INFORMATIVO DIVISIN INDUSTRIA

N. 4 - Septiembre 2010

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informacin romiso de difundir do con nuestro comp iguien entes, en el presente lidad para nuestros cli relevante y de actua s de control de arles a los laboratorio n, queremos brind anlisis bolet s relacionados con los erentes temas de inter calidad dif biolgicos. sicoqumicos y micro qumicos r algunos reactivos n, podrn conoce En esta edici arn un portafolio rlau, donde encontr nuestra lnea de Scha de importancia ico, descubriendo la o para el anlisis qum complet o manufacturados ctivos que han sid de trabajar con rea de las tcnicas usados en cada una ccamente para ser espe ctrometra a acoplada con espe (Cromatografa Lquid de LC-MS rafa de gases con ead Space (Cromatog de masas) y CG-H las principales cabeza), resaltando cin de espacio de S y CGinyec mezclas grado LC-M s de los solventes y caracterstica Head Space . inters ntraran un artculo de microbiologa, enco En el rea de buena prueba de a para realizar una cual les servir de gu ericana el n la farmacopea Am de crecimiento seg adas; promocin onesa (JP) Armoniz a (PH. EUR.) Y jap (USP), Europe se adquiera un lizar cada vez que bas que se deben rea prue de cultivo. lote nuevo de medio en cepas de nuestra nueva lnea almente conocern dios de Adicion y los nuevos me lo para hongos NCPF referencia so indarn soluciones rlau los cuales le br ltivos de la lnea Scha cu lgicos. ntes anlisis microbio ecaces en los difere tra seccin de s a consultar nues almente los invitamo para la Fin diferentes productos s donde observarn novedade y microbiolgicos. lisis sicoqumicos realizacin de sus an s y les sea de su gran inter que este informativo Esperamos actualidad. cimiento en temas de ude a ampliar su cono ay

Nuestra Nueva Sede

ARTCULOS LC-MS: Ms all del HPLC. Disolventes para CG-Head Space en el anlisis de disolventes residuales. Pruebas de promocin de crecimiento segn la armonizacin de las farmacopeas de estados unidos (USP), europea (PH. EUROPEAN) y japonesa (JP). NOVEDADES Nuevos productos qumicos Kubitainer - Patrones para A.A. - Patrones para ICP. Productos microbiolgicos Coliforms Chromogenic Agar, CCA. - Medios de cultivo deshidratados en sobre. - Cepas NCPF. - Destilador de agua - Cabina de ujo laminar. Promocin del Semestre.

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ARTCULOS
LC-MS: Ms all del HPLC
La tcnica LC-MS combina las ventajas de la separacin de la cromatografa lquida con las de la espectrometra de masas. La informacin estructural que proporciona el espectrmetro de masas sobre los compuestos separados, permite su identicacin y cuanticacin, incluso si se encuentran en matrices complejas. Esta caracterstica hace que la tcnica LC-MS sea muy til en el anlisis de compuestos orgnicos, en muestras biolgicas, anlisis de contaminantes en muestras medioambientales y en el estudio de protenas. El paso del anlisis por HPLC al LC-MS es un paso que requiere una adaptacin completa, por lo cual se hace necesario ajustar los mtodos a las nuevas condiciones de anlisis para obtener las mximas prestaciones asociadas al LC-MS. En este contexto, el usuario se cuestiona la necesidad de utilizar disolventes de calidad garantizada para LC-MS. La sensibilidad de los equipos LC-MS se ve potenciada con el uso de eluyentes ms limpios. Un disolvente de calidad HPLC no siempre es adecuado para uso en LC-MS, puesto que la ausencia de impurezas visibles en el ultravioleta no garantiza que no intereran en el espectrmetro de masas. Qu va a ganar usted utilizando disolventes y mezclas LC-MS de Scharlau? Mayor sensibilidad Simplicar la interpretacin de los espectros Mayor eciencia en la formacin de iones moleculares Duracin ms larga de las columnas de HPLC Ahorro de los costos asociados al mantenimiento de los equipos Ahorro de tiempo en la preparacin de eluyentes Garanta de un producto controlado por LC-MS Impurezas metlicas a nivel de ppm, que no afectan en el HPLC, distorsionan los espectros de masas modicando la abundancia de los iones moleculares de inters y complicando la interpretacin de los espectros. A continuacin se muestran 2 espectros del mismo pptido donde se observa el efecto positivo del uso de acetonitrilo y agua calidad LC-MS. El pptido analizado es la gastrina humana y el in mayoritario [M+2H]2+ debera responder a m/z 1050.

En la g. 1 se observa como el pico del in [M+2H]2+ se ve enmascarado por otros picos correspondientes a aductos formados con metales alcalinos [M+Na+H]2+ [M+K+H]2+.

Los disolventes y mezclas para LC-MS marca Scharlau responden a estas nuevas necesidades y garantizan los mejores resultados gracias a sus especiales caractersticas: Bajo contenido en impurezas metlicas (alcalinos y alcalinotrreos) Ausencia total de partculas Mnimos niveles de acidez y alcalinidad libres Bajo contenido en agua Bajo contenido de impurezas no voltiles Control de calidad mediante LC-MS Envasado en condiciones especiales Certicado de anlisis del lote

En la g. 2 se constata como al utilizar ACN y H2O LC-MS de Scharlau, el in molecular [M+2H]2+ es el ms abundante.

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Condiciones analticas LC-MS: Eluyente: mezcla ACN/H2O, 50/50, v/v, con 0,2% cido frmico Flujo: 250l/min. Split Vol. iny.: 50l de una solucin de gastrina humana de 10g/ ml Deteccin: ESI + Frag. 3500V T fuente: 150C MEZCLAS LC-MS En la preparacin de eluyentes para LC-MS es habitual la adicin de modicadores que tienen la misin de fomentar la formacin de iones moleculares y, en denitiva, mejoran la forma de los picos del espectro. Se utilizan con frecuencia cido actico, cido frmico, amonio acetato o cido triuoroactico ultrapuros. Scharlau le ofrece distintas mezclas disolvente/modicador listas para usar. El uso de estas mezclas simplica enormemente la preparacin del eluyente y garantiza su idoneidad para el anlisis por LC-MS. PRODUCTOS AUXILIARES Una vez nalizado el trabajo diario con el equipo de LCMS, es conveniente eliminar los restos de sales de su interior haciendo uir agua durante un tiempo. Una vez eliminadas las sales, se recomienda mantener con una mezcla de agua/2propanol, para inhibir el crecimiento de microorganismos. Fuente: LC-MS-espaol.PDF SCHARLAU

La preparacin de la muestra implica su disolucin en un disolvente de elevado punto de ebullicin, que debe estar totalmente libre de trazas de disolventes residuales. Habitualmente se utilizan dimetilsulfxido (DMSO), N,Ndimetilformamida (DMF) y N,N-dimetilacetamida (DMA). La muestra disuelta se incuba a temperatura elevada para que los disolventes residuales pasen a la fase gaseosa y puedan ser inyectados en el cromatgrafo libres del resto de componentes. Hace dcadas que los laboratorios de control de calidad de la industria farmacutica hacen anlisis de disolventes residuales y a menudo se encuentran con que la calidad del disolvente que utilizan para disolver la muestra no es suciente. La sensibilidad de los detectores aumenta y los lmites de deteccin mejoran, poniendo de maniesto la necesidad de una mejor calidad de disolvente. Los disolventes para CG-HS de Scharlau son puricados de forma especca para liberarlos de impurezas voltiles y controlados lote a lote en el laboratorio mediante CG-HS para asegurar que son adecuados para el anlisis de disolventes residuales. A continuacin se muestra la comparacin entre un cromatograma de un disolvente de calidad analtica ACS frente a un disolvente de calidad GC-HS:

DISOLVENTES PARA CG-Head Space EN EL ANLISIS DE DISOLVENTES RESIDUALES

La industria farmacutica debe garantizar que sus productos no contienen impurezas que provoquen efectos secundarios en los consumidores. Los restos de disolventes empleados en la fabricacin de los APIs o de cualquier otro ingrediente, as como los utilizados en proceso pueden ser perjudiciales para la salud humana, si exceden un nivel determinado. Las farmacopeas americana (USP) y europea (PhEur) establecen los lmites de disolventes residuales permitidos. La USP lo hace en su mtodo USP467, mientras que la PhEur recoge lo dispuesto en la directiva de la ICH (International Harmonization Conference). Ambas farmacopeas coinciden en los lmites as como en la clasicacin de los disolventes residuales en tres grupos de acuerdo con el riesgo que implican para la salud. El anlisis de disolventes residuales es necesario tanto en materias primas como en el producto terminado. Teniendo en cuenta la volatilidad de los disolventes residuales frente al resto de los componentes de la muestra, la tcnica utilizada es la cromatografa de gases con inyeccin de espacio de cabeza (GC-HS) y deteccin de ionizacin de llama (FID) o espectrometra de masas (MS).

Figura 1

Figura 2 3

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Condiciones cromatogrcas Columna de polaridad intermedia Select-624 Programa de temperatura: 40C (20min), incremento de 5C/min hasta 160C Inyector: 200C Detector: 300C, FID Carrier gas: Helio Flujo columna constante: 4.0 ml/min Split ratio: 50 Flujo hidrgeno: 30 ml/min Flujo aire: 300 ml/min Flujo make up: 26 ml/min Volumen inyeccin: 1 ml Figura 3 Fig.1,2y3. Cromatogramas comparativos usando los solventes N,N Dimetilformamida, N,N-Dimetilsulfxido y N,NDimetilacetamida grado ACS, contra solventes calidad GCHS. Condiciones Head Space Temp. horno: 120C Temp. loop: 140C Temp. lnea transferencia: 140C Agitacin: s Tiempo de equilibrado (calentamiento) del vial: 50 min Tiempo de inyeccin: 1 min Volumen vial: 20 ml Volumen muestra: 10.0 ml Fuente: Headspacelow.pdf SCHARLAU

PRUEBAS DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO SEGN LA ARMONIZACIN DE LAS FARMACOPEAS DE ESTADOS UNIDOS (USP), EUROPEAN (PH. EUROPEAN) Y JAPONESA (JP)
INTRODUCCIN: El test de promocin de crecimiento es una tcnica importante en la farmacopea Americana (USP), Europea (PH. EUR.) Y japonesa (JP). El propsito de la tcnica es determinar la susceptibilidad del medio de cultivo usando las diferentes tcnicas microbiolgicas. La intencin de este boletn informativo es discutir sobre los requerimientos bsicos de la tcnica y explicar cmo podra realizarse los anlisis fcilmente, utilizando microorganismos liolizados de referencia con concentracin conocida ej. EZ-CFU, EZ-CFU One step y EZ-Accu Shot de la Lnea de Microbiologics (Ver tabla N4). El test de promocin de crecimiento debe ser realizado por cada lote de medio de cultivo adquirido tanto deshidratado, preparado como el medio preparado por componentes. Los requerimientos bsicos para realizar esta prueba y as poder aprobar un nuevo lote son: El nuevo lote debe ser inoculado con una concentracin mnima conocida de microorganismos. 4 Los microorganismos que deben usarse deben ser los recomendados en la farmacopea. Los microorganismos utilizados no deben ser de un pase mayor a cinco Los microorganismos deben ser derivados de colecciones conocidas internacionalmente tales como la ATCC, NCIMB, National Collection of Pathogenic Fungi ( NCPF) Y National Collection of Type Cultures (NCTC) entre otras. Las 3 farmacopeas decidieron realizar la armonizacin en las pruebas de recuento microbiano y pruebas de microorganismos especcos. La prueba de promocin de crecimiento varia ligeramente entre la prueba de enumeracin Microbiana, Prueba de microorganismos especcos y el test de esterilidad. Por esta razn la prueba de promocin de crecimiento que se utilizar para cada tipo de ensayo se describe a continuacin:

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I ANALISIS MICROBIOLOGICOS DE PRODUCTOS NO ESTERILES: PRUEBAS DE ENUMERACIN MICROBIANA

PROPSITO: El propsito de las pruebas de promocin de crecimiento para enumeracin microbiana es asegurar las propiedades nutritivas de los lotes nuevos de medios de cultivo, esto se logra mediante pruebas de desafo, las cuales consisten en inocular un nmero pequeo de unidades formadoras de colonias (UFC) de microorganismos. REQUERIMIENTOS: Para estas pruebas de promocin de crecimiento se requiere: 1. Inocular las placas de agar o los caldos en tubo solo con una pequea cantidad de microorganismos no ms de 100UFC/0,1. ml. 2. Se debe usar los microorganismos recomendados por la Farmacopea, trazables a una coleccin de referencia. 3. Seguir las instrucciones de farmacopea USP, PH, Eur o JP ya armonizadas PROCEDIMIENTOS: El nuevo lote de medio de cultivo y el lote previamente aprobado deben ser ensayados en paralelo. A todos los medios se les debe hacer las pruebas por duplicado, sembrando un solo microorganismo a la vez realizando la siguiente metodologa: Determinar que microorganismo requiere para probar cada uno de los medios de cultivo a desaar. (Ver tabla 1) Realizar las pruebas por duplicado para el lote nuevo como para el lote ya aprobado. Preparar un inoculo por cada microorganismo que se utilice en las pruebas, se sugiere utilizar cepas con concentraciones conocidas ej. EZ-CFU, EZ-CFU one step o EZ accu Shot (100UFC /0.1ml) para evitar errores que se pueden cometer al realizar estos inoculos mediante la tcnica de diluciones. Dispensar 0.1ml del inoculo por placa de agar o por tubo, debe asegurarse que este volumen tenga una concentracin de 100UFC. Si utiliza medio en placa utilice para la siembra el mtodo de

supercie, recurra preferiblemente a asas en forma de L o T desechables de la marca Copan para realizar un esparcimiento uniforme de la muestra. Si el nuevo medio es caldo, es necesario paralelamente sembrar del mismo inoculo una placa de agar nutritivo, para conrmar que la concentracin inoculada en el caldo es igual a 100UFC en 0.1ml. Se debe realizar un control negativo, el cual debe ser una placa de agar o un tubo no inoculado del nuevo lote que se encuentra en desafo, este control no debe tener ningn tipo de crecimiento despus de la incubacin para poder ser aprobado el lote. La temperatura y el tiempo de incubacin de las pruebas, se encuentran relacionadas en la tabla N 1, las cuales son de acuerdo a las directrices de la farmacopea. CRITERIOS DE ACEPTACIN: 1. Medio Solido El promedio del nmero de colonias en las 2 cajas de petri del nuevo lote y del anterior aprobado debera tener los siguientes criterios para poder ser aceptado: Debe haber crecimiento en todas las placas de agar. El crecimiento no debe ser mayor de 100UFC El nmero promedio de colonias en las placas del nuevo lote de agar debe estar dentro de un factor de dos, del promedio del nmero de colonias del lote aprobado anteriormente. 2. Caldo El crecimiento en el nuevo lote de caldo debe ser visualmente comparado en 2 tubos con otros dos del caldo anteriormente aprobado, adicionalmente debe cumplir con los siguientes criterios de aceptacin de la prueba: Se debe observar crecimiento en todos los tubos sembrados del lote Nuevo, del anterior aprobado y de la placa control. La placa control no debe tener un crecimiento mayor de 100UFC. La cantidad de turbidez en los tubos del nuevo lote deben ser similares a la turbidez del lote anteriormente aprobado. No existe una denicin cuantitativa con la que podamos comparar en estos casos, la Farmacopea establece que es suciente comparar visualmente. Ver graco No. 1

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PRUEBA DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO EN MEDIO SOLIDO

Paso 1 Preparar el inoculo.

PRUEBA DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO

Paso 1 Preparar el inoculo.

Paso 2 Inocular las cajas preparadas del nuevo y del anterior lote por duplicado. Paso 3 Realizar el extendido del inoculo e incubar. Paso 4 Hacer recuento del lote previamente aprobado. Paso 5 Hacer recuento de colonias del lote nuevo. Paso 6 Comparar los resultados de los lotes. El recuento debe estar dentro del factor de 2.

Paso 2 Inocular las cajas preparadas del nuevo y del anterior lote por duplicado. Paso 3 Inocular un medio no selectivo.

Paso 4 Hacer recuento del lote previamente aprobado. Paso 5 Hacer la comparacin visual de los dos lotes analizados. Paso 6 Realizar el recuento en el medio no selectivo el cual debe ser menor a 100UFC.

Graco No. 1
Tabla N1 REQUERIMIENTOS PARA REALIZAR LAS PRUEBAS DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO
MICROORGANISMO Staphylococcus aureus MEDIO DE CULTIVO Agar y caldo tripticasa de soya Agar y caldo tripticasa de soya Agar y caldo tripticasa de soya Agar tripticasa de soya y agar dextrosa Sabouraud TEMPERATURA 30-35C PERIODO DE INCUBACION 3 das (El crecimiento se puede ver de 18-24 horas) 3 das (El crecimiento se puede ver de 18-24horas) 3 das (El crecimiento se puede ver de 18-24horas) 5 das (El crecimiento se puede ver a las 48h en la T 3035C y a 72h a 20-25C) 5 das (El crecimiento se puede ver a las 48h en la T 3035C y a 72h a 20-25C)

Pseudomonas aeruginosa

30-35C

Bacillus subtillis subsp. spizizenii Candida albicans

30-35C

Agar TSA 30-35C Sabouraud dextrosa 20-25C Agar TSA 30-35C Sabouraud dextrosa 20-25C

Aspergillus niguer

Agar tripticasa de soya y agar dextrosa Sabouraud

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II ANALISIS MICROBIOLGICOS DE PRODUCTOS NO ESTERILES: PRUEBA PARA MICROORGANISMOS ESPECFICOS

PROPSITO: El propsito de esta prueba es asegurar que el nuevo lote de agar tiene un desempeo correcto con respecto a la promocin de crecimiento, propiedades inhibitorias y propiedades indicadas del mismo. REQUERIMIENTOS: 1. Inocular las placas de agar o los caldos en tubo solo con una pequea concentracin del microorganismo especco, no ms de 100UFC. Estos anlisis se deben realizar segn indicaciones prescritas en la USP, Ph. Eur y JP para las siguientes pruebas: Promocin de crecimiento para conrmar las propiedades del medio de cultivo. Conrmacin de propiedades inhibitorias del medio de cultivo. Reacciones tpicas de las colonias indicadas en el medio de cultivo sea lquido o slido. Se debe usar los microorganismos recomendados por la Farmacopea, trazables a una coleccin de referencia y no deben tener ms de cinco pases. 2. Seguir las instrucciones de los procedimientos armonizados descritos en la farmacopea USP, Ph Eur o JP 3. El nuevo lote de medio requiere ms de un tipo de prueba. Todos los resultados de las pruebas deberan cumplir los criterios descritos en los procedimientos para poder aprobar el nuevo lote. 4. Las pruebas de los dos lotes (el lote nuevo y el ya aprobado) deben realizarse en paralelo, por duplicado y solo se debe probar un microorganismo a la vez. 5. Preparacin para las pruebas de Promocin de crecimiento, conrmacin de las propiedades y de las reacciones tpicas de las colonias indicadas en el medio de cultivo lquido o slido:

Determinar que microorganismo requiere para probar cada uno de los medios de cultivo a desaar. (Ver tabla 2) Por cada microorganismo probado se debe realizar dos placas o tubos del nuevo lote y dos para el lote aprobado con anterioridad. Utilizar un control negativo el cual debe ser el medio de cultivo sin inocularle ningn microorganismo, este debe ser incubado bajo las mismas condiciones a las que se sometern las pruebas. Procedimiento: Graco No. 2 para las pruebas de Promocin de crecimiento, conrmacin de las propiedades y de las reacciones tpicas de las colonias indicadas en el medio de cultivo lquido o slido: PRUEBA DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO USADA EN PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECFICOS
PASO 1 Prepare el inoculo.

PRUEBA DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO EN MEDIO SOLIDO USADA EN PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECFICOS

PASO 1 Prepare el inoculo por cada microorganismo que se utilizar, se sugiere utilizar cepas con concentraciones conocidas ej. EZ-CFU, EZ-CFU one step o EZ accu Shot (100UFC /0.1ml) para evitar errores que se pueden cometer al realizar estos inoculos mediante la tcnica de diluciones. PASO 2 Inocular el lote nuevo y el ya aprobado por duplicado. . Dispensar 0.1ml del inoculo por placa de agar o por tubo, debe asegurarse que este volumen tenga una concentracin de 100UFC. PASO 3 Inocule las cajas o tubos del nuevo lote y del anterior aprobado con 0.1ml del inoculo con concentracin conocida, si es un medio selectivo, es necesario tener este dato de la concentracin desde la prueba de promocin de crecimiento Debe realizarse la prueba paralelamente en un medio no selectivo para realizar un control de la prueba. Paso 4 Realizar el recuento de colonias del lote ya aprobado.

PASO 2 Inocular el lote nuevo y el ya aprobado.

PASO 3 Inocular en un medio no selectivo.

PASO 4 Esparcir la muestra e incubar todos los medios.

Paso 5 Realizar el recuento de colonias del nuevo lote, indicando las reacciones y comparando la morfologa de las colonias con el medio previamente aprobado. Realizar recuento de colonias en el medio no selectivo para conrmar que sea menor a 100UFC.

PASO 5 Realizar la comparacin de los medios de cultivo observando la turbidez. PASO 6 Realizar recuento de colonias en el medio no selectivo para conrmar que sea menor a 100UFC.

Graco No. 2 7

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CRITERIOS DE ACEPTACIN: 1. Medio Slido El promedio del nmero de colonias en las dos cajas de petri del nuevo lote y del anterior aprobado debera tener los siguientes criterios para poder ser aceptado:

caldo anteriormente aprobado, adicionalmente debe cumplir con los siguientes criterios de aceptacin de la prueba:

Debe haber crecimiento en las placas control y en las placas donde se realiz la prueba de promocin de crecimiento. El crecimiento debe ser menor de 100UFC. El promedio de colonias en el nuevo lote debe ser comparable con el lote anteriormente aprobado. No hay una denicin cuantitativa de comparable en la farmacopea solo establece que los dos lotes sean comparables entre el 50% o 70%.

Debe haber crecimiento en los dos tubos del lote nuevo, del lote previamente aprobado y en los controles realizados en placa de medio no selectivo. El crecimiento debe ser menor de 100UFC en la placa control. La cantidad de turbidez en el nuevo lote debe ser comparable con el lote previamente aprobado. Compare visualmente las colonias en las cajas de agar de los dos lotes analizados etas deben tener apariencia similar.

3. Conrmacin de las reacciones tpicas de las colonias indicadas en el medio de cultivo lquido o slido: Se debe comparar visualmente las colonias en las cajas de agar del lote nuevo y las del lote ya aprobado, estas reacciones deben ser las tpicas segn lo descrito en el medio de cultivo; En los dos lotes el crecimiento debe ser similar.

2. Medio Lquido o caldo El crecimiento en el nuevo lote de caldo debe ser visualmente comparado en dos tubos con otros dos del

III ANLISIS MICROBIOLGICOS DE PRODUCTOS NO ESTERILES: PRUEBA PARA MICROORGANISMOS ESPECFICOS

Estas pruebas deben ser realizadas al mismo tiempo de los ensayos de promocin de crecimiento ya explicados. PREPARACIN: 1. Determinar que microorganismo se requiere para realizar la prueba del medio de cultivo recordar que la idea, es que el microorganismo sea inhibido para poder aprobar el medio de cultivo nuevo, es por esto que es importante seguir las indicaciones que nos da la Farmacopea (ver tabla 2). 2. Para cada lote nuevo, se debe tener un control negativo para asegurarse que el medio este estril, este control negativo es una placa o un tubo de medio de cultivo sin ser inoculado. PROCEDIMIENTO: 1. Prepara un inoculo con el microorganismo que corresponda al medio analizado. El inoculo debe ser menor a 100UFC por 0.1ml (Se recomienda usar cepas de concentracin conocida EZ-CFU, ver tabla 4), determinar el microorganismo a utilizar segn tabla N 3. 2. Dispense 0.1ml del inoculo por placa o tubo. Use el mismo inoculo para todas las cajas o tubos del lote nuevo, del previamente aprobado y las cajas de medios no selectivos. 3. Este procedimiento se realiza para vericar las propiedades inhibitorias del medio de cultivo. Es importante recordar que estos medios de cultivo deben ser inoculados con una concentracin menor a 100UFC ya que el crecimiento ser inhibido por las caractersticas propias del medio de cultivo. CRITERIOS DE ACEPTACIN: Los microorganismos inoculados deben ser inhibidos en las pruebas para el lote nuevo y para el previamente aprobado. el crecimiento en la placa control debe ser menor a 100UFC.

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Tabla N 2. Requerimientos para realizar la prueba de promocin de crecimiento y el test de Microorganismos especficos.
MEDIO DE CULTIVO Caldo de Enriquecimiento Mossel para Enterobacterias (02-064 Scharlau) Agar VRBD (01-295 Scharlau) MICROORGANISMO E. coli P. aeruginosa S. aureus E. coli P. aeruginosa Caldo MacConkey (02-611 Scharlau) Agar MacConkey (01-118 Scharlau) Caldo de enriquecimiento Rappaport Vassiliadis para Salmonella (02-6668 Scharlau) Agar XLD (01-211 Scharlau) Agar cetrimide (01-160 Scharlau) E. coli S. aureus E. coli S. entrica subsp. Entrica serovar Typhimurium S. aureus S. entrica subsp. Entrica serovar Typhimurium P. aeruginosa E. coli PROPIEDADES A ANALIZAR Promocin de crecimiento Promocin de crecimiento Pruebas de inhibicin Promocin de crecimiento y reacciones tpicas(colonias rojas) Promocin de crecimiento y reacciones tpicas(colonias incoloras) Promocin de crecimiento Pruebas de inhibicin Promocin de crecimiento y reacciones tpicas(colonias rosadas) Promocin de crecimiento Pruebas de inhibicin Promocin de crecimiento y reacciones tpicas (colonias rojas con precipitado negro) Promocin de crecimiento Promocin de crecimiento y reacciones tpicas (colonias rojas con precipitado negro Promocin de crecimiento y reacciones tpicas (colonias amarillas o blancas con un precipitado amarillo) Pruebas de inhibicin Promocin de crecimiento 30-35C 30-35C 72hrs 48hrs en condiciones anaerbicas. TEMPERATURA 30-35C 30-35C 30-35C 30-35C 30-35C 42-44C 42-44C 30-35C 30-35C 30-35C 30-35C PERIODO DE INCUBACIN 24h 24h 48h Crecimiento: 18hrs Reacciones: 18-24hrs Crecimiento: 18hrs Reacciones: 18-24hrs 24hrs 48hrs Crecimiento: 18hrs Reacciones: 18-72hrs 18hrs 24hrs Crecimiento: 18hrs Reacciones: 18-48hrs 18hrs 72hrs

30-35C 30-35C

Agar Manitol salado (01-116 Scharlau)

S. aureus

E. coli Agar Clostridium Reinforced (03-289 Scharlau) Agar Columbia (01-680 Scharlau) Agar Sabouraud Dextrosa (01-165 Scharlau) Caldo Sabouraud Dextrosa (02-165 Scharlau) c. sporogenes

c. sporogenes C. albicans C. albicans

Promocin de crecimiento Promocin de crecimiento y reacciones tpicas (colonias blancas ) Promocin de crecimiento

30-35C 30-35C 30-35C

48hrs en condiciones anaerbicas. Crecimiento: 24hrs Reacciones: 48hrs 3 das.

IV PRUEBAS DE ESTERILIDAD
PROPSITO: El propsito de las pruebas de promocin de crecimiento para el test de esterilidad es conrmar las propiedades nutritivas del nuevo lote, mediante el uso de una concentracin conocida baja de microorganismos. El medio debe ser siempre probado en caldo. REQUERIMIENTOS: 1. Inocule el caldo solo con un nmero bajo de microorganismos (no ms de 100UFC). 2. Use los microorganismos recomendados por la Farmacopea, estos deberan ser trazables a una coleccin de referencia y no debera tener ms de 5 pases.

4. Inocular el nuevo y el lote ya aprobado en paralelo y por duplicado 5. solo inocular un microorganismo al tiempo. PREPARACIN: 1. Prepare el inoculo con el microorganismo que se requiera para desaar el medio de cultivo. (Ver tabla N 3.) 2. Dispense 0.1ml del inoculo en dos tubos del lote nuevo y del previamente aprobado. 3. Cada lote debe tener un control negativo, este no debera tener crecimiento despus de la incubacin. PROCEDIMIENTO: 1. Preparar el inoculo con el microorganismos requerido y con una concentracin de 100UFC. 2. Dispense 0.1ml del inoculo en dos tubos del lote nuevo, 9

3. Seguir las instrucciones de la Farmacopea.

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del previamente aprobado y en las placas de medio de cultivo no selectivo. 3. Siga las instrucciones de la farmacopea de temperatura y tiempos de incubacin para cada microorganismo segn tabla N 1 y N 2. CRITERIOS DE ACEPTACIN: 1. Despus de la incubacin, compare visualmente la turbidez en los dos tubos de los lotes trabajados, debe

haber crecimiento en los dos lotes y en las placas utilizadas como control. 2. Las placas control no deben tener un crecimiento menor de 100UFC. 3. La cantidad de turbidez en el nuevo lote debe ser comparable con el lote previamente aprobado. No hay una denicin cuantitativa de comparable en la farmacopea solo establece que los dos lotes sean comparables entre el 50% o 70%.

Tabla N 3 Prueba de Esterilidad

MICRO ORGANISMO
Clostridium. sporogenes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus. aureus Aspergillus brasiliensis Bacillus subtillis Candida albicas

MEDIO
Medio tioglicolato Fluido (03-187 Scharlau) Medio tioglicolato Fluido (03-187 Scharlau) Medio tioglicolato Fluido (03-187 Scharlau) Caldo Tripticasa de Soya Caldo Tripticasa de Soya Caldo Tripticasa de Soya

TEMPERATURA
30-35C 30-35C 30-35C 20-25C 30-35C 20-25C

PERIODO DE INCUBACION
3 das 3 das 3 das 5 das 3 das 5 das

Tabla N 4 Microorganismos de referencia recomendado por la farmacopea

Microorganismo
Aspergillus brasiliensis Bacillus subtillis Bacillus subtillis Bacteroides vulgatus Candida albicas Clostridium. sporogenes Clostridium. sporogenes E. coli E. coli Kocuria rhizophila Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Salmonella. Entrica serovar Typhimurium entrica subsp.enterica Staphylococcus. aureus Staphylococcus. aureus Staphylococcus. aureus

N Cultivo de referencia
ATCC 16404 ATCC 6633 NCIMB 8054 ATCC 8482 ATCC 10231 ATCC 19404 ATCC 11437 ATCC 8739 NCIMB 8545 ATCC 9341 ATCC 9027 NCIMB 8626 NCTC 6017 ATCC 14028 ATCC 6358 NCIMB 9518

Referencia de Cepas de concentracin conocidas marca Microbiologics

0392Z,0392C,0392A 0486Z,0486C,0486A 0582Z 0445C 0443Z, 0443C, 0443A 0317Z, 0317C, 0317A 0487Z, 0487C, 0487A 0483Z, 0483C, 0483A 0581Z 0688Z,0688C 0484Z,0484A 0576Z 0890C,0890Z 0363C,0363Z 0485Z, 0485C, 0485A 0579Z

Fuente: Microbiologic`s, Growth promotion test 10

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NOVEDADES

Nuevos productos qumicos

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