- Cribado de factores ................................................................. 20 Diseo Plackett-Burman ............................................................... 20 I.5.1.3.- Superficies de respuesta .......................................................... 21 I.5.2.-Tcnicas de reconocimiento de pautas............................................ 23 I.5.2.1.- Tcnicas de visualizacin y reduccin de la dimensionalidad..................................................................... 24 1.5.2.1.1.- Anlisis de componentes principales (ACP) ....................... 24 1.5.2.1.2.- Anlisis de Clusters ......................................................... 24 I.5.2.2.- Tcnicas de clasificacin ........................................................ 25 1.5.2.2.1.- Anlisis Lineal Discriminante (ALD) ............................. 26 1.5.2.2.2.- K vecinos ms prximos (KNN) ..................................... 27 1.5.2.2.3.- SIMCA (Soft Independent Modelling of Class Analogy) ................................................................. 27 1.5.2.2.4.- Redes Neuronales (RN)................................................... 28 I.6.- BIBLIOGRAFA .................................................................................. 30

I I.1.- OBJETIVOS .......................................................................................35

PARTE I: MTODOS DE DETERMINACIN DE METALES EN MIELES

III.1.- INSTRUMENTACIN Y REACTIVOS...........................................37 III.1.1.- Intrumentos..................................................................................37 III.1.2.- Material........................................................................................37 III.1.3.- Reactivos .....................................................................................37 III.1.4-Limpieza ........................................................................................38 III.2.- MUESTRAS.......................................................................................39 III.2.1.- Procedencia de las muestras ........................................................39 III.2.2.- Preparacin de la muestra ............................................................39 III.2.2.1.- Miel diluida...........................................................................39 III.2.2.2.- Digestin en microondas ......................................................39 III.2.2.3.- Cenizas..................................................................................40 III.3.1.- DETERMINACIN DE CADMIO EN MIEL MEDIANTEETAAS ........................................................................41 III.3.1.1.- Introduccin..............................................................................41 III.3.1.2.- Optimizacin ............................................................................44 III.3.1.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cadmio mediante ETAAS usando paladio-magnesio como modificador de matriz ...........................................................................44 III.3.1.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cadmio en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz.......................................................48

III.3.1.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cadmio en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra.......................................................... 51 III.3.1.3.-Caractersticas analticas de los mtodos desarrollados ............................................................................ 56 III.3.1.3.1.- Rectas de calibrado y adicin ............................................ 56 III.3.1.3.2.- Recuperacin de los mtodos ............................................ 58 III.3.1.3.3.- Precisin de los mtodos ................................................... 59 III.3.1.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados..................................................................... 60 III.3.1.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos ...................... 61 III.3.1.5.- Conclusin................................................................................ 62 III.3.2.- DETERMINACIN DE PLOMO EN MIEL MEDIANTE ETAAS....................................................................... 63 III.3.2.1.- Introduccin.............................................................................. 63 III.3.2.2.- Optimizacin ............................................................................ 65 III.3.2.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de plomo en miel mediante ETAAS usando paladio-magnesio como modificador de matriz ............... 65 III.3.2.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de plomo en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfafato amnico como modificador de matriz ...................................................... 69 III.3.2.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de plomo en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra .......................................... 72 III.3.2.3.- Caractersticas analticas de los mtodos desarrollados ............................................................................ 76

III.3.2.3.1.- Rectas de calibrado y adicin ............................................76 III.3.2.3.2.- Recuperacin de los mtodos ............................................78 III.3.2.3.3.- Precisin de los mtodos ...................................................79 III.3.2.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados.....................................................................80 III.3.2.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos.......................81 III.3.2.5.- Conclusin ................................................................................82 III.3.3.- DETERMINACIN DE COBRE EN MIEL MEDIANTE ETAAS .......................................................................83 III.3.3.1.- Introduccin..............................................................................83 III.3.3.2.- Optimizacin ............................................................................85 III.3.3.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS en tubo de grafito con plataforma usando paladio como modificador de matriz.............................................85 III.3.3.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS en tubo de grafito sin plataforma empleando paladio como modificador de matriz.............................................88 III.3.3.2.3.- Comparacin de resultados obtenidos mediante tubos con plataforma y sin plataforma ...................................................................91 III.3.3.2.4.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz.......................................................92 III.3.3.2.5.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre mediante ETAAS con digestin previa...................95

III.3.3.3.- Caracteristicas analticas de los mtodos desarrollados ............................................................................ 98 III.3.3.3.1.- Rectas de calibrado y adicin ............................................ 98 III.3.3.3.2.- Recuperacin analtica ...................................................... 99 III.3.3.3.3.- Precisin de los mtodos ................................................. 100 III.3.3.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados................................................................... 101 III.3.3.4.- Comparacin de los mtodos.................................................. 101 III.3.3.5.- Conclusin.............................................................................. 102 III.3.4.- DETERMINACIN DE CROMO EN MIEL MEDIANTE ETAAS..................................................................... 103 III.3.4.1.- Introduccin............................................................................ 103 III.3.4.2.- Optimizacin .......................................................................... 105 III.3.4.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cromo en miel mediante ETAAS usando paladio como modificador de matriz ......................................................................... 105 Procedimiento ................................................................................. 109 III.3.4.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cromo en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz........................................... 109 Procedimiento ................................................................................. 112 III.3.4.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cromo en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra ................................. 113 Procedimiento ................................................................................. 115 III.3.4.3.- Caractersticas analticas de los mtodos

desarrollados...........................................................................116 III.3.4.3.1.- Rectas de calibrado y adicin. .........................................116 III.3.4.3.2.- Recuperacin de los mtodos. .........................................118 III.3.4.3.3.- Precisin de los mtodos. ................................................119 III.3.4.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados. ..................................................................120 III.3.4.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos.....................120 III.3.4.5.- Conclusin ..............................................................................121 III.3.5.- DETERMINACIN DE NIQUEL EN MIEL MEDIANTE ETAAS ..................................................................123 III.3.5.1.- Introduccin............................................................................123 III.3.5.2.- Optimizacin ..........................................................................125 III.3.5.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de nquel mediante ETAAS usando paladio-magnesio como modificador de matriz.....................................................125 Procedimiento .................................................................................128 III.3.5.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de Nquel en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz ...........................................129 Procedimiento .................................................................................131 III.3.5.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de nquel en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra ........................................132 Procedimiento .................................................................................134 III.3.5.3.- Caractersticas analticas de los mtodos desarrollados ........................................................................134

III.3.5.3.1.- Rectas de calibrado y adicin .......................................... 134 III.3.5.3.2.- Recuperacin analtica de los mtodos............................ 136 III.3.5.3.3.- Precisin de los mtodos ................................................. 137 III.3.5.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados................................................................... 138 III.3.5.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos .................... 138 III.3.5.5.- Conclusin.............................................................................. 139 III.3.6.- MTODO COMBINADO PARA EL ANLISIS DE NQUEL, CROMO Y COBRE EN MIEL MEDIANTE ETAAS .................................................................. 141 III.3.6.1.- Introduccin............................................................................ 141 III.3.6.2.- Optimizacin .......................................................................... 141 III.3.6.3.- Caractersticas analticas del mtodo desarrollado ............................................................................ 145 III.3.6.3.1.- Rectas de calibrado y adicin .......................................... 145 III.3.6.3.2.- Recuperacin analtica del mtodo.................................. 146 III.3.6.3.3.- Precisin del mtodo desarrollado................................... 146 III.3.6.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica del mtodo desarrollado. .............. 147 III.3.6.4.- Comparacin estadstica con los mtodos individuales ......... 148 III.3.6.5.- Conclusin.............................................................................. 148 III.4.- DETERMINACIN DE METALES MAYORITARIOS MEDIANTE ICP-AES ..................................................................... 149 III.4.1.- Introduccin............................................................................... 149 III.4.2.- Preparacin de la muestra.......................................................... 150 III.4.3.- Consideraciones preliminares.................................................... 150 III.4.4.- Caractersticas analticas ........................................................... 151 III.4.4.1.- Rectas de calibrado............................................................. 151

III.4.4.2.- Precisin y sensibilidad ......................................................151 III.5.- BIBLIOGRAFA ..........................................................................153

PARTE II: LA MIEL COMO BIOINDICADOR. UN ESTUDIO QUIMIOMTRICO

IV.1.- INTRODUCCIN............................................................................161 IV.2.- METODOLOGA ............................................................................162 IV.3.- DETERMINACIN DEL CONTENIDO METLICO EN MIELES DE LA COMUNIDAD GALLEGA ...........................163 IV.3.1.- Metales minoritarios..................................................................164 IV.3.1.1.- Cadmio ...............................................................................164 IV.3.1.2.- Plomo..................................................................................165 IV.3.1.3.- Cobre, cromo y nquel ........................................................166 IV.3.2.- Metales mayoritarios .................................................................168 IV.4.- ESTUDIO QUIMIOMTRICO .......................................................171 IV.4.1.- Reduccin de datos y visualizacin...........................................172 IV.4.1.1.- Anlisis de componentes principales..................................173 IV.4.1.2.-Anlisis de clusters ..............................................................174 IV.4.2 Tcnicas de reconocimiento de pautas.........................................176 IV.4.2.1.- Anlisis lineal discriminante (ALD)...................................177 IV.4.2.2.- K-vecinos ms prximos (KNN)........................................178 IV.4.2.3.- Soft independent modelling of class analogy (SIMCA)..............................................................178 IV.4.2.4.- Red neuronal artificial (RN). ..............................................179 IV.4.3.- Conclusin.................................................................................180 IV.5.- BIBLIOGRAFA..............................................................................182 V.1.- CONCLUSIONES .............................................................................185 GLOSARIO ................................................................................................187

ANEXO I: resultados de las muestras analizadas....................................... 189 ANEXO II: artculos publicados ................................................................ 195

I.- INTRODUCCIN

Introduccin

En los ltimos aos la contaminacin medioambiental se ha convertido en uno de los principales problemas de los pases industrializados y medir su alcance en determinadas zonas supone un reto para la comunidad cientfica, debido a las dificultades inherentes al muestreo. Una de las estrategias seguidas es la de evaluarla de forma indirecta mediante diversos indicadores que reflejen fielmente el alcance de la polucin en un rea concreta. Uno de estos posibles indicadores es la miel que, ha sido utilizada para monitorizar diversos pesticidas, radionucletidos y metales pesados. Pero, la cuantificacin de estos ltimos en esta matriz es una tarea difcil debido a las bajas concentraciones en las que se encuentran, lo que hace que sea necesario desarrollar mtodos con un bajo lmite de deteccin utilizando tcnicas muy sensibles. En este trabajo se llev a cabo un estudio sobre el posible uso de la miel como bioindicador, segn su contenido metlico, siendo necesario para ello desarrollar mtodos de determinacin mediante Espectrometra de Absorcin Atmica con Atomizacin Electrotrmica (ETAAS). Una vez aplicados estos mtodos a un gran nmero de muestras fue necesario emplear tcnicas estadsticas que permitieron procesar la informacin y alcanzar las conclusiones oportunas segn la hiptesis de partida.

I.1.- LA MIEL COMO ALIMENTO

Desde hace algunos aos se ha planteado el uso de la miel como bioindicador, pero como alimento los seres humanos la conocen y consumen, segn los antroplogos, desde hace unos 200.000 aos. Durante milenios fue la nica fuente de obtencin de edulcorantes. Para las primeras civilizaciones la miel era una especie de milagro: La miel cae del cielo, principalmente al salir las estrellas, escribe Aristteles. Y anteriormente, los egipcios pensaban que sta proceda de las lgrimas del dios Ra y que las abejas se limitaban a recogerla.

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Hipcrates en el siglo V a. C., la considera un medicamento que recomienda a sus pacientes para alcanzar longevidad. Tambin el Corn la describe como: remedio para todas las enfermedades. La miel es un alimento dulce que las abejas producen a partir de nctar de flores, mielatos exudados por insectos y partes vivas de las plantas. Este trabajo corresponde a las abejas pecoreadoras que parten de la colmena unas 12 veces al da para realizar vuelos de recogida que pueden llegar a los 10-12 Km de distancia y en los que visitarn entre 100 y 170 flores, recogiendo unos 50 mm3 de nctar1. En estas visitas pueden realizar la recoleccin en un rea de 7 Km2. A las sustancias recogidas las abejas libadoras aaden saliva, las fluidifican y las enriquecen en enzimas (diastasas, invertasas y glucoxidasas), transportndolas despus en su buche hasta la colmena. En el interior de sta otras obreras y los propios znganos la distribuyen en las celdillas donde la miel sufrir un proceso de concentracin por prdida de agua. Al final la concentracin de azcares alcanza un 70-80% y el agua se reduce a tan slo un 18%, aproximadamente. En este momento las celdillas, con la miel ya madura, son taponadas con una fina capa de cera llamada oprculo. No puede hablarse de una composicin nica para la miel, ya que depende de muchos factores (miel de nctar o de mielatos, flora de la que procede el nctar, origen geogrfico...), no obstante, en la Tabla 1, se muestra una composicin tipo aproximada2. Por su constitucin, rica en hidratos de carbono, la miel es un alimento altamente energtico, que adems aporta a la dieta minerales y vitaminas. Por esta razn, desde los tiempos ms remotos viene siendo recomendada para el tratamiento de ciertas dolencias, ya que, sus constituyentes le confieren innegables propiedades medicinales y dietticas (cardiotnicas, digestivas, diurticas, laxantes...). En farmacia se ha usado
Tabla 1.- Composicin de la miel2. Compuestos Agua Glucosa y fructosa Sacarosa Minerales Sustancias nitrogenadas Cenizas Otros % 17-23 65-80 2-8 0.50 0.75 0.25 1.5-3.0

Introduccin

como excipiente y coadyuvante en diversos preparados, debido a su efecto emoliente, emplendose en cosmticos para el cabello, pies, manos, ojos y labios. En la miel tambin se pueden encontrar sustancias indeseables, como restos de antibiticos, pesticidas o metales pesados. En la mayor parte de los casos, estas sustancias no llegan estar en concentraciones peligrosas para la salud humana, pero s son indicativas de ciertas prcticas apcolas errneas o de contaminacin ambiental en los parajes que rodean a la colmena. La miel, como cualquier otro alimento est sujeta a una normativa estricta, donde se detallan parmetros que van desde la definicin del producto hasta su composicin, pasando por los mtodos de anlisis, as como los valores mximos y mnimos de ciertos parmetros. Actualmente, en Espaa, la miel se rige por la Norma de calidad para la miel destinada al mercado interior3. Esta norma ha sido publicada en el Boletn Oficial del Estado del 5 de agosto de 2003 y viene a derogar la norma del 5 de agosto de 1983. Su uso como alimento, ha llevado a que la comercializacin de este producto presente una gran importancia econmica. En Espaa, ya los fenicios, antes que romanos y rabes comerciaban con este producto. Pero es en la Edad Media cuando la produccin comienza a alcanzar su verdadero auge, llegando los apicultores a organizarse en hermandades, con el fin de defender sus intereses. Hoy en da la apicultura se ha modernizado y desarrollado enormemente, alcanzando en la actualidad ms de dos millones y medio de colmenas en toda Espaa, de las que el 73.8% corresponden a 4500 apicultores profesionales, con lo que la media de colmenas por apicultor se sita en 400. La variedad de miel que ms se produce en nuestro pas es la "mil flores", que representa cerca del 60% de la produccin nacional, seguida de la "miel de brezo". En cuanto a la comercializacin, las ventas se concentran en la industria mayorista, con 19.931 toneladas que representaron un 54.6% del total, mientras que 7374 toneladas, es decir, ms del 20% nacional, se destinaron a la venta directa al consumidor, el resto de

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la produccin se comercializa a travs de cooperativas y minoristas.4 El consumo medio de miel en Espaa es 0.5 Kg por persona y ao, y en el ao 2004, se importaron 13.600 TM de diversas procedencias para cubrir este consumo, aunque tambin es destacable el nivel de exportacin de la miel nacional (10.100 TM) fundamentalmente al mercado europeo (90%)5. La propia Unin Europea constituye un amplio mercado importador (sobre todo de Mxico, Argentina y China) ya que, su produccin, en torno a 130.000 TM slo alcanza a cubrir el 50% del consumo en la U. E.6

I.2.- LA MIEL COMO BIOINDICADOR

Al plantear el estudio de la miel como bioindicador, quiz sea conveniente analizar previamente el concepto de bioindicador, su papel en la deteccin y control de la contaminacin medioambiental y los tipos de bioindicadores.

I.2.1.- Bioindicadores
La proteccin del medio ambiente contra la contaminacin se ha convertido en una tarea urgente en los ltimos aos para la sociedad en general, y en particular en los pases industrialmente ms desarrollados, donde la descarga de sustancias nocivas atenta contra el desarrollo sostenible. Entre los numerosos contaminantes emitidos

antropognicamente, los metales pesados se encuentran entre los ms txicos, ya que, pueden transportarse en la atmsfera a grandes distancias desde el foco de emisin, y una vez depositados no sufren ningn proceso de degradacin o destruccin, por lo cual tienden a acumularse en el suelo, en los sedimentos y en los seres vivos7. Las principales fuentes de emisin de metales pesados son las plantas energticas, los vehculos de motor, la industria (principalmente minera y fundiciones), selvicultura. La evaluacin, control y posible solucin de problemas de contaminacin precisa de la monitorizacin de las sustancias contaminantes, la agricultura y la

Introduccin

la medida de algunas de stas y su deteccin entraan dificultades, ya que se encuentran en matrices complejas y, en ocasiones, en niveles de concentracin muy bajos. Por otra parte, la exigencia de procesar un nmero elevado de muestras aade al problema analtico otro de ndole econmica. Por ello es necesario desarrollar sistemas sencillos y econmicos que permitan monitorizar ciertos contaminantes en el medio ambiente, cuantificar las condiciones del estado global del sistema a estudiar y comprobar la eficacia de los mtodos de recuperacin del ecosistema. Esta monitorizacin puede llevarse a cabo mediante el uso de biomarcadores o bioindicadores, en combinacin con procedimientos analticos que puedan ser desarrollados rutinariamente con un coste aceptablemente bajo. Los bioindicadores son organismos, asociaciones de organismos o sustancias que responden a los contaminantes, bien con cambios en sus funciones vitales o bien acumulando dichos contaminantes. Adems, es necesario que puedan establecerse correlaciones entre los niveles individuales de los bioindicadores y la degradacin ecolgica especfica. En funcin de la respuesta de los organismos frente al contaminante se pueden establecer dos tipos de indicadores de contaminacin.

I.2.1.1.- Tipos de bioindicadores

I.2.1.1.1.- Indicadores acumulativos Son ciertos organismos que pueden nacer y crecer en ambientes contaminantes sin manifestar ninguna patologa y que al mismo tiempo acumulan el contaminante en sus cuerpos. Esta bioacumulacin puede ocurrir a niveles varias veces mayor al de la concentracin del contaminante en el ambiente circundante, lo que proporciona un concentrador natural que reduce los lmites de deteccin requeridos por los mtodos analticos a aplicar. Un ejemplo de este tipo de indicadores son los mejillones en aguas contaminadas. Los bioindicadores acumulativos pueden representar niveles medios de contaminantes en sus ambientes correspondientes a largos periodos de tiempo. Adems, estos organismos o sustancias presentan la

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ventaja de que su muestreo, preservacin y transporte suele ser fcil, barato y exacto, comparado con los enormes esfuerzos y precauciones necesarias para la recogida de muestras medioambientales de esa misma zona. I.2.1.1.2.- Indicadores de respuesta La exposicin a ciertos contaminantes por parte de los organismos conlleva el intento de stos por metabolizar y eliminar directamente aquellos, minimizando cualquier dao y perjuicio celular que pudiesen causar. Los mecanismos de proteccin incluyen, a menudo, alteraciones en la actividad enzimtica que pueden considerarse como un biomarcador de exposicin. Los indicadores de respuesta son aquellos que presentan cambios celulares o sntomas visibles de daos cuando estn sujetos a pequeas concentraciones de sustancias peligrosas. Un ejemplo de indicador de respuesta clsico, sera por ejemplo el canario con el que bajaban a la mina los trabajadores, para comprobar la concentracin de gris. En los ltimos aos, se ha hecho un esfuerzo considerable para establecer bioindicadores o biomarcadores, aunque aun son muy pocos los programas de monitorizacin que emplean rutinariamente esta herramienta. En el medio acutico, se ha propuesto el uso de una gran variedad de organismos para evaluar la calidad del agua como por ejemplo algas, plantas, invertebrados, insectos acuticos y peces8,9. Para evaluar la calidad del aire se han empleado diversas especies de aves cuya nidificacin es sensible a las caractersticas del mismo, as como faisanes que exhiben diferentes niveles de infeccin de nematodos en zonas urbanas e industriales en comparacin con zonas agrcolas. Tambin se han utilizado lquenes, dado que, la densidad de su poblacin aumenta o disminuye de acuerdo con la presencia de factores adversos en la atmsfera10. En general, los efectos de la contaminacin del aire de una regin pueden ser registrados por muestreo de organismos y partes de organismos que son componentes naturales del ecosistema y aparecen espontneamente

Introduccin

(monitorizacin pasiva) o por examen de los organismos que son introducidos bajo condiciones controladas en la zona de control (monitorizacin activa).

I.3.- ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS ACERCA DEL USO DE LA MIEL COMO BIOINDICADOR

La idea de emplear las abejas o los productos de las colmenas como indicador de la contaminacin, no es nueva. Hay que remontarse a 1935, cuando J. Svoboda plante que este insecto se vea afectado negativamente por los contaminantes industriales que afectan a las zonas de pecoreo11, y 25 aos despus, su equipo de investigacin monitoriz mediante el uso de abejas, el incremento del radionucletido 90Sr como consecuencia de pruebas nucleares12,13. En aos posteriores se realizaron diversos estudios con el fin de examinar la efectividad del uso de este himenptero como indicador biolgico de la presencia de contaminantes en el medioambiente14. Las razones por las que se ha propuesto las abejas o los productos de las colmenas como bioindicadores son las siguientes: Son capaces de acumular productos contaminantes en sus cuerpos o en los productos de su trabajo. Recorren para la recoleccin del nctar, el polen y el roco dulce un rea que puede alcanzar varios kilmetros de radio15. Realizan un gran trabajo de muestreo, por la gran cantidad de flores que visitan. Producen una gran cantidad de muestra y fcil de obtener. Pueden obtener muestras de casi todos los sectores del medio ambiente (vegetacin, agua, aire y suelo). Poseen una alta sensibilidad a la mayora de los productos fisiofarmacolgicos, revelando cundo estn extendidos de forma irregular en el medio ambiente14.

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Estn sujetas a una constante renovacin de la colonia, adems de la relativa facilidad de su manejo as como el de sus productos.

Las caractersticas descritas demuestran que las abejas y los productos de la colmena son potencialmente aptos para monitorizar la contaminacin de un rea especfica. Salen de la colmena y vuelan sobre la zona circundante y, casualmente recogen las partculas del aire con sus cuerpos velludos mientras diligentemente pecorean de flor en flor. Adems al recolectar nctar y polen de las flores, propleos de los brotes de varias especies botnicas (especialmente lamos y conferas), mielatos de hojas e insectos y agua de arroyos, realizan un exhaustivo muestreo del entorno. Todo el cargamento lo llevan de regreso a la colmena donde almacenan el polen, hacen la miel, y usan los propleos como sustancia selladora. As, todos los productos de la colmena, incluidas las abejas, pueden ser considerados como ptimos bioindicadores. Se obtuvieron resultados estadsticamente comparables al usar miel o abejas como bioindicadores; pero teniendo en cuenta que los resultados en el insecto son ms difciles de interpretar debido a la complejidad de factores que influyen en la asimilacin de los contaminantes, se ha concluido que la miel fresca parece ser la mejor matriz para programas de monitorizacin, no slo porque se muestrea fcilmente, sino tambin, y sobre todo, debido a la naturaleza amplia de la informacin que es capaz de suministrar. No obstante, el anlisis de las propias abejas puede aportar informacin complementaria adscrita a los cinco o seis das precedentes a su captura14. Se pueden citar varios ejemplos de estudios llevados a cabo con el fin de monitorizar una determinada zona usando las abejas o sus productos como indicadores de la contaminacin ambiental: en los aos setenta, Giordani y col.16 llevaron a cabo un estudio para establecer el impacto de los insecticidas organoclorados, como el Endosan en obreras pecoreadoras. Este estudio contribuy a la consecucin de una regulacin ms estricta de los pesticidas que impidiese su uso durante la floracin, as como a obligar a

Introduccin

compaas y legisladores a clasificar los pesticidas segn su incidencia en las abejas. Otros autores realizaron estudios sobre los niveles de insecticidas clorados y fosforados (DDT, parathion, lindano, aldrn o dieldrn), en muestras de miel17,18. En la dcada siguiente, se profundiz en el uso de la miel como bioindicador desarrollando proyectos de monitorizacin de diferentes zonas de Italia. Se establecieron estaciones de muestreo consistentes en diversas colmenas sanas estratgicamente ubicadas en zonas ms o menos intensamente cultivadas, zonas perifricas, o zonas de baja contaminacin, con el fin de comparar los resultados. Se observ que los compuestos con mayor incidencia en la merma de las colonias eran diferentes pesticidas o herbicidas (dimethoate, paration, azinphos-methyl). Estos fungicidas, presentes en el medioambiente, han sido calificados potencialmente cancergenos12. Tambin la miel y otros productos de la colmena pueden ser usados como indicadores de la presencia de istopos radioactivos, como ya se indic anteriormente. A partir del accidente de Chernobyl en 1986, se llevaron a cabo numerosos estudios, basados en la miel como bioindicador, acerca del incremento de contaminantes radioactivos19, de su distribucin en suelo y plantas20, y de su variacin a lo largo del tiempo21. En las investigaciones acerca de la incidencia y distribucin de metales pesados es donde se encuentra un mayor nmero de referencias en las que las colmenas, sus habitantes y sus productos son empleados como indicadores medioambientales. En 1975, Tong y col.22 estudiaron 47 elementos en 19 muestras de miel producidas en EEUU estableciendo una correlacin entre la proximidad a vas de comunicacin de alta capacidad y la presencia de metales como Al, Cd, Cu, Mg, Mn, Mo, Ni y Pb. Fodor y col.23 han encontrado diferencias significativas en las concentraciones de metales pesados entre muestras de miel de Hungra procedentes de regiones industriales y zonas rurales no contaminadas. Przybylowski y col.24 han comprobado la existencia de una correlacin lineal entre las concentraciones en 1987 por la

Academia de las Ciencias de U.S.A, como compuestos peligrosos al ser

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Tesis doctoral

de Cd encontradas en miel y en otros marcadores biolgicos (ej. flores: Trifolium pratense). Porrini y col.14 han realizado un estudio completo sobre el uso de abejas como bioindicadores, en el que concluyen la factibilidad de su uso junto con otros productos de la colmena, con el fin de detectar la presencia de metales pesados en el medioambiente. Se confirma as mismo las diferencias existentes entre el uso de la miel o de las propias abejas, pues la miel proporciona una media de concentracin en un intervalo de tiempo mientras las abejas slo nos dan una informacin de los cinco o seis das precedentes a su captura. Por el contrario, existen tambin en la bibliografa, trabajos en los que el uso de la miel como bioindicador es criticado y desaconsejado. A diferencia de lo establecido por Tong y col.22, las investigaciones realizadas por Jones y col.25, no demostraron elevacin alguna del contenido en plomo en muestras de miel prximas a vas de comunicacin. ren y col.26 no detectaron influencia en los niveles de metales determinados en miel de Turqua producida en el entorno de una central trmica. Por lo hasta ahora expuesto, se puede decir que, las abejas, como indicadores de respuesta y acumulativos, y sus productos como indicadores acumulativos, son potencialmente bioindicadores a tener en cuenta a la hora de evaluar el impacto ambiental de ciertos contaminantes, y sobre todo de los metales pesados. Aunque, como indican Caroli y col.27, el paso de metales a la miel puede ocurrir de diferentes formas que no siempre son fciles de identificar, y el contenido metlico de la misma depende de mltiples factores como son el origen botnico de la miel, el tipo de suelo en que es producida, el tiempo y el viento que pueden limpiar la atmsfera o transferir los metales pesados a otro sector medioambiental, la estacin del ao de recogida del nctar, y el propio procesado del producto. En el presente trabajo se tratar de evaluar el uso de la miel como bioindicador en la Comunidad Autnoma Gallega, atendiendo al estudio de su contenido metlico.

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I.4.- DETERMINACIN DE METALES EN MIEL

Teniendo en consideracin los objetivos del anlisis de metales en muestras de miel descritos anteriormente, en el presente trabajo se llevar a cabo un estudio crtico de las diferentes tcnicas analticas que han sido aplicadas a la determinacin de diversos metales en miel. El conocimiento del contenido metlico de la miel tiene gran importancia, desde varios puntos de vista. En primer lugar, se trata de un alimento y por tanto, el control al que como tal es sometido exige la determinacin de los niveles de algunos metales de conocida toxicidad como el plomo, cadmio, mercurio, etc. En segundo lugar, tambin es deseable conocer la concentracin en este producto de otros metales esenciales para los seres vivos que desempean un importante papel en funciones estructurales (Ca, Fe), formando parte de enzimas (Cr, Zn, Cu, Mg) o manteniendo el funcionamiento del sistema nervioso (Na, K). Por ltimo y en tercer lugar, si se considera que la miel es el resultado de un proceso natural de bioacumulacin, el conocimiento de su contenido metlico puede usarse para la recogida de informacin del medio donde se desarrolla la vida de la colmena, tal y como se ha descrito anteriormente. La dificultad de la determinacin del contenido metlico en miel es doble, por un lado debido a las posibles interferencias provocadas por la matriz hidrocarbonada y que, a menudo, hace necesario un tratamiento previo de la muestra, y por otra parte, debido al amplio rango de concentraciones en que se pueden encontrar los muy diversos metales. Todo ello hace que de momento no se haya encontrado la tcnica ideal, que sirva para la determinacin de todos los metales en miel sin un tratamiento previo de la muestra. La espectrometra de absorcin o emisin atmica con llama28,29,30,31,32,33,34 ha sido ampliamente usada para la determinacin de metales en mieles debido a que es una tcnica econmica y con buenas caractersticas analticas. Sin embargo, presenta el inconveniente de necesitar un tratamiento previo para obtener una muestra fcil de introducir

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en el nebulizador, que consiste, generalmente, en una carbonizacin de la miel a 450 C y disolucin de cenizas en HCl28,29,30,31,32. Otra limitacin de la tcnica es la insuficiente sensibilidad que imposibilita la determinacin de algunos metales txicos como plomo y cadmio, siendo necesaria una etapa previa de concentracin. Un ejemplo de este planteamiento son los mtodos propuestos por ren y col.26 (un largo proceso de mineralizacin con HNO3 durante ms de 2 das, y extraccin de estos dos metales con metilisobutil cetona para su posterior medida) y Tuzen y col.35 (formacin de quelatos con los metales pesados y posterior concentracin en microcolumna). La espectrometra de absorcin atmica con atomizacin

electrotrmica (ETAAS), da solucin al problema de sensibilidad antes comentado sin dejar de ser relativamente econmica y sencilla. En diversos trabajos se emple esta tcnica para cuantificar metales en miel previamente digerida: Taddia y col.36 determinaron cadmio, cromo, cobre, hierro, manganeso, nquel, plomo, vanadio y zinc en un digerido de miel. Tambin Celechovsk y col.37 realizaron un tratamiento previo de la muestra consistente en la digestin asistida por microondas usando HNO3 concentrado, para determinar cadmio, plomo, cobre y zinc mediante ETAAS. Przybylowski y col.24 han cuantificado plomo, cadmio y zinc usando un procedimiento similar de incineracin y redisolucin en medio ntrico. Sin embargo, son de mayor inters los mtodos directos, sin tratamiento previo de la muestra, como el propuesto por Vias y col.38, que permite determinar cadmio, plomo, cobre y zinc en miel mediante ETAAS por inyeccin directa de la muestra diluida. Otra tcnica de amplia utilizacin es la espectrometra de emisin atmica con fuente de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) y la espectrometra de masas con fuente de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). En ambos casos se trata de tcnicas multielementales, aunque la segunda presenta mayor sensibilidad por lo que es utilizada para medir aquellos metales que aparecen en menor concentracin27,39,40 (Cd, Cr, Ni, Pb). Devillers y col.15 han empleado ICPAES para estudiar 18 metales y no metales en mieles francesas, y han puesto de manifiesto la imposibilidad de detectar cadmio y plomo en un gran

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nmero de las mismas debido a falta de sensibilidad. El mismo problema fue referenciado por Merin y col.41 al tratar de determinar cadmio, plomo y cromo, en muestras de miel procedentes de Israel, y por Terrab y col.42 en mieles de tomillo espaolas. Para solucionar este inconveniente, Cerutti y col.43, han desarrollado sistemas de preconcentracin mediante

microcolumnas de carbn activo antes de la medida mediante ICP-AES. Por el contrario Ioannidou y col.44 cuantificaron plomo, cadmio, cobre, cromo, cobalto y nquel mediante ICP-AES sin ningn tipo de tratamiento ni disolucin de la muestra. ICP-MS es una tcnica bien establecida y poderosa para el anlisis de metales traza y ultratraza en miel, sin embargo, adems de ser cara, est sujeta a interferencias espectrales que pueden afectar seriamente a la determinacin de muchos elementos ( ej. 40Ar 12C vs 52Cr,
40

Ar1 6O vs

56

Fe y

40

Ar

35

Cl vs

75

As) cuando la materia orgnica no est

totalmente destruida o la resolucin msica no es suficiente. Caroli y col.27 han eliminado parcialmente estas interferencias sustituyendo el

espectrmetro de masas cuadripolar por uno de campo magntico de alta resolucin (HR-ICP-MS) y utilizando un nebulizador ultrasnico en vez del neumtico convencional. Bettinelli y col45. han aplicado una etapa de vaporizacin electrotrmica (ETV) previa a la determinacin con ICP-MS, lo que ha permitido la eliminacin de interferencias y la medida de las muestras sin digestin previa. Esta forma de preparacin de la muestra tambin fue estudiada por otros autores39,40 concluyendo que se obtienen resultados comparables con los obtenidos para la digestin en microondas39. Los mtodos voltamperomtricos, particularmente los de

redisolucin andica, se han planteando como una alternativa a las tcnicas espectroscpicas, debido a lo relativamente econmica que resulta su instrumentacin y a su capacidad de evaluar simultneamente cantidades traza de diversos analitos. Sanna y col.46 propusieron el uso de un mtodo basado en la voltametra de redisolucin andica diferencial de impulso (DPASV) para la determinacin de cobre, plomo, cadmio y cinc en mieles con digestin previa de la muestra. Buldini y col.47 han empleado la tcnica de redisolucin catdica (DPCSV), previa fotooxidacin de la miel y han

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explorado la posibilidad de usar la cromatografa inica como mtodo alternativo para la determinacin simultnea de metales pesados en miel. Ambas tcnicas presentaron el inconveniente de que en, ciertos casos, no alcanzan la sensibilidad adecuada para llevar a cabo estas determinaciones. Otras tcnicas propuestas son las basadas en la espectrometra de rayos X, ya sea con reflexin total (TXRF)48,49 o con radioistopos excitados (XRF)48. Estas tcnicas que ofrecen la ventaja de ser multielementales, directas y no destructivas, tienen sin embargo, unos lmites de deteccin demasiado desfavorables para algunos elementos (Pb: 0.44 mg Kg-1 y Cr 0.60 mg Kg-1). La activacin neutrnica50, tambin ha sido usada para analizar metales en miel, aunque presenta la desventaja de ser demasiado cara y en la mayora de los casos no alcanza el lmite de deteccin de ppb47 necesario para cuantificar los metales a estudiar. En el presente trabajo se seleccion ETAAS como tcnica para la determinacin de Cd, Pb, Cu, Cr y Ni en muestras de miel, debido a su adecuada sensibilidad, alta selectividad y caractersticas analticas

apropiadas para la medida de metales traza en productos apcolas. Por otra parte, se trataron de desarrollar mtodos que eviten el tratamiento previo de la muestra y que permitan la inyeccin directa de la muestra diluida, con las consabidas ventajas de evitar prdidas de analito (que pueden ocurrir al incinerar la miel siguiendo la metodologa oficial51) y contaminaciones de la muestra. Pocos laboratorios han desarrollado mtodos exactos y sensibles para la determinacin directa de elementos traza en muestras de miel debido a la complejidad de la matriz y las bajas concentraciones de algunos elementos lo que hace necesario, en muchos casos, un tratamiento previo de la muestra. La determinacin directa de metales en miel mediante ETAAS, al no realizar una destruccin previa de la matriz orgnica, precisa de la introduccin en la cmara de atomizacin de oxidantes como cido ntrico y perxido de hidrgeno. Estos reactivos generan una atmsfera oxidante, que evita la formacin de residuos carbonosos en el interior del tubo, con la consiguiente disminucin de la seal de fondo. Este fin tambin pude

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conseguirse introduciendo aire en la etapa de mineralizacin52, pero con el inconveniente de reducir excesivamente la vida del tubo de grafito. Por otra parte, al ser la miel diluida un lquido de alta viscosidad, cuando se introduce la muestra en la cmara de grafito es necesaria la adicin de algn agente surfactante que permita la adecuada deposicin de la disolucin, de manera que se asegure la reproducibilidad de la inyeccin44. La principal desventaja de ETAAS es la prdida de radiacin no especfica, por humos y vapores de la matriz, lo que provoca la necesidad de una correccin de fondo. Estos efectos, combinados con una incidencia importante de las interferencias de los constituyentes de la matriz, hacen necesario comprender los mecanismos de atomizacin y e interferentes para que la determinacin de metales a niveles traza y ultratraza pudiese ser efectiva. Este hecho se ha logrado en un gran nmero de situaciones mediante el empleo de condiciones STPF. El concepto STPF incluye cuatro principios: a) superficies de grafito bien controladas, b) correccin de fondo efectiva, c) atomizacin bajo condiciones isotrmicas, y d) modificacin qumica. La utilizacin de estos principios permite incrementar la temperatura de pirolisis, poder reducir la concentracin de los componentes de la matriz en la fase de vapor durante la etapa de atomizacin, estabilizar el analito en la plataforma mientras la temperatura de la fase vapor alcanza el equilibrio y separar la seal del analito de la del fondo53. Para evitar que el analito y la matriz se difundan en el tubo retrasando el proceso de atomizacin y provocando seales ms bajas del analito, se emplean recubrimientos de las superficies de grafito con una capa delgada de carbono piroltico que sella los poros del tubo. El uso de sistemas de correccin de fondo permite mejorar la tolerancia a valores altos del fondo de absorcin. Los correctores de fondo continuo, que fueron inicialmente diseados para FAAS y que son perfectamente adecuados para esa tcnica, no son apropiados en determinadas circunstancias para la determinacin mediante ETAAS. Debido a la alta capacidad del corrector que emplea el efecto Zeeman, ste es el corrector recomendado para corregir el fondo cuando se usa ETAAS.

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El empleo de un procedimiento de atomizacin isotrmica minimiza los efectos de las interferencias en la fase gas durante la atomizacin de la muestra. Para ello es necesario retrasar la atomizacin hasta el momento en el cual el tubo y la atmsfera de gas logran su temperatura final. Esto se consigue usando plataformas Lvov, y una velocidad de calentamiento suficientemente rpida, ya que, al tener la plataforma muy poco contacto trmico con las paredes de la cmara, su calentamiento es debido fundamentalmente a un proceso de radiacin. Todas las medidas exigidas para lograr la atomizacin isoterma deben ser apoyadas por la aplicacin de un modificador de matriz eficaz. El uso de modificadores de matriz transforma al analito en compuestos trmicamente ms estables y facilita as la separacin de los componentes de la matriz ms voltiles en la etapa de mineralizacin sin prdida de analito. Se han propuesto muchas sales metlicas o sus mezclas, y algunas sustancias orgnicas para ser usadas como modificadores de matriz efectivos. Los modificadores ms comnmente empleados son Pd, Pd-Mg, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, Mo, W, etc. Tambin el uso de tubos o plataformas recubiertos de modificadores de elementos del grupo del platino (Pd, Pt, Ir, Rh, Ru) o combinaciones de stos han sido empleados recientemente para la determinacin directa de metales, actuando como modificadores

permanentes. Pero, aunque estos modificadores presentan grandes ventajas, no existen referencias bibliogrficas sobre su uso en la determinacin de metales en miel por ETAAS. En este trabajo, el estudio se ha centrado bsicamente en el empleo de Pd-Mg y NH4H2PO4, como modificadores qumicos en la determinacin de metales pesados en miel mediante ETAAS. La mezcla nitrato de paladionitrato de magnesio ha sido propuesta como un modificador universal, al estabilizar en torno a 21 elementos, debido a la formacin de compuestos tipo [Pd-M-O]54 o a la formacin de compuestos covalentes durante la etapa de secado, que conducen a temperaturas de atomizacin muy altas. El fosfato, en la forma de NH4H2PO4 o (NH4)2HPO4 ha sido un modificador

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ampliamente usado para la determinacin de plomo y cadmio, debido a la formacin de un compuesto metal-oxifsforo que los estabiliza54. En la parte I del presente trabajo se desarrollaron nuevas metodologas de anlisis de metales pesados (Cd, Pb, Cu, Cr y Ni) por ETAAS en mieles gallegas sin tratamiento previo de la muestra. La optimizacin de los mtodos, debido al elevado nmero de factores influyentes, se ha llevado a cabo mediante diseo experimental, siendo la sensibilidad y el fondo los parmetros de control.

I.5.- TCNICAS QUIMIOMTRICAS EMPLEADAS

Bajo el trmino, quimiometra, se agrupan un conjunto de tcnicas matemticas, estadsticas y de lgica formal que se aplican para: a) disear y mejorar procedimientos qumicos de medida y b) para extraer informacin til de datos qumicos55,56. As, en este trabajo se hizo uso de las tcnicas quimiomtricas bajo estos dos enfoques. Por un lado se llev a cabo el desarrollo de los mtodos analticos haciendo uso de diseo de experimentos, ya que permiten evaluar el efecto de un conjunto de factores (variables) en la seal analtica y construir el modelo que relaciona la seal y las variables con un mnimo de experimentos. Por otra parte, se emplearon tcnicas de anlisis multivariante para extraer informacin de los resultados obtenidos al determinar 13 metales en 40 muestras de mieles gallegas y comprobar la posible correlacin entre los niveles de metales en miel y el impacto medioambiental de la zona donde se ubic la colmena.

I.5.1.- Diseo de experimentos

El diseo de experimentos consiste en planear un conjunto de pruebas, de tal modo que los datos generados puedan analizarse estadsticamente para obtener conclusiones vlidas y objetivas acerca del sistema57. Los mtodos de diseo de experiencias permiten sistematizar la forma de realizacin de los mismos y lo que es ms importante, obtener la

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mxima informacin posible con la mnima cantidad de experimentos. El trmino de diseo experimental se utiliza para describir las etapas de: Conocimiento e identificacin de factores. Etapa en la que se obtiene conocimiento de los posibles factores influyentes en el resultado de un experimento. Diseo del experimento. Se lleva a cabo de modo que se minimicen los efectos de factores incontrolados. Cribado de factores (Screening). Consiste en la utilizacin del anlisis estadstico para separar y evaluar los efectos de los diversos factores implicados. Es una etapa que se realiza antes de comenzar el proceso de optimizacin, ya que es imprescindible conocer qu factores tienen un escaso o nulo efecto en la seal analtica, de manera que no se desperdicie ni tiempo ni otros recursos en experimentos innecesarios. Optimizacin de la superficie de respuesta. Etapa en la que se buscan los niveles ptimos de cada factor para localizar un extremo de una funcin respuesta dada por esos factores. Esta bsqueda del ptimo puede realizarse de diferentes maneras que se caracterizan por el mecanismo mediante el cual sta es llevada a cabo. Los ms usados son el mtodo univariante iterativo, el mtodo del gradiente, y el mtodo del simplex secuencial. Ensayos de robustez. Su objetivo es explorar la variacin de la respuesta cuando se producen pequeos cambios en los factores. Idealmente, un test robusto, debera mostrar que la respuesta no es sensible a pequeas fluctuaciones de los factores.

I.5.1.1.- Tipos de diseos

I.5.1.1.1.- Diseo factorial completo a dos niveles Un diseo experimental tpico es aquel en el que se emplean todos los factores de entrada fijados en dos niveles cada uno. Estos niveles se llaman `alto' y `bajo' o `+1' y `-1', respectivamente. Al diseo con todas las

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combinaciones altas y bajas posibles de todos los factores de entrada se le conoce con el nombre de Diseo factorial completo en dos niveles. Este tipo de diseo requiere que se lleve a cabo un experimento para todas las posibles combinaciones de los dos niveles de cada uno de los k factores considerados. As, si hay k factores, cada uno en 2 niveles, un diseo factorial completo requiere 2k experimentos. I.5.1.1.2.- Diseo factorial fraccionado Cuando el nmero de factores aumenta, ocurre lo mismo con el nmero de experimentos. Por ejemplo, para 10 variables se requeriran 1024 experimentos, ya que, en un diseo factorial completo el nmero de experimentos crece de forma exponencial con el nmero de factores (si k = 5, 25 = 32 experimentos; k = 7, 27 = 128; k = 9, 29 =512,), lo cual no es ni prctico, ni operativo, ni eficiente. Por ello, ser ms recomendable utilizar un Diseo Factorial Fraccionado. En este caso se llevarn a cabo slo una fraccin de estos experimentos, por ejemplo, 1/2, 1/4, 1/8. Al realizar menos experimentos, se pierde una cierta cantidad de informacin sobre algunas o sobre todas las interacciones entre factores. Mediante un Diseo factorial fraccionado se reduce el nmero de experimentos perdiendo la mnima informacin posible. Cuando se realiza, por ejemplo, un diseo factorial completo en dos niveles para siete factores el nmero de experimentos a realizar es de 128, los cuales son empleados para estimar el valor medio de 7 efectos principales, 21 interacciones entre dos factores, 35 entre tres factores, 35 entre cuatro factores, 25 entre cinco factores, 7 entre seis factores y 1 entre siete factores. Claramente habr una gran redundancia y por tanto, ha de ser posible definir diseos de experimentos menores. Para lograr esto se realizar un medio, un cuarto, un octavo, de un diseo factorial completo y al que se designa como Diseo Fraccionado. Este tipo de diseo se simboliza restando en el exponente del diseo 2 un nmero tal que el cmputo resultante d cmo resultado el nmero de experimentos. Por ejemplo: un diseo factorial fraccionado 24-1 es un diseo para cuatro factores, en el que de los diecisis experimentos requeridos en el
k

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diseo factorial completo slo la mitad sern realizados (8 experimentos, 24-1 = 8). En el presente estudio los diseos de experimentos expuestos se han empleado con el fin de cribar los factores a optimizar y despus encontrar las regiones ptimas de trabajo en las superficies de respuesta obtenidas a partir del estudio de los factores estadsticamente significativos.

I.5.1.2.- Cribado de factores

Cuando se estudia un proceso nuevo, es posible que no se conozca cuales de los muchos posibles factores presentan influencia en los resultados. En ese caso, lo que se desea es conocer aquellos que s la tienen. El tipo de diseo que se emple con este fin es el de la fraccin ms pequea posible de un diseo a dos niveles (Diseo factorial fraccionado saturado) o Diseo Plackett-Burman. Diseo Plackett-Burman En 1946, R.L. Plackett y J.P. Burman publicaron un trabajo en el que describan la construccin de diseos de experimentos muy econmicos con un nmero de ensayos mltiplo de cuatro (en lugar de emplear una potencia de 2). As surgen diseos experimentales de 4, 8, 12, 16, 20, experimentos que son adecuados para estudiar hasta 3, 7, 11, 15, 19, factores respectivamente. En algunos casos donde n x 4 = 2k, el diseo PlackettBurman es un diseo fraccionado especfico de un diseo factorial completo y se puede emplear un diseo factorial fraccionado saturado58. En este trabajo, para una primera aproximacin a la optimizacin de los mtodos y como diseo de primer orden, siempre se emple el diseo Plackett-Burman, con el fin de obtener una seleccin previa de los factores ms significativos. Para este estudio se us siempre una matriz de 12 experimentos, aunque a menudo el nmero de factores fuera inferior a 11. Cuando el nmero de variables a optimizar es inferior a 11 y superior a 7, los factores restantes fueron sustituidos por factores Dummy, realizando igual 12

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experimentos. Los efectos de estos factores carecen de sentido pero son tiles para computar las interacciones56. La matriz de experimentos empleada en este diseo se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2.- Diseo Plackett-Burman para el estudio de 11 factores en 12 experimentos58. Variable Exp. elemental 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 + + + + + + 2 + + + + + + 3 + + + + + + 4 + + + + + + 5 + + + + + + 6 + + + + + + 7 + + + + + + 8 + + + + + + 9 + + + + + + 10 + + + + + + 11 + + + + + + -

I.5.1.3.- Superficies de respuesta

Una vez encontrados los factores que tienen influencia efectiva sobre la respuesta, se procedi a su optimizacin mediante diseos ms completos en los que se incluyen las interacciones. El experimento se dise para permitir que se estime la interaccin e incluso los efectos cuadrticos, y por tanto, para obtener la forma de la superficie de respuesta que se est investigando. Por esta razn, tambin se llaman Mtodos de Superficie de Respuesta (RSM). Como RSM siempre se ha utilizado el diseo Composicional Central. Este es un diseo a tres niveles, que parte de un diseo a dos niveles, al que se aadieron puntos centrales tanto en las caras como en los ejes. Normalmente se parti de un diseo completo 23 24 al que se

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aadieron los puntos centrales, aunque en alguna ocasin se utiliz algn fraccionado 25-1 como base para la construccin del composicional central. Una matriz de experimentos para un diseo composicional central 23 + estrella se muestra en la Tabla 3, en donde el nmero de experimentos viene dado por: 2k puntos del cubo + 2k puntos estrella + n puntos centrales.
Tabla 3.- Matriz de experimentos para un diseo composicional central 23 + estrella. Experimento elemental 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Factor 1 +1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 0 0 0 0 +1 0 0 Factor 2 -1 +1 +1 -1 0 -1 +1 0 -1 0 +1 -1 0 +1 0 0 Factor 3 -1 -1 -1 +1 0 +1 +1 0 -1 0 0 0 0 +1 +1 -1

Una vez realizado el diseo e introducidos los resultados de la variable respuesta, se obtuvo una ecuacin de regresin que represent la superficie generada por los factores estudiados. A partir de esta superficie de respuesta, se computaron los valores ptimos para cada factor estudiado y la variacin de la respuesta frente a la variacin de esos factores.

I.5.2.- Tcnicas de reconocimiento de pautas

Como ya fue comentado anteriormente, despus de optimizar los mtodos de anlisis para metales minoritarios, estos se emplearon para

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cuantificarlos en 40 muestras procedentes de toda la geografa gallega. Como adems de los minoritarios tambin se determinaron otros 8 metales mayoritarios en estas mismas muestras, el volumen de datos obtenidos fue elevado. El procesado y anlisis de estos datos requiri el empleo de herramientas matemticas y estadsticas, que ayudadas por software y hardware, permiten extraer una informacin til de todos ellos. Uno de los campos de actuacin de la quimiometra consiste en el tratamiento e interpretacin de los datos analticos con el fin de obtener la mxima cantidad de informacin mediante la aplicacin de tcnicas matemticas asistidas por ordenador59. Tambin se trata, en este caso, de eliminar informacin redundante y aquella que enmascara o dificulta la interpretacin de los resultados. Con el propsito de caracterizar muestras se emplearon procesos que incluyen tcnicas de visualizacin y reduccin de la dimensionalidad, y tcnicas de clasificacin. Estas tcnicas son conocidas como tcnicas de reconocimiento de pautas (Pattern recognition). Entre las primeras, en el presente trabajo se han usado Anlisis en Componentes principales y Anlisis de Clusters, mientras que como tcnicas de clasificacin se han empleado Anlisis lineal discriminante, KNN, SIMCA y Redes neuronales artificiales. Las tcnicas de reconocimiento de modelos han sido ampliamente utilizadas en diferentes reas de la ciencia, como estudios ambientales60,61,62, autentificacin de alimentos63,64,65,66, estudio de productos farmacuticos67,68, etc. En el presente trabajo han sido aplicadas con el fin de establecer si se pueden agrupar las muestras de miel en funcin de las caractersticas medioambientales de la zona de procedencia, y as establecer la posibilidad de usar estas muestras como bioindicadores.

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I.5.2.1.-

Tcnicas

de

visualizacin

reduccin

de

la

dimensionalidad
1.5.2.1.1.- Anlisis de componentes principales (ACP) El anlisis de componentes principales puede definirse como un mtodo de transformacin de unas variables originales en unas nuevas variables que son combinacin lineal de las primeras y que permite encontrar un conjunto de ejes ortogonales que representan las direcciones de la mxima varianza de los datos, consiguiendo una reduccin de la dimensionalidad de los vectores que caracterizan una muestra. De esta forma, se permite encontrar la estructura relevante de los datos, que la observacin directa impeda69. Adems de las relaciones entre los objetos, pueden tambin establecerse, las relaciones entre las variables. Mediante las tablas de cargas (loadings) se puede conocer qu variables tienen ms influencia en un determinado CP, y as relacionar los componentes principales con una propiedad del sistema a estudiar. Al representar la carga de cada variable en el espacio definido por los componentes principales, las variables muy correlacionadas se manifestarn por ser muy pequeo el ngulo que forman los vectores que las representan, pudindose, as, establecer la relacin entre las variables. As mismo, las puntuaciones (scores) de los objetos con respecto a los componentes principales permiten establecer su posicin en el espacio n-dimensional (n = nmero de variables) y produciendo una reduccin de la dimensionalidad del sistema puede visualizarse las estructuras latentes de los datos estudiados70,71. 1.5.2.1.2.- Anlisis de clusters (AC) Anlisis de Clusters es una tcnica quimiomtrica que permite la agrupacin de los objetos, caracterizados por los valores de un conjunto de variables en funcin de la similitud entre ellos. Es as, una alternativa al anlisis de componentes principales para describir la estructura de un conjunto de datos72. Esta tcnica dada su simplicidad interpretativa se ha

Introduccin

25

aplicado con frecuencia a la evaluacin de agrupamientos en distintos tipos de muestras alimentarias72,73,74, medioambientales75,76, etc. El criterio empleado para agrupar los objetos, es que aquellos que presentan propiedades similares entre si deben ubicarse prximos en el espacio definido por las variables. Como parmetro para medir la semejanza entre objetos, se emplea la distancia entre ellos en el espacio n-dimensional, expresada en trminos de similaridad.
S ij = 1 d ij d max

Donde dij y Sij son la distancia y la similitud entre los objetos i y j, y donde dmax representa la distancia entre todo el conjunto. En el anlisis de cluster los resultados de las agrupaciones de los objetos obtenidas en funcin de la similaridad se representan a travs de un rbol, tambin llamado dendrograma (Figura 1). Los dendrogramas constituyen una proyeccin de la
Berberecho crudo Cangrejo asado Cangrejo crudo Gamba asada Mejilln cocido Almeja cocida Mejilln crudo Cangrejo frito Gamba cruda Gamba frita Almeja cruda 1 0.7 Similaridad en funcin de distancias 0

los dos objetos ms alejados entre si de

posicin de los objetos en el espacio n-

Figura 1.Ejemplo de un dendrograma en anlisis de clsters. Efecto del cocinado en crustceos y bivalvos.

dimensional en una representacin bidimensional77,78. En el presente trabajo, las similaridades entre las muestras fueron establecidas a partir del clculo del cuadrado de la distancia eucldea y el mtodo de agrupamiento elegido fue el mtodo de Ward.

I.5.2.2.- Tcnicas de clasificacin

Las tcnicas de clasificacin se basan en el empleo de modelos de aprendizaje supervisado en los que es necesario un conocimiento de la informacin qumica (variables) y del grupo o categora al que pertenece

26

Tesis doctoral

cada objeto del conjunto de muestras. Es preciso disponer de un grupo de muestras, llamado grupo de aprendizaje, en el que se conoce la asignacin de cada objeto a la categora a la que corresponde, esta informacin se usa para construir modelos matemticos capaces de pronosticar la pertenencia de un objeto a una categora sobre la base de sus caractersticas55. Para la validacin del modelo construido se emplea el denominado grupo de prueba, que consiste en otro conjunto de datos conocido. Si el modelo funciona exitosamente, cabe indicar que los datos disponibles contienen informacin suficiente para alcanzar los fines de clasificacin propuestos, y que la regla de clasificacin puede emplearse para asignar objetos desconocidos a las categoras a las que pertenezcan. Existen diversos tipos de mtodos de clasificacin, que

esencialmente difieren en la forma en como se define las reglas de clasificacin. Los diferentes mtodos de clasificacin usados en este trabajo fueron los que se indican a continuacin. 1.5.2.2.1.- Anlisis lineal discriminante (ALD) El anlisis lineal discriminante es un mtodo propuesto por Fisher y se basa en el clculo de funciones discriminantes. Una funcin discriminante se define como una funcin que divide el espacio en regiones diferentes79 separando las correspondientes clases predefinidas. Geomtricamente, esto significa buscar una lnea a travs de la nube de puntos, tal que, la proyeccin de stos est lo ms separada posible. Por consiguiente, en ALD se busca una funcin lineal de las variables que maximizan la varianza entre categoras a la vez que minimizan las varianzas dentro de las categoras (Figura 2).
Figura 2.- Funcin lineal discriminante y frontera entre ambas categoras (lnea de trazos).
+ + + + + + ++ + + + + + + + + ++ + + ++ + +

f1

Cuando hay k clases, se determinan k-1 funciones discriminantes, ortogonales entres s.

Introduccin

27

La regin crtica o frontera es la recta, plano o hiperplano en donde se igualan las probabilidades de pertenencia a una u otra categora. Se trata de una recta (o plano) ortogonal a la funcin discriminante (Figura 2)80,81. 1.5.2.2.2.- K vecinos ms prximos (KNN) La tcnica KNN82, (K nearest neighbours) o de los K vecinos ms prximos es una poderosa herramienta de gran simplicidad conceptual y computacional. En KNN se clasifica a un objeto desconocido en la categora a la que pertenecen sus k vecinos ms prximos. El valor de K se elige por optimizacin capacidad de determinando prediccin la
clase L X3

para
A B u
x

diferentes valores del nmero de vecinos. Suelen elegirse siempre

X2 C

valores pequeos de K (Figura 3). Este mtodo presenta muchas ventajas, ya que, adems de su simplicidad de clculo, est libre de objeto u desconocido. requerimientos matemticos (tales
clase K X1

Figura 3.- Clasificacin 3-NN de un

como la distribucin normal de las variables) y produce resultados satisfactorios para distribuciones de clases no linealmente separables. Adems mediante el empleo de funciones de probabilidad (mtodos bayesianos)83 calculadas empricamente para cada clase puede conseguirse que KNN descubra clases que no fueron tenidas en cuenta a la hora del aprendizaje. 1.5.2.2.3.- SIMCA (Soft independent modelling of class analogy) Las tcnicas de clasificacin hasta ahora descritas presentaban la limitacin de no poder detectar objetos anmalos o errneos (outliers) que no se ajustan a ninguna de las clases definidas. Por ello surgen tcnicas que como SIMCA, construyen un modelo separado para cada clase y contrastan

28

Tesis doctoral

si el objeto desconocido puede considerarse o no como miembro de la clase. Es decir, se aplica un modelado de las clases previa a la clasificacin84. La primera etapa que se desarrolla en SIMCA es la determinacin de los componentes principales necesarios para describir la estructura de cada clase en el conjunto de aprendizaje. Si el nmero de CP necesarios es 1, todos los datos de esa clase se modelan unidimensionalmente, es decir,
X2 PC2 PC1

mediante una recta. Si se necesitan dos, se asume que el (plano), modelo y es as

X3 X1

bidimensional

sucesivamente. Alrededor del modelo descriptor de cada clase, basado en componentes principales, se construye un volumen de confianza, que viene determinado por la distribucin de los objetos. Las muestras a clasificar son asignadas a una clase si estn incluidas dentro de alguno de estos volmenes o como outliers si no lo estn. Cada objeto en el conjunto de entrenamiento es asignado a su grupo, usando el modelo n-dimensional obtenido, para los otros j-1 objetos del grupo de entrenamiento (Figura 4). 1.5.2.2.4.- Redes neuronales (RN) Una neurona artificial simula las funciones bsicas de la neurona natural. Desarrolla un proceso en dos etapas para transformar un conjunto de entradas en una respuesta o salida. En un contexto de reconocimiento de pautas, la entrada son los valores de las variables y la respuesta sera una variable de clase, por ejemplo 1 para la clase K y 0 para la clase L. La neurona calcula la suma ponderada de las entradas, siendo los pesos determinados en el entrenamiento de la neurona con un conjunto de objetos usados para tal fin. En la segunda etapa, la suma es transformada con la ayuda de una funcin de transferencia. Las neuronas no son usadas de forma aislada, sino que constituyen una red. Existe una capa de entrada que tiene tantas entradas como variables manifiestas, y que genera a su vez el mismo

Figura 4.- SIMCA: modelado en 2 componentes principales.

Introduccin

29

nmero de salidas, cada una de las cuales se comunica a todas las neuronas de la capa siguiente y as sucesivamente (Figura 5). Por ltimo la capa de salida posee tantas neuronas como categoras existen en los datos. La red debe ser entrenada (supervised learning)

suministrando pares de entrada-salida conocidos para extraer el modelo de los Figura 5.- Estructura tipo de una red datos85.
neuronal multicapa.

Para cada problema concreto de prediccin se debe disear y validar una red neuronal distinta. El diseo de una red es un proceso iterativo complejo en el cual, mediante el procedimiento de ensayo y error, se establecen, entre otros, los siguientes parmetros: el nmero de capas de la red, el nmero de nodos de cada, la funcin de transferencia y el algoritmo o mtodo de aprendizaje para el entrenamiento de la red86.

30

Tesis doctoral

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32

Tesis doctoral

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Introduccin

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Tesis doctoral

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II.- OBJETIVOS

Objetivos

35

I I.1.- OBJETIVOS
En el presente trabajo se tratarn de alcanzar los objetivos que a continuacin se enumeran: 1.- Desarrollar un conjunto de mtodos de determinacin de metales minoritarios (Cd, Pb, Cu, Cr y Ni) en muestras de miel mediante la tcnica de espectrometra de absorcin atmica con atomizacin electrotrmica. En todos los casos se tratar de obtener procedimientos, exactos, precisos, sensibles y que permitan la determinacin del analito sin tratamiento previo de la muestra. 2.- Comparar diferentes modificadores de matriz, con el fin de seleccionar aquel que mejores resultados aporte para determinar metales traza en muestras de miel mediante ETAAS. 3.- Comparar distintos tratamientos de la muestra para aplicar el ms adecuado en cada una de las tcnicas empleadas. 4.- Aplicar los mtodos desarrollados (ETAAS), junto con otros para la determinacin de metales mayoritarios (ICP-AES), con el fin de obtener los perfiles metlicos de muestras de miel pertenecientes a la comunidad autnoma de Galicia. 5.- Explorar quimiomtricamente, sobre la base del contenido metlico de la miel, el posible papel de este producto como bioindicador de la contaminacin ambiental.

III.- PARTE I: MTODOS DE DETERMINACIN DE METALES EN MIELES

Instrumentos, reactivos y muestras

37

III.1.- INSTRUMENTACIN Y REACTIVOS

III.1.1.- Instrumentos
Espectrofotmetro de Absorcin Atmica, Varian-SpectrAA-600 con correccin de fondo Zeeman, equipado con un atomizador electrotrmico Varian y con inyector capilar. Para la atomizacin de la muestra se han empleado tubos de grafito piroltico THGA con y sin plataforma. Espectrofotmetro de Absorcin y Emisin Atmica con Llama Varian AA 10 Plus. Espectrofotmetro de Emisin con fuente de Plasma, Perkin Elmer, modelo Optima 4300 DV, equipado con nebulizadores ultrasnico y Low Flow cmara de spray ciclnica y Scout, inyectores de almina y cuarzo de diferentes dimetros. Horno de Mufla Obersal HD-230. Desecador CSN Simax. Balanza analtica Scaltec SBA 31 (Scaltec Instruments). Horno microondas Electrolux EME 235.

III.1.2.- Material
Lmparas de ctodo hueco Varian (Australia). Micropipetas Gilson y Kartell con puntas desechables. Material volumtrico de vidrio de calidad contrastada. Cubiletes de polietileno tipo Technikon de 1.5 mL. Tubos de grafito con y sin plataforma. Crisoles de porcelana. Bombas de baja presin de tefln.

38

Parte experimental

III.1.3.- Reactivos
Disoluciones patrones de Ni, Cr, Cu, Pb y Cd (1.000 0.002 g L-1) (Panreac, Barcelona). Disolucin patrn multielemental para ICP: ICP Multielemental standard solution IV CENTIPUR (1.000 0.002 g L-1) (Merck, Alemania). Disoluciones de Ni, Cr, Cu y Pb de 500 g L-1 obtenidas a partir de los patrones 1.000 g L-1 correspondientes. Disolucin de dihidrgenofosfato amnico del 1.0% (m/v), obtenida disolviendo la cantidad apropiada en agua ultrapura (Fluka, Suiza). Modificador de matriz de magnesio (Mg(NO3)22H2O) de 10.00.3 g L-1 en cido ntrico de 17% (Fluka Chemie, Suiza). Modificador de matriz de paladio (Pd(NO3)22H2O) de 10.00.3 g L-1 en cido ntrico de 15% (Fluka Chemie, Suiza). Disolucin de cido ntrico de 10% (v/v) preparado a partir de una disolucin del 65% (m/v) Suprapur (Merck, Alemania). Disolucin de perxido de hidrgeno 33% (m/v) (Panreac, Espaa). Disolucin de triton X-100 (p-1,1,3,3-tetrametilfenilter) de 1.0% obtenida a partir de una disolucin comercial pura (Merck, Alemania). Disolucin de cido clorhdrico 0.1 M preparado a partir de cido clorhdrico concentrado del 35% (p/v) (Panreac, Barcelona) Agua ultrapura de 18 Mcm-1 de resistividad especfica obtenida a partir de un sistema desionizador Milli-Q (Millipore, USA).

III.1.4.- Limpieza
Todo el material utilizado una vez lavado, fue enjuagado con agua ultrapura y se mantuvo en una disolucin de cido ntrico 10% (v/v) durante 48 horas. Pasado ese tiempo se volvi a lavar nuevamente con agua ultrapura, y una vez seco se almacen para su empleo.

Instrumentos, reactivos y muestras

39

Para la limpieza del capilar de muestreo del sistema de inyeccin se emple una disolucin de 0.7% (v/v) de cido ntrico y 0.2% (v/v) de triton X-100. Despus de cada inyeccin de muestra, el capilar se limpi haciendo pasar la mencionada disolucin durante 10 segundos.

III.2.- MUESTRAS
III.2.1.- Procedencia de las muestras
Las 40 mieles utilizadas en el presente trabajo son mieles artesanales producidas en la comunidad autnoma de Galicia. En todos los casos se trata de mieles multiflorales que no fueron sometidas a ningn tipo de tratamiento susceptible de alterar su composicin. Las muestras fueron suministradas por la Asociacin Lucense de Apicultura (APLA) y por la Agrupacin para o Desenvolvemento e Formacin do Sector Apcola Galego (AIE). Todas ellas fueron conservadas en recipientes de vidrio en la oscuridad y refrigeradas a 4 C.

III.2.2.- Preparacin de la muestra

III.2.2.1.- Miel diluida
En la determinacin directa de metales por ETAAS se emple una disolucin de miel al 20% (m/v), preparada disolviendo 2 gramos de cada muestra en agua ultrapura y enrasando a un volumen exacto de 10 mL. Estas disoluciones fueron preparadas diariamente con el fin de evitar la proliferacin de microorganismos y la floculacin a causa de la desnaturalizacin de protenas.

III.2.2.2.- Digestin en microondas

Con el fin de realizar una validacin de los mtodos directos, stos se compararon con un mtodo en el que se digiri previamente la miel en bombas de tefln de baja presin utilizando energa de microondas. Para ello, en primer lugar se acondicionaron las bombas con cido ntrico

40

Parte experimental

concentrado, aclarndolas tres veces con agua ultrapura. A continuacin se pesaron en ellas 0.6 g de muestra a los que se aadi 1 mL de HNO3 (2.5% m/v), se introdujeron en el horno de microondas a 600 W durante 37 segundos. Despus se dej enfriar la mezcla a temperatura ambiente y se aadieron 425 L de H2O2 (30% m/v) y 575 L de agua ultrapura (1 mL de H2O2 al 12.7% m/v), calentando de nuevo durante 37 segundos a la misma potencia. El digerido se dej enfriar y se llev a un volumen exacto de 5 mL obteniendo as una disolucin al 12% (m/v) en miel.

III.2.2.3.- Cenizas
La determinacin de metales mayoritarios se realiz sobre la miel calcinada con el procedimiento del mtodo oficial1. Para la calcinacin de la miel se comenz por acondicionar los crisoles de porcelana y llevarlos a peso constante. Sobre cada uno de ellos se pesaron de forma exacta 2 gramos de miel y se sometieron previamente a una temperatura de 100 C para proceder a secarlo. En todo momento el proceso estuvo vigilado para evitar prdidas por formacin de espuma o rebosamiento. La calcinacin se complet en horno de mufla a 550 C hasta peso constante de las cenizas (en general entre 12-14 horas). Las cenizas obtenidas se disolvieron en 2 mL de HCl 0.1 M y se llevaron a un volumen exacto de 10 mL. Sobre estas disoluciones de trabajo se procedi a la determinacin de metales mayoritarios mediante ICP-AES.

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

41

III.3.1.- DETERMINACIN DE CADMIO EN MIEL MEDIANTE ETAAS

III.3.1.1.- Introduccin
El cadmio es un metal pesado que se encuentra de forma natural en la corteza terrestre. Es un metal blando, dctil y maleable, de color blanco azulado y poco abundante. Su estado de oxidacin ms comn es el Cd (II)1. En la naturaleza est presente como xido, sulfuro y carbonato en menas de otros metales como plomo, cinc y cobre2. Se estima que entre 25.000 y 30.000 toneladas de cadmio son vertidas al medioambiente cada ao. De ellas la mitad se deben a la erosin de rocas, incendios forestales y actividad volcnica. El cadmio emitido por la actividad humana se calcula entre 4.000 y 13.000 toneladas2, destacando el uso de combustibles fsiles como fuente principal, aunque tambin se pueden citar otras como el desprendido en fundiciones, la incineracin de basura domstica, aguas residuales y algunos fertilizantes fosforados3. El cadmio produce efectos txicos en los organismos vivos, an en concentraciones muy pequeas. La ingestin de altas dosis es causa de severas irritaciones de estmago, vmitos y diarrea, y su inhalacin causa graves afecciones pulmonares4. Cuando se absorbe en pequeas dosis es transportado al hgado donde se une con ciertas protenas y se acumula posteriormente en el rin, causando en ste graves daos en el mecanismo de filtracin5. Puede adems causar disfuncin pulmonar y daos seos6. Recientes investigaciones han demostrado que es un elemento mutagnico al inhibir el proceso de reparacin de errores genticos, catalogndose como cancergeno7. La exposicin al cadmio por parte de los humanos se debe en primer lugar al hbito de fumar, en segundo a su ingesta en la dieta y por ltimo a actividades profesionales8. La organizacin mundial de la salud (OMS) a travs del Codex Alimentarius, ha establecido las cantidades mximas de

42

Parte experimental

cadmio permitidas en ciertos tipos de alimentos, que en ningn caso superan los 0.2 mg Kg-1 como puede verse en la Tabla 49. Adems, la OMS ha cuantificado la ingestin semanal tolerable en 7 g de Cd por Kg de peso corporal8.
Tabla 4.- Niveles mximos de cadmio para algunos alimentos9 segn Codex Alimentarius. Alimento Fruta Vegetales, excluyendo vegetales frondosos, verduras frescas, tallos y races, tomates y mondas de patatas Mondas de patata, tallos y races, menos nabos Vegetales frondosos, hierbas frescas, setas y nabos Cereales y legumbres, excluyendo salvado, germen y grano de trigo, arroz, soja y cacahuetes Granos de trigo y arroz, incluidos salvados y germen Soja y cacahuetes Carne de vacuno, pollo, cerdo y ovino Carne de caballo Hgado de vacuno, ovino, pollo y cerdo Rin de vacuno, ovino, pollo y cerdo Crustceos, excluida langosta y cangrejo Moluscos Nivel mximo (mg Kg-1) 0.05 0.05 0.1 0.2 0.1 0.2 0.2 0.05 0.2 0.5 1.0 0.5 1.0

Por todo lo expuesto, se deduce que conocer la concentracin de este elemento en alimentos es una prioridad y a ello se han dedicado numerosos investigadores, empleando un variado conjunto de tcnicas. En los ltimos tiempos los mtodos basados en la fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP) son de los ms utilizados por su carcter multielemental y su alta sensibilidad. Destacan aquellas aplicaciones basadas en ICP-MS10,11,12 ya que, debido a las bajas concentraciones en que se encuentra el cadmio en ciertos alimentos13, mediante ICP-AES no se alcanza a medirlo sin preconcentracin14. Tambin es necesaria una etapa de concentracin previa para medirlo mediante espectrometra de absorcin atmica con llama (FAAS), as Godoi y col.15 han empleado una columna on line con cido hmico para concentrar cadmio y determinarlo en aguas de consumo. Tambin se ha probado a aumentar la sensibilidad en esta tcnica empleando

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

43

un tubo de cuarzo que hace permanecer durante ms tiempo los tomos del analito en el paso de luz, pero en trabajos como el de M. Yaman16 no alcanzaron LOD menores de 4 ng mL-1, insuficientes para medir la concentracin de cadmio en miel. Las tcnicas potenciomtricas y voltamperomtricas tambin han sido empleadas con el propsito de medir varios metales en alimentos y entre ellos el cadmio, as Sancho y col.17 usaron la voltametra de pulso diferencial con redisolucin andica para cuantificarlo en pulpa de remolacha. Tokusoglu y col.18 han determinado cadmio en leche y derivados mediante polarografa de pulso diferencial, pero con peores LOD que el que se consigue mediante espectrometra de absorcin atmica con atomizacin electrotrmica. ETAAS es la tcnica ms habitual a la hora de analizar cadmio en alimentos6,13,19,20,21 , ya que su alta sensibilidad permite determinar este elemento en las bajas concentraciones en que se encuentra normalmente en alimentos. En ocasiones, incluso es necesario preconcentrar la muestra antes de introducirla en el tubo de grafito usando columnas on line con diferentes rellenos22,23,24, lo que conlleva tambin una reduccin de las interferencias. En otros trabajos como el de Grinshtein y col. la concentracin y reduccin de interferencias se consigui empleando una doble vaporizacin25. Como el cadmio es un elemento muy voltil que puede perderse a temperaturas superiores a los 200 C26, es necesario el empleo de modificadores qumicos que permitan carbonizar la matriz sin prdidas de analito. En ciertos trabajos publicados acerca de la determinacin de cadmio en diferentes matrices se estudia el uso de los modificadores ms comunes entre los que destacan el Pd27, Pd-Mg6,21,28 y el NH4H2PO46, aunque en los ltimos aos se estn imponiendo los modificadores permanentes, que adems de estabilizar al analito, prolongan la vida til del tubo de grafito29. Entre estos destacan W, Rh, Ir, Ru; Pd y mezclas de ellos3, 29. Se encuentran en la bibliografa publicaciones en las que adems de modificadores permanentes se usaron Pd-Mg26 o NH4H2PO419, para asegurar una mayor retencin de cadmio en las etapas previas a la atomizacin.

44

Parte experimental

En este trabajo se desarrollaron tres mtodos mediante ETAAS susceptibles de proceder a la medida del contenido de cadmio en mieles. Dos de ellos fueron mtodos directos sin previo tratamiento de la muestra y empleando los modificadores Pd-Mg y NH4H2PO4; y un tercero se llev a cabo sobre un digerido de miel con Pd-Mg como modificador. Los dos primeros estn basados en el trabajo de Vias y col.30 pero introduciendo diseo de experimentos como herramienta de optimizacin, con el fin de mejorar la sensibilidad, tan necesaria para llegar a detectar cadmio en alguna de las muestras de miel analizadas. Adems al igual que estos autores se usa el perxido de hidrgeno como oxidante para ayudar a destruir la matriz orgnica, pero para potenciar su accin tambin se incluy HNO3. As mismo se emple un surfactante (triton X-100) con el fin de conseguir una perfecta deposicin de la muestra dentro del tubo de grafito y alcanzar con ello una mayor reproducibilidad en las medidas.

III.3.1.2.- Optimizacin
III.3.1.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cadmio mediante ETAAS usando paladio-magnesio como modificador de matriz
En este mtodo, como su nombre indica, se us como modificador qumico una disolucin de paladio y magnesio en cido ntrico. Esta mezcla de modificadores es hoy en da considerado como modificador universal31, ya que el Pd estabiliza al analito formando especies intermetlicas y el magnesio acelera este proceso, formando con el analito pequea gotas32. Para la optimizacin de un mtodo de anlisis mediante ETAAS los parmetros a optimizar son numerosos, porque adems de los propios de la cmara de grafito hay que estudiar las concentraciones de distintos reactivos (oxidantes, modificadores, surfactante, etc.). Para poner a punto el mtodo se realiz, en primer lugar un cribado de factores (screening), con el fin de conocer cuales son estadsticamente significativos en la seal de absorbancia. Se utiliz para ello un diseo Plackett-Burman, que permite

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

45

evaluar el efecto de 8 factores en 13 experimentos (12 ms un punto central). Aqu no se han incluido los tiempos de rampa y de permanencia que fueron tomados de las numerosas experiencias previas realizadas que permitieron concluir, que su efecto no era significativo. Los valores altos y bajos de cada factor estudiado estn expuestos en la Tabla 5.
Tabla 5.- Niveles mnimos y mximos de los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman, para el mtodo de determinacin de Cd en miel mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin [HNO3] [H2O2] [Pd] [Mg] [Triton X-100] Abreviatura T-sec T-min T-atom [HNO3] [H2O2] [Pd] [Mg] [T X-100] Valor mnimo 110 600 1400 0.65 1 65 5 0.01 Valor mximo Unidades 500 900 1700 1.5 25 3000 3000 0.10 C C C % % mg L-1 mg L-1 %

Como se puede comprobar en la Figura 6, la concentracin de triton X-100 y las temperaturas de mineralizacin y atomizacin, son los factores ms influyentes en la seal analtica.
[T X-100] T-min T-atm [Pd] T-sec [Mg] [HNO3] [H2O2] 0 1 2 3 4

+ -

Figura 6.- Carta pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cd en miel mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador.

46

Parte experimental

Los factores fueron estudiados en dos grupos con el fin de que el nmero de experimentos fuera realizable en una sola jornada, despreciando as las posibles interacciones entre los tres primeros y los tres siguientes. Para ello, en primer lugar, se us un diseo composicional central 23 + estrella, el cual permite construir las superficies de respuesta, realizando 16 experimentos, y analizar as los mejores valores para obtener la mxima seal. Los resultados obtenidos para estos tres primeros son los que se comentan a continuacin. La concentracin de triton X-100 elegida es del 0.02%, que proporciona la mejor respuesta como puede verse en la Figura 7.
T-atom= 1500 C
T X-100 = 0.02 v/v

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.02 0.04

800 700 600 0.06 500

T-min (C)

[T X-100] (%v/v)

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 2000 0.00 1600 500 600 700 800 900 1200 T-atom(C)

rea

rea

T-min (C)

Figura 7.- Efecto de la temperatura de mineralizacin, de la concentracin de triton X-100 y de la temperatura de mineralizacin sobre la seal analtica.

En cuanto a la temperatura de mineralizacin, se puede observar en la misma grfica que hasta alcanzar los 650 C, el decaimiento de la seal es casi nulo, a partir de ah la pendiente se hace fuertemente negativa, as que sta es la temperatura que se eligi (la mxima que no produce prdida de seal). La temperatura de atomizacin de 1500 C se presenta como ptima para maximizar la respuesta (Figura 7). Las concentraciones de paladio, de magnesio, de cido ntrico, de perxido de hidrgeno y la temperatura de secado tambin han sido optimizadas, mediante un diseo experimental. Este proceso se llev a cabo mediante un diseo de menor resolucin (25-1 + estrella) por tener estos factores escasa influencia sobre el valor de la respuesta. En la Figura 8 se observa claramente que para los modificadores, paladio y magnesio, las concentraciones ptimas son 2400 y 500 mg L-1 respectivamente (adems

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

47

esta concentracin de magnesio consigue un pico ms estrecho y elevado). El efecto del perxido fuertemente negativo por eso se eligi una concentracin mnima que, sin prdida de seal (inferior al 10%), asegure la oxidacin de la matriz. La concentracin de cido ntrico que produjo los mejores resultados fue la comprendida entre 1.0 y 2.0%, escogindose el valor de 1.0%, ya que condiciones ms suaves contribuyeron a prolongar la vida til del tubo de grafito. La temperatura de secado ptima fue 135 C. Algunos de los factores no evaluados mediante diseos de experimentos (tiempos de rampa y de permanencia) fueron tomados de la bibliografa y de experiencias previas y comprobados de manera univariante, una vez optimizados los anteriores. Procedimiento Para llevar a cabo las medidas mediante este mtodo el procedimiento empleado fue el siguiente: Se tomaron 500 L de la disolucin de miel (20% m/v) y se le aadieron 100 L de HNO3 (10% m/v), 20 L de triton X-100 (1% v/v), 12 L de H2O2 (30% m/v) y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin fueron inyectados 12 L en el sistema de atomizacin junto con 9 L de disolucin de Mg (500 mg L-1) y 9 L de disolucin de Pd (2400 mg L-1). La longitud de onda utilizada fue 228.8 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 10 mA. El flujo de Ar fue siempre de 3.0 L min-1, excepto en la etapa de lectura en que se corta con el fin de no arrastrar el analito atomizado y mejorar as la sensibilidad. En Tabla 6 se muestran las concentraciones ptimas y el programa de la cmara de grafito para el mtodo puesto a punto.
rea
T-sec = 135 C, [H2O2] = 1.2 % v/v, [HNO3] = 1.0% m/v

de

hidrgeno

fue

siempre

0.119 0.115 0.111 0.107 0.103 0.099

1.0 1.4 1.8

2.2

[Pd] g L-1

0.8 0.4 0.0 2.6 3.0 [Mg] g L-1

Figura 8.- Efecto de la concentracin de los modificadores en la seal analtica

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Parte experimental

Tabla 6.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cd mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador de matriz. [Pd] (mg L-1) 2400 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [Mg] (mg L-1) 500 Temperatura (C) 135 650 1500 2400 [H2O2] (% v/v) 1.2 Rampa (s) 10 25 0.4 0 Permanencia (s) 20 50 2.5 2.5 [HNO3] (% m/v) 1.0 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 [Triton X-100] (% v/v) 0.020 Lectura No No Si No

III.3.1.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cadmio en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz
En este mtodo directo se emple el dihidrgenofosfato amnico como modificador, ya que, tanto el fosfato como el cido fosfrico son habitualmente modificadores empleados en el anlisis de elementos como cadmio y plomo31 al formar con ellos compuestos (fosfatos) estables. El modificador incrementa su efectividad en forma de sal amnica, ya que ayuda a eliminar las interferencias de ciertos haluros; por tanto, su funcin es doble, por una parte estabilizar al analito y por otra convertir las sustancias interferentes en compuestos ms voltiles que son eliminables en la etapa de mineralizacin33. Sin embargo, el uso de dihidrgenofosfato amnico presenta el inconveniente de las elevadas concentraciones de esta sal que es necesario introducir en el atomizador, lo que en ocasiones, es fuente de diversas interferencias. Tambin en este caso, se realiz un estudio previo de factores para conocer cuales de ellos presentaban mayor influencia en el anlisis de cadmio mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador. Para ello, se aplic un diseo Plackett-Burman, evaluando 10 variables a optimizar en

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

49

trece experimentos realizados. Se estudiaron tambin los tiempos de rampa y de permanencia para disponer de una mayor informacin del sistema. Los valores mximos y mnimos para cada factor estudiado se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman, para el mtodo de determinacin de Cd en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz. Variable Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades 120 400 5 10 1 10 0.1 1 0.01 0.01 400 900 25 40 10 40 1.0 20 0.20 0.10 C C s s s s % % % %

T-sec Temperatura Secado T-min Temperatura Mineralizacin Ramp-sec Rampa Secado Perm-sec Permanencia Secado Ramp-min Rampa Mineralizacin Perm-min Permanencia Mineralizacin [HNO3] [HNO3] [H2O2] [H2O2] [NH4H2PO4] [NH4H2PO4] [T X-100] [Triton X-100]

Observando la Figura 9, puede comprobarse que los tres factores ms importantes son la temperatura de mineralizacin, la de secado y la concentracin de modificador, los cuales fueron escogidos para ser estudiados mediante un diseo composi23 + cional mentos. central
T-min T-sec [NH4H2PO4] [H2O2] Perm-min [T X-100] Ramp-sec [HNO3] Ramp-min Perm-sec 0 1 2 3 4 5 + -

Figura 9.- Carta pareto para los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cd en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz.

estrella, en 16 experi-

50

Parte experimental

Los intervalos de estudio fueron modificados, ya que, segn la informacin obtenida en el cribado de factores alguno de los valores ptimos se encontraba en el lmite de los intervalos. Al observar la superficie de respuesta (Figura 10) que se obtuvo del estudio de las temperaturas de secado y mineralizacin y de la concentracin de modificador se comprob
analtica
rea
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 400 500 600 700 T-sec = 200 C

800 9001000

0.1 0.0

0.3 0.2

T-min (C)

[NH4H2PO4] (% m/v)

que temperaturas de minera- temperatura de mineralizacin en la seal lizacin superiores a 600 C

Figura 10.- Efecto del modificador y de la

produjeron prdida de seal. Se seleccion este valor como el adecuado (el mayor que provoca una prdida de seal inferior al 10%). Para el modificador se encontr un valor ptimo de concentracin para el 0.2% y como temperatura de secado se escogi el valor ms bajo de los estudiados (105-300 C), ya que condujo a un completa evaporacin del disolvente sin provocar prdida de seal analtica. Las concentraciones de cido ntrico, perxido de hidrgeno y de triton X-100 fueron estudiadas de forma univariante, sus valores ptimos fueron 1.0, 20 y el 0.02%, respectivamente. Se ha considerado siempre, que el perxido de hidrgeno comercial (30% m/v), era un reactivo puro. En cuanto a los tiempos de rampa, valores de 15 s para secado y 1 s para mineralizacin fueron los ms idneos, segn lo obtenido tras el estudio univariante. Tiempos de permanencia de 40 s para secado, y de 50 s para mineralizacin condujeron a una mejor respuesta reduciendo adems la seal de fondo. Procedimiento Para llevar a cabo las medidas de cadmio en miel mediante este mtodo el procedimiento empleado fue el siguiente. Se tomaron 250 L de la disolucin de miel (20%) y se mezclaron con 20 L de triton X-100 (1% v/v), 200 L de H2O2 (30% m/v), 100 L de HNO3 (10% m/v), 200 L de

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

51

NH4H2PO4 y todo ello levado a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se inyectaron 30 L en el sistema de atomizacin. En la Tabla 8 se resumen las concentraciones ptimas de reactivos y el programa de temperaturas utilizado. La longitud de onda utilizada fue 228.8 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 10 mA.
Tabla 8.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cd en miel mediante ETAAS usando NH4 H2PO4 como modificador de matriz. [NH4 H2PO4] (% m/v) 0.20 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [H2O2] (% v/v) 20 Temperatura (C) 105 600 1100 2000 [HNO3] (% m/v) 1.0 Rampa (s) 20 1.0 0.3 0 [Triton X-100] (% v/v) 0.020 Permanencia Flujo Ar (s) (L/min) 40 50 2.5 3.0 3 3 0 3 Lectura No No Si No

III.3.1.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cadmio en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra
El pretratamiento de la muestra en alimentos y muestras biolgicas es un paso usualmente requerido con el fin de destruir la materia orgnica y romper as los enlaces que existen entre sta y los distintos metales34. En los aos 60 y 70, la incineracin seca de la muestra fue uno de los tratamientos ms empleados y como FAAS era la nica tcnica utilizable, este procedimiento cumpla sobradamente con las exigencias requeridas para anlisis de metales traza35. Ms tarde con el empleo de ETAAS, este tratamiento de la muestra se convirti en una fuente de interferencias, sobre todo cuando se empleaban sales como tetraetilborato, carbonato sdico, etc. La incineracin fue entonces sustituida por las digestiones cidas, tanto en recipientes abiertos (con reflujo) como en recipientes cerrados (bajo

52

Parte experimental

presin), estos ltimos con la ventaja de evitar las prdidas de analitos voltiles. Desde finales de los aos 80 se emplean sistemas de digestin cida asistida por microondas y llevada a cabo bajo presin. Este mtodo de preparacin reduce el tiempo de mineralizacin y tiene eficacia contrastada en la destruccin de la materia orgnica36, adems disminuye el valor de los blancos y reduce el consumo de reactivos, presentando la posibilidad de ser automatizado. Quiz el mayor inconveniente sea la necesidad de optimizar cuidadosamente el proceso para cada matriz a analizar. Existen antecedentes en la bibliografa de procedimientos de digestin asistida por microondas aplicados a la miel37,38,39, comparaciones con otros pretratamientos de la muestra40,41 y comparaciones con mtodos en los que simplemente se diluye en agua42. En el presente trabajo, con el fin de llevar a cabo la determinacin de cadmio en los digeridos de miel mediante ETAAS, se procedi a la optimizacin del mtodo. En primer lugar, se optimizaron los parmetros que afectan a la digestin de la muestra, mientras que en segundo lugar se pusieron a punto los valores ptimos de los parmetros propios de la determinacin por ETAAS. III.3.1.2.3.1.- Optimizacin de los parmetros de digestin Para la puesta a punto del procedimiento de la digestin en microondas se escogi un tamao de muestra acorde con el volumen de las bombas de baja presin (0.5 gramos de miel) y se procedi a optimizar el tiempo total de digestin y las concentraciones de los reactivos (cido ntrico y perxido de hidrgeno). El proceso se dividi en dos etapas de igual duracin, en la primera de ellas se aadi 1 mL de cido ntrico de distintas concentraciones y en la segunda 1 mL de perxido de hidrgeno de distintas concentraciones. La optimizacin se llev a cabo mediante un diseo composicional central 23 + estrella, con valores mnimos del 0% para el cido ntrico y perxido de hidrgeno y mximos del 5 y 30%,

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

53

respectivamente. El tiempo total fue ensayado entre 50 y 150 segundos (dividido en dos etapas). Como puede observarse en la Figura 11, un tiempo total de
rea
0.14 0.13 0.12 0.11 0.10 50 70 15 30 90 110 130 0 150 H2O2 (% m/v) HNO3 = 2.25% (m/v)

74 segundos, una concentracin del 12.5% (m/v) de perxido de hidrgeno y del 2.5% (m/v) de cido ntrico, condujeron a una ptima digestin de la miel para la posterior cadmio. cuantificacin de

Tiempo total (s)

Figura 11.- Efecto del tiempo de digestin y de la concentracin de oxidantes en la seal de absorbancia al medir Cd en el digerido de miel mediante ETAAS.

III.3.1.2.3.2.- Optimizacin de los parmetros de la cmara de grafito y concentracin de modificadores en el mtodo de digestin previa A continuacin, una vez que las condiciones de digestin fueron optimizadas, se procedi al estudio de los parmetros de la cmara de grafito y de las concentraciones del modificador de matriz. En este caso se emple como modificador el paladio-magnesio, pues estos modificadores estabilizan mejor al cadmio en los digeridos que el NH4H2PO4, segn lo comprobado en estudios previos. Para averiguar que factores influyen significativamente en el proceso de atomizacin se us un diseo Plackett-Burman con el que se estudiaron 9 factores en 13 experimentos completamente aleatorizados. En este diseo se han introducido las rampas y permanencias, consiguiendo as un diseo asequible. Los valores mximos y mnimos para cada factor se muestran en la Tabla 9. Como se puede observar en la carta pareto (Figura 12), la temperatura de atomizacin fue el factor ms influyente. No obstante, se tomaron tambin los 2 siguientes, para la construccin de la superficie de respuesta con el fin de tener una mayor informacin del sistema a estudiar.

54

Parte experimental

Tabla 9.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de cadmio en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin Rampa secado Permanencia. Secado Rampa Mineralizacin Permanencia Mineralizacin [Pd] [Mg] Abreviatura T-sec T-min T-atom Ramp-sec Perm-sec Ramp-min Perm-min [Pd] [Mg] Valor mnimo Valor mximo 105 400 1000 5 10 5 10 500 0 200 800 2000 30 40 30 40 3000 3000 Unidades C C C s s s s mg L-1 mg L-1

En la construccin de las superficies de respuesta se utiliz un diseo composicional central 23 + estrella, estudiando en l la temperatura de atomizacin, el tiempo de permanencia de mineralizacin y la temperatura de secado. Realizados los 16 experimentos y una vez introducidos en el diseo, se observ que la
Perm-min = 25 s 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 1000

T-atom Perm-min T-sec T-min Perm-sec [Pd] [Mg] Ramp-min Ramp-sec 0 2 4 6 8 10

+ -

Figura 12- Carta pareto para los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cd en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra.

temperatura 1600 C

de (vase

atomizacin Figura 13),

present un mximo muy claro a

rea

mientras que la temperatura de

180 140 2000 100 T-sec (C)

secado, apenas influye en todo el intervalo (105-200 C). Para este factor se seleccion la temperatura de 105 C, la cual permite un

1500

T-atom (C)
Figura 13.- Efectos de las temperaturas de secado y atomizacin en la seal analtica.

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

55

suave, pero completo secado del disolvente. El tiempo de permanencia de mineralizacin tambin present poca influencia, aunque valores altos (entre 25 y 30 s), fueron los que condujeron a mejores resultados. El valor del siguiente factor en importancia (segn la Figura 12), la temperatura de mineralizacin, se optimiz de manera univariante y el resultado se muestra en la Figura
0.120

14. El valor ptimo fue 650 C.

rea

0.110 0.100 0.090 0.080 0.070 0.060 400 450 500 550 600 650 700 750 800

Para la concentracin de los modificadores se comprob que los mejores resultados

-1

se

obtuvieron con 2500 mg L para el Pd y 500 mg L-1 para el Mg, igual que sucedi en el mtodo directo. Procedimiento

T-min (C)

Figura 14.- Efecto de la temperatura de mineralizacin en la seal analtica.

Para llevar a cabo la digestin de las muestras de miel, en bombas de baja presin ayudada con energa de microondas, se tomaron 0.5 g de miel, se aadi 1 mL de HNO3 al 2.5% (m/v) y se someti a una potencia de 600 W durante 37 s. Despus se enfriaron las bombas y se aadi H2O2 al 12.5% m/v, sometiendo de nuevo a una potencia de 600 W durante el mismo tiempo (37 s). El digerido obtenido se llev a un volumen final de 5 mL. Para llevar a cabo la determinacin de cadmio por este mtodo, se tomaron 850 L de la muestra digerida (12% m/v en miel) y se llevaron a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se tomaron 12 L que fueron inyectados en el sistema de atomizacin conjuntamente con 9 L de disolucin de Mg (500 mg L-1) y 9 L de disolucin de Pd (2400 mg L-1), aplicando el programa de temperaturas expuesto en la Tabla 10.

56

Parte experimental

Tabla 10.- Valores ptimos del programa de temperaturas de la cmara de grafito para la determinacin de Cd en miel mediante ETAAS con digestin previa usando paladio-magnesio como modificador. Etapa Temperatura (C) Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza 105 650 1600 2400 Rampa Permanencia (s) 10 7 0.4 0 (s) 40 25 2.5 2.5 Flujo de Ar (L/min) 3 3 0 3 No No S No Lectura

La longitud de onda utilizada para la lectura fue 228.8 nm con un ancho de rendija de 0.5 nm y una intensidad de corriente de la lmpara de 10 mA.

III.3.1.3.-Caractersticas desarrollados

analticas

de

los

mtodos

III.3.1.3.1.- Rectas de calibrado y adicin

Las medidas de rea de pico se transformaron en concentraciones haciendo uso de las rectas de calibrado y adicin, estas ltimas se emplearon cuando fue necesario corregir los efectos de matriz. La recta de calibrado, para la determinacin de cadmio, se obtuvo preparando disoluciones de concentraciones 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g L-1 de cadmio en los tres mtodos. Para la recta de adicin, a cada disolucin de 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g L-1 preparada con el patrn de cadmio se aadieron 500 L de disolucin acuosa de miel (20 % m/v) en el mtodo del Pd y 250
L de esta disolucin en el mtodo de dihidrgenofosfato amnico,

llevndolos a un volumen final de 1 mL. En el mtodo de digestin previa se tomaron 850 L del digerido (0.12% m/v), se aadieron las cantidades equivalentes de patrn y se llev a 1 mL con agua ultrapura. Los valores obtenidos para las rectas de calibrado y adicin se pueden observar en las Tablas 11, 12 y 13 y su representacin grfica en las Figuras 15, 16 y 17.

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

57

Tabla 11.- Rectas de calibrado y adicin ([Cd] g L-1). Mtodo del Pd-Mg.
rea

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.0 0.5 1.0 Calibrado Adicin 1.5 2.0

Calibrado [Cd] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Absorbancia 0.007 0.064 0.120 0.172 0.228 [Cd] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Adicin Absorbancia 0.017 0.079 0.128 0.187 0.233

A=0.110[Cd]+0.008 r2 =0.9997

A=0.109[Cd]+0.019 r2=0.9968

Figura 15.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del Pd-Mg.

Tabla 12.- Rectas de calibrado y adicin ([Cd] g L-1). Mtodo del NH4H2PO4. Calibrado [Cd] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Absorbancia 0.015 0.088 0.156 0.215 0.282
2

0 .35 0 .30 0 .25 0 .20 0 .15 0 .10 0 .05 0 .00 0 .0 0 .5 1 .0 C lib do A icin a ra d 1 .5 2 .0

[Cd] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Absorbancia 0.036 0.115 0.189 0.260 0.327 r2=0.9990

A=0.134[Cd]+0.017 r =0.9992

A =0.148[Cd]+0.036

Tabla 13.- Recta de calibrado y adicin ([Cd] g L-1). Mtodo de digestin previa. Calibrado [Cd] 0.0 1.0 1.5 2.0 Absorbancia 0.001 0.095 0.150 0.200 [Cd] 0.0 1.0 1.5 2.0 Adicin Absorbancia 0.005 0.102 0.159 0.209

rea

Adicin

Figura 16.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del NH4H2PO4.

0.25 0.20

rea

0.15 0.10 0.05 0.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Calibrado Adicin

A=0.100[Cd]-0.000 r2 =0.9990

A=0.103[Cd]+0.005 r2=0.9969

Figura 17.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo de digestin previa.

58

Parte experimental

Al comparar las pendientes de las rectas de calibrado y adicin estadsticamente con un test t para un nivel de significacin del 95%, se comprob que las dos pendientes en el mtodo de dihidrgenofosfato difieren significativamente. Por este motivo se entiende que existe efecto matriz, por lo que en este caso debern de calcularse las concentraciones sobre la recta de adicin. En el mtodo del paladio-magnesio y en el de digestin previa este mismo test reflej que las pendientes son comparables, por lo que en este caso las medidas se realizarn directamente en la recta de calibrado correspondiente.

III.3.1.3.2.- Recuperacin de los mtodos

Aunque algunos autores43 estn trabajando para elaborar un material de referencia que permita evaluar el contenido de cadmio en miel, todava no se halla disponible por lo que la exactitud de los mtodos se evalu a travs de la recuperacin analtica. La recuperacin se estudi aadiendo concentraciones de cadmio de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g L-1 a una misma muestra de miel y calculando la cantidad recuperada segn la Ecuacin 1. Los resultados, que muestran una recuperacin aceptable, se recogen en la Tabla 14.
Tabla 14.- Recuperacin analtica obtenida para los distintos mtodos desarrollados RECUPERACIN (%) Mtodo Pd -Mg [Cd]aadido g L-1 0.5 1.0 1.5 2.0 Total Recuperacin (%) 102.1 104.4 100.9 98.20 101.4 Mtodo NH4H2PO4 Recuperacin (%) 106.8 103.4 100.9 98.30 102.4 Mtodo Digestin previa Recuperacin (%) 99.60 101.9 97.90 100.6 100.0 Ecuacin 1

Recuperacin =

[analito] encontrado 100 [analito] aadido

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

59

III.3.1.3.3.- Precisin de los mtodos

Para llevar a cabo el estudio de la precisin de los mtodos desarrollados, se prepararon disoluciones de miel con concentraciones aadidas de 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g L-1 de cadmio. Para cada disolucin se midieron 10 rplicas y se calcularon los coeficientes de variacin de acuerdo con la Ecuacin 2. En la Tabla 15 se pueden observar los resultados obtenidos para cada uno de los mtodos desarrollados.
Tabla 15.- Coeficientes de variacin obtenidos a los distintos niveles de concentracin estudiados para los distintos mtodos de determinacin de Cd en miel mediante ETAAS. Mtodo Pd-Mg Serie 1 (0.0 g L-1) Mtodo Digestin previa Mtodo NH4H2PO4 Ecuacin 2
RSD (%) = SD X media 100

xmedia SD
RSD (%)

0.12 0.0099
8.3

0.81 0.089
11

0.20 0.0068
3.4

Serie 2 (1.0 g L )
-1

xmedia SD
RSD (%)

1.04 0.069
6.7

1.02 0.022
2.2

0.93 0.050
5.4

Serie 3 (1.5 g L-1)

xmedia SD
RSD (%)

1.51 0.049
3.3

1.94 0.019
1.0

1.41 0.069
4.9

Serie 4 (2.0 g L )
-1

xmedia SD
RSD (%)

1.96 0.140
7.1

1.95 0.039
2.0

1.86 0.039
2.1

En todas las series se obtuvieron coeficientes de variacin inferiores al 10 %, excepto para el nivel de concentracin menor en el mtodo de digestin previa en el que debido a un mayor tratamiento de la muestra, existi una mayor variabilidad. No obstante, se puede concluir que los mtodos optimizados presentaron una repetitibilidad aceptable.

60

Parte experimental

III.3.1.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados
Dentro de las caractersticas analticas de los mtodos se evaluaron los lmites de deteccin (LOD) y cuantificacin (LOQ), as como la masa caracterstica (mo). El LOD se define, segn la IUPAC44, como la concentracin mnima de analito que puede ser detectada y diferenciada del blanco con un determinado nivel de probabilidad. Se calcula a partir de la Ecuacin 3, en donde k vale 3 para un nivel de significacin del 99.7%. El lmite de cuantificacin, definido como aquella concentracin mnima del analito que puede ser determinada cuantitativamente, se calcula a partir de la Ecuacin 4 y en este caso k vale 10 para un nivel de confianza del 99.7%.
Ecuacin 3
LOD = k SD m

k y k= factores estadsticos escogidos de acuerdo con el nivel de confianza establecido. SD = desviacin estndar de las medidas del blanco. m = pendiente de la recta de calibrado y adicin.

Ecuacin 4
LOQ = k 'SD m

La masa caracterstica (mo), expresada en pg, se define como aquella cantidad de analito que produce una absorbancia de 0.044 unidades45 y se calcul a partir de la Ecuacin 5.
Ecuacin 5 mo = V [Cd ] 0.0044 Amuestra Ablanco

V = volumen de muestra inyectado. [Cd] = concentracin de Cd en g L-1. Amuestra = absorbancia de la muestra. Ablanco = absorbancia del blanco.

Para su determinacin se construyeron las rectas necesarias de concentraciones 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g L-1, realizando 3 rplicas de cada una y midindolas por duplicado. La masa caracterstica media para cada mtodo, el LOD y el LOQ se muestran en la Tabla 16.

Mtodos de determinacin de Cd mediante ETAAS

61

Tabla 16.- Valores de LOD, LOQ y mo para los diferentes mtodos de determinacin de Cd en miel desarrollados. Pd-Mg mo ( pg) LOD ( ng g-1) LOQ ( ng g-1) NH4H2PO4 Digestin previa

1.1 0.54 1.8

0.72 0.31 1.0

1.3 0.39 1.3

Los valores de LOD obtenidos mejoran sensiblemente los publicados por Tadda y col. (1 ng g-1)46 que proponen un mtodo mediante ETAAS con digestin previa de la miel usando nitrato magnsico como modificador. As mismo tambin se produce una mejora con respecto al expuesto por Vias y col.30 para un mtodo directo en el que se emple NH4H2PO4 como modificador (1.2 ng g-1). Tambin la mo presenta un menor valor que el obtenido usando modificadores permanentes como W, Rh, Ir, Ru (0.9 pg) o mezclas de ellos W-Rh, W-Ir, W-Ru (0.8 pg)3 en el anlisis de digeridos de diversos materiales (carbones, sedimentos, etc.). De los tres mtodos evaluados se comprob que el que utiliza NH4H2PO4 como modificador de matriz es el que mejor LOD, LOQ y mo presenta. Esto concuerda con lo expuesto por Correia y col.6 que obtienen una mejor mo usando dihidrgenofosfato amnico (1.85 pg) que usando PdMg (2.20 pg) en muestras de alimentos digeridas en microondas.

III.3.1.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos

Los mtodos optimizados fueron comparados estadsticamente entre si, midiendo 7 rplicas de una misma muestra por cada uno de los tres mtodos. Observando la tabla ANOVA (Tabla 17), se comprob que el valor p, del test F, es mayor que 0.05, con lo que se concluy que no existe una diferencia estadstica significativa entre las medias de los valores aportados por cada mtodo, para un nivel de confianza del 95%. Si se realiza un chequeo de la varianza se comprueba que no existe diferencia estadstica entre los valores de las desviaciones estndar de los datos de cada columna, para un nivel de confianza del 95%, aunque el mtodo del

62

Parte experimental

dihidrgenofosfato presente una menor variabilidad como se puede ver en el diagrama de cajas (Figura 18).
Tabla 17.- Tabla Anova. Fuente de variabilidad SC gl CM F0
Digestin previa

Diagrama de cajas

Entre mtodos 0.1433 Dentro de cada 1.4958 mtodo Total

2 18 20

0.0716 0.86 0.0831

NH4H2PO4

Pd-Mg 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4

1.6391

[Cd] (ng g-1 )

P = 0.4389 SC: Suma de cuadrados gl: grados de libertad CM: cuadrados medios

Figura 18.- Diagrama de cajas para lo tres mtodos estudiados

III.3.1.5.- Conclusin
Se desarrollaron tres mtodos para la determinacin de cadmio en miel mediante ETAAS. Dos de estos mtodos fueron mtodos directos en los que el nico tratamiento de la muestra fue la simple dilucin en agua ultrapura (20% m/v). En estos dos mtodos se ensayaron dos modificadores habituales en el anlisis de cadmio: el Pd-Mg y el NH4H2PO4. En el tercer mtodo la muestra fue digerida previamente con cido ntrico y perxido de hidrgeno, en bombas de baja presin y con ayuda de la energa de microondas. En este mtodo se us como modificador el Pd-Mg. Los tres mtodos condujeron a resultados estadsticamente comparables, pero el mtodo directo que usa NH4H2PO4 como modificador present mejor LOD, mejor mo y menores desviaciones estndar de las medidas de una misma muestra (Figura 18). Este mtodo present, as mismo, mejor sensibilidad que los mtodos propuestos por Vias30 y Taddia46 para anlisis de miel por ETAAS. Por ello y ante la necesidad de una sensibilidad extrema a la hora de medir alguna de las muestras, se eligi este ltimo para cuantificar cadmio en mieles artesanas de Galicia, a pesar de tener que medir la concentracin en las rectas de adicin.

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

63

III.3.2.- DETERMINACIN DE PLOMO EN MIEL MEDIANTE ETAAS

III.3.2.1.- Introduccin
El plomo es un metal grisceo, dctil y fcilmente maleable y que funde a baja temperatura (327 C) emitiendo vapores txicos. En la naturaleza se encuentra mayoritariamente como sulfuro de plomo (galena)1. Antropognicamente el plomo es emitido a la atmsfera por plantas de produccin de energa, por pinturas que tienen como base este metal y sobre todo por automviles que consumen gasolinas que incluyen el tetraetilplomo como antidetonante47, aunque hoy en da este combustible est cayendo en desuso. Tambin hay que hacer mencin a la contaminacin por el uso de este metal como municin y en acumuladores y bateras48. El plomo es un metal txico que se acumula en los seres vivos y que provoca graves dolencias que van desde anorexia, irritabilidad y malestar hasta dolores abdominales que pueden conducir al coma o a la muerte49. Tambin afecta al sistema hematopoytico, renal y nervioso50. En nios esta acumulacin puede producir deficiencias mentales4 y es un grave problema en numerosos pases51, ya que los infantes absorben mayor cantidad de plomo y son ms sensibles a sus efectos6. Dado que el 80% de la ingestin de plomo en humanos se produce a travs de dieta49, organismos oficiales como la FAO/WHO ha establecido la ingestin diaria tolerable de plomo en 50 g por Kg de peso corporal para adultos y 25 g para nios y jvenes50. Es por ello de gran relevancia el conocimiento de sus niveles en los distintos tipos de alimentos17. La espectrometra de absorcin atmica con llama (FAAS), ha sido muy empleada para medir este elemento en diferentes matrices. Aunque es una tcnica rpida y sencilla, debido a su baja sensibilidad se han tenido que ingeniar distintas modificaciones como tubos de cuarzo o de nquel que hacen permanecer durante ms tiempo los tomos en el paso de luz16,52,

64

Parte experimental

columnas para retener y preconcentrar al analito15 o preconcentracin offline usando agentes quelatantes53, con el fin de conseguir determinar este

elemento. Para el anlisis de plomo en alimentos una las tcnicas ms empleadas es la espectrometra de absorcin atmica con cmara de grafito6,20,21,50,54,55,56,57,58, debido a la sencillez de la instrumentacin empleada, a un coste aceptable y a su disponibilidad en multitud de laboratorios, adems de ser una de las tcnicas ms sensibles. Sin embargo, presenta inconvenientes como el de su carcter monoelemental y la necesidad de emplear modificadores qumicos adecuados, correctores de fondo y una cuidadosa optimizacin de tiempos y temperaturas con el fin de eliminar las mltiples interferencias qumicas y espectrales, que restan sensibilidad y llevan a medidas errneas25. Adems la determinacin de elementos voltiles (como el plomo) mediante ETAAS est sujeto a dificultades debidas a las prdidas de analito durante las etapas previas a la atomizacin. Con el fin de minimizar las interferencias qumicas y mejorar la exactitud y precisin, habitualmente se utilizan condiciones STPF, que involucran el uso de plataforma, tubos pirolticos, absorbancia integrada, correctores de fondo y modificadores qumicos50,59. Entre estos modificadores destaca el uso de muchas sales metlicas y algunos compuestos orgnicos, por ejemplo NH4H2PO46,30,60, Pd-Mg21,28,61, Pd-Ycido actico50, Pd-Sr62, Mo-Pd, Pd-Pt, Pd-W49, Pd-NH4NO355, etc. Otros autores se inclinan por tcnicas multielementales y de alta sensibilidad como ICP-MS10,11,12 o ICP-AES con nebulizador ultrasnico13 para la determinacin de Pb en diversas matrices. Aunque en la mayor parte de los casos, estas tcnicas necesitan un tratamiento previo de la muestra con los consecuentes problemas de tiempo, esfuerzo, coste y posible prdida de analito y contaminacin. Incluso algunos autores recurren a una preconcentracin previa a la determinacin por ICP-AES con el objetivo de conseguir la sensibilidad necesaria63. Tambin entre las tcnicas empleadas para la determinacin de plomo conjuntamente con otros metales se encuentran la potenciometra de

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

65

redisolucin voltametra

andica64,

de

redisolucin

galvanoplstica65,
18

la

17,37,66

y la polarografa de pulso diferencial , que presentan

lmites de deteccin comparables a los de ETAAS65. En el presente captulo se procedi al desarrollo de tres mtodos, que mediante ETAAS permiten la determinacin de plomo en muestras de miel utilizando condiciones STPF. Dos de estos mtodos no requieren tratamiento previo de la muestra usando Pd-Mg y NH4H2PO4 como modificadores de matriz, y un tercer mtodo que incluye una etapa previa de digestin en microondas y posterior medida por ETAAS, usando Pd-Mg como modificador. El inters de este estudio radica en el nmero reducido de trabajos en los que se propone la determinacin de plomo mediante esta tcnica en miel y matrices similares (como azcar). Los mtodos existentes suelen incluir etapas previas como la digestin en microondas que propone Taddia y col.46 o la fermentacin previa con levaduras propuesta por N. J. Miller67. En otro trabajo previo, P. Vias y col.30 optimizaron un mtodo directo para el anlisis de plomo en miel por ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador pero, la sensibilidad alcanzada no fue suficiente para medir ciertas muestras. Este hecho puede deberse al uso de la longitud de onda de 283.3 nm (menos sensible que la empleada en este trabajo: 217 nm) a la que ciertos compuestos de fsforo y oxgeno interfieren incluso usando como corrector de fondo Zeeman57.

III.3.2.2.- Optimizacin
III.3.2.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de plomo en miel mediante ETAAS usando paladio-magnesio como modificador de matriz
Con el fin de desarrollar un estudio preliminar acerca de los factores que presentan mayor influencia en la determinacin de Pb en miel mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador, se utiliz un diseo PlackettBurman de 8 factores en 13 experimentos. En la Tabla 18 se encuentran los factores evaluados as como los niveles mximos y mnimos estudiados.

66

Parte experimental

Estos valores fueron elegidos de acuerdo con experiencias previas y teniendo en cuenta lo publicado en la bibliografa30,68.
Tabla 18.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Pb en miel mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador de matriz. Variable [Pd] [Mg] [H2O2] [HNO3] [TritonX-100] Temperatura Secado Temperatura mineralizacin Temperatura atomizacin Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[Pd] [Mg] [H2O2] [HNO3] [T X-100] T-sec T-min T-atom

500 500 0.3 0.1 0.01 100 400 1100

2000 2000 9.9 2.0 0.1 200 900 2000

mg L-1 mg L-1 % % % C C C

Como

puede

verse en la Figura 19, la temperatura de atomizacin es el factor que presenta una mayor influencia en la respuesta de la seal. El

T-atom H2O2 T-min T-sec [Mg] [HNO3] [Pd] [T X-100] 0 1 2 3 4

+ -

efecto de este factor travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de junto con la concen- determinacin de Pb en miel mediante ETAAS usando PdMg como modificador.

Figura19.- Carta pareto para los factores estudiados a

tracin de perxido de hidrgeno y la temperatura de mineralizacin, que son los siguientes factores en importancia, fueron estudiados por medio de un diseo composicional central 23 + estrella, en 16 experiencias. En la Figura 20 se representa la superficie de respuesta para las temperaturas de mineralizacin y atomizacin. Como se observa, la seal del plomo aumenta ligeramente al aumentar la temperatura de mineralizacin, alcanzando el mximo a 950 C. Para la temperatura de atomizacin, la seal aumenta de manera ms significativa, y para este caso el mximo de absorbancia se logr a 1850 C. Con estos valores se consigui la eliminacin de la matriz durante la etapa

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

67

de mineralizacin y la completa atomizacin del plomo. La adicin de perxido de hidrogeno aument la seal ligeramente, siendo el 15 % la concentracin ptima observada. A pesar de tener menor influencia en la seal analtica, las concentraciones del paladio, fueron tambin optimizadas por medio de un diseo composicional central 23 + estrella, con el fin de conocer con exactitud las concentraciones ptimas de
rea
H2O2 = 15.0% (v/v)
0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 1500 1600 1700

nitrato magnesio, y cido ntrico

1800 1900 2000

1200 1000 800 600 T-min (C)

T-atom (C)

Figura 20.- Efecto de la temperatura de mineralizacin y atomizacin en la seal analtica.

los modificadores. La superficie de respuesta obtenida se muestra en la Figura 21. Las concentraciones ptimas fueron 2000 mg L-1 para paladio y nitrato magnsico. El efecto de paladio en la seal respuesta es ligero, y sta disminuye para concentraciones mayores de 2000 mg L-1. La seal del analito aument con la concentracin de cido ntrico hasta alcanzar un mximo para una concentracin de cido de 1.25 %.
[Mg] = 2000 g L-1

La seal est pobremente afectada por la temperatura de secado, siendo la menor de las estudiadas (105
2.0 1.0

0.069

rea

0.065 0.061 0.057 0.053

C) la que proporcion los mejores resultados. Esta etapa fue optimizada que no de manera existieron univariante, adems comprobndose

1.0 1.4 1.4 2.2 2.6 3.0 0.0 HNO (% m/v) 3 -1

[Pd] g L

Figura 21.- Efecto de las concentraciones de Pd y HNO3 en la seal analtica.

prdidas por salpicaduras debido a temperatura excesiva o a un calentamiento rpido. Se adicion triton X-100 con el fin de lograr la apropiada cada de la muestra dentro del tubo. A pesar de que el aumento de la concentracin de triton X-100 tiene un efecto negativo en la seal, la concentracin usada fue

68

Parte experimental

la cantidad mnima (0.01%) que, produciendo una adecuada deposicin de la gota, asegur la reproducibilidad de la seal. Bajo las condiciones anteriormente optimizadas se estudiaron (univariantemente) los tiempos de rampas y permanencia. Un tiempo alto de permanencia de secado y de mineralizacin fueron necesarios para asegurar el completo secado de la muestra y separar la matriz de miel antes de la atomizacin. Las rampas de secado y mineralizacin ofrecieron mejores resultados con valores bajos, 10 s para cada una. El tiempo de rampa de atomizacin es el mnimo que permite el instrumento, como indican los manuales de cmara de grafito59 y resaltan algunos autores como Stalikas y col.61 que indican que en esta crtica etapa es deseable un rpido calentamiento con el fin de conseguir una mxima diferencia de temperatura entre el tubo y la plataforma y evitar as prdidas del analito y las interferencias de otras sustancias. Tambin fueron ensayadas las longitudes de onda de 217.0 y 283.3 nm comprobando que la primera ofrece mejores resultados para este mtodo, aumentando un 45% la seal de absorbancia, al no verse influenciada por las interferencias de sulfatos y fosfatos como explican Tahvonen y col57.
Procedimiento

Para llevar a cabo la determinacin de Pb en muestras de miel mediante el presente mtodo, se tomaron 500 L de la disolucin de miel (20% m/v) y se aadieron 125 L de HNO3 (10% m/v), 10 L de triton X100 (1% v/v), 150 L de H2O2 (30% m/v) y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin fueron inyectados 12 L en el sistema de atomizacin junto con 9 L de disolucin de Mg (2000 mg L-1) y 9 L de disolucin de Pd (2000 mg L-1). La longitud de onda utilizada fue 217.0 nm, la anchura de rendija de 1.0 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 5 mA. En la Tabla 19 se resumen las concentraciones ptimas de los reactivos y parmetros de la cmara de grafito.

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

69

Tabla 19.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Pb en miel mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador de matriz. [Pd] (mg L-1) [Mg] (mg L-1) [H2O2] (% v/v) [HNO3] (% m/v) Triton X-100 (% v/v)

2000
Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza

2000
Temperatura (C)

15
Rampa (s)

1.25
Permanencia (s)

0.010
Flujo Ar (L/min) Lectura

105 950 1850 2400

10 10 0.7 0

40 40 2.5 2.5

3 3 0 3

No No S No

III.3.2.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de plomo en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfafato amnico como modificador de matriz
Siguiendo el procedimiento habitual y con el fin de evaluar la influencia de los distintos factores que influyen en el proceso de anlisis del plomo usando dihidrgenofosfato amnico como modificador, se realiz un diseo Plackett-Burman en el que se estudiaron siete factores en 13 experimentos en un bloque simple totalmente aleatorizado. En la Tabla 20 se muestran los factores evaluados as como los niveles inferiores y superiores estudiados en cada caso.
Tabla 20.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Pb en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz. Variable Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[NH4H2PO4] [NH4H2PO4] [H2O2] [H2O2] [HNO3] [HNO3] [T X-100] [TritonX-100] T-sec Temperatura Secado T-min Temperatura mineralizacin T-atom Temperatura atomizacin

0.01 0.3 0.1 0.01 100 600 1300

0.5 9.9 2.0 0.10 200 1200 2000

mg L-1 % % % C C C

70

Parte experimental

Como puede verse en la Figura 22 los factores ms relevantes fueron la temperatura de mineT-min [T X-100] [HNO3] [NH4H2PO4] [T-atm] [H2O2] T-sec 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 + -

ralizacin, la concentracin de triton X-100 y el cido tres medio ntrico. factores de un Estos fueron por

optimizados

Figura 22.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Pb en miel usando NH4H2PO4 como modificador de matriz.

diseo composicional central 23 + estrella en 16 experimentos.

Al estudiar las superficies de respuesta se encontr que la seal disminuye para temperaturas de mineralizacin mayores a 700 C, por lo cual este valor ha sido elegido como ptimo (Figura 23), aunque es bastante menor que la empleada por Vias y col.30 para esta misma matriz y con el mismo modificador.
T X-100 = 0.01%(v/v)
[H2O2] = 30.0% (v/v)

0.12 0.10 0.08 0.04 0.02 0.00 400 500 600 700

2.0 1.0 800 9001000 0.0

T-min(C)

HNO3 (%m/v)

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 1000 1200 1300

rea

rea

0.2 0.1 1400 15001600 0.0

T-atom(C)

[NH4H2PO4] (% m/v)

Figura 23.- Efecto de la temperatura de mineralizacin y la concentracin de cido ntrico en la seal analtica.

Figura 24.- Efecto de la concentracin de la temperatura de atomizacin y la concentracin de NH4H2PO4 en la seal analtica.

En relacin a la concentracin de cido ntrico, se observ que una concentracin de cido ntrico de 0.85 % ofrece la mejor seal de absorbancia, concentraciones mayores dieron lugar a una disminucin de la respuesta de la seal. Para el triton X-100 se comprob que a concentraciones altas se produjo una disminucin de la seal, por ello se

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

71

emple la menor de las concentraciones (0.01%) que asegur una dispensacin adecuada de la muestra. Las concentraciones de dihidrogenofosfato amnico y perxido de hidrgeno tambin se optimizaron por medio de un diseo composicional central 23 + estrella, en el que tambin fue incluida la temperatura de atomizacin. Como se puede ver en la Figura 24, la concentracin de dihidrgenofosfato ptima que permiti la estabilizacin del plomo en la etapa de mineralizacin fue 0.1 % (m/v). La concentracin de perxido de hidrgeno ptima fue 30 % (v/v) (considerando como puro el reactivo comercial de 33% m/v), que aunque fue la mayor de las concentraciones estudiadas, se comprob a posteriori que concentraciones mayores no producan mejora alguna en la seal de absorbancia, adems concentraciones mayores producen un deterioro rpido del tubo de grafito, por lo que no son recomendables. Para la temperatura de atomizacin, el diseo proporcion un ptimo a 1300 C. En la siguiente etapa de optimizacin del mtodo tambin se aplic un diseo composicional central con el fin de encontrar los valores adecuados para el tiempo de permanencia de secado y mineralizacin, as como las correspondientes rampas. Los tiempos ptimos de permanencia en las etapas de secado y la mineralizacin fueron 25 y 30 segundos, respectivamente. El valor ptimo seleccionado para la rampa de mineralizacin fue 25 segundos. En cuanto a la rampa de secado, se observ que tiempos cortos produjeron mejores resultados, en este caso, 5 segundos fue el tiempo de rampa de secado elegido. Por ltimo se hizo una comprobacin de las dos longitudes de onda ms utilizadas para medir plomo mediante ETAAS (217.0 y 283.3). Se constat lo expuesto en la seccin II.3.2.2.1, observando que al usar 283.3 la mo pasa de 12.5 a 8.6 pg, disminuyendo as la sensibilidad. Esto corrobora lo expuesto por J. Y. Cabon69, que afirma que el valor del lmite de deteccin puede incrementarse el doble usando la lnea menos sensible (283.3 nm).

72

Parte experimental

Procedimiento

Para llevar a cabo la determinacin de plomo en miel mediante este mtodo se tomaron 250 L de la disolucin de miel (20%) y se mezclaron con 10 L de triton X-100 (1% v/v), 300 L de H2O2 (30% m/v), 85 L de HNO3 (10% m/v), 100 L de NH4H2PO4 y todo ello fue llevado a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se inyectaron 30 L en el sistema de atomizacin. La longitud de onda utilizada fue 217.0 nm, la anchura de rendija de 1 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 5 mA. En la Tabla 21 se resumen las concentraciones ptimas de reactivos y parmetros de la cmara de grafito.
Tabla 21.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Pb en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz. [H2O2] % (v/v) [HNO3] % (m/v) [triton X-100] % (v/v) [NH4H2PO4] % (m/v)

30
Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza

0.85
Temperatura (C) Rampa (s)

0.01
Permanencia (s)

0.1
Flujo Ar (L/min) Lectura

105 700 1300 2600

5 25 0.3 0

25 30 3.0 2.0

3 3 0 3

No No S No

III.3.2.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de plomo en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra
Al igual que en el captulo anterior, para llevar a cabo la determinacin de plomo en los digeridos de miel por ETAAS, se optimizaron los parmetros considerados en dos etapas. En una primera etapa se optimizaron los parmetros de digestin y despus se optimizaron los parmetros propios de la determinacin por ETAAS.

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

73

III.3.2.2.3.1.- Optimizacin de los parmetros de digestin

Para optimizar el proceso de digestin cida de la miel mediante energa de microondas se procedi en primer lugar a introducir 0.5 gramos de muestra en las bombas de baja presin. Se ensay el tiempo total de digestin en dos etapas de igual duracin, introduciendo en la primera de ellas 1 mL de cido ntrico de distintas concentraciones y en la segunda 1 mL de perxido de hidrgeno de distintas concentraciones. La optimizacin se llev a cabo mediante un diseo composicional central 23 + estrella, con valores mnimos del 0% para el cido ntrico y perxido de
0.069 0.066 0.063 0.060 0.057 0.054 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Tiempo total = 74 s

hidrgeno y mximos del 5 y 30% respectivamente. El tiempo total se ensay entre 30 y 140 segundos. Como puede observarse en la Figura 25, una concentracin de cido ntrico del 2.5%
rea

30 15 5.0 0

H2O2 (% m/v)

[HNO3] (% m/v)

Figura 25.- Efecto de la concentracin de oxidantes en la seal de absorbancia al determinar Pb en el digerido de miel mediante ETAAS.

(m/v) y una del 12.5% (m/v) de perxido de hidrgeno consiguen una ptima digestin de la miel para la subsiguiente medida de Pb mediante ETAAS. El tiempo total ptimo es 74 segundos. Estas condiciones coinciden con las encontradas para cadmio, lo que hace pensar que son condiciones inherentes al tipo de muestra y al medio empleado, y no al analito a medir.
III.3.2.2.3.2.- Optimizacin de los parmetros de la cmara de grafito y concentracin de modificadores en el mtodo de digestin previa

La influencia de los distintos factores que afectan al proceso de atomizacin del analito en el digerido de miel, se ha estudiado mediante un diseo Plackett-Burman. Los factores evaluados as como los niveles inferiores y superiores empleados en cada caso, se muestran en la Tabla 22. En un bloque simple totalmente aleatorizado se analizaron 9 factores en 13 experimentos. Se introdujeron en el diseo los tiempos de rampa y de

74

Parte experimental

permanencia para tener ms informacin del sistema, ya que, en este caso no se sobrepasan los 11 factores que pueden ser estudiados en este tipo de diseo descrito en la seccin 1.7.2.2.
Tabla 22.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Pb en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Variable [Pd] [Mg] Temperatura Secado Temperatura mineralizacin Temperatura atomizacin Rampa secado Permanencia secado Rampa mineralizacin Permanencia mineralizacin Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[Pd] [Mg] T-sec T-min T-atom Ramp-sec Perm-sec Ramp-min Perm-min

500 500 100 400 1100 5 10 10 10

2000 2000 200 900 2000 30 50 40 40

mg L-1 mg L-1 C C C s s s s

En la Figura 26, se muestra la carta pareto resultante del Diseo Plackett-Burman para los nueve factores estudiados. Hay cinco factores que influyen significativaT-atom [Pd] [Mg] Perm-sec Ramp-sec Perm-min T-min Ramp-min T-sec 0 4 8 12 16 + -

mente en la seal del plomo y que son: la temperatura de atomizacin, la concentracin de paladio, la concentracin de magnesio y los tiempos de rampa y permanencia de secado. La tempe-

Figura 26.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman, para el mtodo de determinacin de Pb en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra.

ratura de atomizacin y las concentraciones de Pd y Mg fueron estudiados mediante un diseo composicional central 23 + estrella con 16 experiencias.

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

75

La

temperatura

de
[Pd] = 1000 L-1

atomizacin tiene un efecto claro en la seal, tal como se aumentando respuesta temperatura al de la seal aumentar de la
rea

puede apreciar en la Figura 27,

atomizacin,

0.086 0.076 0.066 0.056 0.046 0.036 1600 1700 1800 1900

700 500
2000 2100 300 [Mg] ( L-1)

T-atom (C)

hasta llegar al valor mximo correspondiente a una temperatura de 1850 C.

Figura 27.- Efecto de la temperatura de atomizacin y la concentracin de magnesio en la respuesta.

El efecto del paladio y el magnesio es ms ligero en el intervalo

Perm-min = 20 s

estudiado.

En

el

caso

del

paladio, el ptimo se encuentra

0.069 0.066 0.063 0.060 0.057 0.054

rea

en la concentracin de 1000 mg L-1. Para el magnesio la

40 0 5 10 15 20 25 30 0 Perm-sec (s) 20

seal aumenta ligeramente al aumentar la concentracin de ste, encontrndose el ptimo para la concentracin de 700

Ramp-sec (s)

Figura 28.- Efecto de los tiempos de rampa y permanencia de secado sobre la seal analtica.

mg L-1 concentracin a partir de la cual empieza a disminuir lentamente, como ya se puso de manifiesto en el cribado de factores y se comprob univariantemente. Se han estudiado mediante un diseo composicional central 23+ estrella los tiempos de permanencia de secado y de mineralizacin, as como la rampa de secado. En la Figura 28, se puede observar que tiempos cortos de rampa y permanencia de secado consiguen la perfecta eliminacin del disolvente. Los mejores valores son 5 y 10 segundos, respectivamente. La mineralizacin requiere tiempos mayores, de 25 y 40 segundos para rampa y permanencia.

76

Parte experimental

Procedimiento

Para llevar a cabo la digestin de las muestras de miel con energa de microondas, se tomaron 0.5 g de miel, se aadi 1 mL de HNO3 al 2.5% (m/v) y se someti a una potencia de 600 W durante 37 s. Despus se enfriaron las bombas y se aadi H2O2 al 12.5% m/v, sometiendo de nuevo la disolucin a una potencia de 600 W durante el mismo tiempo (37 s). El digerido se llev a un volumen final de 5 mL. Para realizar la determinacin de Pb en miel por este mtodo se tomaron 850 L de la muestra digerida (12% m/v en miel) y se llevaron a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin el capilar tom 12 L que inyect en el sistema de atomizacin conjuntamente con 9 L de disolucin de Mg (700 mg L-1) y 9 L de disolucin de Pd (1000 mg L-1). Esta muestra as inyectada fue sometida al programa de temperaturas expuesto en la Tabla 23. La longitud de onda utilizada fue 217 nm, la anchura de rendija de 1 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 5 mA.
Tabla 23.- Valores ptimos del programa de temperaturas de la cmara de grafito para la determinacin de Pb en miel mediante ETAAS con digestin previa usando paladio-magnesio como modificador. Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza Temperatura (C) Rampa (s) Permanencia (s) Flujo Ar (L/min) Lectura

105 820 1850 2600

5 25 0.3 2

10 40 3 0

3 3 0 3

No No S No

III.3.2.3.-

Caractersticas

analticas

de

los

mtodos

desarrollados
III.3.2.3.1.- Rectas de calibrado y adicin
La calibracin instrumental para el mtodo directo de determinacin de plomo mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador, as como para el mtodo de la digestin previa se llev a cabo en el rango de 0.0 a 6.0 g L-1 (en niveles de concentracin 0.0, 2.0, 4.0, y 6.0 g L-1). En todos los

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

77

casos las calibraciones se realizaron en disolucin acuosa y sobre matriz de miel. Las ecuaciones obtenidas para las rectas de calibrado y adicin se recogen en las Tablas 24, 25 y 26, y se hallan representadas en las Figuras 29, 30 y 31.
Tabla 24.- Rectas de calibrado y adicin ([Pb] g L-1). Mtodo del Pd-Mg.
rea
0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0 2 4 6 8 10

Calibrado

Adicin

[Pb]

Absorbancia

[Pb]

Absorbancia

0.0 0.014 0.0 0.024 2.0 0.035 2.0 0.046 4.0 0.056 4.0 0.067 6.0 0.081 6.0 0.094 A=0.0112[Pb]+0.013 A=0.0117[Pb]+0.023 r2 =0.9982 r2=0.9993
Tabla 25.- Rectas de calibrado y adicin ([Pb] g L-1). Mtodo del NH4H2PO4. Calibrado Adicin

[Pb] (g L-1) Calibrado Adicin

Figura 29.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del Pd-Mg.
0.12 0.10 0.08

rea

[Pb]

Absorbancia

[Pb]

Absorbancia

0.06 0.04

0.0 0.004 1.0 0.012 2.0 0.020 4.0 0.039 A=0.009[Pb]+0.004 r2 =0.9977

0.0 0.027 1.0 0.045 2.0 0.062 4.0 0.104 A=0.019[Pb]+0.026 r2=0.9975

0.02 0.00 0 1 2
[Pb] (g L

3
-1

Calibrado Adicin

Figura 30.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del NH4H2PO4.

Tabla 26.- Rectas de calibrado y adicin ([Pb] (g L-1). Mtodo de digestin previa.
rea

0.14 0.12 0.10

Calibrado

Adicin

0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7

[Pb]

Absorbancia

[Pb]

Absorbancia

0.0 0.009 0.0 0.014 2.0 0.039 2.0 0.055 4.0 0.069 4.0 0.094 6.0 0.098 6.0 0.130 A=0.0149[Pb]+0.009 A=0.0194[Pb]+0.015 r2 =0.9999 r2=0.9992

[Pb] (g L-1) Calibrado Adicin

Figura 31.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo de digestin previa.

78

Parte experimental

La comparacin de las pendientes de las rectas de calibrado y adicin para el mtodo que usa como modificador el NH4H2PO4 (test t con un nivel de significacin del 95%) y para el mtodo de digestin previa fue indicativo de un ligero pero significativo efecto de la matriz. Por esta razn y con el fin de obtener resultados exactos, las muestras fueron analizadas en el modo de adiciones estndar cuando se us el dihidrgenofosfato amnico como modificador o cuando se emple el mtodo de las muestras previamente digeridas. El empleo de rectas de adicin en el mtodo que opera sobre digeridos de miel concuerda con lo expuesto por Taddia y col.46 que indican que para corregir la prdida de sensibilidad debida a la corrosin de las superficies pirolticas por el exceso de HNO3 y H2O2 es necesario el empleo de rectas de adicin, siendo ms acusado este efecto a medida que los tubos se van deteriorando. En el mtodo directo del Pd-Mg, la comparacin de las pendientes para las grficas de calibrado y adicin mostr la ausencia de efectos significativos de la matriz. As, la calibracin directa con soluciones estndar puede aplicarse en el anlisis de plomo en mieles usando este modificador.

III.3.2.3.2.- Recuperacin de los mtodos

Como ya se indic anteriormente (vase seccin III.3.1.3.2), debido a la inexistencia de un material de referencia certificado con el contenido de metales en miel, la exactitud de los mtodos propuestos fue evaluada a travs de la recuperacin analtica en una muestra de miel adicionada con 2.0, 4.0, 6.0 g L-1 de Pb. Las recuperaciones analticas obtenidas para los diferentes mtodos se encuentran en la Tabla 27. Los resultados muestran una recuperacin aceptable para los mtodos propuestos muy prxima al 100%.

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

79

Tabla 27.- Recuperacin analtica obtenida para los distintos mtodos de determinacin de Pb en miel por ETAAS desarrollados. RECUPERACIN (%) Mtodo Pd -Mg [Pb]aadido g L-1 2.0 4.0 6.0 Total Recuperacin (%) Mtodo Digestin previa Recuperacin (%) [Pb]aadido g L-1 1.0 2.0 3.0 Total Mtodo NH4H2PO4 Recuperacin (%)

99.1 99.4 99.8 99.4

99.0 101 100 99.9

101 99.1 101 100

III.3.2.3.3.- Precisin de los mtodos

La precisin fue estudiada usando disoluciones de miel a las que se le adicionaron cantidades diversas de plomo (0.0, 2.0, 4.0 y 6.0 g L-1 para el mtodo de Pd-Mg y digestin previa y 0.0, 1.0, 2.0 y 3.0 g L-1 para el mtodo de NH4H2PO4).
Tabla 28.- Coeficientes de variacin obtenidos a los diferentes niveles de concentracin estudiados para los distintos mtodos de determinacin de Pb en miel mediante ETAAS. Mtodo Pd- Mg Digestin previa Mtodo NH4H2PO4

Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (2.0 g L-1) Serie 3 (4.0 g L-1) Serie 4 (6.0 g L-1)

xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%)

1.4 0.088 6.3 2.0 0.12 6.0 4.0 0.16 3.9 6.0 0.22 3.6

1.3 0.13 9.9 2.2 0.18 8.0 4.2 0.19 4.7 6.3 0.27 4.4

Serie 1 (0 g L-1) Serie 2 (1 g L-1) Serie 3 (2 g L-1) Serie 4 (3 g L-1)

0.1 0.0087 8.7 1.0 0.066 6.6 2.0 0.12 6.1 3.0 0.17 5.7

Los resultados obtenidos sobre 10 determinaciones de cada disolucin se muestran en la Tabla 28, en la que se observa que ningn valor

80

Parte experimental

de la desviacin estndar relativa (RSD) es superior al 10%. Esto es indicativo de una buena repetitibilidad.

III.3.2.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados
Con el fin de seguir evaluando los mtodos desarrollados se calcularon los lmites de deteccin y cuantificacin, as como la masa caracterstica, de acuerdo con lo ya indicado en el apartado III.3.1.3.4. A la vista de los resultados obtenidos (vase Tabla 29) el mtodo que hace uso de Pd-Mg como modificador es el que mejor LOD, LOQ y mo, present.
Tabla 29.- Valores de LOD, LOQ y mo para los diferentes mtodos de determinacin de Pb en miel desarrollados. Pd-Mg(NO3)2 mo ( pg) LOD ( ng g-1) LOQ ( ng g-1) NH4H2PO4 Digestin previa

6.3 1.6 5.5

8.6 3.2 11

8.8 3.9 13

En un mtodo directo propuesto por otros autores en los que cuantifican plomo en miel mediante ETAAS30 usando dihidrogenofosfato amnico como modificador, el LOD alcanzado (1.4 ng mL-1, usando un 4% w/v de disolucin de miel) fue peor que el obtenido en el presente trabajo. El mtodo propuesto por Taddia y col.46 para analizar mieles mediante ETAAS con digestin previa de la muestra, tambin presenta peor LOD (13 ng g-1) y peor mo (13-16 pg). Las mejoras producidas en la sensibilidad pueden ser debidas a la optimizacin mediante diseo de experimentos que asegura las condiciones de determinacin idneas y al empleo de una longitud de onda ms sensible (217.0 nm frente a 283.3 nm) al no verse afectado ninguno de los mtodos por las interferencias que sta produce57. Considerando que la miel est formada en la mayor parte por glucosa y fructosa, el mtodo propuesto por Miller y col.67 para la determinacin de plomo en azcar presenta un LOD (0.9 ng g-1) mejor que el

Mtodos de determinacin de Pb mediante ETAAS

81

obtenido en este trabajo, en cambio la masa caracterstica es peor (12 pg), por lo que pensamos que en principio nuestro mtodo es ms sensible aunque presenta una mayor desviacin estndar de los blancos. Para otro tipo de matrices como pueden ser pescado H. Sue-Jean55 obtiene un LOD mucho ms alto (53-58 ng g-1), para huevos Z. Kilic49 tambin presenta un peor valor de mo (14.3 pg) y R. Milacic20 en distintos tipos de alimentos (coles, patatas, pescado...), obtiene un LOD de 200 ng g-1. Como puede comprobarse la sensibilidad de los mtodos optimizados es mejor que la publicada en bibliografa, lo que permiti cuantificar los niveles de Pb en todas las muestras analizadas.

III.3.2.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos

Los mtodos optimizados fueron comparados estadsticamente mediante los resultados obtenidos por cada uno de ellos al medir 7 rplicas muestra. de una Mediante misma un

Tabla 30.- Tabla Anova. Fuente de variabilidad SC gl CM F0

Entre mtodos Dentro de cada mtodo Total

P = 0.1517

2.0123 8.6319 10.6443

2 18 20

1.0062 0.4795

2.10

SC: Suma de cuadrados gl: grados de libertad CM: cuadrados medios

Cochran`s C test de varianzas (p = 0.23) se comprob que las desviaciones estndar de las medidas de cada columna son comparables para un nivel de confianza del 95%. Despus realizando un test ANOVA (Tabla 30), se comprob que el valor p (para una F 0 de 2.10) es mayor que 0.05, con lo que se puede concluir que no existe una diferencia estadstica significativa entre las medias de los valores aportados por cada mtodo, para un nivel de confianza del 95%, siendo comparables los 3 mtodos desarrollados.

82

Parte experimental

III.3.2.5.- Conclusin
Se desarrollaron tres mtodos de anlisis de plomo en miel, dos directos y un tercero con digestin previa en microondas, ensayando los modificadores habituales (Pd-Mg y NH4H2PO4). Aunque los tres condujeron a resultados semejantes, el mtodo directo que usa Pd-Mg como modificador es el que mejores caractersticas analticas present: mayor repetitibilidad y sensibilidad, y la posibilidad de realizar las medidas en las rectas de calibrado. Adems el mtodo de NH4H2PO4 presenta la desventaja adicional de proporcionar una gran seal de fondo, que segn B. Welz y col.59 se debe a la formacin de PO (g) en la etapa de atomizacin produciendo interferencias espectrales. El mtodo directo que usa Pd-Mg como modificador tambin mejora el LOD publicado por Vias y col.30 y por Taddia y col.46 para mtodos de anlisis de miel por ETAAS (comentado en seccin III.3.2.3.4), consiguiendo una mejor sensibilidad, la cual es necesaria para medir plomo en alguna de las muestras gallegas. Por lo expuesto, el mtodo directo que usa Pd-Mg como modificador fue el elegido para la medida del contenido de plomo en mieles de Galicia.

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

83

III.3.3.- DETERMINACIN DE COBRE EN MIEL MEDIANTE ETAAS

III.3.3.1.- Introduccin
El cobre es un elemento traza esencial para el ser humano70, ya que forma parte de numerosos enzimas imprescindibles para el metabolismo71, llegando su deficiencia, a provocar desrdenes como prdida de peso, anemia hipocrmica, problemas gastrointestinales, etc72. Como metal esencial, la OMS lo ha incluido en el listado de elementos qumicos con significacin para la salud humana y recomienda una ingesta mnima diaria de cobre para todas las personas. Segn distintos autores sta debe ser de 2-4 mg/da73 de 1-3 mg/da74. Sin embargo, en elevadas concentraciones, tambin puede ser un metal txico y perjudicial para la salud. Como efectos txicos principales, de forma aguda provoca hemlisis, neurosis heptica, hemorragias gastrointestinales, etc., en forma crnica puede producir irritacin de las vas respiratorias, alteraciones gastrointestinales y dermatitis por contacto75,76. El cobre se encuentra de forma natural en rocas y suelos, aunque debido a la accin del agua de lluvia y por la erosin puede hallarse tambin presente en ros, lagos y mares al ser arrastrado de las rocas por el agua. La emisin antropognica se debe a su empleo como conductor elctrico y trmico, aunque tambin es importante el impacto derivado de su uso como fungicida, empleado desde hace tiempo en agricultura. Son diversas las tcnicas que se han aplicado para la determinacin de este metal en alimentos, y as Caroli38, Bettinelli39, Fodor40, Packer77 hacen uso de la tcnica ICP-AES (Espectrometra de emisin atmica con fuente de plasma acoplado) y de la tcnica de ICP-MS (Espectrometra de masas con fuente de plasma acoplado), que presentan la ventaja de poder realizar anlisis multielementales, con adecuada sensibilidad. Otros autores han utilizado la espectrometra de fluorescencia de rayos-X78,79, que permite

84

Parte experimental

la determinacin multielemental en muestras slidas. Tambin ha sido empleadas tcnicas voltamperomtricas, tanto de redisolucin catdica37,80 como de redisolucin andica41 o potenciometra de redisolucin64. Hay trabajos en los que se recurre a la formacin de complejos fluorescentes y cuantificacin mediante espectrometra de fluorescencia81, e incluso a la preconcentracin mediante microextraccin en fase slida para poder medir mediante espectrometra de absorcin atmica con llama (FAAS)82. El cobre es un elemento que puede ser atomizado con facilidad y prcticamente no experimenta interferencias en la llama aire-acetileno59, por lo que cualquier preparacin de la muestra es vlida para cuantificarlo en alimentos mediante esta tcnica. Existen tambin multitud de ejemplos en la bibliografa en los que se determina Cu mediante ETAAS (Espectrometra de absorcin atmica, con atomizacin electrotrmica), puesto que, es posible la mineralizacin de la muestra a 1100 C sin uso de modificadores71,83,84. Incluso se ha llegado a determinar sin aplicar condiciones STPF71,13,30,85 (ver seccin I.6.1), aunque este punto haya sido puesto en entredicho por algunos autores84,86. ETAAS es la tcnica empleada de forma mayoritaria para medir este metal tanto en alimentos50,60,71,87, como en otras matrices83,85, ya que es relativamente econmica, sensible y est al alcance de cualquier laboratorio. De las referencias bibliogrficas consultadas, slo Vias y col.30 y M. Taddia y col.46 estudiaron el contenido de cobre en miel usando la tcnica ETAAS, empleando los primeros un mtodo directo y los segundos un mtodo con digestin previa en microondas. En este captulo, al igual que en los otros metales estudiados se optimizaron mtodos directos (con Pd-Mg y NH4H2PO4 como modificadores de matriz30,49,88) y uno indirecto (con digestin previa de la muestra haciendo uso de la energa de microondas) para la determinacin de cobre en mieles por ETAAS. Al igual que en los otros casos se hizo uso del cido ntrico y perxido de hidrgeno para facilitar la mineralizacin de la miel en el tubo de grafito y as evitar la formacin de residuos carbonosos en el mismo. Ante las discrepancias observadas en bibliografa sobre la necesidad de usar

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

85

condiciones STPF, se ensayaron tubos pirolticos con y sin plataforma. La optimizacin se llev a cabo usando diseo de experimentos, a travs del cual, no slo se han podido averiguar las condiciones ptimas para los distintos mtodos desarrollados, sino que se ha conseguido obtener unas condiciones intermedias que permitan medir otros metales (Cr y Ni) con el mismo programa de temperaturas y la misma concentracin de reactivos. Este nuevo mtodo conduce a un considerable ahorro de tiempo, de reactivos y de muestra.

III.3.3.2.- Optimizacin
III.3.3.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS en tubo de grafito con plataforma usando paladio como modificador de matriz
Se us un Diseo Plackett-Burman (ver seccin I.7.2.2) con el fin de evaluar los factores que influyen ms significativamente en la determinacin de cobre mediante ETAAS usando tubos de grafito con plataforma. Este diseo se realiz en un bloque simple totalmente aleatorizado de 9 factores en 13 experimentos. En la Tabla 31, se encuentra los factores evaluados as como los niveles mximos y mnimos estudiados en cada caso.
Tabla 31.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS en tubos de grafito con plataforma usando Pd como modificador de matriz. Variable [Pd] [Mg] [H2O2] [HNO3] [TritonX-100] Temperatura Secado Temperatura mineralizacin Temperatura atomizacin Permanencia mineralizacin Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[Pd] [Mg] [H2O2] [HNO3] [T X-100] T-sec T-min T-atom Perm-min

500 500 5 0.5 0.01 105 500 1800 10

3000 3000 20 15 0.05 300 1300 2500 40

mg L-1 mg L-1 % % % C C C s

86

Parte experimental

Estos valores fueron elegidos de acuerdo con experiencias previas y teniendo en cuenta los publicados en la bibliografa para otros mtodos anlogos. Como se puede observar en la carta pareto de la Figura 32 el factor ms influyente fue la temperatura de atomizacin, seguido de las concentraciones de cido ntrico, triton X-100 y paladio. De menor importancia son la temperatura de secado y mineralizacin, aunque su efecto
T-atom HNO3 [T X-100] [Pd] T-sec T-min Perm-min [Mg] H2O2 0 10 20 30 40

+ -

Figura 32.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS en tubo de grafito con plataforma usando Pd como modificador de matriz.

sigue siendo significativo.

T X-100 = 0.02% v/v
0.30 0.26 0.22 0.18 0.14 0.10

Por medio de un diseo composicional central 23 + estrella se llev a cabo la optimizacin de los tres primeros factores ms significativos: temperatura de atomizacin, concentracin de cido ntrico y concentracin de triton X-100. Una vez realizados los 16 experi-

rea

1.0 1.2 1.4 1.6 1.8

2.0

2600 2400 2200 T-atom(C)

[HNO3] (% m/v)

Figura 33.- Superficie de respuesta del efecto de la concentracin del cido ntrico y de la temperatura de atomizacin sobre la seal analtica.

mentos del diseo, cuya matriz se muestra en la seccin I.7.2.3, se han obtenido las superficies de respuesta que se pueden observar en la Figura 33. A la vista de las figuras se puede concluir que existe un ptimo claro para una concentracin de cido ntrico de 1.5 % (m/v) y una temperatura de atomizacin de 2400 C. El ptimo para el triton X-100 fue obtenido para una concentracin de 0.020 % (v/v). Se estudi tambin el efecto de los otros tres factores, temperatura de secado, temperatura de mineralizacin y concentracin de paladio, usando un diseo composicional central 23 + estrella. De este modo la optimizacin

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

87

de los 6 factores se realiz en dos etapas, con lo que no se pudieron evaluar las interacciones entre el primer y el segundo grupo, pero se consigui una matriz de experimentos realizable en una sola jornada de trabajo, evitando as los diseos en bloques que tengan en cuenta factores temporales como el desgaste del tubo de grafito. En la superficie de respuesta obtenida, se observ un aumento
T-sec = 105 C
0.18

progresivo de la seal con el incremento de la temperatura de mineralizacin hasta 700 C y con la concentracin de paladio hasta 1700 mg L-1, valores a partir de los cuales se produjo una disminucin de la seal analtica (Figura 34). La temperatura de secado

rea

0.16 0.14 0.12 1000 800 0.10 600 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 400 T-min (C)

[Pd] (g L-1)

Figura 34.- Superficie de respuesta del efecto de la temperatura de mineralizacin y la concentracin de paladio en la seal analtica.

ptima se encontr en la zona de bajas temperaturas, eligindose 105 C, con la que se alcanz la adecuada volatilizacin del disolvente sin provocar salpicaduras en el tubo de grafito. Para los otros factores que no fueron significativos, se tomaron como valores las aproximaciones resultantes del diseo Plackett-Burman, haciendo comprobaciones de manera univariante. Para los factores que no se estudiaron con el uso de diseo de experimentos, como los tiempos de rampa o algunos tiempos de permanencia, se han usado, los valores recomendados en el equipo. Una vez optimizadas las dems variables, se ha comprobado univariantemente la bondad de estos valores elegidos.
Procedimiento

Para llevar a cabo la determinacin de Cu en miel mediante este mtodo se tomaron 500 L de la disolucin de miel (20% m/v) y se aadieron 150 L de HNO3 (10% m/v), 20 L de triton X-100 (1% v/v), 200 L de H2O2 (30% m/v) y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De

88

Parte experimental

esta disolucin fueron inyectados 12 L en el sistema de atomizacin junto con 18 L de disolucin de Pd (850 mg L-1).
Tabla 32.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cu en miel mediante ETAAS en tubo de grafito con plataforma usando Pd como modificador de matriz. [Pd] (mg L-1) [Mg] (mg L-1) [H2O2] (% v/v) [HNO3] (% v/v) [Triton X-100] (% v/v)

1600

0
Temperatura (C)

20
Rampa (s) Permanencia (s)

1.5
Flujo Ar (L/min)

0.020

Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza

Lectura

105 730 2400 2600

10 10 0.7 0

20 10 2.5 2.5

3 3 0 3

No No S No

La longitud de onda utilizada fue 227.4 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 5 mA. En la Tabla 32 se muestran las concentraciones ptimas de los reactivos y parmetros de la cmara de grafito utilizadas en este mtodo.

III.3.3.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS en tubo de grafito sin plataforma empleando paladio como modificador de matriz
Se emple un diseo Plackett-Burman para establecer los factores significativos que influyen en la determinacin de cobre mediante ETAAS usando en este caso tubos pirolticos sin plataforma de Lvov. Se procedi como en el apartado anterior usando un diseo en un bloque simple en el que se evaluaron 9 factores mediante 13 experimentos. Los valores mximos y mnimos se seleccionaron en funcin de lo publicado por otros autores y segn las experiencias previas. En la Tabla 33 se observan los factores y los niveles estudiados

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

89

Tabla 33.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS en tubo de grafito sin plataforma usando Pd como modificador de matriz. Variable [Pd] [Mg] [H2O2] [HNO3] [TritonX-100] Temperatura Secado Temperatura mineralizacin Temperatura atomizacin Permanencia mineralizacin Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[Pd] [Mg] [H2O2] [HNO3] [T X-100] T-sec T-min T-atom Perm-min

0 0 5 0.5 0.01 105 500 1800 10

2000 1000 30 2 0.05 300 1300 2500 40

mg L-1 mg L-1 % % % C C C s

Realizados los 13 experimentos y obtenidos los resultados correspondientes, stos pueden representarse por medio de la carta pareto de la Figura 35, en la que se indica cules afectan de forma significativa a la determinacin de cobre (en tubo sin plataforma) utilizando paladio como modificador. Como
[HNO3] [T X-100] T-sec T-min [Pd] T-atom [H2O2] [Mg] Perm-min 0 1 2 3 4 5 + -

puede fueron

observarse,

cuatro los factores que afectan a la determinacin de cobre significativamente: la concentracin de cido ntrico, la concentracin de triton X-100, la temperatura de secado y la

Figura 35.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS en tubo de grafito sin plataforma usando Pd como modificador de matriz.

temperatura de mineralizacin. Los restantes factores estudiados no presentan una influencia significativa en el anlisis.

90

Parte experimental

Una vez determinados los factores significativos, se evaluaron los valores ptimos por medio de un diseo composicional central 2 + estrella en 26 Una experimentos,
rea
0.151 0.131 0.111 0.091 0.071 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 0.04 0.02 0.00
4

T- sec = 105 C, T-min = 900 C

obtenindose las superficies de respuesta. de ellas se muestra en la Figura 36. Se observa que el valor mximo de absorbancia se corresponde con una concen-

HNO3 (% m/v)

[T X-100 ] (% v/v)

Figura 36.- Superficie de respuesta del efecto de las concentraciones de cido ntrico y triton X-100 en la seal analtica.

tracin de cido ntrico de 0.75 % (m/v) y un 0.02 % (v/v) de triton X-100. Concentraciones mayores o menores a estos valores provocaron una disminucin de la seal. En Figura 37 se constat que para temperaturas de secado bajas se obtuvieron mejores valores de absorbancia, mientras que para la temperatura de mineralizacin, valores altos produjeron resultados ms adecuados. Los valores ptimos fueron 105 C para la temperatura de secado y 900 C para la de mineralizacin. Debido a
HNO3 = 0.66%, T X-100 = 0.02%

que el extremo superior del intervalo estudiado de la temperatura de mineralizacin coincidi con el ptimo, se estudi la posteriormente de de forma univariante el efecto de temperatura mineralizacin confirmndose el valor obtenido de 900 C. como valores ptimos las

0.14 0.13 0.12 0.11 0.10 800 0.09 600 100 120 140 160 180 200 400 T-min (C)

rea

T-sec (C)

Figura 37.- Superficie de respuesta del efecto de las temperaturas de secado y mineralizacin en la seal analtica.

Para los factores que no fueron significativos al llevar a cabo el diseo Plackett-Burman se tomaron aproximaciones recomendadas por el programa al realizar este diseo y se verificaron posteriormente de manera univariante. Para los factores que no se estudiaron mediante diseo de experimentos, como los tiempos de rampa o

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

91

algunos de permanencia, se usaron en principio, los recomendados en el equipo, y una vez optimizadas las dems variables, se comprobaron univariantemente.
Procedimiento

Para llevar a cabo la determinacin de cobre mediante ETAAS en tubo sin plataforma de Lvov se tomaron 100 L de la disolucin de miel (20% m/v) y se le aadieron 66 L de HNO3 (10% m/v), 20 L de triton X100 (1% v/v), 65 L de H2O2 (30% m/v) y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin fueron inyectados 12 L en el sistema de atomizacin junto con 18 L de disolucin de Pd (1000 mg L-1). La longitud de onda utilizada fue 327.4 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 5 mA. En la Tabla 34 se muestran las concentraciones ptimas de los reactivos y parmetros de la cmara de grafito utilizadas en este mtodo.
Tabla 34.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cu en miel mediante ETAAS en tubo de grafito sin plataforma usando Pd como modificador de matriz. [Pd] (mg L-1) [Mg] (mg L-1) [H2O2] (% v/v) [HNO3] (% v/v) [Triton X-100] (% v/v)

2000

0
Temperatura (C)

6.50
Rampa (s)

0.66
Permanencia (s) Flujo Ar (L/min)

0.020

Etapa

Lectura

Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza

105 900 2500 2600

10 10 0.7 0

20 15 2.5 2.5

3 3 0 3

No No S No

III.3.3.2.3.- Comparacin de resultados obtenidos mediante tubo con plataforma y sin plataforma
Una vez optimizados los factores que pueden tener influencia en la determinacin del cobre por ETAAS, se han comparado las seales

92

Parte experimental

obtenidas para un patrn de cobre de 16 g L-1 usando tubos de grafito con y sin plataforma. Comparando ambas (Figura graficas
0.500

38)

se
0.000 50.00

observa que cuando la muestra es atomizada en un tubo de grafito con plataforma, la seal forma no de tiene pico
Figura 38.- Seal analtica obtenida para un patrn de Cu (16 g L-1) usando un tubo de grafito con plataforma y sin plataforma. (Seal sin plataforma: . Fondo sin plataforma: . Seal con plataforma: . Fondo con plataforma: ).
Time (s)
55.00

gaussiano, lo que indica que la atomizacin no es homognea y se produce lentamente. Usando un tubo sin plataforma se obtuvo un pico alto y estrecho, indicativo de una buena atomizacin. Adems la mo mejora sensiblemente al no utilizar la plataforma, pasando de 24.7 a 12.3 pg. A la vista de estos resultados, se consider ms adecuado el empleo de tubos de grafito sin plataforma para llevar a cabo la determinacin de cobre por ETAAS.

III.3.3.2.4.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre en miel mediante ETAAS como modificador de matriz
Se ha estudiado si el dihidrgenofosfato amnico podra ser usado como modificador de matriz para la determinacin de cobre en mieles por ETAAS, usando tubos pirolticos sin plataforma ya que, previamente se comprob que esta opcin condujo a mejores resultados. Para ello, se analizaron los factores que podran tener ms influencia en la determinacin, haciendo uso de un diseo Plackett-Burman. Se estudiaron 9 factores: concentracin de perxido de hidrgeno, cido ntrico, dihidrgenofosfato amnico, as como los parmetros del programa (temperaturas de secado,

usando dihidrgenofosfato amnico

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

93

mineralizacin y atomizacin, adems de las permanencias en la etapa de secado y mineralizacin). En la Tabla 35, se observan los valores mximos y mnimos ensayados para cada factor.
Tabla 35.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz. Variable [NH4H2PO4] [H2O2] [HNO3] [TritonX-100] Temperatura Secado Permanencia secado Temperatura mineralizacin Temperatura atomizacin Permanencia mineralizacin Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[NH4H2PO4] [H2O2] [HNO3] [T X-100] T-sec Perm-sec T-min T-atom Perm-min

0.02 0 0.5 0.01 105 10 500 1800 10

0.2 30 2 0.05 300 40 1300 2500 40

% % % % C s C C s

Una vez que realizados los 13 experimentos El nico factor significativo determinacin en la de

y procesados los

resultados obtenidos, stos se muestran en la carta pareto de la Figura 39.

T-min T-sec [HNO3] [NH4H2PO4] Perm-sec [H2O2] Perm-min T-atom 0 2 4 6 8 10 12 + -

cobre empleando como modificador dihidrgenofosfato amnico es la temperatura de mineralizacin. El resto de los factores parecen no afectar a la

Figura 39.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz.

seal de un modo significativo en los niveles ensayados. Por ello se hizo un estudio de este factor univariantemente, considerando para el resto de los factores los valores dados como ptimos en el diseo Plackett-Burman.

94

Parte experimental

Se estudi la variacin de la seal analtica de un patrn de

rea

0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

4 g L-1 en funcin de la temperatura de mineralizacin. Se ensayaron temperaturas entre 600 y 1300 C, representando grficamente los resultados en la Figura 40. Escogiendo que la mayor la temperatura produzca

T. Mineralizacin (C)

Figura 40.- Variacin de la seal analtica con

la temperatura de mineralizacin.

mnima prdida de seal se concluy que 1100 C es la temperatura idnea para llevar a acabo la mineralizacin. Para todos los dems factores se usaron como ptimos los dados por el diseo Plackett-Burman aunque se estudi la validez de estos resultados haciendo en cada caso comprobaciones univariantes. Otros factores no se estudiaron mediante diseo de experimentos, ya que previamente se comprob que no tenan casi significacin. En un principio se usaron los valores recomendados por el manual del equipo, y una vez optimizadas las dems variables, se verificaron de manera univariante
Procedimiento

Para llevar a cabo la determinacin de cobre en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador se tomaron 200 L de la disolucin de miel (20%) y se mezclaron con 20 L de triton X-100 (1% v/v), 50 L de HNO3 (10% m/v), 200 L de NH4H2PO4 y todo ello fue llevado a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se inyectaron 30 L en el sistema de atomizacin. La longitud de onda utilizada fue 227.4 nm, la anchura de rendija de 1 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 5 mA. En la Tabla 36 se resumen las concentraciones ptimas de reactivos y parmetros de la cmara de grafito.

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

95

Tabla 36.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cu en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz. [H2O2] % (v/v) [HNO3] % (m/v) [Triton X-100] % (v/v) [NH4H2PO4] % (m/v)

0.50
Temperatura Rampa (s)

0.020
Permanencia (s)

0.20
Flujo Ar (L/min) Lectura

Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza

(C)

105 950 2600 2700

10 10 0.7 0

40 10 2.5 2.5

3 3 0 3

No No S No

III.3.3.2.5.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cobre mediante ETAAS con digestin previa
En esta seccin se han estudiado nicamente las condiciones de atomizacin del cobre en muestras de miel digeridas, partiendo del hecho que la etapa de digestin de la miel, ya fue estudiada previamente (secciones III.3.1.2.3.1 y III.3.2.2.3.1). Se comprobaron las condiciones de digestin ptimas para cadmio y plomo (elementos ms voltiles) encontrando que aportan buenos resultados para cobre. Para optimizar los parmetros de la cmara de grafito se us en primer lugar un diseo Plackett-Burman (cribado de factores) de 8 factores en 13 experimentos, que permite valorar cuales de ellos tienen mayor influencia en el proceso. En la Tabla 37 se pueden ver los niveles mximos y mnimos que se han utilizado para cada factor. En la Figura 41 se observa la carta pareto que se obtiene del anlisis de los experimentos realizados. Ninguno de los factores estudiados present una influencia significativa en la seal, aunque las distintas temperaturas (secado, mineralizacin y atomizacin), fueron los que tuvieron un mayor peso.

96

Parte experimental

Tabla 37.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Variable [Pd] Temperatura Secado Temperatura mineralizacin Temperatura atomizacin Rampa secado Rampa mineralizacin Permanencia secado Permanencia mineralizacin Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades

[Pd] T-sec T-min T-atom Ramp-sec Ramp-min Perm-sec Perm-min

0 105 500 1800 5 5 10 10

3000 300 1200 2600 30 30 40 40

mg L-1 C C C s s s s

Con el fin de elegir turas los usadas valores en el ptimos de las temperaprograma de la cmara de grafito, y tener en cuenta si existen posibles interacciones entre ellas, se ha aplic un

T-atom T-min T-sec [Pd] Ramp-sec Ramp-min Perm-sec Perm-min 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

+ -

Figura 41.- Carta pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman, para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra.

diseo composicional central 23 + estrella realizando 16 experimentos, en un solo bloque totalmente aleatorizado. Interpretando los resultados del diseo, se comprob que un aumento de la temperatura de mineralizacin no provoca una variacin de la
T-sec = 105 C
0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 1300 0.00 900 2000 2200 2400 2600 2800 500 T-min (C)

seal analtica hasta 700 C, temperatura a partir de la cual la seal empieza a disminuir, como se puede ver en la Figura 42. La temperatura de atomizacin tuvo un efecto muy ligero, eligindose como ptima la dada por el diseo (2200 C), ya que

rea

T-atom (C)

Figura 42.- Superficie de respuesta de las temperaturas en la seal analtica.

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

97

sin ser excesivamente alta produjo una atomizacin completa del analito. La temperatura de secado ms adecuada fue 105 C, que asegura la completa evaporacin del disolvente sin prdidas del analito por chisporroteos o salpicaduras. En cuanto a los tiempos, comprobados de manera univariante, decir que rampas cortas (5 s) y permanencias medianamente largas (40 s) condujeron a los mejores resultados. Para el modificador (Pd) el ptimo de concentracin se encontr en 2000 mg L-1.
Procedimiento

Para llevar a cabo la digestin de las muestras de miel con energa de microondas, se procedi de igual modo que en los dos metales vistos anteriormente en las secciones III.3.1 y III.3.2 (cadmio y plomo). Para realizar la determinacin de cobre en muestras de miel digeridas usando este mtodo, se tomaron 200 L de la muestra digerida (12% m/v en miel) y se llevaron a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin con el muestreador automtico se tomaron 12 L que fueron inyectados en el sistema de atomizacin junto con 18 L de disolucin de Pd (1000 mg L-1), aplicando a continuacin el programa de temperaturas optimizado en esta seccin y que puede visualizarse en la Tabla 38.
Tabla 38.- Programa de temperaturas de la cmara de grafito para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Etapa Temperatura (C) Rampa (s) Permanencia (s) Flujo Ar (L/min) Lectura

Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza

105 950 2200 2600

5 5 0.7 0

40 40 2.5 2.5

3 3 0 3

No No S No

98

Parte experimental

III.3.3.3.-

Caracteristicas

analticas

de

los

mtodos

desarrollados
III.3.3.3.1.- Rectas de calibrado y adicin
Se han preparado cuatro disoluciones de cobre de concentraciones 0, 4, 8 y 16 g L-1 para obtener las rectas de calibrado y adicin. La recta de adicin se ha obtenido aadiendo 100 L de disolucin acuosa de miel (20% m/v) a las disoluciones de 0, 4.0, 8.0 y 16 g L-1. En las Tablas 39, 40 y 41 se encuentran los resultados obtenidos y en las Figuras 43, 44 y 45 se pueden ver las representaciones grficas de los mismos. Mediante el test estadstico t con un nivel de significacin del 95%, se observ que las rectas son paralelas para los mtodos del paladio y de digestin previa, pero no as para el que hace uso de dihidrogenofosfato amnico como modificador.
Tabla 39.- Rectas de calibrado y adicin ([Cu] g L-1). Mtodo del Pd sin plataforma. Calibrado Adicin
rea
0.10 0.08 0.06 0.04 0.02

[Cu]

Absorbancia

[Cu]

Absorbancia

0.0 0.009 0.0 0.034 4.0 0.019 4.0 0.047 8.0 0.036 8.0 0.059 16 0.055 16 0.084 A=310-3 [Cu]+0.008 A=310-3 [Cu]+0.035 r2 =0.9987 r2=0.9988
Tabla 40.- Rectas de calibrado y adicin ([Cu] g L-1). Mtodo del NH4H2PO4.

0.00 0 5 10 15 20

[Cu] ( g L -1 ) Adicin Calibrado

Figura 43.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del Pd.

0.24 0.20

rea

Calibrado

Adicin

0.16 0.12 0.08 0.04 0.00 0 5 10

-1

[Cu] 0.0

Absorbancia 0.022

[Cu] 0.0

Absorbancia 0.133

4.0 0.036 8.0 0.052 16 0.079 -3 A=410 [Cu]+0.022 r2 =0.9989

4.0 0.163 8.0 0.188 16 0.243 -3 A=710 [Cu]+0.134 r2=0.9993

15

20

[Cu] (g L ) Adicin Calibrado

Figura 44.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del NH4H2PO4.

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

99

Tabla 41.- Recta de calibrado y adicin ([Cu] g L-1). Mtodo de digestin previa. Calibrado Adicin
rea

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0 5 10 15

-1

[Cu] 0.0

Absorbancia 0.002

[Cu] 0.0

Absorbancia 0.028

4.0 0.022 4.0 0.046 8.0 0.040 8.0 0.062 16 0.075 16 0.100 A=410-3 [Cu]+0.003 A=410-3 [Cu]+0.035 r2 =0.9995 r2=0.9991

20

[Cu] (g L ) Adicin Calibrado

Figura 45.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo de digestin previa.

Al emplear dihidrogenofosfato amnico como modificador, fue necesario usar rectas de adicin para corregir el efecto matriz, mientras en los otros dos casos se pueden usar las rectas de calibrado, para calcular las concentraciones de analito.

III.3.3.3.2.- Recuperacin analtica

La recuperacin analtica de los mtodos se determin mediante la medida de diversas disoluciones de miel de concentracin final aadida de 4.0, 8.0 y 16 g L-1 de cobre. Se midieron diez rplicas para cada nivel de concentracin y se calcul la recuperacin analtica mostrando los resultados obtenidos en la Tabla 42.
Tabla 42.- Recuperacin analtica obtenida con los distintos mtodos desarrollados para la determinacin de Cu en miel mediante ETAAS. RECUPERACIN (%) [Cu]aadido g L 4.0 8.0 16 Total
-1

Mtodo Pd

Mtodo NH4H2PO4

Mtodo Digestin previa

102 100 101

101

103 100 100

101

103 97.5 100

100

100

Parte experimental

En

los

tres

mtodos

estudiados

se

obtuvieron

resultados

satisfactorios. Los porcentajes de recuperacin resultaron comprendidos entre el 100 y 102.5%, lo cual es indicativo de una exactitud aceptable.

III.3.3.3.3.- Precisin de los mtodos

Para llevar a cabo el estudio de la precisin de los mtodos desarrollados, se prepararon una serie de disoluciones de miel con concentraciones aadidas de 4.0, 8.0 y 16 g L-1 de cobre. Para cada concentracin se midieron 10 rplicas, determinndose para cada una de ellas las concentraciones.
Tabla 43.- Coeficientes de variacin obtenidos a los diferentes niveles de concentracin estudiados para los diferentes mtodos de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS.

Mtodo Pd Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (4.0 g L-1) Serie 3 (8.0 g L-1) Serie 4 (16 g L-1) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) 5.2 0.37 7.2 9.6 0.71 7.4 13 0.79 6.1 21 1.6 7.6

Mtodo NH4H2PO4 14 1.2 8.4 17 0.48 2.8 21 0.37 1.8 30 0.90 3.0

Mtodo Digestin previa 6.1 0.29 4.9 9.7 0.30 3.1 14 0.77 5.5 22 0.90 4.1

Con estos datos se procede a calcular la media (xmedia), la desviacin estndar (SD) y el coeficiente de variacin (RSD %) segn la Ecuacin 2 mostrando estos resultados en la Tabla 43. En todos los casos los coeficientes de variacin son menores del 10%, siendo valores aceptables para indicar una adecuada repetitibilidad de los resultados.

Mtodos de determinacin de Cu mediante ETAAS

101

III.3.3.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados
Los resultados obtenidos para el LOD, LOQ, y masa caracterstica (mo), se exponen en la Tabla 44.
Tabla 44.- Valores de LOD, LOQ y mo para los diferentes mtodos de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS, desarrollados. Pd mo (pg) LOD (ng g-1) LOQ (ng g-1) NH4H2PO4 Digestin previa

12 5.0 25

19 20 65

13 10 34

Si se comparan los valores de LOD y LOQ obtenidos, con lo publicado por diferentes autores en matrices diversas se observa que Chmilenko y col.89 obtuvieron un peor LOD (0.013 mg Kg-1) para la determinacin de cobre en azcar despus de disolverlo mediante el uso de ultrasonidos, y lo mismo ocurre para el mtodo propuesto por Noorbasha y col.83 para cuantificar cobre en algas digeridas mediante microondas (LOD = 8.0 ng mL-1). Sin embargo, otros autores como Cabrera y col.71 consiguen una mejor masa caracterstica (4.5 pg), al medir este elemento en digeridos de cereales. Comparando los lmites encontrados por otros trabajos en los que se realiza la determinacin en muestras de miel se observa que, para un mtodo directo sin modificador de matriz Vias y col.30 obtuvieron un peor LOD: 0.6 g L-1 para una disolucin de miel del 4% (p/v) frente a 0.21 g L-1 para una disolucin del 20% (p/v). Tambin M. Taddia46, para un digerido de miel obtuvo un peor LOD (16 ng g-1) que el obtenido en el presente trabajo.

III.3.3.4.- Comparacin de los mtodos

Tres de los mtodos optimizados fueron comparados estadsticamente midiendo 7 rplicas de una misma muestra por cada uno de los tres mtodos seleccionados.

102

Parte experimental

Mediante
ANLISIS DE M EDIAS (95% de confianza) 119 115 111 Media 107 103 99.0 95.0 Dig NH 4H 2 PO 4 previa Pd LD I = 95,78 LDS = 116,87

un

anlisis

Anova se comprob que las medias obtenidas con los tres mtodos son comparables estadsticamente con un 95% de confianza. La Figura 46 permite observar las desviaciones de las medias de cada mtodo con respecto a la media proporcionada por los tres y comprobar que estn dentro de los intervalos de

Figura 46.- Representacin de los valores medios con el intervalo de confianza para los mtodos de digestin previa (Dig previa), del dihidrogenofosfato amnico (NH4H2PO4) y del paladio (Pd). LDS: lmite de decisin superior y LDI: lmite de decisin inferior.

decisin para una confianza de 95%.

III.3.3.5.- Conclusin
Se pusieron a punto varios mtodos para el anlisis de cobre en miel mediante ETAAS, comprobando, en primer lugar, que los tubos pirolticos sin plataforma condujeron a mejores resultados que aquellos que la contienen. De estos mtodos tres de ellos fueron mtodos directos y un tercero con digestin previa de la muestra en microondas usando bombas de baja presin. Dos de los mtodos directos y el de digestin previa fueron comparados estadsticamente comprobando que los directos tienen una mayor reproducibilidad, adems de simplificar la manipulacin de la muestra lo que conlleva a un ahorro de tiempo y de fuentes de posible error. El mtodo que hace uso de Pd como modificador es el ms sensible de los tres y, en oposicin al de NH4H2PO4, permite trabajar con rectas de calibrado. Por ello se seleccion como ms adecuado, el mtodo directo que usa Pd como modificador (en tubo de grafito sin plataforma), para cuantificar los niveles de este metal en las muestras gallegas de miel, aportando adems un mtodo ms sensible que los publicados hasta ahora para determinar cobre en miel mediante ETAAS.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

103

III.3.4.- DETERMINACIN DE CROMO EN MIEL MEDIANTE ETAAS

III.3.4.1.- Introduccin
El cromo es un elemento esencial tanto para animales vertebrados como para humanos90. En el hombre, juega un papel importante en el metabolismo de los hidratos de carbono y de algunos lpidos (especialmente colesterol)91,92. El cromo se encuentra en los alimentos formando un complejo del cido nicotnico llamado factor de tolerancia de la glucosa93 que participa en los procesos de degradacin de azcar en sangre por la accin de la insulina94. Su deficiencia est ligada a enfermedades como alzheimer, diabetes y parkinson95. Como elemento esencial se aconseja una ingesta diaria de 50-200 g90,96. Por otro lado se ha demostrado que cantidades excesivas de cromo en el medio, son muy peligrosas, no slo para el desarrollo de la vida humana, sino tambin para el medio ambiente. El cromo (VI) es particularmente peligroso para la salud, pues es altamente mutagnico y carcinognico97, asocindose a patologas como los cnceres de pulmn y gastrointestinal91. Tambin en su estado de oxidacin (III) el cromo es ligeramente txico a elevadas concentraciones.98 El cromo se encuentra en la naturaleza formando diversos compuestos, siendo la cromita (pirita crmica) el mineral ms importante que lo contiene99. Su presencia en el medioambiente debido a la actividad antropognica puede asociarse a la emisin de residuos en el proceso de cromado galvnico, a su empleo en la fabricacin de acero inoxidable y su uso como catalizador en la sntesis de amonaco. Otra fuente importante de emisin al medio es el uso de combustibles fsiles como fuente de energa92. Adems, sales en su estado de oxidacin ms txica (Cr VI), son empleadas para tratamiento de maderas, curtido de pieles, etc. Para la determinacin de este elemento la mayora de autores han empleado tcnicas espectroscpicas. Dentro estas tcnicas destacan aquellos autores que usan ICP-AES13,100 y los que lo determinan mediante FAAS,

104

Parte experimental

previa extraccin del metal101. Sin embargo, en los ltimos aos ICPMS38,43,102 ha emergido como una tcnica poderosa para el anlisis de elementos traza en muestras diversas, permitiendo realizar anlisis multielementales con muy bajos lmites de deteccin. Esta tcnica junto con ETAAS, son las ms adecuadas para la deteccin de cromo en matrices complejas, pero ambas sufren de ciertas dificultades instrumentales. ICP-MS se ve afectada por interferencias espectrales para la mayora de los istopos de este elemento, especialmente en aquellas muestras de compuestos que contengan carbono o iones cloruro. Este hecho ha propiciado planteamientos alternativos como usar UN-Q-ICP-MS103, o llevar a cabo diversos mtodos de preparacin previa de la muestra. La determinacin por ETAAS90,92,104,105,106 ha sido ampliamente utilizada debido a sus bajos lmites de deteccin y al control de las posibles interferencias. No obstante, tambin en esta tcnica se producen inconvenientes, se pueden producir prdidas del analito en las etapas previas a la atomizacin, existen dificultades para corregir la absorcin del fondo en matrices complejas y efecto memoria. Para evitar los problemas asociados a interferencias y prdidas del analito es recomendable el uso de modificadores de matriz107. Entre los modificadores ensayados en la bibliografa destaca el uso de modificadores permanentes (Eu, Ru, Ir, Mo, Zr, W)92,108,109 que presentan buena eficacia y facilitan la preparacin de la muestra, al no tener que aadirlo a sta o inyectarlo cada vez que se introduce la muestra. Entre los modificadores convencionales se pueden destacar el NH4H2PO4110, Pd(NO3)2106,,111,112 y/o Mg(NO3)271,84,94,102. Sin embargo otros autores recomiendan no emplear modificadores para la determinacin de cromo por ETAAS 70,104,105,113. En vista del carcter esencial y txico del cromo es importante conocer el contenido del mismo en mieles, debido a su uso como alimento o a su posible empleo como bioindicador. En este trabajo se han puesto a punto tres mtodos de determinacin mediante ETAAS, ante los pobres resultados obtenidos al intentar medirlo por ICP-AES (alto LOD y SD muy altas) y ante las pocas referencias existentes114. Los dos primeros son mtodos directos en los que se ensayan los dos modificadores usados hasta

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

105

ahora: Pd(NO3)2-Mg(NO3)2 y H2NH4PO4. En el tercero se optimizan las condiciones de atomizacin para un mtodo indirecto llevado a cabo sobre un digerido de miel obtenido segn el procedimiento visto en la secciones III.3.1.2.3.1 y III.3.2.2.3.1 usando Pd como modificador.

III.3.4.2.- Optimizacin
Ante afirmaciones como la de Brunh y col.112 que aseguran que el uso de plataforma de Lvov en metales refractarios como el cromo no entraa ventajas analticas, se ha realizado un estudio previo, utilizando las condiciones recomendadas por el manual del equipo para evaluar la variacin de la seal del cromo trabajando con y sin
0.000 0.500

plataforma. Cuando la atomizacin se desarrolla en condiciones ideales el pico de la seal de absorbancia que se obtiene es estrecho y elevado, lo cual es indicativo de una atomizacin

50.00

Time (s)

55.00

Figura 47.- Seal analtica obtenida para un patrn de Cr (16 g L-1) usando un tubo de grafito con plataforma y sin pataforma. (Seal sin plataforma: . fondo sin plataforma: . Seal con plataforma: . Fondo con plataforma: ).

uniforme. Se observ que el pico obtenido cuando la atomizacin se lleva a cabo en un tubo con plataforma es demasiado plano, mientras que los obtenidos cuando se ha usado un tubo sin plataforma se asemejan ms a los ideales (Figura 47). Por ello se ha decidido trabajar con un tubo sin plataforma de LVov y realizar as todos los ensayos de optimizacin.

III.3.4.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cromo en miel mediante ETAAS usando paladio como modificador de matriz
La optimizacin de los parmetros que afectan a la determinacin de cromo por ETAAS se ha llevado a cabo mediante el uso de las tcnicas de diseo de experimentos vistas hasta ahora. Se ha averiguado cuales son los

106

Parte experimental

factores que presentan mayor influencia en la determinacin de cromo usando un diseo Plackett-Burman (cribado de factores) de 9 factores, realizado en 13 experimentos. Los factores estudiados, as como los intervalos de estudio para el mtodo que hace uso de paladio-magnesio como modificador de matriz, se encuentran en el Tabla 45.
Tabla 45.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS usando Pd como modificador. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin Rampa Mineralizacin Permanencia Secado Permanencia Mineralizacin [HNO3] [H2O2] [Pd] [Mg] Abreviatura T-sec T-min T-atom Ramp-min Perm-sec Perm-min [HNO3] [H2O2] [Pd] [Mg] Valor mnimo 105 1100 2300 5 10 10 0.5 0 0 0 Valor mximo 200 1900 2700 30 40 40 2.0 20 3000 3000 Unidades C C C s s s % % mg L-1 mg L-1

Una vez realizados los 13 experimentos, en la Figura 48 se muestra la carta Pareto De la se obtenida.
[H2O2] T-atom [HNO3] T-min [Pd] Perm-min T-sec [Mg] Perm-sec 0 1 2 3 4 + -

observacin de esta representacin concluye que los factores que afectan en mayor medida a la seal analtica obtenida fueron la

Figura 48.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS usando Pd como modificador.

concentracin de perxido de hidrgeno, la temperatura de atomizacin y la concentracin de cido ntrico. Se estudi en primer lugar el efecto que tienen sobre el rea de pico los tres factores ms significativos. Se han optimizado conjuntamente para

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

107

tener en cuenta las posibles interacciones entre ellos; empleando un diseo composicional central 23 + estrella, con 16 experimentos. En la Figura 49 se puede observar la superficie de respuesta obtenida al variar la temperatura de atomizacin y la concentracin de cido nitrico, encontrndose que la seal aumenta con la temperatura de atomizacin, temperaturas siendo del el incremento muy pronunciado a intervalo
rea
0.137 0.117 0.097 0.077 0.057 0.037 2100

H2O2 = 30,0% (v/v)

2300

2500

0,8 0,4 0 HNO (% m/v) 2700 3

T-atom (C)

Figura 49.- Efecto de la temperatura de atomizacin y de la concentracin de cido ntrico en la seal analtica

2100-2400 C y mucho menos intenso entre 2400 e 2700 C. Como la vida del tubo se ve reducida con el uso de temperaturas altas de atomizacin, se ha elegido la temperatura de 2700 C, que coincide adems con la recomendada por el manual del equipo y por otros muchos autores90,92,95 . En la misma Figura se puede observar que el aumento de la concentracin de cido ntrico hasta un 0.50% provoc un aumento de la seal. Concentraciones superiores de HNO3 provocaron una disminucin de la seal analtica. Se
T-atom = 2700 C
0.880 0.078 0.068 0.058 0.048 0,8 0.038 0,4 10 14 18 22 26 30 0 HNO3 (% m/v)

estudi

tambin

mediante este diseo experimental el efecto de la concentracin de perxido de hidrgeno. Se comprob, como puede verse en la Figura 50, que la concentracin de este reactivo no afecta para concentraciones menores del 16% (v/v) y a partir de esta

rea

H2O2 (% v/v)

Figura 50.- Efecto de la concentracin de perxido de hidrgeno y cido ntrico en la seal analtica.

concentracin se produjo un aumento continuado hasta el 30% (v/v). No se ensayaron concentraciones mayores porque repercuten negativamente en la

108

Parte experimental

vida del tubo de grafito. La concentracin de perxido de hidrgeno escogida como ptima fue 30% v/v (considerando como puro el reactivo comercial el 33% m/v). El siguiente factor en relacin a su influencia (la temperatura de mineralizacin), fue optimizado conjuntamente con la concentracin de los dos modificadores mediante otro diseo composicional 23 + estrella, ya que, a priori suelen estar relacionados entre s. En la Figura 51 se puede observar que la temperatura de mineralizacin present un ptimo pronunciado a 1265 C. Con respecto a la concentracin de paladio, su incremento no provoca grandes variaciones de la seal, comenzando a disminuir progresivamente a partir de una concentracin de 1500 mg L-1, valor que se ha tomado como ptimo. En cuanto a la concentracin de Mg apenas tuvo influencia en la seal, como cabra esperar a la vista de la carta pareto. Este hecho se comprob posteriormente observando que el nico efecto producido por el Mg fue blanco de reactivos, por lo cual, a partir de este momento, se prescindi de este reactivo. Los dems factores que, segn el cribado de stos, tan slo tienen una influencia
rea [Pd] = 1.5 (g L-1)
0.17 0.14 0.11 0.08 0.05 0.02 0.00

un incremento en la seal del

1800 1400 0.0 0.5 1.0 1.5 1000 T-min (C) 2.0 2.5 3.0

[Mg] (g L-1)

Figura 51.- Efecto de la temperatura de mineralizacin y de la concentracin de Mg en la seal analtica.

relativa en la seal (temperatura de secado, tiempo de permanencia de secado, o de permanencia de mineralizacin), no fueron estudiadas usando un diseo de superficie de respuesta, sino que se consideraron como ptimos los valores obtenidos al aplicar el diseo Plackett-Burman. Una vez establecidos los ptimos, los dems fueron establecidos de forma univariante. En el caso del triton X-100 la concentracin usada es 0.02%, ya que, al igual que en los otros metales es la cantidad mnima que permite una correcta deposicin de la muestra en el tubo de grafito sin perjudicar excesivamente a la seal analtica.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

109

Procedimiento Para llevar a cabo la determinacin de cromo mediante ETAAS usando el mtodo desarrollado, se tomaron 500 L de la disolucin de miel (20% m/v) y se aadieron 300 L de H2O2 (30% m/v), 20 L de triton X100 (1% v/v), 50 L de HNO3 (10% m/v) y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin fueron inyectados 12 L en el sistema de atomizacin junto con 18 L de disolucin de Pd (750 mg L-1). La longitud de onda utilizada fue 357.9 nm, la anchura de rendija de 0.2 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 7 mA. En la Tabla 46 se muestran las concentraciones ptimas de los reactivos y parmetros de la cmara de grafito utilizadas en este mtodo.
Tabla 46.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cr en miel mediante ETAAS usando Pd como modificador de matriz. [Pd] (mg L-1) 1500 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [Mg] (mg L-1) 0 Temperatura (C) 105 1265 2700 2700 [H2O2] (% v/v) 30 Rampa (s) 10 10 0.7 0 [HNO3] (% m/v) 0.50 Permanencia (s) 30 40 2.5 2.5 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 [triton X-100] (% v/v) 0.020 Lectura No No S No

III.3.4.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cromo en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz
Se ha optimizado un mtodo para la determinacin de cromo en mieles mediante ETAAS, sin tratamiento previo de la muestra, utilizando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz. Se realiz un cribado previo de factores mediante un diseo Plackett-Burman escogiendo 8 factores que pueden afectar a la seal. Los factores seleccionados y sus

110

Parte experimental

rangos de estudio se muestran en la Tabla 47.

Tabla 47.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin Permanencia Secado Permanencia Mineralizacin [HNO3] [H2O2] [NH4H2PO4] Abreviatura T-sec T-min T-atom Perm-sec Perm-min [HNO3] [H2O2] [NH4H2PO4] Valor mnimo 105 1000 2300 10 10 2 0 0.05 Valor mximo Unidades 200 1600 2700 40 40 5 20 0.25 C C C s s % % %

En la Figura 52 se muestra la carta Pareto resultante del diseo Plackett-Burman para los 8 factores objeto de estudio. Una vez llevado a cabo el cribado de factores se estudiaron las interacciones de los factores ms significativos entre s, as como su influencia en la seal mediante el uso de superficies de respuesta. Teniendo en cuenta que el factor con mayor influencia es el tiempo de permanencia de secado, seguido del de permanencia de mineralizacin, la temperatura de mineralizacin, la temperatura de atomizacin y la concentracin de dihidrgenofosfato amnico, para evaluar el efecto de estos factores se eligi un diseo composicional central 25-1 + estrella con 28 experimentos. Se emple este tipo de diseo porque la influencia en la seal analtica es semejante para los 5 factores, como puede observarse (Figura 52).
Perm-sec Perm-min T-min T-atom [NH4H2PO4] [HNO3] T-sec [H2O2] 0 1 2 3 4 + -

Figura 52.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

111

En la Figura 53 se observa la superficie de respuesta obtenida al variar la permanencia de secado y la temperatura de mineralizacin, comprobndose que sivamente a medida que el tiempo para de la permanencia temperatura de de secado aumenta. Mientras que mineralizacin se encontr que
rea Perm-min = 5.0 s, T-atom = 2600 C, NH4H2PO4 = 0.2 % m/v
0.106 0.102 0.098 0.094 0.090 0.086 0.082 20 25 30 35 40 45 50

la

seal

disminuye

progre-

Perm-sec (s)

1500 1300 1100 900 T-min (C)

Figura 53.- Efecto de la temperatura de mineralizacin y del tiempo de permanencia de secado en la seal analtica.

la seal analtica aumenta a medida que lo hace la temperatura de mineralizacin hasta una temperatura de 1100 C, a partir de la cual la seal diminuye progresivamente. Se eligi por lo tanto como ptima la temperatura de 1100 C. Del anlisis de la superficie de respuesta no fue posible dilucidar si el tiempo de permanencia ptimo correspondi a 20 s o a un tiempo menor, por lo cual, finalizado este estudio se hizo un anlisis univariante, comprobndose que tiempos menores de 20 s produjeron una menor seal,
Perm-sec = 20.0 s, T-min = 1100 C, T-atom = 2600 C
0.103 0.099 0.095 0.091 0.087 0.083 0.079 5

eligindose ste como el ms adecuado. En la Figura 54 se observa cmo la variacin de la seal analtica en funcin del

rea

0.26 0.18 11 14 17

Perm-min (s)

20

0.1

NH4H2PO4 (% m/v)

tiempo

de

permanencia y de

de la

mineralizacin

Figura 54.- Efecto de la concentracin de NH4H2PO4 y del tiempo de permanencia de mineralizacin en la seal analtica.

concentracin de modificador. Al aumentar el tiempo de permanencia de mineralizacin

la seal prcticamente no vara hasta un valor de 10 segundos a partir del cual sufri un lento descenso, se tom como ptimo 10 segundos pues valores inferiores no aseguraron una buena mineralizacin. Para el modificador, la mxima seal analtica se consigui para una concentracin

112

Parte experimental

del 0.2% (m/v), vase la Figura 54. En este mismo diseo se estudi el efecto de la temperatura de atomizacin, el valor ptimo seleccionado fue 2600 C. Las dems variables, con una menor influencia en la seal, como son la concentracin de cido ntrico, la temperatura de secado y la concentracin de perxido de hidrgeno, no fueron estudiadas utilizando el diseo de superficies de respuesta, se tomaron como valores ptimos los proporcionados por el diseo Plackett- Burman. En cuanto a otros parmetros del programa de la cmara de grafito como son las rampas de secado, de mineralizacin y permanencia de atomizacin, como en los dems casos, al principio del estudio se utilizaron las recomendadas en bibliografa, y una vez que los dems factores fueron optimizados, se estudiaron univariantemente. Los ptimos alcanzados se hallan expuestos en la Tabla 48 de la siguiente seccin. Procedimiento Para la determinacin de cromo en miel por ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador, se tomaron 250 L de la disolucin de miel (20%) y se mezclaron con 20 L de triton X-100 (1% v/v), 40 L de HNO3 (10% m/v), 200 L de NH4H2PO4 y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se inyectaron 30 L en el sistema de atomizacin. En la Tabla 48 se resumen las concentraciones ptimas de reactivos, as como los parmetros ptimos de la cmara de grafito. La longitud de onda utilizada fue 357.9 nm, la anchura de rendija de 0.2 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 7 mA.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

113

Tabla 48.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cr en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador. [NH4 H2PO4] (% m/v) 0.20 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [H2O2] (% v/v) 0.00 Temperatura (C) 105 1100 2600 2700 Rampa (s) 10 10 0.7 0 [HNO3] (% m/v) 0.40 Permanencia (s) 20 10 2.5 2.0 [triton X-100] (% v/v) 0.02 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 Lectura No No S No

III.3.4.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de cromo en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra
Para el desarrollo del mtodo de determinacin de cromo en miel con digestin previa, empleando como modificador el paladio, se procedi como en anteriores casos centrndose el estudio en las condiciones que influyen en el proceso de atomizacin. El diseo Plackett-Burman, en este caso, se llev a cabo con 9 factores en 13 experimentos a realizar aleatoriamente. En la Tabla 49 se pueden ver los niveles mximos y mnimos ensayados para cada factor.
Tabla 49.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo PlackettBurman para el mtodo de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin Rampa secado Permanencia. Secado Rampa Mineralizacin Permanencia Mineralizacin [Pd] [Mg] Abreviatura T-sec T-min T-atom Ramp-sec Perm-sec Ramp-min Perm-min [Pd] [Mg] Valor mnimo Valor mximo 105 500 2200 5 10 5 10 0 0 200 1500 2700 30 40 30 40 3000 3000 Unidades C C C s s s s mg L-1 mg L-1

114

Parte experimental

Una vez realizados los experimentos y obtenidos los resultados se obtiene la matriz del sistema que tras ser analizada produce la carta pareto correspondiente (Figura 55). Como puede verse ningn factor es altamente significativo, aunque los ms relevantes fueron: el tiempo de permanencia de mineralizaron, la temperatura de atomizacin, la rampa de mineralizacin, la concentracin de paladio y la temperatura de mineralizacin. Se estudiaron las condiciones ptimas para los cinco factores sealados como los ms importantes construyendo un nuevo diseo para el estudio de las superficies de respuesta. Estos factores se estudian por medio de un diseo composicional
Perm-min = 10,0 s, T-atom = 2600 C, [Pd] = 3000 g L-1
0.260 0.240 0.220 0.200 0.180 0.140 0.120 600

Perm-min T-atom Ramp-min [Pd] T-min Perm-sec T-sec Ramp-sec [Mg] 0 1 2 3 4

+ -

Figura 55.- Carta Pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra.

central consta

25-1 de

+ 28

estrella

que

experimentos.
rea

En la Figura 56 se puede observar como se comport la

800 1000 1200 0 10 20 30

seal

analtica

cuando

se

Ramp-min (s)

T-min (C)

consider la variacin de la temperatura de mineralizacin y el tiempo de permanencia de mineralizacin.

Figura 56.- Efecto de la temperatura de mineralizacin y el tiempo de rampa de mineralizacin en la seal analtica.

La temperatura de mineralizacin present un valor ptimo en 960 C, a partir del cual empez a disminuir la seal. El comportamiento del tiempo de rampa de mineralizacin es claro, encontrndose el ptimo en 5 segundos, minorndose bruscamente la seal a tiempos superiores.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

115

La temperatura de atomizacin prcticamente no provoc, en el intervalo estudiado, cambios en la seal cuando se emplearon concentraciones bajas de paladio. Sin embargo, para la concentracin mxima estudiada de paladio, se observ un aumento de la seal con la temperatura de atomizacin, encontrndose el ptimo casi en el extremo superior de las condiciones estudiadas (3000 mg L-1 de paladio y 2600 C de temperatura de atomizacin). Con respecto a la temperatura de atomizacin, no se consider necesario realizar un estudio unifactorial posterior, pues sta es la temperatura idnea, teniendo en cuenta los datos experimentales y bibliografcos70. Para la concentracin de paladio se realiz un estudio posterior, observndose que concentraciones mayores a 3000 mg L-1 provocaron una muy pequea variacin de la seal, por lo cual se eligi trabajar con 3000 mg L-1. El tiempo de permanencia de mineralizacin ptima fue de 10 s. La temperatura de secado utilizada fue 105 C y los tiempos y rampas de secado empleados fueron 5 y 10 s respectivamente. Estos valores fueron tomados inicialmente de la bibliografa y verificados posteriormente. El efecto del Mg sobre la seal fue nulo, como puede verse en la carta pareto (Figura 55), por lo que se prescindi de este reactivo, como ya ocurri en el caso anterior. Procedimiento Para llevar a cabo la digestin cida de las muestras de miel asistida con energa de microondas, se procedi como en los tres metales anteriores. Para realizar la determinacin de cromo mediante ETAAS sobre las muestras de miel digeridas, se tomaron 850 L de la muestra digerida (12% m/v en miel) y se llevaron a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se tomaron 12 L que fueron inyectadas mediante el muestreador en el sistema de atomizacin junto con 18 L de disolucin de Pd (300 mg L-1). Se someti a continuacin la mezcla as obtenida al programa de temperaturas optimizado en esta seccin y que puede visualizarse en la Tabla 50. La longitud de onda utilizada fue 357.9 nm, la anchura de rendija de 0.2 nm

116

Parte experimental

y la intensidad de corriente de la lmpara de 7 mA.

Tabla 50.- Programa de temperaturas de la cmara de grafito para el mtodo de
determinacin de Cr en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza Temperatura (C) 105 960 2600 2700 Rampa (s) 10 5 0.7 0 Permanencia (s) 20 10 2.5 2.0 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 Lectura No No S No

III.3.4.3.-

Caractersticas

analticas

de

los

mtodos

desarrollados
III.3.4.3.1.- Rectas de calibrado y adicin.
Las lecturas en el equipo se obtienen como medidas de rea de absorbancia y fue necesario transformarlas en concentraciones; haciendo uso de las correspondientes rectas de calibrado, o rectas de adicin, en el caso de que fuese necesario corregir los efectos de matriz. La recta de calibrado, para la determinacin de cromo, se obtuvo preparando cuatro disoluciones de concentraciones 0.0, 2.0, 4.0 y 6.0 g L-1 de cromo en los mtodos de Pd y digestin y de 0.0, 1.0, 2.0, 3.0 g L-1 en el mtodo del dihidrgenofosfato amnico. Para la recta de adicin, a cada disolucin de 0.0, 2.0, 4.0, 6.0, g L-1 preparada con el patrn de cadmio se aaden 500 L de disolucin acuosa de miel (20 % m/v) en el mtodo del Pd, y se tomaron 850 L del digerido (0.12% m/v) en el mtodo de digestin previa, llevndolos a un volumen final de 1 mL. En el mtodo del dihidrgenofosfato amnico se aadieron a las cantidades equivalentes de patrn (0.0, 1.0, 2.0, 3.0, g L-1) 250 L de disolucin acuosa de miel. Las rectas de calibrado y adicin obtenidas se pueden observar en la Tablas 51, 52, 53 y su representacin grfica en la Figuras 57, 58, 59.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

117

Tabla 51.- Rectas de calibrado y adicin ([Cr] g L-1). Mtodo del Pd. Calibrado [Cr] 0.0 2.0 4.0 6.0 Absorbancia 0.073 0.144 0.211 0.277 [Cr] 0.0 2.0 4.0 6.0 Adicin Absorbancia 0.087 0.159 0.233 0.296
rea

0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0 2 4 6 8

[Cr] (g L-1)
Calibrado Adicin

A=0.034[Cr]+0.074 r2 =0.9997

A=0.035[Cr]+0.087 r2=0.9988

Figura 57.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del Pd.

Tabla 52.- Rectas de calibrado y adicin ([Cr] g L-1). Mtodo de NH4 H2PO4. Calibrado [Cr] 0.0 1.0 2.0 3.0 Absorbancia 0.044 0.073 0.106 0.134 [Cr] 0.0 1.0 2.0 3.0 Adicin Absorbancia 0.057 0.102 0.142 0.177
rea

0.20 0.16 0.12 0.08 0.04 0.00 0 1 2 3 4

[Cr] (g L -1)
Calibrado Adicin

A=0.030[Cr]+0.044 r =0.9992
2

A=0.040[Cr]+0.059 r2=0.9969

Figura 58.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del NH4 H2PO4.

Tabla 53.- Rectas de calibrado y adicin ([Cr] g L-1). Mtodo de digestin previa.
rea

0.30 0.25

Calibrado [Cr] 0.0 2.0 4.0 6.0 Absorbancia 0.077 0.132 0.203 0.273 [Cr] 0.0 2.0 4.0 6.0

Adicin Absorbancia 0.128 0.191 0.254 0.322

0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7

[Cr] (g L-1)
Calibrado Adicin

A=0.033[Cr]+0.072 r =0.9992
2

A=0.032[Cr]+0.127 r2=0.9969

Figura 59.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo de digestin previa.

118

Parte experimental

La comparacin de las pendientes de las rectas de calibrado y adicin se realiz estadsticamente mediante un test t con un nivel de significacin del 95%, poniendo de manifiesto un significativo efecto matriz en el mtodo del dihidrgenofosfato. Por este motivo, para este mtodo las concentraciones se calcularon sobre la recta de adicin. En los mtodos de paladio y de digestin previa, este mismo test reflej pendientes comparables, para estos dos mtodos las medidas de cromo en miel pueden realizarse haciendo uso de las rectas de calibrado correspondientes.

III.3.4.3.2.- Recuperacin de los mtodos.

Como ya se indic con anterioridad, no se dispuso de un material de referencia certificado que permita determinar la exactitud de los mtodos desarrollados, por lo que se realiz un estudio de la recuperacin analtica para cada uno de los mtodos desarrollados. La recuperacin analtica se llev a cabo empleando una muestra de disolucin miel (20% m/v) a la que se aade disolucin patrn de cromo para obtener las concentraciones de 0.0, 1.0, 2.0 y 3.0 g L-1 en el caso del dihidrgenofosfato y de 0.0, 2.0, 4.0, 6.0 en los otros dos casos. Se midieron 10 rplicas de las distintas concentraciones y se calcularon los porcentajes de recuperacin que se recogen en la tabla 54.
Tabla 54.- Recuperacin analtica obtenida para los distintos mtodos de determinacin de Cr en miel por ETAAS desarrollados. RECUPERACIN (%) Mtodo Pd [Cr]aadido g L-1 2.0 4.0 6.0 Total Recuperacin (%) 96.0 98.5 101 98.0 Mtodo Digestin previa Recuperacin (%) 94.2 97.8 102 98.0 Mtodo NH4H2PO4 [Cr]aadido gL-1 1.0 2.0 3.0 Total Recuperacin (%) 100 102 104 102

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

119

Los valores obtenidos para cada uno de los mtodos se hallan en torno al 100%, lo que es indicativo que es una recuperacin aceptable.

III.3.4.3.3.- Precisin de los mtodos.

Para llevar a cabo el estudio de la precisin de los diferentes mtodos desarrollados, se prepararon disoluciones de miel con concentraciones aadidas de 0.0, 1.0, 2.0 y 3.0; y 0.0, 2.0, 4.0 y 6.0 g L-1 de cromo, segn el caso. Para cada disolucin se midieron 10 rplicas y se calcularon los coeficientes de variacin. En la Tabla 55 se pueden observar los resultados obtenidos para cada una de las disoluciones preparadas para los distintos mtodos desarrollados.
Tabla 55.- Coeficientes de variacin obtenidos a los diferentes niveles de concentracin estudiados para los distintos mtodos de determinacin de Cr en miel mediante ETAAS. Mtodo Pd Mtodo Digestin previa Mtodo NH4H2PO4

Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (2.0 g L-1) Serie 3 (4.0 g L-1) Serie 4 (6.0 g L-1)

xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%)

0.6 0.053 8.9 1.1 0.092 8.4 1.5 0.14 9.0 2.1 0.17 8.3

0.5 0.065 13 2.2 0.13 5.8 4.4 0.27 6.1 6.5 0.23 3.6

Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (1.0 g L-1) Serie 3 (2.0 g L-1) Serie 4 (3.0 g L-1)

0.4 0.035 8.7 1.4 0.14 9.9 2.4 0.18 3.5 3.4 0.19 5.6

En todas las series obtenemos coeficientes de variacin inferiores al 10 %, menos para la serie de menor nivel de concentracin correspondiente al mtodo de digestin previa que es de 13%, valor que se puede explicar teniendo en cuenta la mayor manipulacin a que se someti la muestra, al ser digerida previamente.

120

Parte experimental

III.3.4.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados.
Se calcularon los lmites de deteccin y cuantificacin, as como la masa caracterstica, de acuerdo con lo ya indicado en el apartado III.3.4.3.4. A la vista de los resultados obtenidos (vase Tabla 56), el mtodo que hace uso de Pd como modificador es el que mejores LOD, LOQ y mo, present.
Tabla 56.- Valores de LOD, LOQ y mo para los diferentes mtodos de determinacin de Cr en miel desarrollados. Pd mo ( pg) LOD ( ng g-1) LOQ ( ng g-1) 3.3 1.7 5.8 NH4H2PO4 4.4 1.9 6.4 Digestin previa 5.2 2.5 8.4

La masa caracterstica obtenida con el mtodo de Pd se asemeja a la publicada por otros autores, que estudian Cr por ETAAS en diferentes matrices alimenticias como son harinas113 vino90 y legumbres 71. Tambin es semejante a la mo dada por. Burguera y col.92, para el anlisis de cromo en orina. Sin embargo, el mtodo desarrollado en la presente seccin tiene mejor LOD que los mtodos propuestos por Bruhn y col.112 (0.01-0.03 g g-1) para determinarlo en muestras digeridas de mejillones y leche en polvo y as como el propuesto por Vias y col 105 (26 pg) en frmulas infantiles y leche materna. En lo que se refiere a la cuantificacin de cromo en miel por ETAAS, el mtodo aqu propuesto presenta mejor LOD que el mtodo publicado por Taddia y col.46 (9 ng g-1), nico encontrado en bibliografa.

III.3.4.4.- Comparacin estadstica de tres de los mtodos

Los tres mtodos optimizados han sido comparados estadsticamente, midiendo 7 rplicas de una misma muestra por cada uno de los mtodos y comparando resultados.

Mtodos de determinacin de Cr mediante ETAAS

121

Observando la tabla del ANOVA (Tabla 57), se comprueba que el valor p, del test F es mayor que 0.05, con lo que se concluye que no existe una diferencia estadstica significativa entre las medias de los valores aportados por cada mtodo, para un nivel de confianza del 95%. Haciendo un test de varianza tambin se comprueba que las desviaciones estndar de las medidas de cada
Tabla 57.- Tabla Anova. Fuente de variabilidad Entre mtodos Dentro de cada mtodo Total P = 0.1605 SC: Suma de cuadrados gl: grados de libertad CM: cuadrados medios SC gl 2 18 20 CM F0 2.03

columna son comparables para un nivel de confianza del 95%, con aunque el mtodo digestin

22.382 99.287 121.67

93.9615 168.374

previa presente una mayor desviacin, como sucede tambin en los correspondientes mtodos desarrollados para otros metales en anteriores captulos.

III.3.4.5.- Conclusin
Se optimizaron distintos mtodos para el anlisis de cromo en miel mediante ETAAS. En primer lugar se comprob que para esta matriz los tubos pirolticos sin plataforma de Lvov ofrecen mejores resultados, que aquellos en los que se usa dicha plataforma. En segundo lugar se constat que el mtodo directo que usa paladio como modificador de matriz es el que presenta mejores valores de masa caracterstica, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin y de reproducibilidad. Presenta adems la ventaja de realizar las medidas sobre calibrado, en lugar de rectas de adicin. Por todo ello, el mtodo de determinacin directa de cromo mediante ETAAS haciendo uso de paladio como modificador de matriz, ser el empleado para futuras medidas de este elemento en muestras de miel de la Comunidad Autnoma de Galicia.

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

123

III.3.5.- DETERMINACIN DE NQUEL EN MIEL MEDIANTE ETAAS

III.3.5.1.- Introduccin
El nquel es el elemento que ocupa la posicin 22 en el listado de abundancia de los elementos en el planeta, se estima que constituye el 0.008% de la corteza terrestre y el 0.01% de las rocas gneas. Adems se cree que existe en grandes cantidades en el ncleo terrestre (al observarse que los meteoritos contienen una concentracin media del 8-9%). Tambin se halla presente en pequeas cantidades en plantas, animales, agua de mar, petrleo y carbn. El nquel emitido a la atmsfera por la actividad humana est bsicamente asociado a la combustin de carbn, incineracin de basura, as como a la industria siderrgica. El nquel emitido reacciona durante largos periodos de tiempo con las gotas de lluvia, lo que provoca su deposicin en el suelo, donde queda adsorbido o inmovilizado por partculas y sedimentos, a pesar de que en suelos cidos puede presentar una mayor movilidad, alcanzando a menudo las aguas subterrneas115. Fisiolgicamente, el nquel se caracteriza por ser un elemento traza esencial. Aunque poco es sabido sobre su papel en el organismo, s es conocida su participacin en el metabolismo de muchas bacterias y plantas, formando parte de diversos enzimas. Asimismo, no hay mucha informacin disponible sobre los efectos del nquel sobre los organismos y los humanos, por lo que muchos autores dudan en tratarlo como elemento esencial13,116,117 Su deficiencia en el ser humano est asociada a retrasos en el crecimiento, menor produccin de leche y lesiones en la piel y el esqueleto118. En personas expuestas a altas dosis (trabajadores de refineras de nquel o plantas para su procesado) provoca bronquitis crnica, alteraciones de pulmn y aumenta el riesgo de padecer cncer de pulmn, laringe y fosas nasales71. Su efecto ms comn es una reaccin alrgica por contacto, conocida como eczema del nquel.

124

Parte experimental

En cuanto a las metodologas para su anlisis y cuantificacin en alimentos, ICP-AES13 ICP-MS103 y ETAAS71,83,117 son las tcnicas ms empleadas, pues presentan una adecuada sensibilidad. Aunque tambin existen trabajos en la bibliografa en los que se usa FAAS119. En estos casos fue necesaria una concentracin previa del elemento con el fin de alcanzar la sensibilidad suficiente. Para la determinacin de nquel en miel, tambin las diferentes tcnicas basadas en el fuente de plasma acoplada por induccin (ICP) son las ms empleadas y as, Caroli y col.38,42 emplean la tcnica ICP-MS, y Devillers y col120 ICP-AES. Aunque en algunas ocasiones esta ltima no presenta la sensibilidad suficiente para detectar este metal en miel34,121. Incluso, algunos autores que usan ETAAS con digestin previa de la muestra han puesto de manifiesto en algunos casos la insuficiente sensibilidad para la deteccin de nquel en algunas muestras de miel46. Por todo ello, en el presente captulo, se han desarrollado tres mtodos diferentes para medir nquel en mieles, mediante espectrometra de absorcin atmica con atomizacin electrotrmica. Se han ensayado los dos modificadores que ya fueron usados para los otros metales (Pd-Mg y NH4H2PO4) y que fueron propuestos por diversos autores
110,121-124

para

cuantificar nquel en distintas matrices, a pesar de que en algunos otros trabajos se determin nquel sin emplear ningn tipo de modificador qumico84,113,117,125. Con los modificadores qumicos ensayados se pusieron a punto dos mtodos directos y con el mejor de ellos (Pd) se optimizaron los parmetros de la cmara de grafito para un digerido de miel, con el fin de compararlo con los mtodos directos.

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

125

III.3.5.2.- Optimizacin
III.3.5.2.1.- Optimizacin del mtodo de determinacin de nquel mediante ETAAS usando paladio-magnesio como modificador de matriz
Ante la controversia bibliogrfica de usar46,83,110,113 o no usar71,84,117,122 plataforma de Lvov en los tubos de grafito, para la determinacin de nquel, se ha desarrollado un estudio preliminar con el fin de seleccionar la mejor opcin. Para los ello se
0.500

estudiaron

picos

obtenidos al inyectar una muestra adicionada con 8 g L-1 de nquel y medida con los 2 tipos de tubos bajo las condiciones dadas por el manual del
Figura 60.- Seal analtica obtenida para un patrn de Ni (8 g L-1) usando un tubo de grafito con plataforma y sin plataforma. (Seal sin plataforma: . Fondo sin plataforma: . Seal con plataforma: . Fondo con plataforma: ).
0.000 50.00

Time (s)

55.00

equipo. Observando la Figura 60 se comprueba que al emplear un tubo con plataforma de Lvov el pico obtenido fue demasiado plano, lo que indica un proceso de atomizacin lento que produce un resultado indeseable. Por el contrario, se observ que la seal del pico correspondiente a un tubo sin plataforma, aparece en forma de pico estrecho, alto y bien definido, lo que es indicativo de una buena atomizacin. A la vista de estos resultados se tom la decisin de emplear tubos de grafito sin plataforma para llevar a cabo la atomizacin y medida del nquel en la cmara de grafito por ETAAS. Con el fin de desarrollar un estudio preliminar, se emple un diseo Plackett-Burman de 9 factores en 13 experimentos. En la Tabla 58, se encuentra los factores evaluados as como los niveles mximos y mnimos estudiados. Estos valores fueron elegidos de acuerdo con experiencias previas y con lo hasta ahora publicado en la bibliografa.

126

Parte experimental

Tabla 58.- Niveles mnimos y mximos de los factores estudiados a travs de un diseo
Plackett-Burman, para el mtodo de determinacin de Ni en miel usando Pd-Mg como modificador. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin Rampa Mineralizacin Permanencia Mineralizacin [HNO3] [H2O2] [Pd] [Mg] Abreviatura T-sec T-min T-atom Ramp-min Perm-min [HNO3] [H2O2] [Pd] [Mg] Valor mnimo Valor mximo 105 600 220 5 10 0 0 0 0 200 1200 2700 30 40 2 30 3000 3000 Unidades C C C s s % % mg L-1 mg L-1

La carta pareto
T-sec T-min [H2O2] T-atom [Pd] [HNO3] Ramp-min Perm-min [Mg] 0 1 2 3 4 + -

(Figura 61) obtenida, muestra que las temperaturas de secado, mineralizacin y atomizacin as como las concentraciones de perxido de hidrgeno y paladio fueron los

Figura 61.- Carta pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Ni en miel mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador.

factores ms importantes que afectan a la respuesta del nquel. Estos factores fueron optimizados conjuntamente por medio de un diseo composicional central 25-1 + estrella, en 28 experiencias, con el fin de tener en cuenta las posibles interacciones entre los distintos factores. En la Figura 62 se encuentra la superficie de respuesta para la temperatura de secado y de atomizacin. Como se puede ver, la seal del nquel
rea
0.125 0.115 0.105 0.095 0.085 0.075 2600 0.065 2400 100 120 140 160 180 200 2200 T-atom T-min = 1200 C, H2O2 = 16%, [Pd] = 2248 mg L-1

T-sec (C)

(C)

Figura 62.- Efecto de las temperaturas de secado y de atomizacin en la seal analtica.

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

127

disminuy ligeramente cuando la temperatura de secado aumenta, por ello se eligi una temperatura en el rango entre 105 y 130 C como ptima. Para la temperatura de atomizacin, se observ un aumento de la seal cuando la temperatura aumenta, logrndose el mximo de seal a 2620 C, siendo sta temperatura la elegida como ptima. La temperatura de mineralizacin ptima fue 1200 C, ya que a partir de esta temperatura se puso de manifiesto una evidente disminucin de seal. La superficie de respuesta obtenida al considerar el efecto de la concentracin de paladio y de perxido de hidrgeno se encuentra representada en la Figura 63. Para ambos factores, el comportamiento de la seal es similar, aument junto
T-sec = 130 C, T-min = 1200 C, T-atom = 2620 C

con las respectivas concentraciones hasta un valor correspondiente al 16% (m/v) de perxido de hidrgeno y de 2448 mg L-1 de concentracin de paladio, disminuir. Con los resultados obtenidos de las superficies de respuesta, se establecieron las condiciones ms adecuadas para cada uno de los factores considerados como ms significativos. Para los factores de menor relevancia, (concentracin de magnesio, concentracin de cido ntrico, rampa y permanencia de mineralizacin), se tom como valor a emplear el indicado como ptimo por el diseo Plackett-Burman realizado previamente para este mtodo. Se comprob que la adicin de cido ntrico y magnesio que no aportaban mejoras en la seal, por lo que se decidi prescindir de ellos. El nico factor que se estudi univariantemente fue la concentracin de triton X-100, reactivo que es necesario para una correcta dispensacin de la muestra en el tubo de grafito debido a la elevada viscosidad de la miel. Se utiliz el triton X-100 en una concentracin del 0.02% (v/v), que es el valor mnimo que permite obtener los beneficios que aporta a la muestra como a partir de estos niveles empieza la seal a
rea
0.124 0.120 0.116 0.112 0.108 0.104 0.100

10

14

18

22

26

30

0.0

1.0

2.0

3.0

H2O2 (% v/v)

[Pd] (g L-1)

Figura 63.- Efecto de la concentracin del paladio y del perxido de hidrgeno en la seal analtica.

128

Parte experimental

tensoactivo. Esta concentracin es la ptima tambin para otros metales y otros mtodos puestos a punto en diferentes secciones de este trabajo, lo que hace suponer que est vinculada a la matriz (miel) y que no afecta al tipo de elemento a medir. Procedimiento Para llevar a cabo la determinacin de nquel mediante EIAAS por el mtodo desarrollado, se tomaron 500 L de la disolucin de miel (20% m/v) y se aadieron, 20 L de triton X-100 (1% v/v), 160 L de H2O2 (30% m/v) y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin fueron inyectados 12 L en el sistema de atomizacin junto con 18 L de disolucin de Pd (1220 mg L-1). La longitud de onda utilizada fue 232 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 4 mA. En la Tabla 59 se pueden ver los valores ptimos para las distintas concentraciones de los reactivos estudiados y el programa de temperaturas de la cmara de grafito.
Tabla 59.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Ni mediante ETAAS usando Pd-Mg como modificador de matriz. [Pd] (mg L-1) 2448 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [Mg] (mg L-1) 0 Temperatura (C) 130 1200 2620 2700 [H2O2] (% v/v) 16 Rampa (s) 15 10 0.5 0 Permanencia (s) 20 10 2.5 2.5 [HNO3] (% m/v) 0 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 [triton X-100] (% v/v) 0.02 Lectura No No S No

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

129

III.3.5.2.2.- Optimizacin del mtodo de determinacin de nquel en miel mediante ETAAS usando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz
Para el desarrollo del mtodo de determinacin de nquel empleando dihidrgenofosfato amnico como modificador de matriz se llev a cabo un diseo Plackett-Burman para establecer los factores ms significativos. Se trabaj siempre en tubo de grafito sin plataforma ya que, como ya se indic previamente, la seal obtenida corresponde a un pico ms ntido, alto y estrecho. El diseo Plackett-Burman llevado a cabo incluy el cribado de 9 factores en 13 experimentos (12 del diseo ms un punto central aadido para aumentar los grados de libertad). En la Tabla 60 se indican los niveles mximos y mnimos considerados para cada factor.
Tabla 60.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman, para el mtodo de determinacin de Ni en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz. Variable Temperatura Secado Temperatura Mineralizacin Temperatura Atomizacin Permanencia. Secado Rampa Mineralizacin Permanencia Mineralizacin [HNO3] [H2O2] [NH4H2PO4] Abreviatura Valor mnimo Valor mximo Unidades T-secado T-min T-atom Sec-Perm Ramp-min Perm-min [HNO3] [H2O2] [NH4H2PO4] 105 500 2200 10 5 10 0 0 0 200 1600 2700 40 30 40 15 25 0.25 C C C s s s % % %

Una vez realizados los experimentos se obtuvo la carta pareto que se muestra en la Figura 64. Se concluy que el factor ms significativo en la determinacin de nquel empleando dihidrgenofosfato amnico como modificador en las condiciones ensayadas fue la temperatura de mineralizacin.

130

Parte experimental

La
T-min [NH4H2PO4] [H2O2] T-atom Ramp-min Perm-min Perm-sec [HNO3] T-sec 0 1 2 3 4 5 6 + -

concentracin

de a-

dihidrgenofosfato

mnico y la concentracin de perxido de hidrgeno tambin presentaron cierta influencia en la seal analtica en el intervalo ensayado, por lo que se estudiaron en un diseo

Figura 64.- Carta pareto para los factores estudiados a travs de un diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Ni en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz.
3

ms robusto (composicional 2 + estrella), para construir las superficies de respuesta correspondientes. Este tipo de diseo precis de 16 experimentos a realizar para establecer los ptimos correspondientes, pudindose comprobar adems si existe algn tipo de interaccin entre los distintos factores influyentes. Al estudiar la variacin de la seal con la temperatura de mineralizacin con la concentracin de dihidrgenofosfato amnico, se apreci que al aumentar la temperatura de mineralizacin la seal se mantiene prcticamente constante hasta 710 C, a partir de la cual empieza a disminuir la seal, eligindose por ello sta temperatura como ptima. Para la concentracin de dihidrgenofosfato amnico, se obtuvo un mximo de rea de absorbancia usando las concentraciones intermedias del intervalo estudiado, correspondiendo el ptimo a una concentracin de 0.15 % m/v. En la Figura 65, se observ ms claramente que el modificador est entorno el 0.15% (m/v). As mismo fue posible seal confirmar analtica con la la tendencia de aumento de la
rea
T-min = 710 C

la concentracin ptima para

0.044 0.042 0.040 0.038 0.036 30 20 0.034 10 0.10 0.14 0.18 0.22 0.26 0.30 0 H2O2 (% v/v)

NH4H2PO4 (% m/v)

Figura 65.- Efecto de la concentracin de modificador y de perxido de hidrgeno en la seal analtica

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

131

concentracin de perxido de hidrgeno hasta alcanzar un mximo en 27% (v/v), el cual fue considerado como ptimo. Como en el caso anterior, se realiz un estudio univariante sobre la influencia de la variacin de la seal con la concentracin de triton X-100, concluyndose que la concentracin empleada fue la establecida como ptima en los estudios previos realizados con muestras de miel (0.02% v/v). Tambin en esta ocasin se comprob que la adicin de cido ntrico no influy en el anlisis por lo que se elimin como oxidante en este mtodo. Las condiciones de la cmara de grafito en lo que respecta a tiempo de permanencia y rampas para la etapa de secado y mineralizacin fueron estudiados mediante un diseo de experimentos 24 + estrella, obteniendo valores ptimos de 6.5 y 39 segundos para las rampas y permanencia de secado, y 5 segundos para las de mineralizacin. Procedimiento Con los resultados obtenidos en este estudio se establecieron las condiciones ms adecuadas para cada uno de los factores significativos del mtodo desarrollado para la determinacin de nquel. Para llevar a cabo la determinacin de nquel en miel mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz el procedimiento a seguir fue el siguiente: se tomaron 250 L de la disolucin de miel (20%), se mezclaron con 20 L de triton X-100 (1% v/v), 270 L de H2O2 (30% m/v), 150 L de NH4H2PO4 y todo ello fue llevado a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin se inyectaron 30 L en el sistema de atomizacin. La mezcla obtenida se someti a absorcin atmica bajo las condiciones de cmara de grafito detalladas en la Tabla 61. La longitud de onda utilizada ha sido 232 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 4 mA.

132

Parte experimental

Tabla 61.- Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Ni mediante ETAAS usando NH4H2PO4 como modificador de matriz. [NH4 H2PO4] (% m/v) 0.15 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [H2O2] (% v/v) 27 Temperatura (C) 105 710 2600 2000 Rampa (s) 6 5 0.7 0 [HNO3] (% m/v) 0 Permanencia (s) 40 5.0 2.5 2.5 [triton X-100] (% v/v) 0.020 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 Lectura No No S No

III.3.5.2.3.- Optimizacin del mtodo de determinacin de nquel en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra
Se emple un diseo Plackett-Burman para establecer los factores significativos que influyen en la determinacin de nquel mediante ETAAS en muestras de miel previamente digeridas en medio cido. Se procedi como en el apartado anterior usando un diseo en un bloque simple en el que se evaluaron 9 factores mediante 13 experimentos, eligiendo los valores mximos y mnimos segn lo publicado por otros autores y segn las experiencias previas. En la Tabla 62 se observan los diferentes factores y los niveles mximos y mnimos estudiados para cada uno de ellos.
Tabla 62.- Niveles mximos y mnimos de los factores estudiados a travs del diseo PlackettBurman para el mtodo de determinacin de Ni en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Variable Temperatura Secado T.Mineralizacin T Atomizacin Rampa secado Permanencia. Secado Rampa Mineralizacin Permanencia Mineralizacin [Pd] [Mg] Abreviatura T-sec T-min T-atom Ramp-sec Perm-sec Ramp-min Perm-min [Pd] [Mg] Valor mnimo Valor mximo Unidades 105 900 2300 10 10 5 10 0 0 200 1500 2700 40 40 20 40 3000 3000 C C C s s s s mg L-1 mg L-1

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

133

Como se puede
Ramp-sec T-sec T-min [Pd] T-atom Perm-min Ramp-min [Mg] Perm-sec 0 1 2 3 4 + -

ver en la carta pareto (Figura 66) el factor ms significativo es la rampa de secado, seguido de la temperatura de secado y la temperatura de mineralizacin siguientes importancia. que son los en

Figura 66.- Carta pareto para los factores estudiados a travs del diseo Plackett-Burman para el mtodo de determinacin de Cu en miel mediante ETAAS usando Pd como modificador de matriz.

factores

Estos tres factores se evaluaron por medio de un diseo composicional central 23 + estrella que consta de 16 experimentos aleatorizados. En la Figura 67 se representa la influencia en la seal analtica de la variacin de los tiempos de rampa y de la temperatura de secado. La representacin tridimensional no es demasiado explcita, pero si se estudia
T-min = 900 C

mediante una representacin de

rea 0.085 0.088 0.091 0.094 0.097 0.100 0.103 0.106

200

contorno, se observ que la rampa de secado present un ptimo en 9.6 s, mientras que la temperatura de secado apenas afect a la absorbancia desde su valor mnimo hasta 150 C. Por ello se escogi el valor mnimo que es 105 C y que es la temperatura

T-sec (C)

180 160 140 120 100

5 8 11 14 17 20

Ramp-sec (s)

Figura 67.- Superficie de respuesta del efecto del tiempo de rampa de secado y temperatura de secado.

elegida para la mayora de los mtodos optimizados y adems la ptima dada por el diseo. Para la temperatura de mineralizacin, el programa estadstico nos presenta como mejor valor el de 900 C. La concentracin ptima de paladio se estudi de forma univariante una vez optimizados los factores anteriormente indicados. Se observo que el valor que produjo un mejor resultado para la seal analtica fue 1000 mg L-1, que se eligi como ptimo.

134

Parte experimental

Procedimiento Para llevar a cabo la digestin cida de las muestras de miel asistida con energa de microondas, se aplic el mismo procedimiento que el usado para los metales anteriormente estudiados. Para realizar la determinacin de nquel mediante ETAAS sobre la muestra de miel digerida se procedi de la forma siguiente. Se tomaron 850 L de la muestra digerida (12% m/v en miel) y se llevaron a 1 mL con agua ultrapura. De esta disolucin mediante el sistema de inyeccin automtico 12 L de esta disolucin fueron inyectados en el atomizador junto con 18 L de disolucin de Pd (1000 mg L-1), La mezcla obtenida se someti al programa de temperaturas optimizado en esta seccin y que puede visualizarse en la Tabla 63. La longitud de onda empleada fue 232 nm, la anchura de rendija de 0.5 nm y la intensidad de corriente de la lmpara de 4 mA.
Tabla 63.- Programa de temperaturas de la cmara de grafito para el mtodo de determinacin de Ni en miel mediante ETAAS con digestin previa de la muestra. Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza Temperatura (C) 105 900 2500 2700 Rampa (s) 9.6 11 0.70 0 Permanencia (s) 11 20 2.5 2.5 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 Lectura No No S No

III.3.5.3.-

Caractersticas

analticas

de

los

mtodos

desarrollados
III.3.5.3.1.- Rectas de calibrado y adicin
La recta de calibrado, para la determinacin de nquel, se obtuvo preparando cuatro disoluciones de concentraciones 0.0, 2.0, 4.0 y 8.0 g L-1 de nquel para los mtodos de Paladio y digestin en microondas, y 0.0, 1.0, 2.0, 3.0 g L-1 de nquel para el mtodo de dihidrgenofosfato amnico. Para construir la recta de adicin se aadieron 500 L de disolucin acuosa de miel (20% m/v) a cada disolucin preparada con el patrn de nquel, en el

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

135

caso del mtodo del paladio, mientras que en el del dihidrogenofosfato se aadieron 250 L de muestra y en el de la digestin previa 850 L. Las rectas de calibrado y adicin obtenidas se pueden observar en las Tablas 64, 65 y 66, y su representacin grfica en las Figuras 68, 69 y 70.
Tabla 64.- Rectas de calibrado y adicin ([Ni] g L-1). Mtodo del Pd. Calibrado [Ni] Absorbancia 0.0 0.026 2.0 0.035 4.0 0.043 8.0 0.060 A=0.042[Ni]+0.026 r2 =0.9997 Adicin [Ni] Absorbancia 0.0 0.044 2.0 0.052 4.0 0.061 8.0 0.075 A=0.040[Ni]+0.044 r2=0.9995
rea
0.08

0.06

0.04

0.02

0.00 0 2 4 6 8 10

[Ni] (g L -1)
Calibrado Adicin

Figura 68.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del Pd.

Tabla 65.- Rectas de calibrado y adicin ([Ni] g L-1). Mtodo del NH4H2PO4.
rea

0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Calibrado [Ni] Absorbancia [Ni]

Adicin Absorbancia

0.0 0.021 1.0 0.028 2.0 0.037 3.0 0.041 A=0.007[Ni]+0.021 r2 =0.9987

0.0 0.026 1.0 0.038 2.0 0.050 3.0 0.063 A=0.012[Ni]+0.026 r2=0.9996

[Ni] (g L -1)
Calibra do Adicin

Figura 69.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo del NH4H2PO4.

Tabla 66.- Rectas de calibrado y adicin ([Ni] g L-1). Mtodo de digestin previa. Calibrado [Ni] Absorbancia [Ni] Adicin
rea

0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 0 2 4 Calibrado 6 Adicin 8 10

Absorbancia

0.0 0.027 2.0 0.032 4.0 0.039 8.0 0.050 A=0.003[Ni]+0.027 r2 =0.9980

0.0 0.034 2.0 0.040 4.0 0.045 8.0 0.055 A=0.003[Ni]+0.034 r2=0.9983

[Ni] (g L-1)

Figura 70.- Representacin grfica de las rectas de calibrado y adicin. Mtodo de digestin previa.

136

Parte experimental

Al comparar las pendientes de las rectas de calibrado y adicin estadsticamente con un test t para un nivel de significacin del 95%, se comprob que para los mtodos del paladio y de digestin previa, stas no difirieron significativamente. Por ese motivo, se concluy la posibilidad de trabajar con la recta de calibrado para llevar a cabo la determinacin de la concentracin de nquel presente en las muestras usando estos dos mtodos, ya que no existen interferencias de la matriz. La situacin contraria se puso de manifiesto para el mtodo que hace uso de NH4H2PO4 como modificador, por lo que en este caso ser necesario realizar las determinaciones de nquel en muestras de miel haciendo uso de las rectas de adicin, debido a la existencia de un significativo efecto matriz.

III.3.5.3.2.- Recuperacin analtica de los mtodos

La recuperacin analtica se llev a cabo empleando una muestra de disolucin de miel (20% m/v) a la que se aadieron 0.0, 2.0, 4.0 y 8.0 g L-1 de nquel para los mtodos de paladio y de digestin, y 1.0, 2.0 y 3.0 g L-1 para el mtodo de dihidrgenofosfato amnico. Se midieron 10 replicas de las distintas concentraciones y se calcularon los porcentajes de recuperacin segn la ecuacin 1 (vase seccin III.3.1.3.2). Los resultados obtenidos se muestran a continuacin en la Tabla 67.
Tabla 67.- Recuperacin analtica obtenida para los distintos mtodos de determinacin de Ni en miel por ETAAS desarrollados. RECUPERACIN (%) Mtodo Pd [Pb]aadido g L-1 2.0 4.0 8.0 Total Recuperacin (%) 97.8 101.9 99.1 99.6 Mtodo Digestin previa Recuperacin (%) 93.9 103.8 102.5 100.1 Mtodo NH4H2PO4 [Pb]aadido g L-1 1.0 2.0 3.0 Total Recuperacin (%) 101.9 99,5 99.5 100.1

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

137

Los porcentajes de recuperacin obtenidos aplicando los distintos mtodos desarrollados en este trabajo, son aceptables desde el punto de vista analtico.

III.3.5.3.3.- Precisin de los mtodos

Para llevar a cabo el estudio de la precisin de los mtodos desarrollados, se prepararon disoluciones de miel con concentraciones aadidas de 0.0, 2.0, 4.0 y 8.0 g L-1 de nquel para los mtodos del paladio y de la digestin, y con concentraciones aadidas de 0.0, 1.0, 2.0, 3.0 g L-1 para el mtodo de dihidrgenofosfato. Los resultados obtenidos sobre 10 determinaciones de cada disolucin se muestran en la Tabla 68. En todas las series se obtuvieron coeficientes de variacin inferiores al 10%, salvo en el mtodo de digestin previa en el que un valor es ligeramente superior. Por ello se puede concluir que los mtodos optimizados son precisos, aunque el de digestin presenta una mayor variabilidad porque existe un mayor tratamiento y manipulacin de la muestra.
Tabla 68.- Coeficientes de variacin obtenidos a los diferentes niveles de concentracin estudiados para los distintos mtodos de determinacin de Ni en miel mediante ETAAS. Mtodo Pd Digestin previa Mtodo NH4H2PO4

Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (2.0 g L-1) Serie 3 (4.0 g L-1) Serie 4 (8.0 g L-1)

xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%)

1.1 0.11 9.7 2.8 0.20 7.2 4.7 0.23 5.0 8.7 0.45 5.2

1.4 0.20 14 3.2 0.30 9.3 5.5 0.49 8.9 9.4 0.60 6.4

Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (1.0 g L-1) Serie 3 (2.0 g L-1) Serie 4 (3.0 g L-1)

1.1 0.10 9.2 2.0 0.19 9.5 3.1 0.15 4.8 4.1 0.32 7.8

138

Parte experimental

III.3.5.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica de los mtodos desarrollados
Se determinaron los lmites de deteccin y cuantificacin, as como la masa caracterstica para los mtodos estudiados, de acuerdo con lo ya indicado en el apartado III.3.4.3.4. A la vista de los resultados obtenidos (vase Tabla 69) el mtodo que hace uso de Pd como modificador es el que mejor LOD, LOQ y mo, present.
Tabla 69.- Valores de mo, LOD y LOQ para los diferentes mtodos de determinacin de Pb en miel desarrollados. Pd mo ( pg) LOD ( ng g-1) LOQ ( ng g-1) 8.80 3.30 11.0 NH4H2PO4 10.7 6.20 20.8 Digestin previa 19.0 21.5 71.6

La sensibilidad del mtodo de Pd, medida como mo (8.8 pg) supera notablemente a las dadas por Man-Ching122(30.3 pg) para un mtodo de cuantificacin de nquel en orina, Vias117 en alimentos infantiles (27 pg) y Meravali 83. en digeridos de algas (20 pg); se asemejan un poco ms a los valores obtenidos por Taddia46 para medir nquel en miel (13 pg) y C. Cabrera 71 que lo cuantifican en legumbres (13 pg). Con respecto al LOD de este trabajo (3.3 ng g-1) es mejor que el publicado por Taddia46 (27 ng g-1) para un mtodo de determinacin de nquel en miel digerida mediante ETAAS.

III.3.5.4.- Comparacin estadstica de los mtodos

Los mtodos optimizados han sido comparados estadsticamente, midiendo 7 rplicas de una misma muestra por cada uno de los mtodos y comparando resultados. Observando la tabla del ANOVA (Tabla 70), se comprob que el valor p, del test F es mayor que 0.05, con lo que se concluy que no existe una diferencia estadstica significativa entre las medias, para un nivel de confianza del 95%.

Mtodos de determinacin de Ni mediante ETAAS

139

Tabla 70.- Tabla Anova. Fuente de variabilidad Entre mtodos Dentro de cada mtodo Total P = 0.7815 SC: Suma de cuadrados gl: grados de libertad CM: cuadrados medios SC 4.4057 239.073 243.48 gl 2 27 29 CM 2.2028 8.8548 F0 0.25

Al

realizar

un

chequeo de la varianza se comprob que no existe diferencia estadstica entre los valores de las desviaciones estndar de los datos de cada columna, para un nivel de confianza del 95%, aunque los mtodos del dihidrgenofosfato y de

digestin en microondas presentan una mayor variabilidad

III.3.5.5.- Conclusin
Se desarrollaron tres mtodos de anlisis de nquel en miel, dos directos y un tercero con digestin previa en microondas, ensayando los modificadores habituales (Pd-Mg y NH4H2PO4). Aunque los tres condujeron a resultados semejantes, el mtodo directo que usa Pd como modificador es el que mejores caractersticas analticas present: mayor repetitibilidad y sensibilidad, y la posibilidad de realizar las medidas en las rectas de calibrado; alcanzando, adems, un LOD muy superior a otros mtodos publicados para el anlisis de nquel en miel mediante ETAAS46. Ante la semejanza de los parmetros de atomizacin y de la concentracin de reactivos usados para los mtodos de determinacin de los metales Cu, Cr y nquel usando Pd como modificador, en el captulo siguiente se expondr un mtodo comn para los tres metales. Este mtodo fue construido a partir del estudio de las diferentes superficies de respuesta de los mtodos individuales, visualizndolas como superficies de contorno y calculando condiciones intermedias que no involucren prdida excesiva de seal de absorbancia.

Mtodo combinado para determinar Cu, Cr y Ni mediante ETAAS

141

III.3.6.- MTODO COMBINADO PARA EL ANLISIS DE NQUEL, CROMO Y COBRE MEDIANTE ETAAS
III.3.6.1.- Introduccin
Tras la optimizacin llevada a cabo en las secciones anteriores de diversos mtodos para la determinacin de diferentes metales mediante ETAAS en muestras de miel sin necesidad de tratamiento previo, en el presente captulo se propone un mtodo combinado para la determinacin de tres elementos: cobre, cromo y nquel, haciendo uso de paladio como modificador de matriz. La ventaja del mtodo combinado es una notable reduccin del tiempo de anlisis ya que la muestra se procesa al mismo tiempo para medir los tres metales, y en el caso de disponer de un equipo que permitiese la determinacin simultnea de los tres elementos, el mtodo combinado, tendra la ventaja adicional de acortar incluso aun ms el tiempo de anlisis. Para alcanzar este objetivo no fue necesario desarrollar nuevas estrategias de optimizacin, sino que una vez obtenidas las condiciones ptimas para cada metal, mediante diseo de experimentos (vase secciones III.3.3, III.3.4, III.3.5), se buscaron las condiciones comunes de trabajo estudiando las superficies de respuesta individuales. Los diseos de experimentos aplicados ofrecieron una herramienta rpida y apropiada para la optimizacin del mtodo combinado para los tres metales.

EN MIEL

III.3.6.2.- Optimizacin
Segn lo expuesto en la optimizacin de los mtodos de determinacin de cobre, nquel, y cromo, el modificador ms adecuado para la determinacin de los tres metales fue el paladio y adems en los tres casos la atomizacin se produjo a altas temperaturas. A partir de estas

142

Parte experimental

observaciones y usando de las superficies de respuesta obtenidas en los apartados III.3.3.2.2, III.3.4.2.1 y III.3.5.2.1, se ha tratado de encontrar unos valores de compromiso para las variables influyentes en cada una de las determinaciones individuales que permitiesen la determinacin conjunta de cobre, cromo y nquel con buenas caractersticas analticas.

En la determinacin de cromo usando el mtodo del paladio se ha demostrado que la adicin de perxido de hidrogeno ha sido relevante ([H2O2]=30% como ptimo); sin embargo en el mtodo para la determinacin de cobre sta es una variable con poca significacin; y en el caso del nquel, aunque la concentracin ptima de perxido de hidrgeno encontrada fue del 16%, no se produjo una variacin significativa de la seal (mayor del 10%) si la concentracin de H2O2 usada fuera del 26%. No se producen, pues, variaciones significativas de la seal para los tres metales cuando se emplea una concentracin de perxido de hidrgeno del 26%. En el mtodo desarrollado para la determinacin de cobre con paladio (III.3.3.2.2) se ha encontrado que el cido ntrico es una variable significativa, obtenindose un valor ptimo del 0.66 %, mientras que en el caso de la determinacin del cromo, de acuerdo con la superficie de respuesta obtenida (vase Figura 71), la concentracin de cido ntrico puede ser modificada en el rango 0.30.7% sin influencia en la seal, Para la determinacin de nquel, el efecto de esta variable es mnima. Concluyndose que
[HNO3] (m/v)
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 T-atom = 2700 C

rea
0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

una concentracin del 0.66 % puede ser elegida como la optima solucin de compromiso para la determinacin de los tres metales.

10

14

18

22

26

30

[H2O2] (% v/v)

Figura 71.- Superficie de repuesta de Cr en el mtodo de Pd, donde se observa una isorespuesta para valores de HNO3 comprendidos entre 0.3-0.7%.

El efecto de la adicin de triton X-100 a las muestras de mieles se ha estudiado para todos los mtodos desarrollados, encontrndose en todos los

Mtodo combinado para determinar Cu, Cr y Ni mediante ETAAS

143

caso que la concentracin ptima de este surfactante fue siempre del 0.02 %, por lo cual, sta es la cantidad usada para la determinacin de los tres metales en el mtodo individual y en el combinado. El efecto de la temperatura de secado en los tres mtodos individuales de determinacin con paladio, fue negativo. A medida que la temperatura aument siempre se produjo una disminucin de la respuesta. Aunque en el caso del nquel, el valor ptimo de la temperatura de secado fue 130 C, puede trabajarse con temperaturas menores sin producir una disminucin significativa de la seal (como puede observarse en la Figura 72), por lo cual, se eligi la
T-min = 900 C, [H2O2] = 26% (v/v), [Pd] = 1750 g L-1 2700 rea 0.089 0.093 0.097 0.101 0.105 0.109 0.113 0.117

temperatura de105 C como la idnea para secar el disolvente en el mtodo combinado, al no provocar prdidas de seal por encontrarse dentro de la

T-atom (C)

2600 2500 2400 2300 2200 100 120 140 160 180 200

T-sec (C)

Figura 72.- Efectos de las temperaturas de secado y atomizacin en la seal del Ni.

isosuperficie del ptimo. La temperatura slo de es

mineralizacin

estadsticamente significativa en el caso del cobre. Su valor ptimo de acuerdo con el diseo composicional central desarrollado para la determinacin en la seccin III.3.3.2.2 fue de 900 C. Esta temperatura no repercute significativamente de forma negativa en la seal del cromo y nquel de acuerdo con las superficies de respuesta obtenidas. Sin embargo, temperaturas de mineralizacin mayores de 900 C s producen una disminucin acusada de la seal del cobre. Por tanto, 900 C fue la temperatura de mineralizacin utilizada para el mtodo combinado. La temperatura de atomizacin fue uno de los factores que condujo a la idea de construir un mtodo comn, ya que los tres metales estudiados se atomizan a altas temperaturas. Aunque para el cobre es suficiente una temperatura de 2500 C y para el nquel de 2620 C, (Figura 31 y Figura 60) se us 2700 C para el mtodo combinado, temperatura necesaria para atomizar el cromo, asegurando la completa atomizacin de cobre y nquel..

144

Parte experimental

Se comprob experimentalmente, que esta temperatura no provoca prdidas de seal para cobre y nquel (menores del 10 %). En lo que se refiere a la concentracin del modificador para el caso del mtodo combinado, se observ, que una concentracin de paladio de 1600 mg L-1, es un valor que queda incluido en los intervalos ptimos de cada caso individual. Se ha elegido este valor de la concentracin de paladio como idneo para llevar a cabo el mtodo combinado dado que produjo unos valores adecuados de la seal analtica. Los tiempos de rampa y de permanencia fueron calculados experimentalmente en funcin de los que fueron usados en los mtodos individuales. Sus valores junto con el de los otros factores se resumen en la Tabla 72. Elegidas las condiciones comunes se pudo llevar a cabo la determinacin de los tres metales de forma combinada, sin perdida de sensibilidad, lo que ofreci la ventaja de un ahorro considerable de tiempo de anlisis. Procedimiento Se tomaron 500 L de miel diluida (20%) y se mezclaron con 20 L triton X-100 (1 %), 260 L de H2O2 (33 % m/v) y 65 L de HNO3 (10 %), y todo ello se llev a 1 mL con agua ultrapura 12 L de esta disolucin fueron inyectados en el atomizador junto con 18 L de disolucin de Pd (800 g mL-1). En las Tablas 71 y 72 detallan las condiciones de trabajo utilizadas.
Tabla 71.- Valores de los parmetros espectroscpicos utilizados para la determinacin de Cr, Cu y Ni en miel usando el mtodo combinado mediante ETAAS. Condiciones Longitud de onda Anchura de rendija Intensidad de corriente de la lmpara Cromo 357.9 nm 0.2 nm 7 mA Cobre 227.4 nm 1 nm 5 mA Nquel 232 nm 0.5 nm 4 mA

Mtodo combinado para determinar Cu, Cr y Ni mediante ETAAS

145

Tabla 72.-Valores ptimos de los factores estudiados para la determinacin de Cr, Cu y Ni en miel usando el mtodo combinado mediante ETAAS. [Pd] (mg L-1) 1600 Etapa Secado Mineralizacin Atomizacin Limpieza [Mg] (mg L-1) 0 Temperatura (C) 105 900 2700 2800 [H2O2] (% v/v) 26 Rampa (s) 10 10 0.7 0 Permanencia (s) 20 15 2.5 2.5 [HNO3] (% m/v) 0.66 Flujo Ar (L/min) 3 3 0 3 [triton X-100] (% v/v) 0.020 Lectura No No S No

III.3.6.3.- Caractersticas analticas del mtodo desarrollado

III.3.6.3.1.- Rectas de calibrado y adicin
La calibracin del instrumento fue llevada a cabo en el mtodo combinado, en matrices acuosas y de miel en el rango de 0.0-6.0 g L-1 para el cromo y el nquel, mientras que para el caso del cobre el calibrado se realizo en el rango comprendido entre 0.0-20 g L-1. Estos intervalos fueron seleccionados de acuerdo con las concentraciones encontradas en las muestras de miel. Las ecuaciones obtenidas para las rectas de calibrado y adiciones estndar para los tres metales se muestran en la Tabla 72.
Tabla 73.- Rectas de calibrado y adicin obtenidas con el mtodo combinado (cromo, cobre, nquel).

Mtodo Combinado

Calibrado A=0.034 [Cr] + 0.074 A=0.071 [Cu] + 0.014 A=0.041 [Ni] + 0.019

Adicin A=0.035 [Cr] + 0.088 A=0.068 [Cu] + 0.050 A=0.040 [Ni] + 0.031

De la evaluacin estadstica de las pendientes de las rectas de calibrado y adicin para el mtodo combinado, se concluy que en todos los casos fueron comparables con un 95% de significacin, lo cual indic la

146

Parte experimental

inexistencia de efecto matriz. Por ello, la determinacin de las concentraciones de estos metales en las muestras de mieles puede llevarse a cabo mediante el uso de calibracin acuosa.

III.3.6.3.2.- Recuperacin analtica del mtodo

La exactitud del mtodo propuesto fue evaluada midiendo la recuperacin en una muestra real a la que se le adicionaron los tres metales (en el intervalo de 0.0 6.0 g L-1 para el Cr y Ni y 0.0-20 g L-1.para el Cu). El rango y las recuperaciones obtenidas se muestran en la Tabla 74, pudindose concluir que los resultados obtenidos para el mtodo propuesto son aceptables (97.8 -103.1%).
Tabla 74.- Valores de la recuperacin obtenidos usando el mtodo combinado (cromo, cobre y nquel). Cr [Metal]aadido g L-1 2.0 4.0 6.0 Total Recuperacin (%) 101.5 101.9 99.20 100.8 Ni Recuperacin (%) 97.80 101.9 99.10 99.60 [Metal]aadido g L-1 5.0 10 20 Total Cu Recuperacin (%) 103.1 100.4 101.0 101.5

III.3.6.3.3.- Precisin del mtodo desarrollado

La precisin fue estudiada usando disoluciones de miel a las que se le aadi cromo y nquel (0.0, 2.0, 4.0 y 6.0 g L-1) y cobre (0.0, 5.0, 10.0, 20.0 g L-1). Las desviaciones estndar para las diez determinaciones de cada disolucin han estado por debajo del 10% tanto para el mtodo directo como para el combinado. En la Tabla 75, se reflejan los coeficientes de variacin encontrados para el mtodo combinado.

Mtodo combinado para determinar Cu, Cr y Ni mediante ETAAS

147

Tabla 75.- Coeficientes de variacin obtenidos con el mtodo combinado para la determinacin de cromo, nquel y cobre en miel por ETAAS. Cr Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (2.0 g L-1) Serie 3 (4.0 g L-1) Serie 4 (6.0 g L-1) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) xmedia SD RSD (%) 0.6 0.06 9.1 2.7 0.09 3.2 4.9 0.15 9.0 6.6 0.07 1.1 Ni 0.6 0.05 9.9 2.5 0.22 8.9 4.6 0.26 6.1 6.5 0.23 3.5 Serie 3 (10 g L-1) Serie 4 (20 gL-1) Serie 1 (0.0 g L-1) Serie 2 (5.0 g L-1) Cu 1.1 0.05 4.4 6.8 0.12 1.8 11.2 0.27 3.5 21.4 0.55 2.6

III.3.6.3.4.- Lmite de deteccin, lmite de cuantificacin y masa caracterstica del mtodo desarrollado
El lmite de deteccin (LOD), el lmite de cuantificacin (LOQ) y la masa caracterstica se han calculado segn las Ecuaciones 4 y 5. Los resultados obtenidos para el LOD, LOQ, y masa caracterstica (basado en la absorbancia integrada) estn detallados en la Tabla 76 de forma comparada con los obtenidos en cada caso en el mtodo directo individual. Como se puede observar, los mtodos individuales directos siempre produjeron valores de masa caracterstica, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin mejores que los correspondientes del mtodo combinado, tal y como era previsible, ya que en este ltimo caso la utilizacin de valores de compromiso para algunas variedades, produce un alejamiento del mximo de respuesta que marcara el ptimo; sin embargo, los lmites de deteccin obtenidos para el mtodo combinado no fueron muy diferentes de los logrados para los mtodos directos (excepto para el cobre), consiguiendo una sensibilidad suficiente para la determinacin de los metales estudiados en las muestras de mieles.

148

Parte experimental

Tabla76.- Valores de LOD, LOQ y mo para los diferentes mtodos de determinacin de cromo, cobre y nquel. Mtodo Elemento mo (pg) Individual Cr Cu Ni Cr Cu Ni 2.30 12.3 12.2 3.33 12.2 12.8 LOD (g L-1) 0.170 0.210 0.330 0.210 0.350 0.370 LOQ (g L-1) 0.580 0.680 1.07 0.730 1.18 1.20

Combinado

III.3.6.4.individuales

Comparacin

estadstica

con

los

mtodos

Con el fin de validar este mtodo se midieron 7 rplicas de una misma muestra y los resultados fueron comparados con aquellos que proporcionaron los mtodos individuales para 7 rplicas de esa misma muestra. Al aplicar un test Anova no se encontraron diferencias significativas para las medias proporcionadas por este mtodo y cada una de las proporcionadas por los mtodos individuales.

III.3.6.5.- Conclusin
Se desarroll un mtodo que permite la determinacin mediante ETAAS usando Paladio como modificador de tres metales: cobre, cromo y nquel, sin tratamiento previo de la muestra y con las mismas condiciones de preparacin de la misma. Este planteamiento supone un ahorro considerable de tiempo, sin prdida significativa de sensibilidad o reproducibilidad en comparacin con los mtodos desarrollados para la determinacin individual de cada metal.

Determinacin de metales mayoritarios mediante ICP-AES

149

III.4.- DETERMINACIN DE METALES MAYORITARIOS MEDIANTE ICP-AES

III.4.1.- Introduccin
La miel es uno de los alimentos ms complejos producidos por la naturaleza. La composicin y propiedades del producto final dependen del origen botnico del nctar o secrecin usado. Pero aun as todos los tipos de miel comparten una serie de caractersticas, un contenido en humedad por debajo del 20%, un contenido en azcares reductores del 60-65 % y un contenido total de sacarosa del 5-10 %, de forma que, no se pueden usar los componentes mayoritarios para distinguir muestras, pero s su contenido mineral que depende ampliamente del origen botnico, fuentes minerales en el suelo, condiciones climticas, etc.,126. Por este motivo, el estudio del contenido metlico se justifica, no slo desde el punto del conocimiento de los diferentes componentes de la miel, sino tambin como una herramienta de cara a trabajos de caracterizacin y tambin a su posible utilizacin como bioindicador de la contaminacin ambiental. La determinacin de metales mayoritarios en muestras de miel se ha llevado a cabo usando diferentes tcnicas, tales como la espectrometra de absorcin atmica con llama126,127,128,129, la espectrometra de absorcin atmica con atomizacin electrotrmica30, espectrometra de emisin atmica con plasma acoplado por induccin34,38,130, voltametra37, cromatografa inica41, espectrometra de fluorescencia de rayos X con reflexin total78, y anlisis de activacin neutrnica131. Actualmente la tcnica ms ampliamente empleada, a pesar de que es necesario un tratamiento previo de la muestra, es la espectrometra de emisin atmica con plasma acoplado por induccin debido a su carcter multielemental. En base a estas consideraciones, fue la tcnica empleada en el presente trabajo para la determinacin de metales mayoritarios en muestras de miel de la comunidad gallega.

150

Parte experimental

III.4.2.- Preparacin de la muestra

Para la determinacin de los metales mayoritarios por ICP-AES se procedi a una preparacin clsica de la muestra segn el mtodo oficial132. Una vez puestos los correspondientes crisoles de porcelana a peso constante se pesaron de forma exacta sobre cada uno de ellos 2.0 g de miel sin diluir y se sometieron a una temperatura de 100 C (para secar evitando as prdidas por formacin de espumas o rebosamiento). Por ltimo se introdujeron en un horno de mufla a una temperatura de 550 C hasta peso constante de las cenizas (normalmente entre 12 y 14 horas). Las cenizas obtenidas se disolvieron en 2 mL de HCl 0.1 M y se llevaron a un volumen exacto de 10 mL (disolucin al 20% m/v en miel). Sobre estas disoluciones de trabajo se procedi a la determinacin de metales mayoritarios.

III.4.3.- Consideraciones preliminares

Con el fin de contrastar los resultados obtenidos por ICP-AES (llevado a cabo en el laboratorio de Servicios Centrales de Investigacin de la Universidad de Santiago de Compostela en el Campus de Lugo) se realiz una comparacin estadstica con los producidos sobre las mismas muestras por espectrometra de absorcin atmica con llama en nuestro laboratorio. Se hicieron medidas para 8 metales (Ca, Li, Mn, Zn, Na, Mg, Fe y K) por ambas tcnicas en diferentes muestras de miel. Del test de parejas empleado puede deducirse que no existen diferencias significativas (a un nivel de significacin de 95%) entre los resultados proporcionados por ICPAES y por FAAS. A la vista de estos resultados y por tratarse de una tcnica multielemental, con la sensibilidad adecuada, se tom la decisin de emplear la tcnica de ICP-AES de los Servicios Generales de Investigacin de la Universidad de Santiago de Compostela, para determinar la concentracin de estos metales en las 40 muestras de miel representativas de la Comunidad Autnoma de Galicia. Se us un instrumento de Perkin Elmer, modelo

Determinacin de metales mayoritarios mediante ICP-AES

151

Optima 4300 DV que permite la medida simultnea de los elementos con lectura axial o radial intercambiables.

III.4.4.- CARACTERSTICAS ANALTICAS

III.4.4.1.- Rectas de calibrado
En esta tcnica se usan las rectas de calibrado para la medida de la concentracin de metales ya que al atomizar a temperaturas tan elevadas se desprecian las interferencias de matriz. La Tabla 77 nos muestra las rectas de calibrado para la cuantificacin de los 8 metales.
Tabla 77.- Rectas de calibrado obtenidas para cada metal analizado por ICP-AES a la longitud de onda caractersticas. Metales Mn Fe Zn Li Ca Na K Mg Long. onda 257.6 238.2 206.2 670.8 317.9 589.6 766.5 285.2 Recta de Calibrado y=270125x+19713 y=5961.4x+264.65 y=24958x+1030.1 y=91061x+4225.2 y=47007x-33518 y=15497x-16930 y=3621x+3667.9 y=193578x+31532 Regresin r2=0.9970 r2=0.9998 r2=0.9980 r2=0.9997 r2=0.9976 r2=0.9950 r2=0.9999 r2=0.9999

III.4.4.2.- Precisin y sensibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la precisin de los mtodos, se prepararon disoluciones patrn de diferentes concentraciones para cada metal a determinar. Para cada disolucin se midieron 10 rplicas y se calcularon los coeficientes de variacin. La Tabla 78 muestra los datos de la RSD para cada uno de los metales estudiados mediante ICP. La sensibilidad calculada segn la Ecuacin 3 se puede observar tambin en la Tabla 78 donde se observan los valores del LOD y LOQ para cada uno de los metales analizados.

152

Parte experimental

Tabla 78.- Precisin, LOD Y LOQ para cada uno de los mtodos para los metales medidos por ICP. Metales RSD (%) 2.2 4.3 1.4 4.3 8.6 3.4 2.8 2.1 LOD (g L-1) 0.14 2.31 1.80 1.29 3.27 12.45 43103 0.51 LOQ (g L-1) 0.47 7.70 6.0 4.30 10.9 41.5 143103 1.70 LOD (g g-1) 0.70 11.55 9.00 6.45 16.35 62.25 215103 2.55 LOQ (g g-1) 2.35 38.5 30.0 21.5 54.5 207.5 715103 8.5

Mn Fe Zn Li Ca Na K Mg

La exactitud no fue hallada por no disponer de un material de referencia, pero se admite que es suficiente al ser comparables los resultados obtenidos por este mtodo con aquellos obtenidos mediante FAAS (seccin III.4.3). Estas caractersticas analticas corroboran la idoneidad de la tcnica para determinar los 8 metales mayoritarios en muestras de miel de la Comunidad Autnoma de Galicia.

Bibliografa

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IV.- PARTE II: LA MIEL COMO

BIOINDICADOR. UN ESTUDIO QUIMIOMTRICO

Resultados

161

IV.1.- INTRODUCCIN
En los ltimos aos, se ha llevado a cabo investigaciones acerca del contenido metlico en mieles con el fin de alcanzar tres objetivos posibles. El primero de ellos es establecer los niveles de los distintos elementos en mieles, con especial inters, de metales pesados. Bajo este punto de vista, diversos autores han determinado el contenido mineral de la miel de distintos orgenes botnicos y geogrficos1,2,3,4. El segundo objetivo de la determinacin de metales en mieles ha sido el procesar la informacin contenida en los datos qumicos mediante tcnicas estadsticas multivariante con el fin de establecer el origen botnico y geogrfico del producto5,6,7,8. A travs de este prometedor enfoque, tcnicas quimiomtricas de reduccin de datos y visualizacin (tales como anlisis de componentes principales y/o anlisis de cluster) revelaron estructuras latentes en las complejas matrices de datos estudiadas. En distintos trabajos9,10,11,12 se han desarrollados tambin diversos sistemas de clasificacin y prediccin basados en las tcnicas de aprendizaje supervisado tales como anlisis discriminante, k-vecinos ms prximos (KNN), modelizacin suave de clases anlogas independientes (SIMCA) y diferentes tipos de redes neuronales. El tercer objetivo de la determinacin del contenido metlico en miel es y ha sido evaluar su empleo para monitorizar la contaminacin en diversas regiones. Los productos de las colmenas, especialmente la miel, han sido considerados como un indicador apropiado para un amplio grupo de sustancias contaminantes como ya se puso de manifiesto en la seccin I.5. El propsito de esta ltima parte del presente trabajo consisti en explorar quimiomtricamente el uso de la miel como bioindicador con el fin de monitorizar la contaminacin ambiental por metales pesados en el entorno de ubicacin de la colmena: rural, urbano e industrial.

162

Parte experimental

IV.2.- METODOLOGA
Determinacin analtica: 13 diferentes metales (Ca, Cd, Cr, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, Pb y Zn) fueron determinados en 40 muestras de miel de la comunidad gallega. Cd, Cu, Cr Pb y Ni se midieron mediante ETAAS, mientras que los 8 restantes elementos se analizaron mediante ICP-AES. En ambos casos las tcnicas empleadas fueron descritas en detalle en la parte I de este trabajo. Anlisis de datos: Se construy una matriz de 40x13 cuyas filas representaron las diferentes muestras analizadas (objetos) y cuyas columnas correspondieron a los 13 metales analizados (variables, vase Anexo I). El anlisis quimiomtrico fue desarrollado por medio de los paquetes de contenidos estadsticos Statgraphics13, Parvus14 y Pirouette15. El desarrollo de las redes neuronales se realiz mediante diferentes programas escritos en programacin Matlab16. Muestras de miel: 40 muestras de miel representativas de Galicia con origen garantizado y producidas segn los mtodos tradicionales de la regin, fueron suministradas por la Asociacin Lucense de Apicultura (APLA) y por la Agrupacin para o Desenvolvemento e Formacin do Sector Apcola Galego (AIE). 22 muestras fueron producidas en reas urbanas e industriales (para propsitos de identificacin fueron

respectivamente codificadas como 1 y 2), mientras las 18 muestras restantes proceden de zonas no contaminadas (codificadas como 3). En la Figura 73, se presenta un mapa de Galicia con las distintas zonas de procedencia de las muestras analizadas. Todas las muestras examinadas fueron mieles de tipo multifloral, envasadas en recipientes de vidrio y almacenadas en la oscuridad a 3-4 C hasta el momento del anlisis. En ningn caso las mieles sufrieron tratamientos que pudieran alterar su composicin.

Resultados

163

Figura 73.- Mapa de Galicia con las distintas zonas de muestreo estudiadas
Cedeira Ortigueira Burela Muras Fene As Pontes Villalba Arteixo Laxe Cee Melide Castro Pastoriza de Teixeiro A Fonsagrada Castroverde Baralla Os Ancares Cervantes

Outeiro

Samos Chantada Luintra Sober

Pedrafita

Larouco Manzaneda Montederramo O Porrio Xunqueira Santa Cruz A Gudia Baltar Ris

Vigo Mos

Tomio Muios

Lobios

IV.3.-

DETERMINACIN EN MIELES

DEL DE LA

CONTENIDO COMUNIDAD

METLICO GALLEGA

Los resultados de los 13 elementos determinados en las muestras de miel gallegas son resumidos en la Tabla 79 (valores medios, desviacin estndar, mximo y mnimo), y en el Anexo 1 se encuentran los resultados para cada miel en concreto. A la vista de los resultados se dividi para su estudio el conjunto de metales en minoritarios (Cd, Pb, Cr, Cu y Ni), y mayoritarios (el resto de los determinados). Dentro de los primeros, asociados al impacto ambiental, los menores valores medios correspondieron a Cd, Cr y Pb (2.54, 12.2, 15.0 ng g-1). Entre los mayoritarios las concentraciones ms elevadas correspondieron a K (1417 g g-1), Mg (103 g g-1) y Na (92.6 g g-1).

164

Parte experimental

Tabla 79.- Valores medios, desviacin estndar, valores mximos y valores mnimos para cada uno de los metales en el total de las muestras analizadas (n=40).
Metal [Pb] (ng g-1) [Cd] (ng g-1) [Ni] (ng g-1) [Cr] (ng g-1) [Cu] (ng g-1) [Mn] (g g-1) [Fe] (g g-1) [Zn] (g g-1) [Li] (g g-1) [Ca] (g g-1) [Na] (g g-1) [K] (g g-1) [Mg] (g g-1) V. medio 15.0 2.54 53.9 12.2 814 7.77 1.99 2.20 8.15 90.8 92.6 1417 103 S. D. 9.77 1.26 44.7 7.66 486 5.28 3.53 1.44 8.93 38.5 36.8 680 82.8 V. mximo 49.4 6.21 172 41.5 2048 20.3 20.6 7.10 38.1 185 194 3016 308 V. mnimo 1.96 0.78 11.8 5.62 78.8 0.46 2.31 0.04 0.03 40.6 47.1 283 18.2

IV.3.1.- Metales minoritarios

Los metales anteriormente considerados como minoritarios (Cd, Pb, Cr, Cu y Ni) fueron cuantificados en las 40 muestras de miel antes indicadas y pertenecientes a distintas zonas geogrficas de la comunidad autnoma de Galicia, empleando la tcnica de ETAAS y las metodologas apropiadas, desarrolladas en la parte I de esta memoria.
20

IV.3.1.1.- Cadmio
Para la determinacin de este metal se emple el mtodo que hace uso del dihidrN de muestras
15
16

10
10

genofosfato amnico como modificador. Los resultados obtenidos se representan en la Figura 74, en la Tabla 79 y en el Anexo 1.

4 3

0
.8 - 1.7 1.7 - 2.6 2.6 - 3.5 3.5 - 4.4 4.4 - 5.3

1 5.3 - 6.3

Cd (ng/g)

Figura 74.- Histograma de frecuencias para la concentracin de Cadmio en las muestras de miel analizadas.

Resultados

165

Los niveles de Cadmio encontrados en el presente trabajo estn comprendidos entre 0.78-6.2 ng g-1. Estos valores son ligeramente inferiores a los obtenidos en muestras de miel turcas (4.53-10.8 ng g-1) y concordantes con los de otras mieles espaolas (1.2-5.4 ng g-1)17. Debe sealarse, observando el histograma, que la mayora de las muestras presentaron concentraciones menores de 2.6 ng g-1. Concentraciones de Cd medidas por Caroli y col.18 en mieles italianas fueron ligeramente inferiores (0.700.08 ng g-1) comparables a las dadas por Betinelli y col.19 (0.65-0.80 ng g-1), aunque en muestras de este mismo pas, Buldini y col.20 encuentran valores mximos de hasta 550 g Kg-1 (los mayores de todos los registrados en la bibliografa). Tambin Devillers y col.21,22 para mieles de distintos pases europeos (0.08-0.250 ppm) y por Iannidou y col.
23

para mieles griegas

(0.078-0.222 mg Kg-1),determinaron valores de Cd elevados en las muestras analizadas. Por ltimo, Przbylowski y col.24, en mieles polacas, dan cuenta de valores mnimos parecidos a los de este trabajo (0.008 mg Kg-1), aunque los valores mximos fueron ms coincidentes con los de los dos autores anteriores que con los aqu presentados. Por otro lado, es importante el indicar que, en el Codex Alimentarius (Revised Codex Standard for honey, 2001)25 no se han establecidos valores mximos permitidos para los metales pesados presentes en mieles, a pesar de que podra ser muy importante el conocer la concentracin de dichos metales en estas muestras con vistas a evaluar la calidad de este producto.
20

IV.3.1.2.- Plomo
17

ficado mediante ETAAS empleando el modificador PdMg por ser el que mejores caractersticas analticas present tanto en sensibilidad como en reproducibilidad

N de muestras

El plomo fue cuanti-

10
9 8

0
-3 - 7 7 - 16 16 - 25 25 - 34

1 34 - 43

1 43 - 53

Pb (ng/g)

Figura 75.- Histograma de frecuencias para la concentracin de plomo en las muestras de miel analizadas.

166

Parte experimental

(seccin III.3.2.3). Los resultados de su aplicacin a las muestras de miel analizadas se representan como histograma de frecuencias en la Figura 75, se recogen como valores medios, desviacin estndar, valor mximo y valor mnimo en la Tabla 79 y se detallan en el Anexo 1. Los valores encontrados para el contenido de este metal en las muestras analizadas se hallan en el rango comprendido entre 2.0 y 49.4 ng g-1 (valor medio de 16.0 ng g-1). La mayora de las muestras presentaron una concentracin inferior a 26 ng g-1. Estos resultados son, en general muy inferiores a los encontrados por otros autores, en diferentes localizaciones: Devillers y col.21,22 (0.28-1.08 ppm), Yilmaz y col.26 (1.86-4.30 mg kg-1), Vias y col.17 (0.07-0.27 g g-1), y Celechovska y col.27 que en mieles checas llegaron a registrar concentraciones superiores a los 1000 g Kg-1. En mieles turcas, ren y col.28, encontraron tambin concentraciones superiores, con valores comprendidos entre 32.9 y 55.2 mmol Kg-1. En mieles de Polonia Przybylowski y col.24 han encontrado concentraciones ligeramente superiores a las del presente trabajo (0.025-0.071 mg kg-1), similar situacin aconteci para mieles de eucalipto italianas (91-141 ng g-1) analizadas por Bettinelli y col.19, aunque en este mismo trabajo, las mieles de robinia presentaron concentraciones inferiores, ms acordes con las muestras gallegas aqu analizadas (23-31 ng g-1). Por el contrario Caroli y col. obtuvieron valores inferiores en mieles de Italia (3.97 ng g-1).
14

18,29

IV.3.1.3.- Cobre, cromo y nquel

N de muestras

12
12

10
10 9

El cobre junto con el cromo y nquel, fueron cuantificados mediante el mtodo

2
2 2

combinado desarrollado para la determinacin por medio de

0
-100 - 267 267 - 633 633 - 1000 1000 - 1367 1367 - 1733 1733 - 2100

Cu (ng/g)

ETAAS, que se optimiz en la

Figura 76.- Histograma de frecuencias para la concentracin de Cobre en las muestras de miel analizadas.

Resultados

167

seccin III.3.6.

Los resultados se presentan como histogramas de

frecuencias en las figuras 76, 77 y 78, en la Tabla 79 y referidos a cada muestra en el Anexo 1. En lo que concierne al cobre, los resultados comparados con los obtenidos por otros autores son los siguientes: los valores encontrados en el presente trabajo (79-2049 ng g-1) han sido del mismo nivel que los dados por ren y col.28 para mieles de Turqua (0.450-1.24 ppm) y superiores a los proporcionados por Caroli y Betinelli en mieles de Italia 19, 18, 29 (141-216 ng g-1). Concentraciones en el mismo rango que el presente trabajo han sido registradas en mieles de Francia21,22 (0.03-2.30 ppm), en mieles de acacia de Eslovenia30 (0.78-3.55 mg Kg-1) e Italia20 (1200-2800 g Kg-1). Merin31, aport valores de concentracin de Cu para mieles de Israel (0.1-0.9 g g-1), comparables a los de otras mieles gallegas9, lo mismo que Yilmaz y col.26, que para muestras procedentes de Anatolia describen un intervalo de concentraciones 1800170 ng g-1, casi coincidente con el intervalo registrado para muestras gallegas analizadas en el presente trabajo.

En cuanto al contenido en cromo se

-1

observ

que

su

30

concentracin vari entre 5.6 y de 12.2 ng g-1 y con un contenido inferior a 10.5 ng g-1 en la mayora de los casos. Respecto a
N de muestras

24

41.5 ng g , con un valor medio

20

10
9

lo publicado por otros autores y otras regiones debe indicarse que existe un amplio rango de

0
4 - 10 10 - 17

2 17 - 24 24 - 30 30 - 37 37 - 44

Cr (ng/g)

concentraciones registradas en la

Figura 77.- Histograma que refleja la frecuencia de concentracin para el Cromo en las muestras analizadas.

bibliografa. As, en las mieles italianas, la concentracin de cromo se halla entre 2.73 y 39.0 ng g-1 segn datos de Caroli y col.18,29, y en torno a 3.93 ng

168

Parte experimental

g-1 Forte y col.32. Concentraciones superiores ha sido determinadas por Devillers y col.21,22 en mieles de Francia (0.08-0.36 ppm). El contenido de nquel encontrado en las muestras analizadas en este trabajo estuvo en el rango comprendido entre 11.80 y 172.2 ng g-1, contenido que es superior al encontrado en las muestras italianas por Caroli y col.18,29 (7-49 ng g-1) y Betinelli y col.19 (7.0-31.0 ng g-1), pero inferior al de muestras de este mismo pas analizadas por Buldini y col.20 (375-400 g
N de muestras
30

Kg-1), e inferior a las francesas analizadas por Devillers y col. (0.05-0.52 ppm). Tambin el nivel de Ni en mieles de Galicia

20

21

10

7 5

es muy inferior al registrado en

0

3 2 5 - 33 33 - 62 62 - 90 90 - 118 2 118 - 147 147 - 175

mieles de Israel31 (0.3-1.0 g g-1) y mieles de Eslovaquia mg Kg ).

-1 30

Ni (ng/g)

(0.6-1.7

Figura 78.- Histograma de frecuencias de concentracin para el nquel en las 40 muestras estudiadas.

IV.3.2.- Metales mayoritarios

Los resultados obtenidos para los diferentes metales mayoritarios se resumen en la Tabla 79 y se detallan en el Anexo 1. En todos los casos las determinaciones se llevaron a cabo mediante ICP-AES sobre la disolucin resultante al disolver las cenizas obtenidas por calcinacin en HCl 0.1 M (vase apartado III.2.2.2). En las Figuras 79-86 se muestran las frecuencias de distribucin de concentraciones de estos metales, que no presentan en la mayora de los casos una distribucin gaussiana, sino que concentraciones menores fueron las que presentaron frecuencias mayores, mientras que concentraciones altas, correspondieron a casos ms excepcionales. Tambin para metales mayoritarios fue difcil comparar los resultados obtenidos para los metales determinados en este trabajo con los

Resultados

169

publicados en los ltimos aos por diferentes autores. Los motivos de esta dificultad fueron: las diferentes especies botnicas de las cuales proceden las mieles a comparar, la diferente composicin geoqumica del suelo de la zona estudiada, y la posible contaminacin medioambiental, entre otros. An as, se ha intentado realizar una comparacin de las concentraciones de los metales mayoritarios halladas con las que presentan diversos autores en mieles de diversos orgenes botnicos y geogrficos.
20
19
13

14

12

10

N de muestras

N de muestras

10

8 7

2
2 2 2

0
10 - 61 61 - 112 112 - 162 162 - 213 213 - 264 264 - 315

0
125 - 625 625 - 1125 1125 - 1625 1625 - 2125 2125 - 2625 2625 - 3125

Mg (g/g)

K (g/g)

para la Figura 79.- Histograma de frecuencias de Figura 80.- Histograma concentracin para el Mg en las 40 muestras concentracin de K en las muestras de miel analizadas de miel analizadas.
14
20

13

12
16

10
10 10

N de muestras

N de muestras

10
9

4
4
5

2
2 1

0
45 - 70 70 - 95 95 - 120 120 - 145 145 - 170 170 - 195

0
35 - 62 62 - 88 88 - 115 115 - 142

1 142 - 168 168 - 195

Na (g/g)

Ca (g/g)

82.Histograma para la Figura 81.- Histograma para la concentracin Figura concentracin de Ca en las muestras de miel de Na en las muestras de miel analizadas. analizadas.

En general, es necesario indicar que los valores mximos, para estos metales, encontrados en mieles gallegas fueron mayores que los encontrados por otros autores. As, el valor mximo para Magnesio fue 308.3 g g-1, cuando el mayor de los registrados en bibliografa es de 109.5 ppm dado por

170

Parte experimental

Devillers21,22 para mieles de acacia en Francia. Para este metal los valores mnimos coinciden, sin embargo, con los aportados por Merin31 y ren28 en mieles israelitas y turcas, respectivamente. En cuanto a potasio y sodio, los valores observados en otros trabajos estn incluidos dentro del intervalo de concentraciones dadas en ste: con valores mximos inferiores y con valores mnimos semejantes o ligeramente inferiores. En lo que se refiere al calcio, tambin, se vuelve a repetir esta misma tendencia y solamente Merin31 encontr, en mieles de Israel, valores superiores (67-310 vs. 41-185 g g-1).
30

12

11

10
25

20

N de muestras

N de muestras

6
6 6

10

6 5

2
2

0 0- 6 6 - 13 13 - 19

19 - 26

26 - 32

32 - 39

0
.2 - .9 .9 - 1.6 1.6 - 2.3 2.3 - 3.0 3.0 - 3.7 3.7 - 4.4 4.4 - 5.1 5.1 - 5.8 5.8 - 6.5 6.5 - 7.2

Li (g/g)

Zn (g/g)

Figura 83.- Histograma para la concentracin Figura 84.- Histograma para la concentracin de Zn en las muestras de miel analizadas. de Zn en las muestras de miel analizadas.
40

12

11

10
33 10

30
9

N de muestras

20

N de muestras

4 10
3

2
2 5

0 0- 4 4- 7 7 - 11 11 - 14 14 - 18 18 - 21

0 0- 4 4- 7 7 - 11 11 - 14 14 - 18 18 - 21

Fe (g/g)

Mn (g/g)

Figura 85.- Histograma para la concentracin Figura 86.- Histograma para la concentracin de Fe en las muestras de miel analizadas. de Zn en las muestras de miel analizadas.

Resultados

171

El litio es un metal que ha sido muy poco estudiado en miel. Los pocos valores registrados en la bibliografa difieren con los presentados en este trabajo. Devillers21,22 mostr valores entre 0.02 y 0.24 y Merin31 valores inferiores a 0.3 g g-1 frente a los 0.51-38 g g-1 de este trabajo. Para el zinc los valores publicados son muy semejantes a los encontrados en ste o estn dentro del intervalo de concentraciones (0.047.1) y slo las concentraciones dadas por Przybylowski24 (4.17-22.3 mg Kg-1) son ms elevadas. Para valores de hierro en la bibliografa se registran valores mximos inferiores a los de este trabajo (20.6 g g-1) a excepcin del publicado Devillers21 en mieles no francesas (86.76 ppm). ren y col.28 en mieles turcas recolectadas en las cercanas de una planta trmica han encontrado valores superiores (19.7 ppm) muy semejantes a los valores mximos de este trabajo (20.6 g g-1). En cuanto al manganeso se observ la misma tendencia que en el caso del hierro y slo Devillers21 en mieles no francesas encuentra valores superiores (42.81 ppm) a la concentracin mxima de mieles de Galicia (20.3 g g-1). En los valores mnimos s se observ semejanza en las concentraciones con las encontradas en el presente trabajo (0.46 g g-1). Las concentraciones de Na, K, Ca, Mg, Cu, Fe y Mn se hallan en los mismos rangos de magnitud que las dadas por Rodrguez-Otero1 y Latorre 33 para otras mieles de la comunidad autnoma de Galicia.

IV.4.- ESTUDIO QUIMIOMTRICO

Uno de los objetivos del presente trabajo es evaluar la capacidad de la miel como bioindicador de la contaminacin ambiental por metales pesados en la comunidad autnoma de Galicia. Para ello el conjunto de muestras representativas se han obtenido considerando su pertenencia a zonas industriales (codificadas como 1), a zonas urbanas (codificadas como 2) y a zonas rurales no impactadas (codificadas como 3).

172

Parte experimental

Una vez realizados los anlisis del contenido metlico los datos fueron estudiados mediante anlisis univariante y mediante tcnicas multivariantes con el fin de descubrir las posibles relaciones entre los valores de concentracin y el origen de las muestras.

IV.4.1.- Reduccin de datos y visualizacin

En primer lugar, se realizo un estudio univariante con el fin de examinar si alguna de las variables por si sola es capaz de discriminar entre los tres orgenes establecidos. Mediante las representaciones Box-Whisker (ver Figuras 87 y 88), se pudo comprobar que, aunque hay diferencias entre los valores medios para los diferentes metales, existe una superposicin de rangos obtenidos para las muestras en funcin de su origen (industrial, urbano o rural). Por ello, y dado que ninguno de los metales examinados constituye un elemento discriminante para los diferentes orgenes, se evalu un enfoque multivariante con el fin de estudiar si el conjunto total de la informacin qumica obtenida permitir la consabida discriminacin entre zonas.

350

200

300

150 250

Concentracin

200

Concentracin
Ca (g/g)

100

150

100 50

50

Na (g/g) Mg (g/g)
0

Ni (ng/g) Pb (ng/g)

2
Grupo de muestras

2
Grupo de muestras

Figura 87.- Diagrama Box-Whisker de las concentraciones de Ca, Na y Mg; 1: muestras de zonas industriales, 2: muestras de zonas urbanas, 3: muestras de zonas rurales no impactadas.

Figura 88.- Diagrama Box-Whisker de las concentraciones de Ni y Pb; 1: muestras de zonas industriales, 2: muestras de zonas urbanas, 3: muestras de zonas rurales no impactadas

La matriz multivariante de trabajo se prepar a partir de los datos de los 13 metales (mayoritarios y minoritarios) analizados en las 40 muestras

Resultados

173

objeto de estudio, pertenecientes a las tres zonas consideradas (industriales, urbanas y rurales) Una primera estrategia de estudio en quimiometra al enfrentarse a un nuevo conjunto de datos es aplicar grupos de tcnicas que permitan revelar las estructuras latentes residentes en dicho conjunto, estas son anlisis en componentes principales y anlisis de cluster.

IV.4.1.1.- Anlisis de componentes principales

Anlisis de componentes principales34 (ACP) es una tcnica que transforma la matriz de datos original (Xnxm) en un producto de dos matrices, la primera de las cuales contiene informacin sobre los objetos o muestras (matriz de scores o de puntuaciones Snxm) y la segunda de las variables (matriz de loadings o de cargas Lmxm). En el presente caso se aplic sobre los datos originales autoescalados el anlisis de componentes principales para obtener un estudio de los datos en una dimensin reducida,
Ca Cd Cr Cu Fe K Li Mg Mn Na Ni Pb Zn Tabla 80.- Puntuaciones de las variables en los tres primeros componentes principales. Componente principal 1 0.392 -0.052 -0.116 0.004 -0.120 0.428 0.248 0.488 0.426 -0.051 0.354 -0.155 -0.032 Componente principal 2 -0.320 0.238 0.175 0.418 -0.409 0.070 0.104 0.010 0.222 0.075 0.234 -0.308 -0.495 Componente principal 3 -0.033 0.082 0.151 0.323 0.497 0.004 0.405 -0.019 0.044 0.592 0.187 0.244 0.066

reteniendo la mxima variabilidad datos. Los loadings o puntuaciones de las variables en los tres primeros componentes principales, que pueden observarse en la Tabla 80, mostraron que las variables dominantes (que represent el 26.44 % de la de los

en el primer componente principal

variabilidad total) fueron Mg, Mn, K, Ca, Ni y Li (todos ellos en la parte positiva). Cu, Cd y Cr (en la parte positiva de PC2) y Fe, Zn y Pb (parte

174

Parte experimental

negativa) son los dominantes en el segundo componente principal (que represent el 17.24 % de la varianza total de los datos). Qumicamente, el primer componente principal puede relacionarse con las caractersticas edafolgicas y las practicas agrcolas, mientras que el segundo componente puede ser interpretado en trminos de relacin con la contaminacin ambiental por metales pesados. Cuando se llev a cabo una representacin de las muestras de miel en el espacio formado por los tres primeros componentes principales (56.12% de la varianza total acumulada), se detect una separacin natural en dos grupos. Como se puede observar en la Figura 89, la miel de las zonas rurales no impactadas se agrupan en la parte positiva del PC1, mientras que las muestras de los otros dos orgenes se disponen en un slo grupo (en la parte negativa de PC1), que incluye muestras urbanas e industriales.

Componente Principal 3

3.9 2.9 1.9 0.9 -0.1 -1.1 -2.1 -2.6 -0.6 1.4 3.4 5.4 -6 -4 -2 0 2 4

Componente Principal 1

Componente Principal 2

Figura 89.- Representacin de las muestras en el espacio generado de los tres primeras componentes principales. muestras de zonas industriales, muestras de zonas urbanas, muestras de zonas rurales no impactadas.

IV.4.1.2.-Anlisis de clusters
Debido a su carcter no supervisado, el anlisis de clusters es una tcnica comnmente aplicada en combinacin con ACP con el fin de describir la estructura latente de un conjunto de datos, antes de emplear otras tcnicas quimiomtricas. Anlisis de cluster puede desvelar el agrupamiento natural existente entre las muestras en el espacio tridimensional. Para lograr

Resultados

175

este objetivo, se aplic anlisis de Cluster a los datos autoescalados. La similaridad entre muestras se calcul en base al cuadrado de la distancia Eucldea, mientras que el procedimiento de agrupamiento usado como con el fin de establecer los clusters fue el mtodo de Ward35. Los resultados obtenidos se representan en forma de dendrograma de la Figura 90.

Distancia

c a b

111 11 11 3112 22 122 22 23 32 32 313 33 33 33 32 33 333

Figura 90.- Dendrograma obtenido para el anlisis de Clusters de las 40 muestras analizadas. 1: muestras de zonas industriales; 2: muestras de zonas urbanas; 3: muestras de zonas rurales no impactadas.

A la vista del mismo, se identificaron tres clusters (codificados como a, b y c) para un nivel de similaridad de 0.4 (Figura 90). De izquierda a derecha, el primer cluster (cluster a) es un grupo formado por 8 muestras de zonas industriales que incluyen una muestra de zona rural no impactada. El segundo cluster (b) esta principalmente formado por muestra de miel de zonas urbanas, a pesar de que incluye algunas muestras de los otros dos orgenes. El tercer cluster (c) est formado por muestras de origen rural no impactadas, incluyendo una muestra de zona urbana. El anlisis de cluster confirm la separacin entre muestras rurales no impactadas y muestras impactadas urbanas e industriales, separacin que ya haba sido puesto de manifiesto mediante ACP. Adems, el dendrograma de la Figura 90 confirma la superposicin de las categoras urbana e industrial en el espacio 13-dimensional de las variables. Los dos procedimientos no supervisados aplicados al estudio de las estructuras latentes de los datos produjeron resultados consistentes entre si, la separacin de 2 grupos de muestras bien

176

Parte experimental

diferenciadas correspondientes a zonas rurales no impactadas, por una parte, y de otra parte zonas industriales y urbanas (muestras stas ltimas que aparecen solapadas en un nico grupo) Por todo ello puede concluirse que la informacin qumica presente en los datos del contenido metlico podra constituir la base para el desarrollo de procedimientos de clasificacin que pudiesen, en funcin de las caractersticas qumicas de una muestra de miel, proporcionar el agrupamiento de su zona de procedencia como rural no impactada o bien urbana/industrial impactada. Para ello, en adelante se construirn y validarn modelos de asignacin llevados a cabo por diferentes tcnicas

quimiomtricas (LDA, KNN, SIMCA y ANN) con el fin de alcanzar este objetivo.

IV.4.2 Tcnicas de reconocimiento de pautas

En esta seccin, como se ha indicado anteriormente, los datos del contenido metlico de las mieles fueron procesados mediante

procedimientos de reconocimiento de pautas supervisado con el fin de crear diferentes reglas de clasificacin para relacionar el contenido metlico de las mieles analizadas y las caractersticas de su entorno. De acuerdo a los resultados puestos de manifiesto en los apartados IV.4.1.2. y IV.4.1.3, se han considerado dos categoras diferentes: la primera compuesta por muestras de miel rurales procedentes de zonas no afectadas por fuentes de contaminacin (R-NI: rurales no impactadas); la segunda formada por mieles procedentes de zonas industriales y urbanas (UI-I: urbanas-industriales impactadas). Se han aplicado varios mtodos de reconocimiento de modelos supervisados (los cuales difieren esencialmente en el modo de definir la regla de clasificacin) a la matriz de datos autoescalados 40x13, con el fin de obtener un procedimiento de categorizacin para los grupos R-NI y UI-I. En todos los casos, el conjunto original de los datos autoescalados fue dividido de forma aleatoria en un conjunto de aprendizaje (75 % de las muestras) y un conjunto de prueba (25 % restante). En base al primer conjunto se deriv la regla de clasificacin que fue evaluada mediante la aplicacin de la misma al

Resultados

177

conjunto de prueba. Con el fin de obtener una adecuada estimacin de la capacidad clasificatoria y predictiva de los diferentes modelos, se llev a cabo una validacin realizada en 4 etapas, asegurando que todas las muestras tienen, al menos, la posibilidad en una ocasin de formar parte del conjunto de prueba. El xito de los diferentes sistemas de clasificacin fue expresado como capacidad de reconocimiento (porcentaje de los miembros del conjunto de entrenamiento correctamente clasificados) y capacidad de prediccin (porcentaje de miembros del conjunto de prueba adecuadamente clasificados al usar las reglas desarrolladas en la etapa de entrenamiento).
Tabla 81.- Resultados de la clasificacin para la comparacin de procedimientos de reconocimiento de modelos supervisados. Categora LDA UI-I R-NI UI-I R-NI UI-I R-NI UI-I R-NI Capacidad de reconocimiento (%) 99.2 92.4 88.2 70.0 85.3 94.6 100 100 Capacidad de prediccin (%) 81.6 71.8 87.5 94.1 85.0 93.7 90.0 90.1

KNN (K=3)
Inversa de la distancia Eucldea al cuadrado

SIMCA
Rango normal; 3 componentes

MLF-ANN
13-9-2

IV.4.2.1.- Anlisis lineal discriminante (ALD)

ALD busca la frontera lineal ptima entre categoras en el espacio 13-dimensional (nmero de dimensiones igual al nmero de variables), de manera que la funcin discriminante se establece con el fin de lograr la discriminacin mxima entre las categoras dadas36. La aplicacin de ALD al caso que nos ocupa produjo resultados insatisfactorios. Como puede observarse en los valores proporcionados en la Tabla 81, se alcanzaron niveles adecuados de reconocimiento (entre 92-99%), pero la regla de clasificacin obtenida no fue apropiada en trminos de generalizacin, ya que los resultados de capacidad predictiva son claramente insuficientes en el

178

Parte experimental

rango entre 71-82 %. Un resultado como el obtenido por este procedimiento cabra ser esperado teniendo en cuenta que ALD opera bien en aquellas ocasiones en que las clases son linealmente separables y en el caso estudiado, no ocurre esto, (vase la Figura 79).

IV.4.2.2.- K-vecinos ms prximos (KNN)

KNN clasifica un objeto desconocido en la categora en la cual contribuyen los K objetos conocidos del conjunto de prueba ms prximos37. As, la existencia de una mtrica local relacionada con la semejanza (similaridad) entre objetos constituye la base de este sistema de reconocimiento de modelos. En el presente trabajo, el cuadrado de la distancia Eucldea se us como mtrica local y la importancia de un vecino dado en la asignacin de una clase fue evaluada en base a la inversa del cuadrado de dicha distancia. El valor de K fue seleccionado por optimizacin, determinando la capacidad de clasificacin con diferentes valores de K comprendidos entre 1 y 5. El valor de K seleccionado como ptimo fue 3. Bajo estas especificaciones, KNN se aplic a los diferentes conjuntos de aprendizaje/prueba obtenidos como ya se ha descrito con anterioridad. Los resultados logrados fueron poco exitosos para la capacidad de reconocimiento y prediccin en las dos clases consideradas, especialmente para la categora R-NI, en la cual, la regla derivada se demostr inestable (vase Tabla 81).

IV.4.2.3.- Soft independent modelling of class analogy (SIMCA)

SIMCA es una tcnica de modelado de clases, en la que para cada categora se obtendr un modelo basado en un determinado nmero de componentes principales (obtenidos para cada categora separadamente) que se aplica en funcin de una distancia crtica con significacin probabilstica15. Un objeto desconocido pertenecer a una categora determinada en funcin de la distancia del mismo al modelo de la clase correspondiente.

Resultados

179

En el presente trabajo, los modelos desarrollados por SIMCA para las categoras en cuestin (con rango normal y 3 componentes principales en ambos casos) produjeron, en trminos de capacidad de reconocimiento y prediccin los resultados recogidos en la Tabla 81. El modelo construido para la clase R-NI produjo un resultado satisfactorio , en torno a un 95% de las muestras rurales no impactadas son clasificadas como tales, sin embargo, existe una mayor posibilidad (en torno al 15%) de que las muestras de la clase UI-I fuesen clasificadas como no impactadas. Como puede verse, los modelos proporcionados por SIMCA no son apropiados para el objetivo que se plantea de calificar el entorno medioambiental de la colmena en funcin del contenido metlico de la miel para el uso de sta como bioindicador.

IV.4.2.4.- Red neuronal artificial (RN)

En el presente trabajo las redes neuronales utilizadas fueron siempre redes multicapa con aprendizaje mediante retropropagacin. La red neuronal opera desarrollando un modelo de clasificacin basado en un conjunto de entrenamiento de muestras con entrada-salida (input-output) conocidas. La estrategia de aprendizaje consiste en la actualizacin de los pesos asociados a las conexiones interneuronales con el fin de obtener la adecuada salida para cada muestra introducida en el sistema.

Una vez que la red neuronal ha sido entrenada y validada, esta puede usarse con los fines pesos
Tabla 82.- Arquitecturas de red ensayadas. Arquitectura red neuronal MLF 13- 5- 1 13- 5- 2 13- 7- 2 13- 9- 2 Error cuadrtico medio (RSME) 0.0331 0.0279 0.0277 0.0273

clasificatorios:

finales suministran suficiente informacin para predecir la etiqueta de salida (categora) segn la entrada (variables qumicas)38. En este caso, se

ha empleado una red neuronal multicapa para predecir la categora de las mieles (UI-I, R-NI) en base a la informacin de entrada formada por las trece variables qumicas autoescaladas. Con el fin de

180

Parte experimental

seleccionar la arquitectura de la red ms adecuada se ensayaron diferentes estructuras neuronales usando el conjunto completo de datos. En todos los casos, las arquitecturas presentaron 13 neuronas en la capa de entrada, diferente nmero de neuronas en la(s) capa(s) oculta(s) y una capa de salida de dos neuronas (ver Tabla 82). El mejor resultado fue el obtenido usando una red con estructura de 3 capas: una capa de entrada de 13 neuronas, una capa oculta con 9 neuronas, y una capa de salida de dos neuronas con salida binaria. La etiqueta de salida fue escrita como 1 para la clase UI-I, y 0 para la categora R-NI. La funcin de transferencia usada fue sigmoidal f(x) = 1/(1 + [exp(-x)]) y los valores iniciales de los pesos asociados a las conexiones entre neuronas se seleccionaron aleatoriamente entre -3 y 3. El nmero mximo de etapas (iteraciones) fue 2000. La validacin de la clasificacin resultante se llev a cabo mediante el proceso de validacin cruzada en 4 etapas anteriormente mencionado. Como puede observarse en la Tabla 81, la regla de clasificacin desarrollada por la red neuronal multicapa produjo muy buenos resultados con capacidad de reconocimiento del 100% y de prediccin en torno del 90 % para las dos clases.

IV.4.3.- Conclusin
Mediante las tcnicas de ACP y AC se observ el conjunto de datos estudiados concluyendo que en el espacio n-dimensional (n=13), existen 3 conjuntos de muestras que pueden identificarse con los grupos rural no impactada, urbana e industrial impactadas, si bien entre estos dos ltimos se observ una clara superposicin, indicativa de la imposibilidad de diferenciar (en base a la informacin qumica disponible) el origen urbano o industrial de muestras polucionadas.

Resultados

181

Se han aplicado tcnicas de clasificacin (LDA, KNN, SIMCA y RN) con el fin de predecir el estado medioambiental (impactado o no) del entorno de la colmena de la que se obtuvo la correspondiente muestra de miel. Con este fin se establecieron nicamente dos grupos, rural no impactada y urbano/industrial impactado, para estimar la capacidad de prediccin de las diferentes tcnicas a la hora de predecir el estado ambiental del entorno de la colmena, y por tanto poder usar la miel como bioindicador. Aunque se obtuvieron resultados prometedores en trminos de reconocimiento y prediccin (sobre todo cuando se usaron redes neuronales multicapa con aprendizaje por retropropagacin), debe indicarse que para obtener una mejor estimacin del papel de la miel como bioindicador en la Comunidad Autnoma de Galicia se debera realizar un estudio ms

profundo en cuanto a nmero de muestras y espacio temporal.

182

Parte experimental

IV.5.- BIBLIOGRAFA
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data

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CONCLUSIONES

Conclusiones

185

V.1.- CONCLUSIONES
En este trabajo, se han puesto a punto diferentes mtodos para la determinacin de metales minoritarios (Cd, Pb, Ni, Cu, Cr y Ni), en miel mediante ETAAS. Para ello se procedi al desarrollo de mtodos de anlisis indirectos en los que la muestra fue digerida previamente, con cido ntrico y perxido de hidrgeno, empleando energa de microondas para lograr su mineralizacin y adems otros mtodos directos que, permiten la determinacin de estos metales sin tratamiento previo de la muestra. A su vez se ensayaron como modificadores de matriz la mezcla de paladiomagnesio y el modificador dihidrgenofosfato amnico, en todos los casos. La optimizacin de los mtodos desarrollados se realiz usando la tcnica de diseo de experimentos. Con respecto al tratamiento de la muestra se concluy que tanto los mtodos directos como los mtodos con tratamiento previo condujeron a resultados comparables, pero el empleo de la muestra sin digerir siempre produjo a mtodos analticos con una menor variabilidad en los datos e implcitamente a un mejor lmite de deteccin. En lo referente a los modificadores de matriz, el Pd o la mezcla PdMg fueron los que proporcionaron mejor LOD y menor variabilidad en todos los metales estudiados, a excepcin del Cd, metal para el que el NH4H2PO4 mejor la sensibilidad. En cualquier caso, los mtodos puestos a punto alcanzaron la sensibilidad suficiente para medir estos metales en mieles representativas de la comunidad autnoma de Galicia y mejoraron la sensibilidad de otros mtodos referenciados en bibliografa, para esta misma tcnica e incluso para otras como ICP-AES. Esta mejora de las caractersticas analticas de los mtodos puestos a punto pudo ser debida a la optimizacin mediante diseo de experimentos, lo que llev a una mejor exploracin de las condiciones ptimas en un menor tiempo y con menor nmero de experimentos.

186

Tesis doctoral

Aplicados los mtodos de determinacin de Cd, Pb, Cu, Cr y Ni a un conjunto de 40 muestras de miel de Galicia correspondientes a diferentes entornos medioambientales y realizados los correspondientes anlisis de metales mayoritarios mediante ICP-AES, se obtuvieron los resultados que se detallan a continuacin. Las concentraciones de metales abarcaron un amplio rango que fueron desde 0.780 ng g-1 valor mnimo analizado para Cd hasta 3016 g g-1 valor mximo para K. Estas concentraciones concuerdan en algunos casos con lo publicado por otros autores, pero en otros muchos difieren significativamente. Cabe indicar la dificultad de realizar una comparacin de resultados, ya que la concentracin metlica se ve influenciada por el origen botnico, geogrfico y, en ocasiones, por la manipulacin y tratamiento de las muestras por parte de los apicultores. Obtenidos los resultados de los valores de 13 metales para 40 muestras de miel, se procedi al estudio de la informacin contenida en ellos mediante anlisis multivariante. De este estudio quimiomtrico puede concluirse que es posible distinguir entre entornos rurales no impactados y entornos industriales y urbanos impactados, sin embargo, debido a la superposicin en el espacio multidimensional, se ha puesto de manifiesto la imposibilidad de diferenciar entre estos 2 ltimos entornos. En base a estos resultados, puede decirse que existe un pilar prometedor para poder usar la miel como bioindicador de la contaminacin ambiental en la Comunidad Autnoma de Galicia, si bien para completar esta ltima parte del estudio, sera necesario realizar una investigacin ms amplia aumentando el nmero de muestras estudiadas, el periodo temporal, adems de disponer de informacin adicional de los entornos (anlisis de agua, aire, suelo, etc.).

GLOSARIO

Glosario

187

Abs AC ACP ALD APLA CP CV DPASV

Absorbancia Anlisis de Cluster Anlisis en Componentes Principales Anlisis Lineal Discriminante Asociacin Provincial Lucense de Apicultura Componente principal Coeficiente de variacin Voltametra de Redisolucin Andica Diferencial de Impulsos

DPCSV

Voltametra de Redisolucin Catdica Diferencial de Impulsos

EEA ETAAS

Espectrometra de Emisin Atmica Espectrometra de Absorcin Atmica con Atomizacin Electrotrmica

ETV FAAS HR-ICP-MS

Vaporizacin Electrotrmica Espectrometra de Absorcin Atmica de Llama Espectrometra de Masas de Campo Magntico de Alta Resolucin con Fuente de Plasma Acoplado

inductivamente ICP-AES Espectrometra de Emisin Atmica con Fuente de Plasma Acoplado Inductivamente ICP-MS Espectrometra de Masas con Fuente de Plasma Acoplado Inductivamente KNN LOD LOQ mo Perm-min Perm-sec Ramp-min Ramp-sec RN K Nearest Neighbours Lmite Inferior de Deteccin Lmite Inferior de Cuantificacin Masa Caracterstica Permanencia de Mineralizacin Permanencia de Secado Rampa de Mineralizacin Rampa de Secado Red Neuronal artificial

188

Glosario

SD STPF T X-100 T-atom T-min T-sec TXRF

Desviacin Estndar Stabilized Temperature Platform Furnace Triton X-100 Temperatura de Atomizacin Temperatura de Mineralizacin Temperatura de Secado Espectrometra de Rayos X con Reflexin Total Fluorescencia de rayos-X

XRF

ANEXOS

Resultados

189

Tabla I.- Muestras, codificacin y procedencia.

Muestra C0301 C0302 C0303 C0304 C0305 C0307 C0310 C0311 OU0301 OU0302 OU0303 OU0304 OU0305 OU0306 OU0307 OU0308 OU0309 OU0310 OU0311 P0301 V2 P0302 P0303 P0304 L0301 L0304 L0305 L0307 L0308 L0309 L0310 L0314 L0315 L0316 L0317 L0318 L0320 L0321 L0322 L0323 Codigo 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 3 3 3 2 3 3 2 3 3 2 2 2 2 2 3 1 3 3 2 2 3 3 3 3 1 2 3 3 3 1 Procedencia Manxarrn Cee Ortigueira Fene Cedeira Laxe Melide Arteixo Luintra Muios Baltar Ris A Guidia Xunqueira Lovios Manzaneda Santa Cruz Larouco Montederramo Mos Vigo Castro Tomio Porrio Baralla Burela Sober Chantada Outeiro de Rei Teixeiro Ancares Ancares Castro verde Cervantes Vilalba Pastoriza Cebreiro Fonsagrada Samos Muras Provincia A Corua A Corua A Corua A Corua A Corua A Corua A Corua A Corua Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Ourense Pontevedra Pontevedra Pontevedra Pontevedra Pontevedra Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo Lugo

190

Anexo I

Tabla II- Concentraciones de cadmio en las muestras analizadas.

Muestra (n=3) OU0306 OU0308 OU0303 L0323 OU0301 OU0309 OU0302 OU0305 OU0307 L0315 P0302 OU0304 P0303 L0321 L0310 L0320 L0305 L0308 L0316 C0302 Cd (ng/g) 2.14 2.33 5.19 1.87 2.38 6.21 1.96 2.13 1.50 3.08 1.96 1.86 1.91 2.12 1.22 1.69 1.50 2.51 3.09 3.01 SD (ng/g) 0.08 0.16 0.32 0.07 0.19 0.48 0.15 0.15 0.09 0.36 0.24 0.24 0.16 0.09 0.09 0.11 0.11 0.23 0.12 0.29 Muestra (n=3) C0303 L0314 L0318 L0317 OU0311 V2 OU0310 C0307 P0301 L0309 P0304 L0322 L0301 L0304 C0310 L0307 C0311 C0304 C0301 C0305 Cd (ng/g) 3.01 2.35 3.18 2.66 3.06 4.52 3.95 4.97 4.48 3.95 3.87 1.33 1.33 2.13 6.25 1.54 2.15 1.30 0.78 1.69 SD (ng/g) 0.29 0.13 0.30 0.19 0.19 0.31 0.24 0.07 0.35 0.12 0.19 0.11 0.11 0.23 0.48 0.18 0.00 0.11 0.19 0.11

Tabla III.- Concentraciones de plomo en las muestras analizadas.

Muestra (n=3) V2 OU0302 OU0304 OU0307 L0323 OU0305 OU0301 OU0303 P0303 L0322 OU0308 OU0309 C0301 C0305 L0315 L0321 L0314 L0316 L0318 L0309 Pb (ng/g) 26.3 10.5 21.1 9.09 6.82 13.6 16.7 5.91 31.4 17.6 19.61 23.5 9.52 49.4 16.7 5.55 5.55 11.1 5.55 4.22 SD (ng/g) 0.8 0.8 1.3 0.73 0.73 1.4 1.3 0.73 3.4 1.3 3.4 0.73 0.73 4.8 1.3 0.73 0.73 0.7 0.73 0.73 Muestra L0320 L0307 L0317 C0310 C0311 C0302 C0307 OU0310 OU0311 P0301 P0302 P0304 OU0306 L0310 L0304 L0301 L0308 L0305 C0304 C0303 Pb (ng/g) 1.96 11.1 9.70 29.6 11.1 24.1 12.7 11.1 7.14 34.9 20.3 5.88 11.8 9.70 6.25 12.5 19.0 14.3 12.7 25.4 SD (ng/g) 3.40 1.3 0.73 1.3 0.7 1.3 1.4 1.4 0.73 2.8 1.4 0.73 0.7 1.37 2.22 1.4 0.7 4.7 1.4 2.7

Resultados

191

Tabla IV.- Concentraciones de cobre en las muestras analizadas.

Muestra (n=3) OU0308 OU0305 OU0302 OU0303 OU0301 OU0309 OU0304 L0308 L0309 C0303 C0304 L0318 L0314 C0301 L0320 L0316 C0305 C0310 L0317 L0307 Cu (ng/g) 767 644 1325 659 269 656 925 340 428 788 900 259 1590 1230 919 1017 100 1090 1122 779 SD (ng/g) 21 8 68 36 8 68 18 4 12 41 12 27 33 29 78 11 8 23 47 4 Muestra C0311 C0302 C0307 OU0310 OU0311 P0301 L0321 L0315 P0302 L0323 L0310 P0303 OU0307 V2 L0301 L0304 OU0306 P0304 L0322 L0305 Cu (ng/g) 200 1995 1687 1138 2048 979 533 549 355 1200 698 630 1276 78.8 297 1063 502 204 747 571 SD (ng/g) 19 10 37 62 49 67 41 32 4 8 27 43 46 7 24 31 23 17 45 7

Tabla V.- Concentraciones de cromo en las muestras analizadas.

Muestra (n=3) L022 OU0309 OU0303 L0323 OU0305 OU0301 P0304 OU0302 OU0307 OU0306 L0310 L0304 L0301 L0305 L0308 P0302 OU0304 P0303 L0321 L0315 Cr (ng/g) 12.4 10.9 7.03 6.82 8.10 7.89 10.9 9.59 25.8 8.10 8.10 9.27 5.75 16.6 14.7 26.4 26.4 23.9 9.4 9.4 SD (ng/g) 0.7 1.9 0.64 0.98 2.58 0.37 0.74 1.48 0.4 1.48 0.74 0.45 0.64 0.6 1.2 0.4 2.6 0.4 1.0 1.0 Muestra L0316 L0318 L0314 L0309 L0317 L0307 L0320 OU0308 C0304 C0303 C0301 C0305 C0302 C0310 V2 C0311 C0307 OU0310 OU0311 P0301 Cr (ng/g) 8.27 8.49 9.92 6.18 5.80 6.37 5.62 6.18 10.7 8.48 7.19 12.9 18.9 12.3 8.4 16.9 41.5 21.9 7.6 8.7 SD (ng/g) 0.38 0.56 0.32 0.56 0.32 0.65 0.32 0.56 0.6 0.64 0.55 1.1 0.7 0.3 0.6 0.3 2.8 0.4 0.5 0.5

192

Anexo I

Tabla VI.- Concentraciones de nquel en las muestras analizadas.

Muestra (n=3) P0304 L0301 OU0302 OU0305 L0304 OU0303 OU0308 OU0309 L0321 L0322 OU0306 P0302 L0323 L0310 OU0307 L0314 L0320 L0316 L0307 L0317 Ni (ng/g) 18.8 33.0 105.1 71.3 17.3 132 78.8 73.6 17.3 60.1 42.8 26.3 74.3 160 78.8 126 42.5 172 76.3 11.8 SD (ng/g) 1.3 2.6 2.6 3.4 1.3 4 4.5 5.2 1.3 1.3 3.9 1.3 3.9 6 1.3 3 2.4 2 2.7 4.1 Muestra C0303 C0304 C0301 C0305 C0310 L0318 C0311 P0303 V2 C0302 C0307 OU0310 P0301 OU0311 OU0301 L0315 OU0304 L0308 L0305 L0309 Ni (ng/g) 17.3 55.0 17.3 12.6 1414 14.9 23.8 30.0 36.7 22.5 29.1 107 17.3 29.1 22.5 20.3 147 27.5 69.6 22.0 SD (ng/g) 1.4 1.4 1.4 1.4 2 1.3 2.6 1.4 1.4 1.4 1.4 3 1.4 2.7 2.3 2.3 2 1.4 3.0 1.4

Resultados

193

Tabla VII.- Concentraciones de manganeso, hierro, zinc y litio en las muestras analizadas.
Muestra C0301 C0302 C0303 C0304 C0305 C0307 C0310 C0311 OU0301 OU0302 OU0303 OU0304 OU0305 OU0306 OU0307 OU0308 OU0309 OU0310 OU0311 P0301 V2 P0302 P0303 P0304 L0301 L0304 L0305 L0307 L0308 L0309 L0310 L0314 L0315 L0316 L0317 L0318 L0320 L0321 L0322 L0323 Mn (g/g) 1.25 0.06 2.21 0.14 2.94 0.24 3.52 0.09 126 0.7 1.16 0.09 8.39 0.18 9.03 0.82 5.57 0.49 9.56 0.46 4.48 0.19 12.5 0.6 6.26 0.39 6.11 0.42 9.21 0.12 8.04 0.40 6.06 0.39 5.46 0.34 2.88 0.48 1.71 0.03 5.64 0.39 2.38 0.29 4.65 0.14 6.69 0.32 9.74 0.94 0.46 0.08 12.0 0.4 11.5 0.3 9.95 0.96 8.16 0.96 19.2 0.7 15.7 1.4 20.3 0.2 17.3 1.7 2.09 0.16 7.140.65 17.361.43 13.910.92 6.410.87 1.430.08 Fe (g/g) 4.11 0.24 3.18 0.30 4.28 0.23 0.47 0.03 20.6 0.9 1.53 0.05 1.51 0.08 1.31 0.07 0.84 0.05 0.16 0.02 0.58 0.01 0.32 0.05 0.18 0.01 0.66 0.05 0.56 0.01 0.86 0.02 1.38 0.12 0.38 0.03 0.24 0.02 0.92 0.04 1.14 0.10 3.49 0.19 0.86 0.03 0.68 0.01 5.70 0.49 8.25 0.13 0.57 0.04 < LOD 1.01 0.02 0.88 0.06 3.55 0.04 5.24 0.50 0.27 0.04 0.23 0.01 2.00 0.10 0.790.09 0.120.02 0.490.03 0.280.04 < LOD Zn (g/g) 2.01 0.18 1.95 0.12 1.71 0.16 2.12 0.10 5.26 0.33 2.84 0.23 2.84 0.02 2.72 0.28 1.34 0.08 1.20 0.08 1.92 0.06 1.05 0.08 1.32 0.07 1.38 0.07 0.56 0.02 1.58 0.10 1.03 0.08 0.78 0.01 0.62 0.01 1.71 0.09 5.51 0.56 1.06 0.08 1.34 0.07 1.29 0.07 7.10 0.28 3.06 0.09 2.94 0.15 2.48 0.05 2.89 0.21 3.43 0.20 3.490.05 2.740.06 2.730.13 <LOD 2.900.10 3.040.02 3.260.06 0.710.02 1.380.12 0.560.01 Li (g/g) 0.51 0.04 1.55 0.09 0.44 0.03 0.80 0.08 1.49 0.08 6.83 0.09 3.44 0.31 1.56 0.20 7.31 0.10 17.9 0.9 6.13 0.08 20.1 2.1 2.19 0.83 6.04 0.09 5.98 0.58 3.41 0.45 23.8 1.9 13.8 0.07 10.17 0.08 9.79 0.13 2.68 0.09 4.36 0.09 3.09 0.51 2.58 0.06 10.80 1.05 19.16 1.54 5.51 0.18 13.430.88 5.970.79 15.330.82 38.083.63 34.791.15 2.930.42 < LOD 1.340.08 4.250.84 3.070.23 11.091.18 < LOD 3.590.39

194

Anexo I

Tabla VIII.- Concentraciones de calcio, sodio, potasio y magnesio en las muestras.

Muestra Ca (g/g) 54.0 1.6 53.0 2.1 59.2 2.4 57.7 1.3 136 3 47.6 1.1 104 1 105 6 62.5 2.3 94.2 7.7 71.8 4.1 85.9 3.7 71.6 4.2 54.6 2.2 85.5 1.3 151 4 56.9 1.3 78.1 5.5 40.6 1.5 134 7 110 6 63.9 2.5 78.3 1.2 83.8 1.8 93.9 9.3 72.4 5.6 117 6 1855 70.98.9 69.32.7 1392 13210.5 1727.9 1246. 65.76.18 69.44.52 182.94.43 73.33.24 85.15.15 41.22.62 Na (g/g) 105 3 139 10 99.7 10.0 61.1 6.3 127 13 105 7 91.0 9.2 86.6 1.8 119 3 82.1 1.9 114 10 61.4 6.5 77.3 5.5 63.0 7.0 116 7 194 4 102 5 86.3 4.6 74.5 5.4 101 8 64.1 5.6 101 7 53.4 4.1 47.1 3.2 59.1 3.4 186 6 56.8 7.5 70.4 5.0 51.0 4.9 48.2 0.7 137 10 97.0 4.1 58.1 5.2 62.6 7.1 91.4 4.72 54.6 6.00 73.3 10.0 135 9 81.2 7.96 166 9 K (g/g) 750 32 1261 93 630 62 523 20 1027 23 794 72 1215 93 1172 93 1520 96 2118 112 1773 96 1719 83 2200 102 1253 105 1232 87 1794 96 883 62 2587 112 837 65 1775 94 781 50 1290 87 1605 37 1125 58 283 17.1 1051 65 2031 103 3016 110 716 93 819 90 1719 61 2367 85 2653 70 2051 152 1041 60 595 57 2685 214 1874 62 1180 92 724 35 Mg (g/g) 27.8 0.27 36.3 0.73 27.60.95 18.2 0.49 35.7 2.56 27.2 0.48 52.9 1.20 54.0 4.36 52.8 2.54 197.8 5.6 188.7 6.6 204.8 8.3 156.3 6.8 106.2 3.7 134.5 1.1 227.8 3.12 93.1 3.28 65.9 2.18 68.4 3.56 58.2 2.74 22.4 1.10 37.9 2.12 31.7 1.25 24.0 0.59 90.3 3.86 28.2 1.15 201.9 5.0 297.5 7.8 54.1 5.21 67.9 4.58 235.6 2.2 169.4 13 206.4 3.6 194.0 2.5 31.6 0.33 56.11.15 308.3 4.5 107.810.2 98.8 5.63 24.5 1.28

C0301 C0302 C0303 C0304 C0305 C0307 C0310 C0311 OU0301 OU0302 OU0303 OU0304 OU0305 OU0306 OU0307 OU0308 OU0309 OU0310 OU0311 P0301 V2 P0302 P0303 P0304 L0301 L0304 L0305 L0307 L0308 L0309 L0310 L0314 L0315 L0316 L0317 L0318 L0320 L0321 L0322 L0323

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208

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232

Anexo II

Artculos

233

234

Anexo II

Artculos

235

236

Anexo II

Artculos

237

238

Anexo II

Artculos

239

240

Anexo II

Artculos

241

242

Anexo II

Artculos

243

244

Anexo II

Artculos

245

246

Anexo II

Artculos

247

248

Anexo II

Artculos

249

250

Anexo II