I.

INTRODUCCION

La agricultura se beneficia de la aplicacin extensiva de pesticidas debido a que disminuye la prdida de cultivos y aumenta la produccin. Al igual que en la mayor parte del pas, la agricultura en la regin Hunuco involucra el uso de diversos pesticidas para el control de pestes, enfermedades y todo tipo de amenaza en los cultivos de vegetales y frutas. La poblacin de Tingo Mara, demanda y consume una gran variedad de vegetales cultivados a cielo abierto en donde se emplean diferentes pesticidas. Se determin que algunos de los vegetales de mayor consumo en la ciudad mencionada son: pltano (Musa paradisiaca), papa (Solanum tuberosum) y la yuca (Manihot esculenta). Para la realizacin de este estudio, la yuca se obtendr del mercado modelo Tingo Mara, en los meses de noviembre y diciembre del 2012 y enero del 2013. Los pesticidas empleados indiscriminadamente, dependiendo de la toxicidad, el tiempo y el tipo de exposicin, representan un riesgo potencial a los consumidores y al ambiente, incluyendo los suelos y el agua. La peligrosidad y toxicidad recomendada por la OMS, solo agrupa a las formulaciones de plaguicidas conforme a la dosis letal media por va oral o drmica (la que sea ms baja). Pero no indica la dosis letal que se puede ingerir de manera indirecta (mediante el consumo de alimentos vegetales), sobre todo si sabemos que en los ltimos aos la ingesta de este tipo de alimentos se a incrementado. Por lo tanto es importante determinar el factor de bioacumulacin de pesticidas en uno de los vegetales mas consumidos en la ciudad de Tingo Mara, la yuca, y establecer si es seguro para la salud de los consumidores. Por otro lado existe muy poca informacin cientfica sobre factores bioacumulativos de pesticidas en tejidos de yuca (Manihot esculenta) lo que resalta la importancia de este trabajo de investigacin ya que si cuantificamos la de concentracin de pesticidas y/o plaguicidas por cada kilogramo de yuca se obtendr muchos mas beneficios, aparte de los conocimientos logrados.

La metodologa que se emplear para realizar la separacin, identificacin y cuantificacin ser la cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC), este mtodo mide residuos a niveles de concentracin de ppm, y provee evidencia confiable para confirmar la identidad y la magnitud de los residuos detectados (Lambropoulou, D. A.; Albanis, T. A., 2007; Rubinson, K. A.; Rubinson, J. F., 2001).

OBJETIVOS Conocer los factores de bioacumulacion de plaguicidas en los tejidos de la yuca. Identificar correctamente los plaguicidas ms txicos usados en la agricultura amaznica Plantear soluciones alternativas para el ataque de plagas en esta planta, que no incluya el uso de contaminantes y venenos.

II.

MARCO TEORICO

El uso intensivo de pesticidas en cultivos de vegetales propicia su persistencia en estos, y dependiendo de la concentracin y toxicidad del pesticida puede llegar a perjudicar la salud de los consumidores. Realizar el anlisis de pesticidas en concentraciones de ppm ppb en alimentos es una tarea delicada, debido a la composicin de la matriz y a la variedad de pesticidas que existen. Recientemente, la tendencia en el anlisis de pesticidas es el desarrollo de mtodos multi-residuos que detectan un gran nmero de compuestos en un solo proceso. En general dicho anlisis incluye extraccin, separacin, identificacin y cuantificacin (Lambropoulou, D. A.; Albanis, T. A., 2007). Para efectuar la extraccin efectiva de los residuos de pesticidas se han desarrollado varias tcnicas. Una vez obtenido el extracto es necesario realizar el anlisis instrumental, que consiste en la separacin, identificacin y cuantificacin de los pesticidas mediante cromatografa liquida alta resolucin (HPLC) acoplada a un detector selectivo (Lambropoulou, D. A.; Albanis, T. A., 2007). Este captulo incluye informacin sobre los pesticidas de inters en esta investigacin y sus consecuencias en la salud, as como la situacin de los pesticidas a nivel mundial. Se enumeran tcnicas de extraccin y equipos para anlisis instrumentales ms usados, principalmente en el anlisis de residuos de pesticidas en alimentos, as como los empleados en este trabajo.

2.1.

Generalidades sobre los pesticidas

Debido a las necesidades alimenticias que requiere la poblacin, los productores necesitan asegurar una determinada produccin de alimentos y, si es posible, aumentar los rendimientos. El uso de pesticidas es una herramienta que permite asegurar y alcanzar los objetivos de produccin de vegetales. Los pesticidas son definidos por la comisin del Codex alimentarius en conjunto con la FAO/OMS (1997) como:

toda sustancia que se emplea para combatir las plagas agrcolas durante la produccin, comercializacin o elaboracin de los alimentos o a toda sustancia que pueda administrarse por aplicacin interna a los animales para destruir insectos o arcnidos, incluyndose herbicidas, fungicidas, rodenticidas,

reguladores del crecimiento vegetal; no incluyndose los abonos. Los pesticidas no son necesariamente venenos, pero pueden ser txicos (Alarcn-Rodrguez, R., 2004). Aunque los pesticidas son necesarios, los residuos de stos en los vegetales y en el ambiente; provocan efectos negativos en la salud que dependen de la proporcin con la que se absorbe el pesticida. Algunos efectos que se presentan son: toxicidad neurolgica aguda, dao neurolgico crnico, disfuncin de los sistemas inmune, reproductivo y endocrino o cncer (Dmtrova, M.; Matisov, E., 2008). Por lo que es necesario que su monitoreo y control se convierta en una actividad prioritaria para determinar la calidad y seguridad de los alimentos. A continuacin se mencionan caractersticas generales de los pesticidas (segn su grupo qumico) de mayor inters en esta investigacin. Organoclorados. Son de bajo costo y amplio espectro, su persistencia va desde moderada a muy persistentes, y sus residuos se encuentran en el ambiente y en los seres vivos. Son liposolubles, solubles en compuestos orgnicos de baja polaridad. Se acumulan en el tejido graso y se metabolizan lentamente. Son estables qumica y bioqumicamente. Se caracterizan por tener una estructura cclica y tomos de cloro; dependiendo de dicha estructura, los pesticidas organoclorados se clasifican en tres grupos principales. a) Derivados halogenados de hidrocarburos alicclicos, como el lindano. b) Derivados halogenados de hidrocarburos aromticos, como el DDT. c) Derivados halogenados de hidrocarburos ciclodinicos, como el aldrn y el endosulfn.

El lindano, los ciclodinicos (aldrn, dieldrn, endrn, clordano) y el endosulfn son absorbidos a travs de la piel. La accin txica principal de estos pesticidas se dirige al sistema nervioso, en donde estos compuestos inducen a un estado de sobre-excitacin en el cerebro (SAGARPA, 2005). Organofosforados.

Son

generalmente

steres

de

cido

fosfrico

sustituidos. Se descomponen con mayor facilidad y son menos persistentes en el ambiente que los organoclorados, pero ms peligrosos debido a que tienen un grado alto de toxicidad. Son biodegradables y no se acumulan en el organismo. Se han convertido en los insecticidas de mayor uso (Albert, L. A., 1990). Los sustituyentes tienen gran influencia en las propiedades fisicoqumicas del compuesto y se relacionan adems con la capacidad de penetracin, distribucin, activacin y degradacin del pesticida, con su sitio de ataque, potencia y selectividad. Algunos ejemplos son: clorfenvinfos, demetin, diclorvos, diazinn, etil paratin, etin, fentin, fosfoln, malatin, metamidofos, metilazinfos, monocrotofos, tricorfn. La intoxicacin por organofosforados provoca que los impulsos nerviosos no se transmitan normalmente. Los compuestos

organofosforados varan

de moderada a

extremadamente txicos.

Generalmente la va de penetracin de estos compuestos al organismo humano es la piel, aunque tambin puede ocurrir intoxicacin aguda al ingerirlos o inhalarlos Algunos organofosforados que se degradan lentamente, pueden almacenarse temporalmente de manera significativa en el tejido graso (Albert, L. A., 1990). Carbamatos. Todos los carbamatos comparten la misma estructura base, son steres Nsustituidos del cido carbmico. Las diferencias en la longitud de sus cadenas laterales determinan su toxicidad. Generalmente se consideran menos txicos que los compuestos organofosforados. Son usados principalmente como insecticidas de amplio espectro. Los

tiocarbamatos y ditiocarbamtos son generalmente insecticidas dbiles y tambin son usados frecuentemente como herbicidas o fungicidas. La mayora de los carbamatos son fcil y rpidamente absorbidos a travs de la piel, pulmones, tracto gastrointestinal y mucosas. Se ha reportado que la exposicin crnica causa debilidad, anorexia, prdida de la memoria y temblores musculares. El carbofurn es considerado un insecticida con toxicidad alta (DL50 = 50 g/kg) (Dart, R. C. et al., 2003). Dicarboxiimidas. Dentro de este grupo se agrupan las sulfonimidas y las imidas N-cclicas, aunque son compuestos diferentes estructuralmente se clasifican como fungicidas dicarboxiimidas. Estos heterociclos sufren degradacin hidroltica y/o fotoltica en suelos, plantas y animales.

2.2.

Mtodos empleados en el anlisis de residuos de pesticidas en alimentos

El anlisis de pesticidas en alimentos est sujeto a la complejidad de la matriz y a las concentraciones bajas a las cuales estos compuestos estn presentes. Por lo tanto, la extraccin de los residuos constituye el paso ms crtico. Este paso consiste en la extraccin de los analitos desde su matriz con un disolvente apropiado, opcionalmente se puede realizar la remocin de sustancias que podran causar interferencias mediante varios pasos de limpieza y finalmente, la reduccin del volumen del disolvente en el extracto antes del anlisis instrumental (Patnaik, 2004). Despus de la extraccin, el anlisis se contina comnmente con la separacin de los analitos empleando cromatografa de gases (GC) o cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), acopladas a uno o varios detectores selectivos para la determinacin, identificacin y cuantificacin de residuos de pesticidas (Pang, G. F. et al., 2006).

En las siguientes secciones se describen los procesos de extraccin y los mtodos de separacin e identificacin de residuos de pesticidas en diversas matrices alimentarias.

2.2.1. Mtodos de extraccin de residuos de pesticidas en alimentos.

El reto en la extraccin de pesticidas es maximizar la recuperacin de los analitos y minimizar las interferencias mediante el uso de una extraccin apropiada. El proceso de extraccin comienza con separar los analitos de la matriz y presentar el material en una forma que pueda analizarse ms fcilmente. La extraccin selectiva de analitos se basa en sus diferentes caractersticas y propiedades qumicas y fsicas, como: peso molecular, carga, solubilidad, polaridad, volatilidad.

Se han propuesto muchas opciones para el pre-tratamiento y extraccin de residuos de pesticidas en alimentos. En la mayora de estas, el proceso de extraccin usualmente involucra la homogenizacin de la muestra con un disolvente orgnico, solo o en mezcla, usando un homogenizador, mezclador o sonicador, conocida como extraccin lquidolquido o extraccin slido-lquido, dependiendo de la naturaleza de la muestra. A continuacin se describe la tcnica de extraccin a usar en este trabajo de investigacin. sta ser la extraccin slido-lquido con acetato de etilo como disolvente, debido a que es la ms empleada en el anlisis multi-residuos de pesticidas en vegetales, adems esta tcnica es relativamente sencilla, rpida y se recupera un porcentaje alto de los residuos de pesticidas presentes en los vegetales (Garrido-Frenich, A. et al., 2004 y 2005; Martnez-Vidal, J. L. et al., 2002 y 2006).

2.2.2. Extraccin con disolventes orgnicos.

Es la tcnica ms usada, principalmente por la facilidad de uso y la amplitud de aplicacin. El proceso de extraccin vara ligeramente dependiendo si la muestra es lquida o slida. Las muestras slidas se homogenizan antes de la extraccin mediante la molienda, mezclado, agitado, aplastado, macerado, presurizado y pulverizado. Despus, una porcin se lica o agita con un disolvente orgnico o con una mezcla de diferentes disolventes orgnicos. Despus de agitar correctamente, puede centrifugarse y la fase orgnica se evapora para obtener un volumen pequeo, o a la fase orgnica se le agrega sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) para eliminar el agua presente en la muestra. En el primer caso, el residuo se re-disuelve en una mezcla de disolventes orgnicos y, posteriormente se inyecta en el sistema de GC. En el segundo caso, el Na2SO4 se separa, mediante la centrifugacin o filtracin, y el sobrenadante se concentra o inyecta directamente en el cromatgrafo de gases. Generalmente es necesario evaporar o concentrar el extracto para disminuir el volumen del disolvente. La concentracin ayuda a reducir los lmites de deteccin. Ya que las muestras alimenticias son complejas, suelen ser necesarios pasos de limpieza, para eliminar pigmentos, protenas, azcares y cidos grasos que interfieren con la deteccin de pesticidas a niveles de trazas y aunque stos consumen tiempo, se incluyen para evitar contaminacin del sistema de GC, de esta manera se reduce la cantidad de interferencias que provocan prdida de resolucin, aunque aumenta el costo del anlisis (Colum, A. et al., 2001).

Para realizar la extraccin existe una gran variedad de disolventes orgnicos disponibles que permiten una homogenizacin fcil durante el licuado o la agitacin, Anexo 1.

La polaridad es el factor ms importante en la eleccin del disolvente para una aplicacin en particular. En mtodos multi-residuos de pesticidas, la acetona, el acetonitrilo y el acetato de etilo han mostrado proporcionar altas recuperaciones para un amplio intervalo de pesticidas, cada uno con algunas ventajas sobre otros disolventes (Lambropoulou, D. A.; Albanis, T. A., 2007). La habilidad para remover agua del extracto inicial es esencial para obtener un alto grado de selectividad en muestras con humedad alta, como los alimentos. La co-extraccin de protenas, azcares y otros compuestos polares suele incrementar junto con la cantidad de agua en el extracto; as, los disolventes que eviten el agua dan una mayor selectividad. El acetato de etilo y acetonitrilo son mejores que la acetona porque el agua se elimina ms fcilmente usando una sal. El acetonitrilo es un disolvente polar, miscible en agua pero con suficientes propiedades dispersivas (hidrofbicas) para extraer

eficientemente tanto residuos de pesticidas polares como no polares desde alimentos no grasos. Los extractos de acetonitrilo contienen usualmente co-extrados (pigmentos principalmente). Se han descrito mtodos basados en el uso de acetato de etilo como disolvente y se han validado y usado para la determinacin de diferentes grupos de pesticidas en frutas y vegetales (Krynitsky, A. J.; Lehotay, S. J., 2003). Adems este disolvente provee buenas recuperaciones para un nmero amplio de pesticidas con propiedades diferentes (Garrido-Frenich, A. et al., 2004 y 2005; Martnez-Vidal, J. L. et al., 2002 y 2006). Es menos contaminante que los disolventes clorados, aunque puede co-extraer pequeas cantidades de compuestos de la matriz.

Esta tcnica se emplea en alimentos lquidos, muestras acuosas, frutas y vegetales (Araoud, M. et al., 2007). Se prefiere en el anlisis de rutina de laboratorios por su simplicidad, rapidez y altas recuperaciones de compuestos que se encuentran en un amplio intervalo de polaridad.

2.3.3. Mtodos de separacin, identificacin y cuantificacin de pesticidas.

Una vez obtenido el extracto orgnico, la mezcla de pesticidas se separa mediante tcnicas instrumentales como cromatografa de gases (GC) o cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). La identificacin y cuantificacin de los pesticidas se realiza con detectores selectivos que se encuentran acoplados al equipo de GC HPLC. Las tcnicas cromatogrficas permiten una aproximacin eficiente en el anlisis de pesticidas. La espectrometra de masa (MS) generalmente se prefiere como detector y sus resultados tpicamente son incuestionables (Rubinson, K. A.; Rubinson, J. F., 2001). En el anlisis de pesticidas es importante cubrir el aspecto cuantitativo y cualitativo. Una respuesta cuantitativa no puede existir en el anlisis sin un componente cualitativo que proporcione suficiente confianza para alcanzar las necesidades analticas (Lehotay, S. J. et al., 2008). Una respuesta cuantitativa no debe darse sin un grado aceptable de conocimiento cualitativo para que el resultado de la medicin est relacionado solamente con el analito y no con algo ms. Es importante entender tres conceptos en el anlisis de pesticidas.

1). La determinacin es un resultado cuantitativo que se obtiene a partir de un mtodo que alcanza un desempeo aceptable para el propsito del anlisis (cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) con detector selectivo de un elemento).

2). La identificacin es un resultado cualitativo de un mtodo capaz de proveer informacin estructural (deteccin MS) que es aceptable para el propsito del anlisis. La confirmacin es la combinacin de dos o ms anlisis que aportan el mismo resultado (idealmente usando mtodos de selectividad ortogonal, basados en diferentes mecanismos qumicos). 3). La confirmacin requiere que un resultado confirme el otro, as al menos se necesitan dos anlisis.

En la seccin siguiente se mencionan las caractersticas principales de los mtodos de separacin, especialmente la HPLC debido a su amplio uso en el anlisis de residuos de pesticidas en alimentos y a que fue la tcnica de separacin a emplear en este trabajo.

2.3.3.1. Tcnicas de separacin: Cromatografa.

La cromatografa permite separar entre s los componentes de una sustancia, y su gran aplicabilidad se debe a la variedad de condiciones que pueden utilizarse para separar dichos componentes. Se pueden utilizar fases mviles distintas (gases, lquidos o fluidos supercrticos) y fases estacionarias distintas (minerales, polmeros orgnicos e inorgnicos o slidos recubiertos de lquidos (Rubinson, K. A.; Rubinson, J. F., 2001).

La cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de dlares. Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o

termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides, especies

organometlicas y una cierta variedad de sustancias inorgnicas. Los procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores a 10 000, a menudo se utiliza la cromatografa de exclusin, aunque ahora tambin es posible tratar estos compuestos con cromatografa de reparto en fase inversa. Para especies inicas de baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografa de intercambio inico. Los mtodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no inicas. Adems, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin de los integrantes de una serie homloga. La cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia para separar compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos. A continuacin se ilustra el importante efecto del tamao de partcula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que a veces son de notable importancia en cromatografa de lquidos.

Efectos del tamao de partcula del relleno. El coeficiente de transferencia de masa de la fase mvil es funcin inversa del cuadrado del dimetro de las partculas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC debera mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamao de partcula. Por ejemplo una reduccin del tamao de partcula de 45 a 6 m origina una disminucin de diez o ms veces de la altura de plato.

Ensanchamiento de banda extra columna en cromatografa de lquidos. En cromatografa de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda extra columna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyeccin, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El

ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con ms rapidez que la periferia. En cromatografa de gases la difusin compensa la dispersin extra columna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es significativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente. Cuando se utilizan columnas de pequeo dimetro, el

ensanchamiento extra columna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a la reduccin del radio de los tubos del sistema externos a la columna.

Efecto del tamao de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra (g de muestra/g de relleno) tambin afecta a la eficacia de la columna. Para las aplicaciones con columnas de reparto y adsorcin, la eficacia decrece notablemente con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es mucho ms pequeo.

2.3.3.2 Tcnicas de identificacin: Detectores. A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores.

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.

Tabla1. Caractersticas de los detectores de HPLC

2.4 Instrumentacin para cromatografa de lquidos

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. La Figura 1 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico.

Figura 1. Esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico.

III.

MATERIALES Y MTODOS

Para efectuar el anlisis de residuos de pesticidas en yuca (Manihot esculenta), se realizar un muestreo en el mercado modelo de Tingo Mara. La extraccin de los residuos de pesticidas en este vegetal, se realizara con la tcnica slido-lquido y la separacin, identificacin y cuantificacin mediante HPLC. Para obtener resultados confiables del anlisis, adems de seleccionar las tcnicas correctas para la extraccin y determinacin de los residuos de pesticidas, se establecieron las condiciones adecuadas en el equipo de HPLC, se realiz la limpieza del material de vidrio y se purificaron algunos de los disolventes y reactivos. En esta seccin se describen reactivos y disolventes, equipo y material, muestreo del vegetal, tcnica de extraccin, condiciones en el sistema de HPLC y mtodos de separacin, identificacin y cuantificacin empleados en la investigacin. 3.1. Disolventes y reactivos Los reactivos y disolventes que se emplearan en el anlisis de residuos de pesticidas en yuca se muestran en la Tabla 1. Con la finalidad de purificar la acetona, el acetato de etilo y el hexano se bi-destilaron mediante destilacin fraccionada. El etanol se someti a destilacin simple, el resto de los disolventes, como cloruro de metileno y metanol, no se destilaron. Los disolventes se almacenaron a temperatura ambiente en frascos de vidrio protegidos de la luz hasta el momento de su uso. La cafena (estndar interno), se purific cristalizndola tres veces con una solucin de etanol/agua (85/15), el punto de fusin de los cristales obtenidos fue de 234236C (234-236.5C (lit.)). 3.2. Equipo, material en general e instrumentacin Los equipos empleados durante el anlisis sern: mezclador casero, balanza analtica digital, sistema de recirculacin de agua, congelador.

Se usa material de vidrio de laboratorio diverso. Para eliminar residuos de pesticidas, todo el material utilizado se lavara siguiendo el tratamiento de lavado de la EPA (mtodo 1668, revisin A, 2003). Se usaran micropipetas de graduacin diferente, filtros, envases de polipropileno de 2 L y jeringas de plstico de 10 mL. 3.3. Recoleccin y almacenamiento El vegetal se muestrear con base en la Directiva 2002/63/CE del Diario

Oficial de la CE, en la que se establecen los mtodos comunitarios de muestreo para el control oficial de residuos de plaguicidas en los productos de origen vegetal y animal. La Yuca se obtendr del mercado modelo Tingo Mara, en los meses de noviembre y diciembre de 2012 y enero del 2013. Asimismo, tambin se recolectara muestras en diferentes lugares de la provincia de Leoncio prado las estas sern obtenidas directamente de los productores con el objetivo de comparar los niveles de bioacumulacin. Se obtendrn 2 kg del vegetal, esta cantidad se lavara y se molera en el mezclador casero. Aquellas muestras que no se analizan en ese momento, se guardan en envases de polipropileno y se almacenan en refrigeracin (4C) hasta su extraccin. El tiempo de almacenamiento no puede ser mayor a 48 horas.

Inmediatamente despus de la adquisicin de la muestra, se somete a lavado con jabn y agua corriente, se escurre, y cuando fuese necesario se cortan en trozos de mnimo tamao para facilitar la molienda. Se molieron de 1 a 2 min en el mezclador casero hasta obtener una mezcla homognea con consistencia de papilla.

3.4. Extraccin de residuos de pesticidas de los vegetales La tcnica de extraccin slido-lquido consiste en el siguiente

procedimiento. Por cada rplica (10 rplicas), se tomara una porcin representativa de los 2 kg de vegetal homogenizado y se dejara atemperar de 30 a 50 min. Se pesa aproximadamente 5 g y se mezclan con 10 ml de acetato de etilo. Se agita durante 10 minutos. Se filtra a travs de algodn para eliminar el material vegetal y se enjuaga con 5 ml de acetato de etilo. Las fases orgnicas se mezclan. Posteriormente, se transfiere el acetato de etilo a un embudo de separacin para eliminar la mayor cantidad de agua posible. La fase orgnica se separa y el embudo de separacin se enjuaga con 45 ml de acetato de etilo. La muestra se sella con parafilm y se guarda en congelacin a 20C. Es importante mencionar que el acetato de etilo tiene una polaridad media y capacidad de extraccin de compuestos en un intervalo amplio de polaridad, tal como los pesticidas. Los pesticidas, motivo del presente estudio tienen diferente polaridad entre s pero todos son solubles en acetato de etilo. La efectividad de la extraccin de residuos de pesticidas empleando acetato de etilo desde matrices vegetales est demostrada en la literatura, se reportan porcentajes de recuperacin entre 70 y 110%, (Garrido-Frenich, A. et al., 2005; FernndezMoreno, J. L. et al., 2008; Martnez-Vidal, J. L. et al., 2006).

3.5. Condiciones en el equipo de HPLC Para el anlisis se us un cromatgrafo lquido de alta eficiencia (HP Serie 1100), equipado con desgasificador, bomba cuaternaria, inyector manual con

volumen de inyeccin de 20 L. La columna analtica a emplear es una Spherisorb ODS-2 (5m de tamao de partcula, 4,6 mm x 25 cm). Como fase mvil acetonitrilo: agua (60:40) y un flujo de 0,7 ml/min. Se utiliz un sistema de recoleccin de datos HP-Chemstation.

Para realizar estos anlisis en el equipo de HPLC, se probaron diferentes condiciones para establecer aquellas que dieran los resultados mejores, es decir, que permitieran obtener una separacin mejor de los pesticidas, mejor resolucin de los iones precursores y producto y un tiempo de anlisis corto. 3.6. Mtodos de identificacin y cuantificacin

Una vez establecidas las condiciones de operacin del equipo de HPLC, se generaron dos curvas de calibracin usando diferentes grupos de soluciones de trabajo. Las soluciones de trabajo difieren en la concentracin de los pesticidas y del estndar interno, para solucin de trabajo 1, son 1.0, 5.0 y 10 ppm de cada pesticida con 2.0 ppm de cafena (estndar interno) y para la solucin de trabajo 2, son 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ppm de cada pesticida con 0.5 ppm de cafena. 3.7. Criterios de calidad interna

Para asegurar la calidad de los resultados de la metodologa propuesta, se establecen algunos criterios de calidad interna, se consideraron: coeficientes de variacin y desviacin estndar. En este trabajo, como estndar interno se emple cafena. Los coeficientes de variacin se calcularon para los extractos obtenidos y para el anlisis en el equipo de HPLC. La ecuacin 1 se emple para calcular el coeficiente de variacin de los resultados obtenidos.

Donde: CV: Coeficiente de variacin S: desviacin estndar x: valor de la rplica : Promedio n: nmero total de rplicas

IV.

PRESUPUESTO

PRESUPUESTO DE ACUERDO AL CLASIFICADOR DE GASTOS

2 2 2 2 2 2

1 1 3 3 3 3

1 1 1 1 1 1

1 1 3 5 6 8

2 2 1 1 2

2 Asignacin por gastos operativos 1 Asignacin a fondos para personal Combustibles, carburantes, lubricantes y afines Papelera en general, tiles y 2 materiales de oficina Repuestos y accesorios (de 3 construccin y maquinas) Material, insumos, instrumental y accesorios medios, 1 quirrgicos, odontolgicos y de laboratorio

V.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

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VI.
Tabla 1:

ANEXOS

Anexo 1:

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES

PROYECTO DE INVESTIGACION

Ttulo: FACTORES BIOACUMULATIVOS DE PESTICIDAS EN TEJIDOS DE YUCA Autor: TAMANI AGUIRRE, Helen Yilsa IQUE ALVAREZ, Manuel Tingo Mara 12 semanas

Colaborador:

Lugar de Ejecucin: Duracin del Trabajo: