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Introduo ao conceito de Biotecnologia

As biotecnologias em seu sentido mais amplo compreendem a manipulao de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obteno de processos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicao dos conhecimentos de fisiologia, bioqumica e gentica, considerada como tcnica biotecnolgica. Em seu senso mais restrito as biotecnologias esto associadas ao emprego das tcnicas modernas de biologia molecular e celular. Outros conceitos de biotecnologias: a) a utilizao de sistemas celulares para a obteno de produtos e desenvolvimento de processos (CNPq); b) a aplicao dos princpios cientficos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes biolgicos proporcionando produtos ou servios (FAO, 1989); c) o uso das tcnicas de regenerao in vitro e do DNA recombinante (Fernandes, 1987). Uma das principais caractersticas das biotecnologias modernas sua abrangncia ampla e seu carter multidisciplinar. Sua insero em pases com padres desiguais de desenvolvimento deve ser baseada no conceito de biotecnologias apropriadas ou pertinentes, proposto pela FAO. Assim, biotecnolgias apropriadas seriam aquelas que contribuem com o desenvolvimento sustentvel por: a) serem tecnicamente factveis no atual contexto de desenvolvimento tecnico-cientfico do pas; b) proporcionarem benefcios mensurveis aos destinatrios; c) serem ambientalmente seguras, socio-economicamente e culturalmente aceitveis no atual estgio de desenvolvimento do pas. Dentre as muitas aplicaes destas tcnicas, destacam-se aquelas relacionadas com a transferncia de genes de organismos diferentes para a incorporao de caractersticas como a resistncia de pragas e patgenos e a estresses abiticos, no genoma de uma determinada planta. Outras aplicaes visam o aumento da eficincia fotossinttica ou a produo de metablitos e constituintes importantes do ponto de vista nutricional e farmacutico . Estas tcnicas, quando associadas com procedimentos de cultura de tecidos, permitem a propagao rpida e massal de gentipos superiores estveis e isentos de doenas. Novas estratgias para a propagao clonal, para a fixao de ganhos genticos e novas abordagens para gerar variao gentica so requisitos fundamentais para o melhoramento de plantas. Desta maneira, um dos maiores benefcios das tcnicas de cultura de tecidos vegetais para o melhoramento de plantas perenes, refere-se possibilidade de capturar e fixar os componentes aditivos e no aditivos da varincia gentica atravs da propagao clonal. Desta maneira estas tcnicas, baseadas que so na totipotencialidade de explantes, podem se tornar ferramentas poderosas para a propagao massal de gentipos superiores. A possibilidade de manipulao de sistemas in vitro para a clonagem de gentipos superiores de espcies vegetais dependente de uma srie de fatores. A compreenso e domnio de conceitos bsicos em fisiologia do desenvolvimento de fundamental importncia para a aplicao deste conhecimento. Um dos objetivos do presente texto a apresentao e a discusso sucinta dos principais tpicos pelos quais possvel extrair-se respostas morfogenticas orientadas quando correlaes morfolgicas, fisiolgicas, genticas e bioqumicas, existentes em uma planta intacta so rompidas e sistemas de culturas de tecidos clulas e rgos so utilizados para "orientar" novos padres morfogenticos.

Apostila de Biotecnologia 1Cultura de tecidos vegetal

LAB. FISIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO E GENTICA VEGETAL

Material de Apoio - 8 Fase do Curso de Agronomia - CCA/UFSC, Florianpolis

Micropropagao
Diferentes rotas morfogenticas para a obteno de plantas in vitro
1.1 Cultura de tecidos desorganizados
Calos Cultivo e manuteno de massas celulares desorganizadas que se originam da proliferao desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro. Suspenses Proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados dispersos em um meio lquido, sob agitao.

1.2 Cultura de estruturas organizadas


Cultura de rgos Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdios e segmentos foliares. Para os propsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so: a)Cultura de meristemas pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou dois primrdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares. b) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregada para estabelecer culturas que originam multgemas, gemas, eixos ou brotaes caulinares mltiplos. c)Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples ou mltiplas. d) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem plntulas. e) Cultura de razes isoladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando novas razes.

1.3 Quanto a rota morfogentica


1. Organognese direta Gemas ou primrdios de gemas pr-existentes que so induzidas proliferao. 2.Organognese indireta Novas gemas e eixos caulinares so induzidos e formados a partir de tecidos no organizados (calos) originados de explantes de diferentes origens.

2. BASE CONCEITUAL
pice caulinar: segmento do pice do caule, composto pelo meristema apical (0,05 a 1,0 mm) juntamente com os primrdios foliares e folhas em desenvolvimento. Porm, no deve ser confundido com o meristema, que o conjunto de clulas indiferenciadas e de caractersticas embrionrias. Ativao: processo que favorece a reentrada ao novo ciclo bioqumico oi fisiolgico de rgo ou tecido. muito comum referir-se a ativao de gemas. Para ocorrer a ativao necessria a existncia de rgo ou tecido pr formado ou formado. Clulas indiferenciadas: refere-se ao estado caracterizado por clulas isodiamtricas, com pouco ou nenhum vacolo e grande ncleo. Geralmente esto localizadas no meristema e mantm as caractersticas embrionrias. Ciclo celular: processo ou fases celulares de diviso padro. Enquadra-se em dois grandes grupos: meiose e mitse, que em um organismo diplide pode originar respectivamente uma nova clula haplide, quando ocorre a sada do ciclo celular no final de G2 (sem a duplicao dos cromossomos) ou diplide, quando do completo processo de diviso celular (cdc).

Figura 01 Diagrama representativo do ciclo de diviso celular (cdc) de uma clula diplide.(Adaptado de George, 1993).
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Clones: Independente da origem e sob o aspecto aplicado, as tcnicas de cultura de tecidos vegetais permitem a propagao clonal massal de gentipos superiores. Segundo o Cdigo Internacional de Nomenclatura de Plantas Cultivadas, clone uma das categorias bsicas da cultivar e designa um conjunto geneticamente uniforme de indivduos, derivados originalmente de um individuo simples por propagao assexuada (enxertia, estaquia, mergulhia, apomixia ou micropropagao). O conceito de propagao clonal implica na seleo de gentipos com graus variados de heterozigose e sua fixao nas geraes subseqentes (Kester, 1983). Clones so empregados no melhoramento de plantas para capturar os componentes aditivos e no-aditivos da varincia gentica. Os componentes aditivos da varincia gentica baseiam-se no efeito independente dos alelos, enquanto que os efeitos no-aditivos, muitas vezes perdidos nos cruzamentos sexuais, baseiam-se na interao dos alelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Uma das maiores vantagens da propagao clonal a possibilidade de se explorar a varincia gentica total, ao invs dos componente aditivo apenas. Muitos dos programas de melhoramento gentico de plantas perenes e estabelecidos no hemisfrio norte, a partir da dcada de 50, foram baseados na seleo recorrente. Nestes programas a seleo feita aps cada gerao de intercruzamentos de materiais selecionados para proporcionar a recombinao gentica. Enquanto que o melhoramento convencional permite a fixao dos ganhos genticos nas geraes subseqentes, a micropropagao permite a explorao da variao gentica em uma gerao, atravs da clonagem de gentipos superiores (Figura 2). Apesar dos benefcios dos clones para a agricultura, a concentrao de uma produo em larga escala de apenas um gentipo ou de poucos gentipos de origem comum pode tornar todas as plantas igualmente vulnerveis pragas e molstias ou estresses abiticos e pode tambm diminuir o interesse na manuteno de uma diversidade mais ampla nos bancos de germoplasma existentes, Figura 02 - Explorao da variao gentica em uma gerao, atravs da resultando no estreitamento da base genclonagem de gentipos superiores. tica. Crescimento desorganizado: Quando, tecidos formados in vitro, no apresentam estruturas claramente definidas e contm um nmero limitado de clulas especializadas e diferenciadas. Uma clula diferenciada aquela que desenvolveu forma especializada (morfologia) ou funo especializada (fisiologia). Um tecido organizado a agregao de clulas diferenciadas (ex. xilema ou epiderme). Por outro lado estruturas indiferenciadas podem ocorrer na induo de calos que so agregados celulares desorganizados que se originam da proliferao desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro e por meio de suspenses celulares que so a proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados de clulas dispersos em um meio lquido, sob agitao Crescimento organizado Tecido ou rgo de crescimento determinado em produzir um novo rgo (desenvolvimento) de forma a resultar novas estruturas vegetais. Crescimento ps meristemtico. Competncia celular: Capacidade das clulas reagirem a sinais (que podem ser reguladores de crescimento) especficos de desenvolvimento. Diz respeito capacidade das clulas em expressar um potencial inerente. Esta habilidade da clula pode se dar por: a) Ativao que pode ser definida como a mudana na competncia envolvendo a rediferenciao de determinadas clulas (modelos diretos); b) Induo: que pode ser definida como a iniciao de uma resposta particular de diferenciao a partir da desdiferenciao celular (modelos indiretos). A induo est associada processos de desdiferenciao, que pode ser definida como a (re)entrada no ciclo celular. Buvat (1944) demonstrou que a desdiferenciao celular consiste de dois estgios: regresso capacidade de diviso e retorno estrutura citolgica de clula meristemtica (embrionria)

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Cultura de rgos: Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdios e segmentos foliares. Para os propsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so: f) Cultura de meristemas: pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou dois primrdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares. g) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregada para estabelecer culturas que originam multgemas, gemas, eixos ou brotaes caulinares mltiplos. h) Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples ou mltiplas. i) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem plntulas. j) Cultura de razes isoladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando novas razes. Diferenciao: processo de diversificao das caractersticas bioqumicas, anatmicas, morfolgicas e fisiolgicas, ocorrida nas clulas, nos tecidos ou rgos durante o desenvolvimento a partir do estado meristemtico ou juvenil para o adulto. As clulas do embrio meristema apical so exemplos de estado indiferenciado, as quais ganham novas competncias se tornando diferenciadas. Desdiferenciao celular: retorno de clulas diferenciadas ao estado meristemtico no diferenciado. Determinao celular: Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma clula torna-se limitado a uma rota especfica (Christianson,1985). A determinao celular diz respeito a uma canalizao progressiva no desenvolvimento. Epignese: Ativao seletiva e diferencial de genes (reprogramao celular). Um exemplo comumente citado como representativo em uma planta intacta a transio da fase juvenil para a fase adulta. Epistasia: refere-se inativao de um (trans)gene (o supressor) sobre um outro (trans)gene. Induo: o desencadeamento de um processo morfogentico pela exposio do explante a um estmulo fsico, qumico ou biolgico. A induo envolve o controle da expresso gnica, embora no seja um fenmeno gentico, pois no ocorre ganho ou perda gentica (modificao allica ou genotpica). Refere-se somente a expresso dos genes pr existentes. Em cultura de tecidos, a sinalizao por um fitormnio a uma resposta especfica a nvel celular. Haplide: indivduo que apresenta o nmero de cromossomoss igual ao do gametfito ou da haplofase (n). de maneira mais especfica, plantas haplides so aquelas com carga cromossmica no duplicada, monoplides. Hormnios vegetais: No presente contexto este trmo define uma das classes de compostos que regulam processos de desenvolvimento (morfognese) em plantas, sendo, provavelmente, os mais importantes mediadores na transduo de sinais. Os hormnios so molculas regulatrias de ocorrncia natural que agem como sinais qumicos para regular o crescimento e o desenvolvimento (morfognese). Fitorreguladores ou reguladores de crescimento so substncias sintticas que mimetizam os efeitos dos hormnios no metabolismo celular. Meristema: tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido com sntese protoplasmtica e formao de novas clulas por diviso mittica. Sem especificao, o termo refere-se normalmente ao meristema apical do caule (regio localizada numa depresso central que d origem aos mais novos primrdios foliares de tamanho varivel entre espcies vegetais, normalmente formado por uma poro de 60 a 100 clulas isodiamtricas indiferenciadas, que mantm permanentemente as caractersticas embrionrias primrias. Micropropagao: Propagao clonal massal de um gentipo selecionado por tcnicas de cultura in vitro. Este trmo, utilizado primeiramente por Hartman e Kester (1975), passou a ser empregado para definir os processos de propagao vegetativa na cultura de tecidos vegetais.

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Morfognese: Integrao entre crescimento (mudanas quantitativas) e diferenciao (alteraes qualitativas), mediada por diviso e especializao celular. A morfognese o resultado de um complexo controle hormonal mltiplo, espacial e temporal, atravs da regulao e expresso de sistemas gnicos mltiplos. A morfognese na planta intacta mediada pela ao correlativa dos meristemas e de seus produtos. Na cultura de tecidos vegetais, ao se romper as correlaes endgenas os tecidos ficam sujeitos s condies exgenas, representadas no caso pelos fitorreguladores adicionados ao meio de cultura. A morfognese in vitro passa ento a ser modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura. Isto foi comprovado experimentalmente por Skoog e Miller (1955) e cujos resultados so sumarizados na figura 03.

Figura 03 - Morfognese in vitro modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura.
Totipotencialidade: Princpio biolgico creditado ao fisiologista vegetal alemo Haberlandt, que em 1902, enunciou que cada clula vegetal possua o potencial gentico para reproduzir um organismo inteiro. Como corolrio, este fisiologista elaborou previses de que tecidos, clulas e rgos poderiam ser mantidas indefinidamente em cultura. De certa forma o conceito de totipotencialidade j era inerente teoria celular de Schleiden e Schwan (1838 apud Vasil et al., 1979) ao postularem que algumas clulas eram capazes de serem separadas do organismo e continuar a crescer 3. MECANISMOS REPRODUTIVOS E PADRES DE DESENVOLVIMENTO ENTRE ANIMAIS E PLANTAS Plantas e animais apresentam similaridades na natureza de seu material gentico e nos mecanismos pelos quais a informao gentica processada e utilizada. Nos outros nveis as diferenas so bvias e considerveis: A) Plantas no estabelecem uma linhagem germinativa especfica, no havendo distino entre clulas que formam o organismo e as clulas reprodutivas. Em animais os gametas so produzidos apenas por clulas-filhas descendentes de uma linhagem germinativa. Todas a clulas vegetais nucleadas, possuem, em princpio, a capacidade de produzir um novo individuo (totipotencialidade) e a possibilidade de uma clula produzir gametas apenas uma funo de sua localizao no organismo. B) Plantas se reproduzem tanto sexuada como assexuadamente. C) O ciclo de vida de uma planta mais elaborado e complexo do que em animais. Neste a reproduo resulta da produo direta de gametas como resultado da meiose na linhagem de clulas germinativas. O ciclo de vida das plantas envolve duas geraes alternantes. A gerao dominante a esporoftica e inicia com a fertilizao do ovo e culmina com o desenvolvimento e maturao. A gerao gametoftica, atravs da microsporognese e megasporognese gera respectivamente plen e saco embrionrio. Um dos ncleos da clula espermtica masculina fecunda o ovo para formar o zigto, marcando o fim da gerao gametoftica e o incio da esporoftica. A embriognese acompanhada pela formao da semente. que , em ltima anlise, uma estrutura complexa para nutrir o embrio.
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O desenvolvimento animal pode ser confundido com desenvolvimento embriolgico, uma vez que nesta fase so formados os rgos componentes do seu organismo. Possivelmente isto confere maior determinao (canalizao de desenvolvimento) s clulas vegetais e o retorno ao estado embrionrio de uma clula animal adulta somente ocorre por meio da transferncia nuclear que gerou a clonagem da ovelha Dolly (Fig. 4). Ao contrrio, no desenvolvimento embrionrio de plantas superiores a maior parte dos sistemas de tecidos e rgos no esto presentes. Estes somente so formados depois da germinao e a longo da vida da planta atravs da diferenciao de uma linhagem de clulas embrionrias mantidas nos meristemas. Outro aspecto que diferencia a morfognese animal da vegetal que na primeira, as clulas, tornam-se direcionadas para um caminho particular e especfico de desenvolvimento, enquanto que nas clulas vegetais este direcionamento pode ser reversvel. Toda a clula nucleada, mesmo diferenciada, pode ser induzida uma re-entrada no ciclo mittico, desde que ativada com o sinal adequado. Em clulas animais, portanto, a totipotencialidade encontra-se restrita a uma fase especfica e limitada do desenvolvimento embrionrio. A migrao celular componente importante da morfognese animal. Clulas animais possuem motilidade e migram em direes definidas de acordo com as informaes recebidas de outras clulas. Por sua vez, a rota de desenvolvimento de uma clula vegetal determinada pela sua posio na estrutura da planta. No apresentando mobilidade, a posio das clulas vegetais determinada pelos planos de diviso da clula-me. Mesmo considerando que as interaes entre as clulas tm papel fundamental na morfognese animal e vegetal, a natureza das informaes trocadas mais limitada em plantas do que em animais.

Figura 04 Processo de obteno de clones animais


4 MEIOS DE CULTIVO 4.1. INTRODUO Meios de cultivo so combinaes de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento. Podem ser slidos (adicionando-se gar ou outro agente para geleificao) ou lquidos, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos utilizados para as culturas fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro do desenvolvimento in vitro (Torres, 1998). A constituio do meio baseada nas exigncias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender em necessidades especficas. Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apresenta baixo nvel de nitrognio e de potssio, restringindo o seu uso para muitas clulas; entretanto, esta formulao com baixa concentrao em sais, usada em muitas situaes. O meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi uma das primeiras formulaes melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos nveis de nitrato, potssio e amnio.
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4.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios nutritivos so formados por mltiplos componentes, sendo bastante variveis em funo da espcie vegetal e da origem do explante. constitudo de componentes essenciais e opcionais. Os essenciais compreendem a gua, os sais inorgnicos, a fonte de carbono e energia, vitaminas e substncias reguladoras de crescimento. Entre os componentes adicionais esto includos os aminocidos e amidas, cidos orgnicos e substncias naturais complexas. Os principais componentes de uso mais freqente nos meios de cultura so: 4.2.1 gua o componente em maior quantidade do meio de cultura. A qualidade da gua muito importante em cultura de tecidos vegetais. Pode ser uma fonte potencial de impurezas. Para melhor controle devese usar gua destilada, bidestilada e deionizada. A utilizao de gua de torneira pode comprometer o desenvolvimento da cultura. Em alguns explantes como calos de fumo a quantidade de gua pode ser limitante para o desenvolvimento normal (Linsmaier & Skoog, 1965; Torres, 1998). 4.2.2 Nutrio mineral Os nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmo estabelecidos para a nutrio mineral bsica das plantas no campo. So eles: a) Nitrognio: pode ser acrescentado aos meios na forma orgnica (prontamente disponvel as culturas) ou na forma mineral. Na forma pode estar disponvel como amnio (ction) ou nitrato, nitrato (nion), ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo do material em cultura (George, 1993). constituinte de aminocidos, nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia na sntese protica. A toxidez do amnio s clulas diminui ou desaparece quando ele usado como nica fonte de nitrognio na forma de sal de um cido orgnico, de preferncia um cido tricarboxlico (ciclo de Krebs), como cido ctrico ou cido alfa-cetoglutarico (Torres, 1998). A glutamina (precursora de vrios aminocidos) a mais utilizada como fonte de nitrognio orgnico. Meios enriquecidos com nitrognio so fundamentais para a embriognese somtica, bem como diferenciao de parte area (Amirato, et. al. 1983). b) Fsforo: adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio monobsico (H2PO4-), pois a forma que absorvido(George, 1993). O fosfato monobsico no meio MS utilizado na concentrao de 1,25 mM. Algumas fontes orgnicas podem ser utilizadas quando existem restries aos fosfatos minerais (Torres, 1998). Atua no metabolismo energtico, na regulao de processos enzimticos e na ativao de enzimas (Santiago, 20010). Necessrio para a sntese do ATP e na organognese est envolvido na diferenciao da parte area, pois reverte o efeito das auxinas. c) Potssio: usado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de vrias enzimas do metabolismo de carboidratos e protenas. Uma das mais importantes a quinase do piruvato, enzima envolvida nos processos de gliclise e respirao (Santiago, 2001). necessrio para a embriognese somtica (Ammirato, 1983). A deficincia de potssio pode conduzir a hiperhidricidade e decrscimo na taxa de absoro de fosfato. d) Enxofre: utilizado na forma de sulfato ou na forma de aminocidos (cistina, cistena e metionina). Envolvido no metabolismo energrtico na formao do fosfosulfato de adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A. Sua absoro relacionada assimilao do nitrognio e, independentemente, do pH (Santiago, 2001). e) Clcio: usado na forma de nitrato ou cloreto. Est envolvido na diviso celular, uma vez que um dos componentes da lamela mdia o pectato de clcio. Mantm a integridade da membrana celular e importante para a germinao de gros de plen (George, 1993). um agente quimiotrfico para o direcionamento do tubo polnico. Altas concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para controle da necrose do pice caulinar.Pode ter limitaes na translocao entre as clulas. f) Magnsio: usado na forma de sulfato de magnsio. um dos componentes da clorofila; co-fator importante para vrias reaes enzimticas que atuam sobre substratos fosforilados. g) Carbono: uma fonte importante de energia a forma o esqueleto de todos os compostos orgnicos. A suplemenao gralmente pela adio de acar na forma de sacarose, glicose, frutose e outras. h) Ferro: est numa faixa intermediria entre os macros e micronutrientes. adicionado ao meio na forma quelato Fe-EDTA. Envolvido nas reaes de oxi-reduo nos organismos vivos. Essencial para a sntese da clorofila, integrante do grupo protico (heme) das porfirinas.
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j) Molibidnio: adicionado na forma de molibidato de sdio (Na2Mo04). Co-fator da redutase do nitrato. k) Cobre: usado como sulfato de cobre. um ction que em dose acima do normal fitotxico s culturas. Constituinte da enzima plastocianina que importante componente do transporte de eltrons. l) Cloro: essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao de Hill. m) Zinco: sulfato de zinco. Importante nas reaes de oxi-reduo das plantas. Co-fator de enzimas anidrase carbnica. n) Mangans: sulfato de mangans. Essencial no metabolismo para a reao de Hill na fotossntese, quando a molcula de gua quebrada produzindo eltrons e oxignio. o) Cobalto: usado como cloreto de cobalto e est envolvido na expanso foliar. 4.2.3. Constituintes orgnicos Os compostos orgnicos importantes so os carboidratos, substncias reguladoras de crescimento, vitaminas, aminocidos e amidas, certas purinas e pirimidinas, hexitis e cidos orgnicos. a) Carboidratos As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no encontram condies adequadas de iluminao e concentrao de CO2 e, as vezes, no apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotossntese (Torres, 1998). Muitas vezes, acares que no so efetivos na manuteno do crescimento do calo, sustentam a iniciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica. Os carboidratos mais usados nos meios de ciultura so a sacarose, a glicose e a frutose nos nveis de 2% a 5% (p/p) (George, 1993). A concentrao de 3% a mais usada. Concentraes de sacarose entre 6% a 12% podem ser usadas em cultura de embries, frutos e anteras, enquanto que o nvel de 1,5% usado em cultura de protoplastos. Pode ocorrer a caramelizao do acar quando exceder o tempo de autoclavagem e a sua degradao pode ocorrer a formao de hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2-metilfurano, 2,5-dimetilfurano e maltol (Ammirato et. al. 1983). Estes compostos formam meladoidinas que so compostos de colorao amarronzada, de alto peso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O acar purificado com acetato, para precipitar impurezas e pode conter alto nvel de zinco que txico para o tecido. Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio. b) Aminocidos e amidas A suplementao pode ser realizada pela incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeito benfico pode ser avaliado pela substituio desta protena por uma mistura de aminocidos e amidas. Os aminocidos e amidas tm importncia na amplificao das respostas morfogenticas, proporcionando maior crescimento e facilitando a diferenciao no sentido da regenerao. As formas "L" dos aminocidos so de ocorrncia natural. A tirosina apresenta influencia na iniciao de parte area em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries haplides mediante o cultivo de micrsporo. As amidas L-glutamina e L-aspagarina so benficas na obteno de embries somticos, e a cistena includa, s vezes, como agente redutor. c) Vitaminas Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes, desempenham funes reguladoras catalticas no metabolismo celular. A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos a tiamina (B1). A tiamina solvel em gua. Outras vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B3) e piridoxina (B6). Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da autoclavagem, a esterilizao a frio recomendada. Vitamina A: no utilizada nos meio pois, ainda no foi ainda encontrada nas plantas. Riboflavina (Vit. B2): componente da coenzima FMN (Flavina mononucleotdeo) e o FAD (Flavinaadenina-dinucleotdeo) que atuam em oxidaes biolgicas. Na fotossntese FMN participa do transporte de eltrons (George, 1996). Tiamina (Vit. B1): atua no metabolismo celular devido funo como coenzima na descarboxilao dos cetocidos. Ex: Piruvato e cetoglutarato (George, 1996). cido pantotnico: um dos componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo de lipdios.

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cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B3): um componente das coenzimas NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio. Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B6): Fazem parte de coenzima metablicas de aminocidos. Estas vitaminas tm papel importante nas reaes de transaminao e descarboxilao (George, 1996). Biotina: atua no metabolismo do cido asprtico, e nas reaes do ciclo de Krebs que levam formao deste cido (Ammirato, 1983). cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao fotossinttica devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente (Santiago, 2001). d) Outros suplementos orgnicos - Misturas complexas: So preparaes obtidas de produtos naturais, de composio indefinida, que servem para enriquecer o meio de cultivo. A composio destes produtos de difcil determinao e de uso restrito a algumas culturas e de difcil repetio experimental, quando as tentativas de adequao no forem suficientes para promover determinado processo morfogentico. Em trabalhos de rotina, estas preparaes podem ser usadas caso estimulem respostas desejadas. Protenas hidrolisadas: a mais comum a casena hidrolisada, por ser importante fonte de aminocidos. Outras tambm so utilizadas: lacto-albumina hidrolisada, triptona, peptona, etc. Suco de laranja, tomate e outros: contm cido ctrico e outras substncias de crescimento no identificadas. Leite de coco: o endosperma de Cocus nucifera na fase lquida ou gelatinosa. um suplemento bastante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio. Extrato de leveduras: fonte de aminocidos e vitaminas. Polpa de Banana: usada na suplementao do meio de cultura de orqudeas. - Hexitis: Os hexitis so compostos cclicos com grupos OH em todos os seis carbonos. O mais usado o inositol, myo-inositol a forma inativa e i-inositol a ativa. O meso-inositol uma mistura das formas d e l. O inositol considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir como fonte de carboidrato. Desempenha papel importante na biossntese do ciclitol, no armazenamento de compostos polihdricos como reserva, na germinao de sementes, no transporte de acar, na nutrio mineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de membranas, formao de parede celular, homeostase de hormnios e no estresse fisiolgico (Santiago et. al. 2001). - Compostos fenlicos: So compostos derivados de fenlicos (mono-OH) e atuam em processos que promovem o desenvolvimento areo enquanto que os derivados fenlicos (bi-OH) esto envolvidos com a iniciao de razes (George, 1996). Estas substncias atuam na degradao oxidativa do AIA. Por outro lado, compostos fenlicos (bi-OH) inibem a degradao oxidativa do AIA, tendo efeito benfico no enraizamento (Santiago et. al. 2001). - cidos orgnicos: A adio de cidos de compostos intermedirios do ciclo de Krebs, tais como malato ou citrato, comum em meio destinado cultura de protoplastos (Santiago, 2001). Estes compostos parecem estar envolvidos na minimizao do efeito inibitor da amnia. Por serem solues antioxidantes so preparadas usando uma mistura de 100 mg de cido ascrbico e 150 mg de cido ctrico, dissolvido em 1litro de gua e sua esterilizao feita em filtro bacteriolgico de 0,22 ou 0,45 micras (Ammirato, 1983; Santiago, 2001). O cido ascrbico e o cido ctrico so usados para prevenir o escurecimento de tecidos excisados de plantas. - Purinas e Pirimidinas: A concentrao mais usada varia de 40 a 160 mg/L. As bases nitrogenadas citosina e guanina podem tambm promover o crescimento de cultura de calo. A adenina ou o sulfato de adenina estimulam o crescimento de brotaes in vitro.

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4.2.3. Reguladores do crescimento vegetal Para ocorrer o desenvolvimento ou a entrada de atividade de um determinado possesso necessrio a sinalizao especfica por reguladores de crescimento em stios regulador por kinases. O controle qumico da diferenciao da parte area foi primeiramente observado em cultura de calo de tabaco. Foi observada inibio na formao de gemas por auxinas, e reverso deste efeito estimulando brotaes utilizando-se adenina bem como o fosfato inorgnico. Esta foi a constatao de que o processo de organognese in vitro controlado por substncias hormonais sendo que o desenvolvimento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano entre auxinas e citocininas. O balano de auxinas/citocininas em alto/baixo favorecem o enraizamento e o balano inverso promove a formao de parte area. Concentraes iguais promovem a produo de calos. As auxinas nos meios variam de 0,01 a 10 mg/L. As auxinas mais usadas so AIA (cido indol-3-actico), AIB (cido indol-3-butirico), ANA, 2,4-D, 2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D bastante usada para a induo de calos e tem o efeito de supresso da morfognese. As auxinas 2,4-D e ANA so sintticas e tm efeitos semelhantes s auxinas de ocorrncias naturais, sendo mais estveis degradao. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a formao de calos em monocotiledneas (Ammirato, 1983). As auxinas so termo-estveis, no decompondo quando autoclavadas. O AIA a auxina natural e a menos estvel, sendo destrudo em pH baixo. A no ser o 2,4 D e ANA, as solues estoques no devem ser armazenadas por mais de uma semana. A dissoluo das auxinas feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base para dissolver 10 mg de auxina. As citocininas so derivadas da adenina (aminopurina) e tm um papel fundamental na diferenciao e regenerao de plantas na maioria das espcies (Santiago, 2001). Induzem a diviso celular, proliferao e morfognese da parte area. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos so a cinetina (CIN), benziladenina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ). O cido giberlico (GA3) usado, algumas vezes, em cultura de meristemas, na recuperao de plantas livres de vrus. O GA3 deve ser dissolvido em gua com pH ajustado a 5,7 ou em base (NaOH 1N). As solues de GA3 devem ser esterilizadas em filtro bacteriolgico uma vez que esta substncia se decompe por autoclavagem. As solues estoques devem ser preparadas na hora. O cido abscsico (ABA) est envolvido na dormncia e absciso de folhas e frutos. Na cultura de tecidos o papel deste composto aest envolvido principalmente na maturao de embries obtidos na embriognese somtica. Este composto termoestvel e fotossensvel, recomenda-

Figura 06 Estrutura qumica dos principais reguladores de crescimento vegetal.


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4.2.4. pH O pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente cido, entre 5 e 6 (normalmente 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulaes lquidas. Em meios gelificados com gar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitao de sais (George, 1996). No ajuste do pH, lava-se primeiramente o eletrdo e, em seguida, faz-se a leitura em tampo 4,0. Posteriormente lava-se o eletrdo e desta maneira o potencimetro estar calibrado para uso. O pH varia durante o perodo de cultura. 4.2.5. Materiais de suporte a) gar gar um polissacardeo obtido pela purificao de algas marinhas. A concentrao usada varia de 0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O gar impuro constitudo de polissacardeos, aminocidos, sais, acar, etc., devendo ser lavado em gua destilada antes de ser usado. O gar alcalino, lquido temperatura de 80C e se solidifica 40C. necessrio a aquisio de agar de boa qualidade, pois podem ser txicos em algumas condies de cultivo (Guerra, 2002). Outros produtos gelificantes so Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). So mais puros que o gar e provenientes de fermentaes bacterianas (George, 1996). Usados na concentrao de 0,2% (2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar vitrificao em algumas espcies. Alguns laboratrios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes, porm apresentam restries quanto a longevidade por degradar ao longo do cultivo. b) pontes de papel Em muitas cultura no possvel utilizar agentes geleificantes ao meio e tambm no possvel o uso em imerso em meios lquidos, nestes casos ento, usa-se pontes de papel com meios lquidos. Utilizado principalmente no resgate de embries imaturos e no cultivo de ovrios. c) Outros produtos: poliacrilamida, slica gel e papel de filtro. 4.2.6 Carvo ativado E um p bastante fino e de cor escura, sendo utilizado para eliminar substancias txicas produzidas pelo explante. Concentraes em torno de 0,3% so usadas quando se deseja enraizamento in vitro, pois auxiliam na ao das auxinas e promovem a fixao dos compostos fenlicos produzidos pelo explante. Sugere-se, em alguns casos, aumento da concentrao de auxina, quando na presena de carvo ativado. A pureza deste produto varivel. 4.3 PREPARAO DOS MEIOS O preparo de solues estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e preciso na dosagem dos componentes. Normalmente se mantm os macronutrientes em solues estoque em concentraes 10 vezes superior ao da concentrao final (Torres, 1998). Para os micronutrientes as solues estoques so de 1000 vezes superior. Para o quelato EDTA F a soluo estoque de 50 vezes. As pores so mantidas em geladeira e por um perodo no superior a uma semana para a maioria das solues estoques, principalmente aquelas que apresentam precipitao. Solues estoques de vitaminas devem ser mantidas em geladeira ou em congeladores. Recomenda-se montar estoques de sais minerais (conjuntos de macrtonutrientes e micronutrientes), Fe EDTA, misturas orgnicas e reguladores de crescimento. A sacarose e o mio-inositol so pesados e preparados no momento do preparo do meio. 4.4. QUANTIDADE DE MEIO Como regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser utilizado. Devem ser considerados principalmente as exigncias de luminosidade, temperatura, trocas gasosas e acmulo de produtos txicos no meio, que sero discutidas na morfognese.

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4.5. DESINFETANTES E ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURA Os desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas esto apresentados na tabela 2. Tabela 2: Desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma).

Desinfestante
Hipoclorito de Clcio Hipoclorito de Sdio gua Oxigenada lcool etlico Nitrato de prata Cloreto de mercrio

Concentrao(%)
9-10 0,5-5,0 3-12 70-95 1 0,1-1,0

Exposio (min.)
5-30 5-30 5- 15 5- 15 5-30 2-10

Tabela 3: Perodo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma).

Volume por recipiente (ml)


25 50 100 250 500 1000 2000 4000 121C e 1,05kg/cm/cm2 = 105kPa

Tempo de autoclavagem (min.)


20 25 28 31 35 40 48 63

5. PADRES MORFOGENTICOS IN VITRO


A possibilidade de manipulao da morfognese relaciona-se com a exata compreenso dos conceitos enunciados anteriormente. Desta forma, tecidos, rgos ou clulas com intensidades variadas de determinao podem adquirir novas competncias atravs da ao de determinados sinais quimicos (reguladores de crescimento) que ativam seletivamente determinados genes (epignese). A resposta final a expresso morfogentica em dois nveis bsicos: organognese e embriognese somtica. Uma representao esquemtica das rotas e sistemas de regenerao in vitro apresentada na figura
Figura 07 Principais mtodos de micropropagao e as rotas de crescimento vegetal dos explantes. (Adaptado de George, 1996)
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5.1. ORGANOGENESE A organognese relaciona-se com a obteno de eixos caulinares monopolares originados de gemas pr-existentes ou neoformadas. Estes eixos caulinares so induzidos ao enraizamento in vitro ou ex vitro resultando em plntulas completas que podem ser ento aclimatizadas. A organognese pode ser direta ou indireta. No primeiro caso, a partir de um explante primrio h a formao de um eixo caulinar a partir de gemas apicais, laterais ou axilares. No segundo caso ocorre a desdiferenciao do explante, resultando na formao de calos, que podem ser definidos como a proliferao de clulas no diferenciadas massas, originado meristemides (Thorpe, 1980). Para finalidades de micropropagao clonal a formao de calos indesejvel uma vez que a constituio cromossmica deste material , em geral, instvel, podendo originar variantes genticos, por meio de um processo chamado variao somaclonal (Larkin & Scowcroft, 1981). Neste caso, o perodo de crescimento desorganizado deve ser o menor possvel, ou preferencialmente eliminado (Street, 1975; Murashige, 1977). A possibilidade de manipulao da organognese depende do tipo e concentrao relativa dos reguladores de crescimento, como indicado pelo j clssico trabalho de Skoog e Miller (1957). Estes autores observaram que a relao entre a auxina e a citocinina no meio de cultura era responsvel pela resposta organogentica em tecidos medulares de tabaco. Desta forma meios de cultura contendo concentraes mais elevadas de citocininas promoviam a formao de brotaes areas ou eixos caulinares; meios de cultura contendo nveis mais elevados de auxinas induziam a formao de razes e em concentraes equimolares destes reguladores de crescimento verificava-se a formao de calos. A seleo de uma planta matriz e de um explante adequado condio fundamental para orientar os padro de morfognese (Thorpe, 1980). Murashige (1974) discutiu os vrios fatores que devem ser considerados nesta seleo, tais como o rgo da planta a ser utilizado como fonte de explante, a idade fisiolgica, a poca do ano em que feita a coleta e as condies gerais da planta doadora. 5.1.1. SISTEMAS ORGANOGENTICOS O termo cultura de rgos usado para todos os tipos de cultura nos quais uma forma organizada de crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdio foliar, flores imaturas e frutos, e seu crescimento in vitro. Para a micropropagao os mais importantes tipos de culturas de rgos so: a) Cultura de meristema Consiste no estabelecimento do domo meristemtico apical sem os primrdios foliares. A brotao apical tipicamente cresce, originando um nico broto. b) Cultura de pices caulinares o estabelecimento in vitro a partir de brotaes apicais maiores do que aquelas utilizadas para iniciar a cultura de meristema, tendo alguns primrdios foliares. Essas brotaes apicais podem produzir mltiplas brotaes. c) Cultura de segmentos nodais Os segmentos nodais so constitudos de gemas laterais isoladas, segmentos de caule com uma ou mltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma nica brotao. d) Cultura de embries iniciada a partir de embries zigticos extrados de sementes. Os embries germinam originando brotos. A cultura de meristema e a cultura de embries so descritos com mais detalhes a seguir. 5.1.1. Cultura de meristemas apicais Esta tcnica compreende o isolamento e a inoculao do domo apical e alguns primrdios foliares, ou do meristema (figura 5) isoladamente (0,10 a 0,20 mm de comprimento). Usualmente, a cultura de meristema refere-se ao crescimento do domo apical da brotao, excluindo as folhas primordiais. O meristema no apresenta fololos, sendo constitudo por duas regies diferentes, tnica e corpus. A tnica constituda de uma a trs camadas de clulas, a mais interna forma a epiderme e as outras duas restantes do origem a folha ou somente a epiderme foliar.

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O corpus a camada mais interna, responsvel pela formao do restante da planta. O plano de diviso da tnica anticlinal e do corpus periclinal. O objetivo neste caso a produo de uma microplanta enraizada que deve ser livre de virus, fungos e bactrias. Quanto menor for o explante mais efetiva ser a eliminao de patgenos. Esta tcnica tem obtido sucesso com muitas plantas herbceas exploradas economicamente, como cravo, crisntemo, batatinha, batata-doce, mandioca, banana. No caso do morango a simples utilizao de mudas obtidas por cultura de meristemas propiciou um aumento na produtividade de 3 para 12 t/ha em lavouras do RS (Peters, 1986). Atualmente com a introduo de tecnologias adicionais na cadeia produtiva do morango, j so obtidas produtividades de at 80 t/ha, em cultivos no RS, SC e SP. Para plantas lenhosas a cultura de meristemas apresenta algumas dificuldades havendo a necessidade de utilizao de tcnicas auxiliares como a microenxertia (Hartmann et al., 1990). A histria da erradicao na cultura de tecidos de virus iniciou em 1934 quando White observou que subcultivos de segmentos de razes de plantas infectadas por virus, levavam sua eliminao. Observou-se posteriormente que a gema apical de crescimento tambm se encontrava livre de vrus. Morel e Martin Lo, na dcada de 40, cultivaram meristemas caulinares de plantas infectadas, obtendo sucesso. Hoje esta tcnica universalmente utilizada e apresenta grande impacto na produo agrcola vegetal. Em uma planta infectada, a concentrao de virus no uniforme e maior em tecidos maduros e menor em tecidos meristemticos. Na primavera quando o crescimento intenso, os meristemas alongam-se rapidamente e a concentrao de virus menor.

Figura 09 - Seco longitudinal do meristema apical do caule de Coleus sp. Seta grossa = gema axilar; seta fina = protoderme; cabea de seta = procmbio; MF = meristema fundamental; PM = promeristema. Barra = 500 mm. (Apezzato, 2003).
Estudos demonstram que plantas obtidas por cultura de tecidos esto livres de vrus. A hiptese mais aceita para a ausncia de vrus nestes tecidos diz que a interrupo temporal da organizao normal do tecidos meristemticos, ocasiona uma inibio da multiplicao do vrus devido a no disponibilidade de enzimas chaves. Esta hiptese do efeito da desorganizao celular foi reforada pela presena de baixas concentraes de vrus em calos friveis de tabaco, quando comparados com calos compactos e com maiores nveis de organizao. Alm disto, a ausncia de tecido vascular na regio do meristema apical, a presena de conexes plasmodesmticas em dimenses diminutas nestas clulas e o ritmo ativo de divises celulares nesta regio, tambm so fatores que podem explicar a baixa concentrao ou a ausncia de vrus nesta clulas. O processo ativo de diviso celular poderia utilizar a maior parte da energia para a formao de macromolculas e componentes celulares estruturais, deixando os vrus em condies pouco competitivas para a prpria multiplicao. Comprovou-se tambm que a concentrao de vrus aumenta na regio sub-apical dos meristemas de plantas tratadas com substncias inibidoras de crescimento, as quais reduzem as taxas de diviso celular. Em resumo, a inexistncia de vrus nos meristemas apicais pode ser atribuda aos seguintes aspectos: a) O domo apical mantm certa distncia das terminaes vasculares e, nestas condies os virus necessitariam passar de clula a clula at o domo apical;
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b) Quando as clulas meristemticas do domo apical esto em diviso ativa, o RNA do virus no consegue introduzir-se no genoma destas clulas; c) Clulas meristemticas podem ter sistemas qumicos de inativao, que podem ser potencializados em meristemas isolados; d) Altas concentraes de auxinas presentes nos meristemas caulinares seriam responsveis pela ausncia de virus. A propagao massal das plantas isentas de viroses poder ser feita atravs de outras tcnicas como as que so descritas posteriormente. 5.5.1.1. Aplicaes da cultura de meristema A cultura de meristemas utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores na iniciao foliar e no estudo do florescimento, na propagao vegetativa para obteno de plantas livres de patognos e, na multiplicao clonal rpida. Os meristemas so amplamente utilizados na limpeza pois estes materiais so livres de vrus. Isto explicado plos seguintes fatos: a) Crescimento contnuo do tecido. A diviso celular intensa, o que aumenta a competio por metablitos e desta forma o vrus no tem energia suficiente para sua multiplicao. b) Ausncia do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. muito difcil a passagem do vrus clula a clula (o DNA do vrus maior que o plasmodesmata). Vrios fatores so determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre estes, pode-se destacar: Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num maior sucesso na limpeza, mais a sobrevivncia menor; Localizao do explante: explantes retirados da ponta do broto esto em um estdio mais jovem de desenvolvimento do que explantes da base; poca de coleta: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo. 5.1.1.2. Proliferao de gemas axilares (segmentos nodais) Esta tcnica fundamentada pela induo das gemas laterais existentes. Inclui o isolamento e a inoculao de segmentos nodais contendo gemas vegetativas axilares, propiciando a multiplicao direta (ausncia de calo) de brotaes que podem ser separadas em microestacas para enraizamento in vitro ou in vivo. Este procedimento pode originar respostas de propagao massal em progresso geomtrica. Por ser um sistema direto, apresenta menores possibilidades de gerar variantes somaclonais. Um dos exemplos de utilizao desta tcnica a propagao clonal do abacaxi atravs da liberao das gemas axilares. Atualmente um sistema utilizado em laboratrios junto a viveiros comerciais de espcies lenhosas, pois fcil de fcil manipulao e de alta taxa de regenerao de explante. Alm disso, o material vegetal mantm as caractersticas genticas com quase ausncia absoluta de variaes epigenticas. 5.1.2. INDUO E PROLIFERAO DE GEMAS ADVENTICIAS Consiste na induo e formao direta ou indireta de meristemides a partir de discos foliares, pices caulinares ou radiculares, segmentos caulinares nodais e internodais, cotildones, hipoctilos e outras estruturas de plntulas, segmentos de flores e inflorescncias imaturas (monocotiledneas: Gladiolus, Hemerocallis, Iris, Freesia; Dicotiledneas: Gerbera, Chrysanthemum), escamas de bulbos (tecidos meristemticos na placa basal). Neste modelo, a escolha do explante e o tipo e concentrao do regulador de crescimento determinam o sucesso da iniciao das brotaes adventcias. No caso de iniciao direta, algumas clulas parenquimticas epidrmicas ou sub-epidrmicas tornam-se meristemticas e grupos celulares (meristemides) com forte reao a corantes especficos se desenvolvem. No modelo indireto ocorre a desdiferenciao das clulas parenquimticas e a organizao dos meristemides e as brotaes adventcias surgem a partir da periferia dos calos. Este modelo organogentico resulta nas maiores taxas de multiplicao, sendo de uso mais geral e comum em plantas hortcolas. Por outro lado ele pode originar a produo de variantes ou quimeras por estar baseado na formao de calos. Outro uso freqente deste modelo o co-cultivo com Agrobacterium em tcnicas de transformao de plantas. 5.1.2. ESTGIOS E MODULAO DA ORGANOGNESE A microproagao de plantas atravs da cultura de tecidos pode ser operacionalizada em uma seqncia laboratorial de trs estgios, cada qual apresentando objetivos, pressuposies e necessidades especficas em termos de composio dos meios de cultura, tipo e balano dos reguladores de crescimento e condies fsicas como luz, temperatura, foto perodo.
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Em condies laboratoriais cada estgio deve ser identificado e as condies timas devem ser estabelecidas (Murashige 1974). Debergh e Read (1991) propuseram a incluso do estgio 0 nesta seqncia de operaes e, desta maneira, a induo e a expresso de respostas organogenticas in vitro deve obedecer aos passos listados a seguir: Estgio 0 - Consiste em selecionar e cultivar a planta matriz doadora de explantes em condies adequadas e, eventualmente, controladas. Isto significa que pode ser necessrio modificar as condies de fotoperodo e temperatura, ou aplicar a essa planta fitorreguladores do grupo das giberelinas e auxinas, alterando com isto a sua condio fisiolgica. Estgio I - Consiste no estabelecimento da cultura assptica. O objetivo deste estgio a definio do tipo de explantes a ser utilizado, o estabelecimento de culturas isentas de microorganismos contaminantes, a obteno de altos ndices de sobrevivncia e de rpido crescimento dos explantes. Neste estgio torna-se necessrio monitorar e controlar as reaes de oxidao que ocorrem: a) pela oxidao de compostos fenlicos presentes no explante, como resposta ao ferimento provocado pela exciso de um rgo ou tecido e; b) pela sntese de compostos mono e polimricos por parte do explante. A incubao destas culturas na ausncia da luz por alguns dias pode inibir os processos oxidativos. Estgio II - Multiplicao: este estgio fundamentado na diviso e diferenciao celular, objetivando a obteno de uma plntula, de acordo com as diferentes rotas morfogenticas possveis. De maneira geral procura-se promover a liberao de gemas axilares pr-formadas ou a induo de gemas adventcias. Em muitos casos estgios intermedirios de calo esto envolvidos, contudo, quando o objetivo a manuteno da conformidade clonal, a passagem por estgios de calo deve ser evitada, tendo em vista a possibilidade de ocorrncia de variaes somaclonais. Neste estgio deve-se determinar o nmero e intervalo de sub-cultivos, bem como determinar e otimizar a taxa de multiplicao, ou seja, o nmero de gemas ou de eixos caulinares que podem ser obtidos a partir de cada inculo nos sub-cultivos. Para bananeira e abacaxizeiro, partindo-se de gemas apicais e laterais respectivamente, a taxa mdia de multiplicao de 10 eixos caulinares a cada sub-cultivo realizado a cada 20 dias. A experincia adquirida com esses dois sistemas indica que podem ser efetuados cinco sub-cultivos com certa garantia de manuteno de fidelidade clonal. A partir deste sub-cultivo podem aparecer mutantes ou variantes somaclonais. No Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal do Depto. de Fitotecnia do CCA/UFSC, no foram observadas alteraes morfolgicas na organognese do abacaxizeiro at o quinto sub-cultivo, a partir do qual se identificaram mutantes, na freqncia de 1 para 700. As condies ambientais neste estgio relacionam-se com a temperatura, cuja faixa tima est entre 22 e 27oC para plantas de clima temperado e tropical, respectivamente. O perodo de luz deve permanecer em torno de 16 a 18 horas em intensidades luminosas mdias de 5 W.m-2. Estgio III - Nesta fase busca-se o elongamento, a induo e iniciao radicular e a preparao para a aclimatizao. O objetivo deste estgio a preparao para a converso das condies heterotrficas para autotrficas. As estratgias deste estgio incluem eventuais incluses no meio de cultura de: a) GA3 para induzir o elongamento de eixos caulinares; b) AIB para induzir a iniciao radicular e; c) carvo ativado para favorecer a iniciao radicular. Redues nas concentraes dos sais e das fontes de carboidratos do meio de cultura podem trazer benefcios iniciao radicular, bem como facilitar o processo de aclimatizao. Tendo em vista que este estgio da cultura in vitro pode representar 30 a 60% do custo de uma planta micropropagada, muitos laboratrios preferem promover o enraizamento ex-vitro e esta estratgia deve ser considerada sempre que possvel. O emprego da tcnica da dupla-camada que consiste em adicionar uma pequena quantidade de AIB sobre a superfcie do meio slido, para que ocorra a induo radicular dos eixos caulinares tem gerado execelentes resultados em muitos sistemas. Estgio IV - Aclimatizaco: Neste estgio ocorre a transio da condio heterotrfica para autotrfica. O principal objetivo neste estgio diminuir ao mximo as perdas que ocorrem principalmente pela desidratao dos tecidos da microplanta. O emprego de estufas, tneis plsticos, sistemas de nebulizao e de antitranspirantes deve ser considerado para cada situao, tendo em vista que as plantas neste estgio normalmente no apresentam estmatos funcionais e suas folhas tem reduzida capacidade de formao cutculas cerosas protetoras. Composies adequadas de substratos tambm so importantes e na maior parte dos casos o emprego de areia, terra, vermiculita, casca de arroz carbonizada isoladamente ou em misturas proporcionais, resulta em elevados ndices de sobrevivncia.

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De maneira geral este estgio inicia com a retirada das plntulas dos frascos e a cuidadosa remoo por lavagem de resduos de meio de cultura solidificado junto ao sistema radicular. Um segundo passo consiste em repicar estas plntulas para bandejas de isopor contendo o substrato autoclavado, cuja composio foi previamente determinada. O terceiro passo consiste em manter estas bandejas, por perodos de at 15 dias, em sala de cultura cuja temperatura e durao e intensidade luminosa possam ser controladas. A manuteno de uma cmara mida sobre as bandejas pode ser feita pela utilizao de filmes plsticos em cobertura. Posteriormente, transfere-se esta bandeja para uma estufa com sistema de nebulizao intermitente por perodos mdios de 15 a 30 dias, podendo-se aps, repicar estas plntulas para sacos plsticos contendo uma mistura convencional no autoclavada de solo argiloso, arenoso e matria orgnica e mant-las em condio de ripado ou cobertura com sombrite que deixem passar em torno de 50% da luminosidade. Por fim procede-se uma retirada gradual da cobertura para que as mudas sejam submetidas s condies normais que se verificam aps o transplante para o local definitivo. importante salientar que determinada seqncias destas operaes podem ser eliminadas em algumas espcies. Para abacaxizeiro, por exemplo, o segundo passo anteriormente descrito pode ser eliminado e no h a necessidade de ser feita a repicagem para sacos plsticos, podendo as mudas ser comercializadas ou enviadas ao campo nas bandejas de isopor. Torna-se necessrio, portanto, estabelecer procedimentos especficos para cada espcie a ser trabalhada em um laboratrio de micropropagao. 5.1.3. CULTURA DE EMBRIES A cultura de embries pode ser definida como o isolamento estril e crescimento de um embrio imaturo ou maturo in vitro, com o objetivo de se obter uma planta vivel. Embries zigticos ou de sementes so frequentemente usados vantajosamente como explantes em cultura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Em cultura de embries, entretanto, os embries so retirados das sementes e so individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendo uma planta por explante. A cultura de embries isolados pode ajudar na produo rpida de plntulas de sementes que apresentam dormncia embrionria ou embrio imaturo. 5.1.3.1.Tipos de cultura de embries: a) Cultura de embrio imaturo Originado de sementes imaturas, usado para evitar o abortamento natural. mais difcil, devido a exciso e meio de cultura mais complexo. b) Cultura de embries maduros Originado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao de semente. 5.1.3.2. Estdios de desenvolvimento do embrio Quanto mais imaturo for o embrio maior ser o requerimento nutricional. No estdio globular h requerimento de meios mais complexo (fitormnios, altas concentraes de acares, gua de coco, etc.). Antes do formato de corao, os embries so bastante heterogneos, no sintetizando fitormnio ou mobilizando compostos de carbono. No estdios heterotrficos, os embries requerem sais, acares, vitaminas, nitrognio, citocininas, auxinas, gua de coco (algumas substncias podem ser opcionais). Quando aumentam de tamanho, tornamse autotrficos e neste estdio requerem um meio mais simples. Os embries geralmente requerem alta taxa de acar (fonte de carbono e agente osmtico), pois tm um potencial hdrico muito negativo (contedo alto de slidos). Uma alternativa para resolver a dificuldade imposta pelo potencial hdrico do embrio fixar a sacarose e elevar o teor de manitol (agente osmtico). 5.1.3.3 Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrio 1) Gentipo: em algumas espcies o embrio cresce facilmente enquanto que em outras muito difcil (h tambm diferenas entre cultivares de uma espcie). 2) Estdio de desenvolvimento do embrio no isolamento: muito difcil desenvolver embrio muito pequeno in vitro. 3) Condio de crescimento da planta-me. crescer a planta-me em condies controladas resulta em um melhor desenvolvimento do endosperma, portanto melhora o crescimento do embrio isolado. 4) Composio do meio: embries imaturos requerem uma composio mais crtica do que embries maturos. Em ambos (maduro e imaturo) os macro e microelementos so importantes.

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Os meios usados so slidos: MS, White e 85, em uma faixa de pH entre 5 a 6. Carboidratos (sacarose, usada na concentrao de 2-3% e 8-12% para embries maturos e imaturos, respectivamente) so fontes de energia e tambm agem abaixando o potencial osmtico, especialmente em embrio jovens. O gar usado em concentraes entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam em inibio de crescimento). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininas geralmente no so usados. As vezes se utiliza giberelina. Substncias de contribuio complexa como a gua de coco so bastante utilizadas, especialmente para embries imaturos. 5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantm-se o embrio isolado no escuro por 7 a 14 dias. 6) Temperatura: a temperatura tima dependente da espcie, variando, geralmente entre 22 e 28C). 5.1.3.4. Aplicaes prticas da cultura de embries a) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de semente Em algumas espcies absolutamente impossvel obter a germinao in vivo devido a caractersticas genticas ou fisiolgicas. b) Recuperao de hbridos de cruzamentos incompatveis No melhoramento, cruzamentos interespecficos e intergenricos para transferir genes de interesse da espcie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidade gentica) podem produzir embries abortivos devido a incompatibilidade. Isto ocorre tambm em cruzamentos onde existam barreiras pr ou ps-zigticas (sementes murchas e embries abortivos). Os embries hbridos so salvos e removidos antes que ocorra o aborto e, posteriormente cultivados in vitro. c) Superao da dormncia das sementes Em algumas sementes ocorrem inibidores qumicos endgenos ou h requerimentos especficos de luz e temperatura ou ainda a resistncia fsica presente nas estruturas que recobrem o embrio. A cultura de embries uma alternativa para superar estes problemas. d) Superao da esterilidade das sementes. As causas de ocorrncia de sementes estreis em algumas espcies podem ser o desenvolvimento incompleto do embrio, mutaes das estruturas que cobrem o embrio ou algum tipo de dormncia recalcitrante para a qual nenhum mtodo tem sido desenvolvido. e) Germinao de sementes de parasitas obrigatrios. Sem o hospedeiro, impossvel a ocorrncia in vivo. Assim tambm a retirada dos embries e cultivo in vitro pode suprir esta necessidade, permitindo o desenvolvimento de plantas. f) Preveno do embrio abortivo que ocorre com o amadurecimento precoce de frutos carnosos Em cruzamento dos frutos (pssego, ameixa, cereja) o transporte de gua e nutrientes para o embrio imaturo algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o aborto. g) Propagao vegetativa Devido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embries so excelentes explantes para propagao clonal in vitro. Especialmente para conferas e gramneas. 5.1.4. MICROENXERTIA Esta tcnica (figura 10) consiste em excisar de uma planta matriz uma gema apical ou o meristema propriamente dito que enxertado sobre uma plntula porta-enxerto que foi obtida em condies asspticas. Sua principal aplicao a eliminao de viroses e de outros microorganismos de natureza sistmica que tendem a se acumular em plantas propagadas vegetativamente, quando da impossibilidade de se usar a tcnica de cultura de meristemas Na citricultura esta tcnica tem sido empregada rotineiramente nos laboratrios de micropropagao porque no sistema tradicional baseado na propagao de clones nucelares de espcies poliembrinicas, o tempo necessrio para a superao da juvenilidade muito longo. Alm disto, em espcies monoembrinicas ocorre variabilidade gentica uma vez que o embrio pode ser resultante de um processo de fecundao cruzada. A termoterapia tambm pode ser empregada para a limpeza de virus em plantas de propagao vegetativa, contudo nem todas as plantas apresentam-se isentas dos vrus aps serem submetidas a este processo.

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Figura 10 Microenxertia da cultivar de ma Gala sobre porta enxerto Marubakaido. LFDGV. Fitotecnia. UFSC/CCA, 2002.
5.2. EMBRIOGNESE SOMTICA Uma das mais claras demonstraes da totipotencialidade em clulas de plantas superiores a obteno de estruturas embrionrias bipolares em sistemas in vitro. De maneira geral este modelo morfogentico inicia com a seleo e ativao de clulas embriogenticas competentes (modelo direto) ou com a induo destas clulas (modelo indireto) e progride atravs de seqncias idnticas aquelas observadas para a embriognese zigtica. Na definio de Haccius (1978) embriognese somtica ou adventcia o processo pelo qual novos indivduos se originam a partir de clulas simples, que no so produto da fuso de gametas e que no apresentam conexes vasculares com os tecidos maternos. A iniciao e o desenvolvimento de embries somticos em sistemas in vitro foi obtida quase simultaneamente por Steward et al. (1958) e por Reinert (1959) em Daucus carota. No final dos anos 70, a ocorrncia deste padro morfogentico j era relatada para 32 famlias, 81 gneros e 132 espcies vegetais. Existem claras evidncias de que a ocorrncia da ES in vitro favorecida por uma adequada manipulao de uma auxina forte no meio de cultura. O 2,4-D parece ser esta auxina na maior parte dos sistemas experimentais. Segundo Vasil (1982), a competncia embriogentica aparentemente adquirida durante o perodo inicial em cultura na presena de altos nveis desta auxina. Contudo a expresso da embriognese somtica somente ocorre na presena de baixos nveis deste regulador de crescimento. 5.2.1. EMBRIOGENESE SOMTICA ADVENTICIA Ocorre a partir de clulas ou calos originados em aparatos reprodutivos. As clulas que iniciam o processo (clulas-mes) so proembriogeneticamente determinadas (PEDC). Exemplos ilustrativos deste sistema incluem a regenerao a partir do tecido nucelar em citros (Button & Kochba, 1977), de vulos imaturos de mamo (Litz, 1987) e de videira (Mullins, 1987). Embries adventcios podem ter origem direta a partir de clulas simples localizadas na epiderme dos embries zigticos, via alterao nos planos de diviso, como o caso do palmiteiro (Guerra e Handro, 1988), ou indireta a partir de calos de embries zigticos de cacau (Pence et al., 1979). 5.2.2. POLIEMBRIOGNESE SOMTICA uma forma de multiplicao que captura o processo natural de reconstituio do embrio zigtico. Inicia com o transplante para culturas in vitro de massas suspensor-embrionrias, que so massas celulares derivadas dos primeiros estgios da embriognese zigtica. A correta manipulao deste sistema permite a clonao em larga escala destas clulas em um ciclo repetitivo. A alterao das condies de cultura permite a progresso destes pr-embries para estgios subseqentes (ciclo de maturao) e a obteno de um grande nmero de embries somticos que podem ser encapsulados em cpsulas de hidrogel para armazenamento ou semeadura (sementes artificiais ou sintticas). Este processo distinto daquele verificado para a embriognese somtica adventcia porque os estgios de desenvolvimento ocorrem sem a necessidade de se excisar um tecido, induzir a desdiferenciao e a posterior rediferenciao celular, o que implica dizer que na poliembriognese somtica no h formao de calos.

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Alm disto, algumas das clulas transplantadas podem dividir-se sem a necessidade da adio de reguladores de crescimento ao meio de cultura. Este fenmeno atribudo a superioridade gentica e aos altos nveis endgenos de fitorreguladores nestas clulas. A poliembriognese somtica de ocorrncia ampla nas gimnospermas, mas pode ocorrer tambm em angiospermas. Revises completas sobre o assunto so encontradas nos artigos de Gupta e Durzan (1986) e Durzan e Gupta (1988) e no livro "Plant Morphogenesis" de Sinnot (1960). 5.2.3. EMBRIOGNESE SOMTICA INDUZIDA Este modelo resulta de calos e suspenses celulares depois que o tecido matriz (explante) submetido a tratamentos que induzem competncia embriogentica (detalhes na figura 12). Isto significa que necessrio que ocorra a desdiferenciao e posterior rediferenciao celular atravs de uma reprogramao gentica (epignese) cujos determinantes bsicos so o estgio fisiolgico do explante e o tipo e concentrao do regulador de crescimento que atuar como sinal qumico para a ativao gnica diferencial. De maneira geral, a perspectiva de sucesso em extrair resposta embriogentica neste modelo depende da utilizao de explantes juvenis ou embrionrios e da manipulao adequada de uma auxina forte, como o 2,4-D. Esta auxina atua como indutora do processo (efeito "pulse"), contudo sua presena no meio de cultura depois da induo pode causar anormalidades ontogenticas. Portanto, neste modelo em particular e na embriognese somtica em geral, a ativao ou induo desencadeada pelo uma auxina forte como o 2,4-D mas a expresso desta rota morfogentica somente ocorrer em meios de cultura isentos ou com baixas concentraes deste regulador de crescimento. Exemplos ilustrativos deste modelo foram obtidos e/ou citados para o cafeeiro por Sondahl et al. (1981), para palmeiras por Tisserat et al. (1979), para gramneas por Vasil (1982), para soja por Christianson (1985) e para cenoura por Litz et al. (1985), cujos artigos ampliam e aprofundam detalhes sobre este modelo.

Figura 12 - Ciclos da embriognese somtica e a seqncia de eventos celulares da desdifenciao e diferenciao (Adaptado de Durzan, 1988)

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5.2.4. SUSPENSES CELULARES Suspenses celulares consistem de clulas e agregados celulares dispersos em meios lquidos em agitao. O crescimento celular baseia-se nas mudanas das taxas de diviso em fases definidas. No incio as clulas dividem-se lentamente (lag fase), posteriormente ocorrem fases de rpido crescimento (exponencial e linear) e por fim, as clulas tendem a taxas menores de diviso por efeito de competio (fase estacionria). Neste momento, atravs da subcultura de uma amostra destas clulas, possvel reiniciar a cultura e este procedimento pode ser mantido indefinidamente (Street, 1977). Suspenses celulares podem ser iniciadas pela inoculao de calos friveis ou outros tecidos que possam originar linhagens celulares organogenticas ou embriogenticas. Uma suspenso celular de primeira passagem contem uma mistura de clulas vivas, mortas e resduos. Filtragem seletiva, uso de pipetas ou seringas auxiliam na obteno de culturas puras e homogneas. A possibilidade da manipulao e do cultivo de clulas em escala comercial pode exigir o uso de biorreatores. Estes equipamentos foram desenvolvidos originalmente para o cultivo de microorganismos e outras clulas vivas para propsitos de fermentao e/ou para a produo de produtos secundrios para uso industrial. Para suspenses celulares vegetais, os meios de cultura so praticamente idnticos aqueles exigidos para a obteno de calos e incluem os macro e micronutrientes, sacarose, vitaminas e um adequado balano de reguladores de crescimento. De maneira geral a maior utilidade dos biorreatores relaciona-se com a obteno de um grande nmero de clulas ("scale-up") em ciclos repetitivos de diviso celular e para a obteno de metablitos secundrios. Para efeitos de micropropagao, as clulas obtidas so plaqueadas e manipuladas para a ativao de processos regenerativos nas rotas de organognese ou embriognese somtica. A induo/ativao de linhagens celulares embriogenticas atravs de suspenses em meios lquidos pode propiciar a obteno de uma relao direta (1 clula pr-embrionria/ 1 plntula) e parece ser o melhor sistema pelo qual tecnologias de encapsulamento em hidrogel possam gerar sementes sintticas. Alm disto, o estabelecimento de linhagens celulares embriogenticas a maneira mais elegante de se manipular e modular a embriognese somtica para a propagao massal de gentipos superiores. Suspenses celulares so tambm as melhores fontes para a obteno de protoplastos para propsitos de fuso, transformao e introduo de organelas. 5.2.4.1. Aplicaes da suspenso celular: usada para obteno de sementes sintticas (embriognese somtica isolamento de protoplastos, isolamento de mutantes, obteno de resistentes certos elementos (Alumnio, toxinas, herbicidas, sal), produo de metablito secundrios e nos processos de transformao de plantas. 5.2.4.2. Mtodos mais utilizados para medir o crescimento celular: Para quantificar o crescimento de clulas em suspenso, so utilizado: principalmente os mtodos baseados no nmero de clulas, peso de matria seca peso de matria fresca, volume de clulas e protena total da clula. Um calos tpico iniciado de um explante passa por trs estgios de desenvolvimento, que compreende a induo da diviso celular, um perodo de diviso celular ativa durante o qual as clulas diferenciadas perdem a; caractersticas especializadas para tornarem-se desdiferenciada e um perodo no qual a diviso celular reduzida ou mesmo cessa, iniciando ento a especializao celular. Esses estdios podem ser acompanhados numa curva de crescimento caracterizadas por seis fases (figura 13). Fase lag: caracterizada por no ter ganho em nmero de clulas, pelo inicio da mobilizao de metablitos sem ocorrer qualquer diviso celular, pela sntese de protenas e sntese de metablitos especficos. A ateno deve ser dada densidade do incuo que afeta o comprimento da fase lag. Quanto menor o peso do calos utilizado, maior a fase lag. Fase exponencial: caracterizada por diviso celular intensa, aumento no nmero de clulas, porm clulas de tamanho pequeno com formao de agregados de clulas. Fase linear, a fase exponecial seguida pela fase linear. O crescimento celular ativo e as clulas adquirem competncia para proceder a repicagem. Fase de desacelerao: ocorre uma reduo na diviso celular. no final dessa fase que se deve iniciar o processo de repicagem. Fase estacionria: a repicagem deve ser terminada ainda no inicio dessa fase quando no h diviso celular. As culturas no podem ser mantidas nessa fase por um perodo longo. Fase de declnio: as clulas comeam a morrer, culminando com a lise celular.

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5.2.4.3. Importncia da dinmica de crescimento A curva de crescimento de calos calculada com o objetivo de se obter a poca de repicagem (subcultura), para determinar onde h a maior produo de metablitos (quando o estudo objetiva o metabolismo secundrio). Esta fase de desacelerao, pois os metablitos secundrios no constituem prioridade no metabolismo celular.

Figura 13 - Dinmica de crescimento de uma suspenso celular.(Adaptado de George, 1993).


5.2.5 .BIORREATORES Os biorreatores so equipamentos usados para micropropagao clonal e massal de plantas, cujo objetivo a imerso temporria ou permanente de cultura de clulas ou tecidos vegetais ao meio de cultivo lquido. Tem propsito fundamental de facilitar o trabalho rotineiro e melhorar as condies ambientais e aspticas para as culturas, produzindo em larga escala.. Historicamente, os biorreatores foram mais conhecidos por fermentadores e estavam direcionado para o cultivo de clulas ou microrganismos, com vistas a produzir metablicos secundrios, alcalides, antibiticos, entre outros (Barruetto, 2002). O nome fermentador est relacionado etimologicamente com fermentao que, na sua raiz latina, deriva de fermentare, cujo significado ferver, isto , produzir bolhas de ar, numa aluso ao fato de os fermentadores serem destinados a processos fermentativos como, por exemplo, a produo de lcool, onde as leveduras regeneram NAD a partir de sua forma reduzida NADH, com produo de etanol e C02, na qual este ltimo, pela apario de bolhas, d a idia de fazer ferver o meio lquido nutritivo (Leveau & Bouix,1985). Inicialmente, e pelo fato de serem destinados a usos industriais, esses fermentadores foram de grande capacidade: de 20 a 4.000 mil litros de meio lquido nutritivo. Em decorrncia disso, esses fermentadores devem ter acurados sistemas de oxigenao, agitao mecnica do meio lquido, monitoramento do pH, da temperatura e da formao de espuma, tudo o que os converte em verdadeiras obras da engenharia e da automatizao, que asseguram parte bitica (microrganismos) sobreviverem nesse ambiente abitico artificial, visando aumentar seus rendimentos (biomassa, metablicos secundrios, antibiticos, etc.), porm com altos custos de instalao. Paralelamente biotecnologia da fermentao, a cultura de tecidos vegetais vinha desenvolvendo seu trabalho biotecnolgico de manipulao de clulas, tecido e rgos com vistas a propagar material clonal para uso comercial. Os primeiros biorreatores adaptados para plantas datam de, aproximadamente, 26 anos atrs (Levin et al., 1988) De l para c, muitos tipos tm sido propostos, isso porque um biorreator concebido em funo do tipo de processo que se deseja obter. Assim, para embriognese somtica, se requer um tipo de biorreator, mas, para micropropagar atravs de organogense, gemas, o desenho mais eficiente pode ser outro (Merchuk, 1990).

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5.2.5.1. Sistemas de biorreatores Biorreatores de imerso temporria; Consiste geralmente de um conjunto de dois recipientes com capacidade de 1 a 5 litros. Um que contm o meio de cultivo lquido (menos de 20% da capacidade do frasco), outro que comporta os explantes. Em tempo pr-determinado ocorre a transferncia do meio de cultivo para o frasco que contm os explantes por um breve perodo (de 1 a 3 minutos). Depois o meio sugado para o depsito em mesmo nvel ou escoado em depsito com nvel inferior. Este ciclo repetido a cada hora, ou ento, conforme as exigncias do explante. Sua utilizao efetiva tem sido para sistemas morfognicos, j que uma das dificuldades a fixao de pequenos explantes (figura 14).

Figura 14 Tipos de biorrteatores e sistemas de funcionamento

Biorreatores de imersso permanente; Em geral so os biorreatores utilizados para a micropropagao massal de plantas, mais especificamente para a cultura de clulas isoladas, calos ou de protoplastos. Tem pequena capacidade (1 a 5 litros), e, no caso de serem desenhados para multiplicao de clulas ou embries somticos. Devem possuir um sistema de oxigenao, um outro de agitao mecnica, por meio de ps giratrias ou um sistema vibratrio para produzir a turbulncia necessria homogenizao e homeostase no interior do biorreator, e ainda, sensores de pH, temperatura, 02 e espuma (Preil et al. 1988; Takayama & Akita, 1994). Tambm outra opo so bales volumtricos com depresses laterais, os quais so rotacionados em sentido orbital (figura 14). Biorreatores de tipo air-lift; No tocante propagao de plantas atravs de gemas, existem os biorreatores de imerso temporria (Alvard et al.,1993) e os de borbulhamento contnuo ou imerso permanente (BIPER) tipo air-lift (George, 1993-96) Nos de imerso temporria, as gemas a serem multiplicadas ficam expostas a ciclos de imerso, evitando a presena de dispositivos de agitao e arejamento e, portanto, simplificando o desenho do biorreator. Este biorreator, basicamente um sistema de engenharia simples e barata. Consta de um recipiente de vidro com capacidade de 500 a 1000 ml, cuja tampa apresenta dois furos, um para a entrada do ar e outro para sada, sendo que, em ambos os casos, esses orifcios esto providos de dutos de ao inox com filtro Millipore (0,2 m de poro) a fim de evitar a contaminao interna. O ar provido atravs de um microcompressor (aproximadamente 3 litros/ minuto), e conduzido ao fundo do recipiente atravs de uma mangueira de silicone, de onde sai, atravs de um tubo poroso, formando bolhas que agitaro o meio lquido. Com exceo da borracha que liga o filtro de entrada ao compressor, todos os componentes do sistema so autoclavveis (120C e 20 minutos) (figura 14).

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Figura 15 - Culturas de bromlia cultivada em processos de biorreatores de imerso temporria e a seqncia de formao, determinao e regenerao dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.

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5.2.5.2. Inoculao dos explantes feita a autoclavagem, o frasco, contendo o meio nutritivo. Depois em cmara de fluxo laminar aberto para a inoculao de brotos, suspenses celulares ou calos. O meio lquido normalmente constitudo do meio SP (Barrueto Cid et al., 1999) complementado com diferentes concentraes de BAP (6benzilamino purina) segundo se trate de orqudeas (Ionopsis ochlereuca), abacaxi (Ananas comosus L. cv. Perola) caf (Coffea arabica), mamo (Carica papaya L. cv Tainug), lamo (Populus tremula x P. alba). As touceiras contendo um nmero variado de brotos so previamente obtidas em meio slido e uma precondio ter seu protocolo de multiplicao estabelecido, antes de iniciar os trabalhos com o biorreator. Os explantes em geral podem ser de origem do prprio sistema dos biorreatores, dando a possibilidade de processar cultivos seqncias de explantes em escalas comercias, as biofbricas. 5.2.6. PROTOPLASTOS Protoplastos so a parte viva das clulas vegetais. Contm o ncleo, citoplasma, vacolo e outros componentes celulares circundados por uma membrana semi-permevel. A clula vegetal, em contraste com a clula animal, circundada por uma parede celular constituda de celulose, hemicelulose e materiais pcticos. Protoplastos podem ser obtidos a partir de clulas em suspenso ou diretamente a partir de clulas do mesfilo foliar. A obteno de protoplastos foi possvel a partir da descoberta de que a parede celular das clulas vegetais poderia ser removida por enzimas que a digerem (Cocking, 1960). Preparaes enzimticas comerciais so baseadas em misturas de celulase e pectinase. A manuteno de uma presso osmtica adeuqada necessria para prevenir a ruptura da membrana celular e para contrabalanar a remoo da parede celular. A utilizao de alguns corantes tais como carmin actico, azul de Evans e compostos de reao de fluorescncia pode indicar a viabilidade ou no dos protoplastos obtidos. As aplicaes das tcnicas de isolamento e regenerao de protoplastos podem ser vistas sob dois ngulos. Do ponto de vista do conhecimento bsico possvel o estudo dos aspectos relacionados com a formao da parede celular e com a ontognese de processos regenerativos a partir de clulas simples. Do ponto de vista aplicado torna-se possvel a utilizao de tcnicas de transformao como a fuso de protoplastos de espcies no aparentadas, rompendo com isto os limites impostos pela propagao sexual. A fuso de protoplastos de gentipos distintos gerando a combinao de dois ncleos e citoplasmas chamado de hibridizao somtica ou parasexual. Alm disto, protoplastos so considerados como o material ideal para a utilizao de tcnicas de transformao direta atravs de metodologias envolvendo DNA recombinante. 5.2.7. CULTURA DE POLN E ANTERAS A cultura de anteras uma tcnica para a obteno de plantas haplides a partir de plantas normalmente diplides. A descoberta que o gro de plen poderia desenvolver embries foi feita por acaso na dcada de 60. Atualmente, muitas plantas so produzidas a partir do gro de plen imaturo ou calo que desenvolve a partir do micrsporo. A cultura de anteras tem grande potencial para o melhoramento de plantas e usada para a obteno de plantas haplides. A palavra haplide refere-se a plantas que possuem o nmero gametoftico de cromossomos em seus esporfitos, ou seja, so originrias de um esporfito e contm metade do nmero de cromossomos da espcie. Plantas haplides podem ser obtidas in vivo atravs de polinizao com plen irradiado, polinizao com plen abortivo (estril), tratamento do plen com choques trmicos, hibridao distante. In vitro pode ser obtido pelo desenvolvimento da oosfera no fertilizada, pela cultura de anteras e ou gros de plen (diretamente por embriognese e indiretamente via formao de calos). As fontes de explantes usadas so anteras imaturas, que fornecem plen uninucleado (por ocasio da primeira mitose) se constituindo no material mais promissor para induo de andrognese e botes florais fechados. 5.2.7.1. Obteno de haplides por cultura de anteras O protocolo para cultura de anteras pode ser descrito resumidamente: a) os botes florais fechados so desinfestados; b) faz-se uma inciso de um dos lados do boto floral e estames so delicadamente removidos. O filamento do estame removido (com bastante cuidado para no danificar as anteras) e c) as anteras so inoculadas em meio de cultura.

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5.2.7.2. Fatores que influenciam a andrognese 1) Gentipo da planta doadora: tem sido observado que gneros, espcies e cultivares apresentam diferentes respostas na cultura de anteras. 2) Condies fisiolgicas e idade da planta: flores das plantas relativamente novas, no incio da florao so mais adequadas do que botes florais de plantas velhas e em final de seu perodo de crescimento. 3) Estdio de desenvolvimento do plen: o micrsporo no estgio uninucleado o mais adequado (antes ou logo aps a primeira antese). Existe correlao entre o tamanho do boto floral e o estdio do desenvolvimento do plen (importante ao se considerar a ploidia do embrio produzido). O estgio do desenvolvimento do plen na antera pode ser determinado pelo corante acetocarmicima ou reagente de Schiff. 4) Pr-tratamento dos botes ou anteras: a) Tratamento trmico: deve ser feito em baixa temperatura (3 a 5 C). Assim se retm a viabilidade do plen por mais tempo, retardando a senecncia, sincronizando as clulas e prevendo o aborto do plen. b) Tratamento qumico: aplicaes de qumicos como o etrel (paclobutrazol), hidrazida maleica, carvo ativado, podem induzir as anteras a formar em embries. c) Tratamento fsico: radiaes ionizantes, presses atmosfricas reduzidas (uso de dissecador); centrifugao. 5) Composio do meio de cultura: os meios mais utilizados so o MS, White, Nitsch. A sacarose a fonte de carbono mais efetiva de carboidratos e sua concentrao varia com as espcies. A necessidade de reguladores de crescimento, tambm varivel. Suplementos orgnicos como casena hidrolizada, gua de coco, extraio de leveduras, aminocidos, cido ascrbico tem sido utilizados com sucesso. 5.2.7.3. Identificao de haplides A identificao de haplides pode ser feita com genes marcadores, que produzem cor, cuja manifestao possa ser mostrada na semente ou plntulas. Marcadores morfolgicos e por contagem de cromossomos, atravs de tcnicas citolgicas. 5.2.7.4. Problemas Alguns problemas relacionados cultura de anteras podem ocorrer quando so usadas tcnicas inadequadas para se produzir plantas dipides a partir de haplides regenerados de cultura de anteras; uso de tcnicas inadequadas de regenerao; ocorrncia de elevada taxa de mutao (anormalidades); desdiferenciao de calo a partir de clulas dos tecidos somticos da antera e; alta incidncia de plantas albinas (principalmente em gramneas) 5.2.7.5. Utilizao de plantas haplides A tcnica da andrognese permite: a) Obteno de homozigose. Em programas de melhoramento, onde necessrio a obteno de linhagens, a homozigose destas pelos processos tradicionais s ocorre aps 6 a 8 geraes de autofecundao ou retrocruzamento. Atravs da cultura de anteras, plantas haplides so obtidas imediatamente, pois uma vez duplicado seu nmero de cromossomo, originam plantas diplides que apresentam homozigose em 100% dos loci, reduzindo o tempo. b) Produo de supermachos. Tomando-se com exemplo o aspargo, que diica, as plantas masculinas so mais produtivas. H interesse na determinao de um mtodo que produza por sementes todas as plantas hbridas F, heterticas masculinas. A partir de plantas femininas (XX - homogamticas) e plantas masculinas (XY -heterogamticas), por cultura de anteras, pode-se obter plantas haplides tanto X como Y, pela duplicao: XX (plantas femininas) e YY (supermachos). Usando estes supermachos na produo de hbridos, toda a prognie de plantas ser masculina (XY) e portanto, mais produtiva e menos fibrosa. A obteno de haplides in vitro pela cultura de anteras j uma realidade em solanceaes, gramneas e crucferas.

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5.3. CRIOPRESERVAO Desde o inicio da multiplicao clonal ou da micropropagao das plantas, uma das grandes dificuldades era a conservao de estoques de material vivo para os cultivos posteriores. A conservao por um logo perodo pode ser aplicada por tcnicas de congelamento de explantes a baixas em nitrognio lquido (196 C). a partir de ento tornou-se possvel no s a conservao do material por um perodo mais longo, como tambm a conservao de recursos genticos vegetais de germoplasmas. Este procurou atender dois problemas bsicos de estocagem em bancos de germoplasma; de materiais de propagao vegetativa e de espcies com sementes recalcitrantes. 5.3.1. Mtodos para a criopreservao Basicamente so dois os mtodos; o congelamento gradual e o congelamento imediato. O resfriamento lento composto de etapas de congelamento a -20 C em freezer, seguido de abaixamento de -70 a -100C e a criopreservao em - 196 C. No congelamento rpido existe a necessidade de evitar que as clulas produzam cristais a partir do contedo celular. Atravs dessa tcnica o contedo celular aquoso adquire a conformao vtrea, o que desejvel. Dois momento so crticos para a cultura a ser criopreservada quanto a possibilidade da formao de cristais; na entrada e na sada da criopresrvao. a razo do sucesso e do fracasso desta tcnica em muitos experimentos. Antes da cultura entrar para o sistema de criopreservao, aplicado um redutor osmtico (manitol 4%) para diminuir o contedo celular e um crioprotetor (DMSO), cuja funo de modificar a permeabilidade da membrana, proteo de macromolculas e inativao de radicais livres (Benson & withers, 1987). A criopreservao pode atender a conservao de suspenses celulares utilizando os seguintes passos (Torres, 1998): - Pr-condicionamento por a 5 dias em meio contendo 6% de manitol. - Crioproteo com 0,5 mol.l-1 DMSO + 0,5 mol.l-1 de glicerol + 1,0 mol.l-1 de sacarose no meio de cultura. - Transferir as clulas e soluo crioprotetora para uma ampola e congelar a uma taxa de 1 C por minuto at -35 a -40C, manter a temperatura por 40 minutos, aps transferir para o nitrognio lquido. - Armazenar em nitrognio lquido; - Descongelar em banho-maria a 40 C. - Extrair as culturas dos meios de crioproteo. Para culturas de parte area o procedimento assim definido (Torres, 1998): - Pr-condicionamento por a 2 dias em meio contendo 5% de DMSO. - Crioproteo com 10% de DMSO no meio de cultura. - Transferir as clulas e soluo crioprotetora para uma ampola e congelar a uma taxa de 0,5 C por minuto at -40C, manter a temperatura por 40 minutos, aps transferir para o nitrognio lquido. - Armazenar em nitrognio lquido; - Descongelar em banho-maria a 40 C. - Extrair as culturas dos meios de crioproteo. 6. PROBLEMAS NA CULTURA IN VITRO O cultivo in vitro como qualquer outro processo sensvel a alguns problemas de ordem ambiental ou bioligico que afetam diretamente o desenvolvimento das culturas. Dentre estes problemas pode-se citar a oxidao, o declnio no vigor e a hiperhidricidade. 6.1. DECLNIO DE VIGOR As plantas desenvolvem o metabolismo de acordo com os estmulos recebidos, e portanto, quando ocorre problemas determinantes refletido diretamente na fisiologia vegetal do explante. A baixa taxa de desenvolvimento chamada de dclnio do vigor e est associado com a produo de substncias fenlicas ou a outros fatores como vitrescncia, habituao ou maturidade dos explante. A perda de vigor pode ser tambm afetado por erros no balano nutricional do meio de cultura, utilizao de fitorreguladores inadequados ou falta de repicagem do material vegetal. a) Diminuio da taxa de proliferao algumas espcies apresentam curvas acentuadas na taxa de proliferao da cultura. Esta taxa bastante varivel de acordo com espcie e o tempo de cultivo ou subcultivos. O declnio na taxa de formao de brotos tambm ocorre frequentemente em culturas que no so repicadas.

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b) Habituao Quando os explantes esto em meio de cultura, pode haver habituao para fitorreguladores como a citocinina, que por doses de concentrao normais no respondem bem ao estmulo. 6.2. NECROSES Necrose pode ser descrita como sendo a morte de uma parte de um organismo vivo. Isto ocorre com explantes colocados in vitro, podendo ter uma perda parcial ou a de toda a cultura (Santos, et. al., 2001). a) Necrose apical em brotaes Causas: - Deficincia de clcio ocorre principalmente no pice quando o explante colocado em meios com baixa concentrao para a espcie ou quando ocorrem barreiras de disponibilidade do nutriente para a planta. Muito comum acontecer problemas relacionados com elevadas temperaturas que favorece a diferena entre crescimento e translocao do nutriente. Em cultivo in vitro, a alta umidade limita a transpirao e consequentemente a translocao no xilema de ons e compostos, assim como o clcio pode no alcanar os tecidos da regio apical. - Substncias de crescimento - Alguns fitorreguladores podem induzir a necrose apical, principalmente em subculturas, ou ainda, meio inadequado para determinada fase. - Intervalo de subculturas quando as subculturas no so repicadas e ficam velhas pode ser observado folhas amarelas e queda destas. O momento de fazer a subcultura deve se ajustado de acordo com cada espcie de cultivo. - Gases txicos a chama do bico de bussen para a flambagem da boca dos frascos pode produzir internamente e a diminuio de oxignio. Ocorre a produo de gases como o metano, butano, entano, propano, etileno, metanol e etanol. Esses gases provocam a absciso foliar, podendo causar a paralisao da cultura, ou ainda ocasionar a morte das brotaes. O prprio estado de desenvolvimento fisiolgico e crescimento da planta pode produzir altas taxas de CO2, que tambm varivel de acordo com o perodo do dia. b) Diminuindo a necrose Prover as culturas com nitrato de clcio e procurar disponibiliz-lo na forma de fornecer ambiente adequado favorece a diminuio de necroses. Outro nutriente importante para algumas espcies o boro, que tambm atua nas regies de intensa diviso celular. A reduo dos gases pode ser conseguida com chamas de cor azul para fazer a flambagem da boca dos frascos. Tambm as fontes podem ser substitudas como areia seca em altas temperaturas. Permitir as trocas gasosas em culturas que se deseja crescimento reduz a concentrao de gases txicos e aumenta a disponibilidade de oxignio. Porm, esta prtica no deve ser adotada quando se deseja um crescimento mais lento da cultura. 6.3. OXIDAO A oxidao a reao do oxignio com ons metlicos (+) dos outros compostos do meio de cultivo. Os explantes ao serem inoculados no meio de cultura podem liberar exudatos que tornam o meio de cultivo escuro. Este tipo de escurecimento conseqncia da liberao de fenis dos ferimentos ocasionados no processo de extrao dos explantes (Santos, 2001). As substncias encontradas em meio de cultura no cultivo de algumas espcies lenhosas foram identificadas como sendo taninos, flavonides e fenis (George, 1993). Ferimentos normalmente provocam oxidao, sendo que discos foliares apresentam maior oxidao do que segmentos nodais por sofrerem ferimentos em maior rea. O efeito inibitrio no desenvolvimento dos explantes atribudo presena de taninos e fenis, sendo a autotoxidade dos exudatos varivel com as cultivares, espcies e gneros. A ocorrncia de oxidao pode ser geneticamente correlacionada, ou seja, em gneros cujas plantas apresentam maiores teores de tanino ou hidroxifenis a oxidao ocorre de forma mais intensa como o exemplo de Quercus, Rhododendron, Sorghum e das conferas (Santos 2001). Compostos como a cistena, o carvo ativado, PVP, cido ascrbico e cido ctrico tm sido adicionados ao meio de cultura com o objetivo de controlar o processo de oxidao. Carvo ativado adicionado ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,3 a 2,0%, cuja ao adsorver fenis do meio de cultura, alm de atuar induzindo os processos de morfognese e rizognese. A poliamina PVP possui tambm a capacidade de adsorver os compostos fenlicos evitando que estes oxidem e polimerizem. Esta substncia geralmente adicionada ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,01- 4,0 %.

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Composio dos meios de cultura com variaes na concentrao do meio MS, sacarose, excluso ou diminuio em concentrao de ferro e cobre, uso de reguladores de crescimento (variaes em tipo e concentraes) alm da adio de antioxidantes tambm podem ser eficientes para controle da oxidao. O cido ctrico atua como agente quelante de metais, mas no muito eficiente em retirar ferro da soluo. J o cido ascrbico normalmente acrescido ao meio de cultura, possuindo a propriedade de estimular a atividade metablica dos tecidos. A efetividade destes cidos s tem sido observada, quando adicionados ao meio em concentraes entre 10 e 140 mgL-1, podendo reduzir a oxidao em 50%. Explantes jovens so mais propensos a ocorrer a oxidao e geralmente no inicio da cultura de tecidos. A preveno da ocorrncia de oxidao pode ser feita minimizando os danos causados ao explante, removendo os compostos fenlicos produzidos ou atravs da alterao da composio do meio de cultura e a concentrao ou tipo de reguladores de crescimento empregados. A remoo dos compostos pode ser feita ainda pela utilizao de meios lquidos (facilitam a difuso dos compostos), de diferentes agentes de solidificao, alm da adio ao meio de substncias de adsoro. O agar usado para geleificao do meio pode conter compostos como acares, galactose, sulfatos reativos e at mesmo presena de cobre, podem apresentar elevada oxidao. 6.4. HIPERHIDRICIDADE A hiperhidricidade definida como o estado fisiolgico que a planta apresenta elevado teor de gua no interior das clulas e tecidos com aspecto translcido. As alteraes na estrutura das plantas cultivadas in vitro so sintomas bastante prematuros de uma complexa sndrome de caractersticas anormais. O fenmeno pode ser revertido, desde que seja realizada a transferncia de meio de cultivo e adequar o ambiente, dando ateno especial para a temperatura, irradincia, fotoperodo e concentraes dos elementos do meio de cultivo. A "sndrome do broto de vidro" como tambm chamado pode ocorrer em vrios nveis de severidade. Inicialmente, apenas uma parte do broto, ou uma ou duas folhas podem ser afetadas. As brotaes de culturas que demonstram sintomas leves frequentemente crescem mais rapidamente do que o normal e pode mostrar altas taxas de brotaes axilares. Esta vantagem perdida em condies mais severas de hiperhidricidade (Santos, 2001). Em casos mais extremos, brotos vitrificados tem interndios curtos e o pice aparece fasciculado. Os brotos afetados frequentemente apresentam-se inchados e com uma colorao verde claro e suas folhas so translcidas, aquosa e com aparncia de vidro; as folhas se apresentam tambm alongadas, trgidas e frgeis, com uma colorao verde azulada. a) Ocorrncia A hiperhidricidade pode ocorrer em culturas de brotos e ns, em regenerao de brotos a partir de calos, em todos as espcies. mais freqente em massa de calos de plantas lenho as, mas tambm ocorre em plantas herbceas, pode ser conseqncia da difuso passiva da gua dentro dos tecidos ou um fenmeno ativo relacionado a um distrbio no processo metablico da planta. b) Fatores que influenciam a hiperhidricidade Culturas que desenvolvem-se rapidamente so menos propensas. Quando se busca melhores condies de cultivo para cada espcie, diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a hiperhidricidade. A hiperhidricidade tende a ser promovida por altas temperaturas, baixa irradincia luminosa ou em culturas mantidas no escuro. Brotos que se desenvolvem em condies contnuas de alta umidade relativa apresentam maior susceptibilidade hiperhidricidade, pois este provavelmente o ambiente mais favorvel para ocasion-la. Culturas mantidas em meio lquido, incluindo aquelas realizadas com suportes (ponte de papel) geralmente desenvolvem mais facilmente do que aquelas que so cultivadas em meio slido. Em algumas plantas, brotaes normais cultivadas em meio slido ficam totalmente vitrificadas quando so transferidas para um meio de cultivo lquido. Os brotos apresentam sintomas mais freqentes quando se utiliza concentraes de BAP acima de 2,0 mg.L-1, suplementado com sacarose e baixas concentraes de sorbitol. Culturas em meios com altas concentraes de BAP sofrem imensamente a induo de hiperidricidade. Isto pode ser evitado transferindo a cultura para um meio que no possua BAP. As auxinas podem s vezes induzir a hiperhidricidade entretanto, a adio de auxinas no meio contendo citocininas, frequentemente aumenta a proporo de vitrificao. O cido giberlico pode ser utilizado no controle deste problema.

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c) Diminuindo a hiperhidricidade Existem vrios fatores que podem auxiliar na preveno da vitrificao, dentre estes pode-se destacar: 1) Utilizao da tcnica de duas fases (meio lquido e slido) no meio de cultura. 2) Aumento da concentrao de gar no meio semi-slido. 3) Controle da concentrao de sacarose. 4) Reduo da umidade relativa no ambiente in vitro. 5) Em meio lquido, utilizar suportes porosos para sustentao dos explantes (ponte de papel). 6) Adio ao meio de cultivo um ou mais cidos orgnicos como o citrato, succinato ou malato para auxiliar a assimilao do NH4+. 7) Reduo da concentrao de ons de amnio no meio de cultivo. 8) Utilizao de alta de luminosidade. 9) Em meio lquido pode adotar a tcnica de submerso temporria. 10) Utilizao de um balano mais adequado entre auxina / citocinina para a espcie estudada. 11) Reduo da concentrao de micronutriente no meio de cultivo. 12) Transferncia da cultura para um meio de cultivo ausente de fitorreguladores. 13) Diminuio do uso de citocininas ou restrio do uso do BAP. Pode-se tambm aumentar o nmero de subcultivos. 14) Substituio da sacarose por frutose ou galactose. 15) Ajuste correio do pH do meio de cultivo. 7. ACLIMATIZAO DAS PLANTAS Aclimatizao e aclimatao so termos que apresentam conotaes diferentes. O primeiro trata dos processos para a passagem da planta que est in vitro para o ambiente e definido como a adaptao climtica de um organismo, especialmente uma planta, que transferida para um novo ambiente, sendo todo esse processo realizado artificialmente. O termo aclimatao tem um significado similar, mas um processo no qual as plantas ou outros organismos se tomam ajustados a um novo clima ou situao, como resultado de um processo essencialmente natural. Na figura 8 so apresentadas as etapas do desenvolvimento vegetal observando as fases da aclimatizao e enraizamento de Feijoa sellowiana. Pesquisas foram realizadas para verificar quais os possveis problemas referem-se aclimatizao. Um grande nmero de planta micropropagada no sobrevive quando so transferidas das condies in vitro para o ambiente externo. 7.1. PROBLEMAS DA ACLIMATIZAO a) Baixa capacidade fotossinttica A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas so, inicialmente, muito diferentes daquelas cultivadas em condies de campo. Esta variao na anatomia ou ultra-estrutura pode afetar o processo de fotossntese. As organelas que apresentam capacidade autotrficas no esto bem desenvolvidas, e consequentemente, existe uma dificuldade em aclimatizao. No estgio de aclimatizao as plntulas sofrem uma mudana drstica quando so removidas dos frascos onde a luz e as trocas gasosas so limitadas e existe grande disponibilidade de acar. Essa passagem faz com que mudem de heterotrficas para autotrficas, com grande gasto de energia. b) Desidratao A desidratao causada pela elevada perda de gua pelas plantas, principalmente nas folhas, ou absoro inadequada de gua pelas razes e, em geral, o maior problema no processo de transplante e aclimatizao. In vitro, as plntulas se desenvolvem com baixa luminosidade e elevada umidade relativa com conseqente reduo do fluxo respiratrio. Ao serem expostas a um ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa, a taxa de transpirao aumenta, surgindo um dficit hdrico na planta. As plantas que so levadas s casas de vegetao so desprovidas de cutcula na folha e possuem muitos estmatos no funcionais. Quando expostas ao ambiente ocorre elevada perda de gua e um agravamento osmtico intracelular. A morfologia e a densidade dos estmatos podem ser alteradas mudando-se as condies ambientes. Em plntulas de rosa, por exemplo, um aumento na luminosidade e uma diminuio na umidade relativa de 100 para 75%, resultou em estmatos semelhantes s plantas cultivadas em estufa.

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Figura 15 - Culturas de bromlia cultivada em processos de biorreatores de imerso temporria e a seqncia de formao, determinao e regenerao dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.

c) Absoro de nutrientes Plantas in vitro quase sempre produzem razes no funcionais, ou seja, no apresentam capacidade de absoro de gua e nutrientes quando colocadas em contato com o solo. As plntulas in vitro ao serem aclimatizadas, passam de um meio onde tm disposio alta concentrao de nutrientes para um substrato no qual so foradas a iniciar o processo de absoro de sais para seu desenvolvimento. A emisso de novas razes muito importante, pois as formadas in vitro tm pouca capacidade de absoro e no respondem imediatamente ao momento do transplante, alm de serem pouco funcionais, delicadas e propensas ao ataque de microorganismos. d) Doenas Problemas de doenas podem facilmente aparecer nas culturas que so levadas s casas de vegetao, pois a falta de presso de inoculo e a dependncia do meio no estimulou as plantas a desenvolver o sistema de defesa contra microrganismos. A fragilidade da plntula in vitro aliada alta umidade relativa, na qual aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactrias. essencial, portanto, que se faa uma preveno de doenas para o sucesso do transplante, durante e aps a aclimatizao.

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7.2. FATORES QUE AFETAM A ACLIMATIZAO 1) As plantas micropropagadas devem ser sadias e apresentarem baixo inoculo de patgenos. 2) A manuteno da alta umidade relativa, por alguns dias aps o transplante, considerada ponto crtico para a sobrevivncia das plntulas. Um nmero significante de laboratrios comerciais tem evitado o uso de um sistema automtico de irrigao para este propsito, por tornar o meio excessivamente mido, favorecendo o crescimento de fungos e algas. O sistema preferencial o "fogging" ou nebulizao so os mais indicados. 3) Inicialmente necessrio fornecer baixas quantidades de luminosidade e irradincia para as plntulas. Quando submetidas ao aumento de luz sofrem um processo de destruio das molculas de clorofila, tornando-se clorticas e queimadas. Para evitar esses problemas, as plntulas podem ser removidas.gradualmente, para uma intensidade de luz sob a qual manter seu crescimento; 4) A temperatura da aclimatizao deve ser to prximo a que estava no ambiente, podendo ser gradualmente ajustada com o decorrer do tempo. 5) O pH do solo deve ser apropriado para cada espcie. Fertilidade e porosidade para promover drenagem adequada e aerao; 6) Fornecer volume adequado da rea de enraizamento, conforme cada espcie. 7) Para a fertilizao muitos laboratrios adicionam, periodicamente, macro e/ou micronutrientes no substrato em que as plntulas so transplantadas; 8) Normalmente, antes do transplante, as plntulas so lavadas, de preferncia, com gua morna para retirada total do meio de cultura e plantadas em substrato esterilizado. Alguns autores recomendam a lavagem das plntulas com soluo fungicida, enquanto outros, no aconselham seu uso durante as primeiras duas semanas depois do transplante, pois podem ser fitotxicos nesta fase. 8. ENRAIZAMENTO O enraizamento uma etapa que define o resultado final da microropagao, a etapa onde ocorre a formao de razes adventcias nas partes areas. Pode ser dividido em induo, iniciao e alongamento das razes (Torres, 1998). Pode ser realizada in vitro como no ambiente externo, porm resultados mais satisfatrios para a maioria das espcies, tem sido obtidos no enraizamento ex vitro. A opo por um dos sistemas depende da qualidade da estaca, da espcie de trabalho, das condies do laboratrio e dos recursos disponveis. Pode-se tambm criar um terceiro sistema, onde as estacas so mantidas in vitro at a induo da rizognese e, posteriormente, so transplantadas em um substrato ex vitro para desenvolvimento das razes. necessrio que se tenham formados estacas da espcie de trabalho, com folhas e outros tecidos diferenciados, para a induo e formao das razes. O enraizamento varivel de espcie para espcies e de acordo com o tratamento hormonal aplicado. O uso de auxinas favorece a induo e a iniciao radicular e inibe o alongamento, porm concentraes elevadas podem levar formao de calos. Para a induo de enraizamento o mtodo mais utilizado o uso de pulsos de auxina (normalmente, AIB na concentrao de 500 a 1000 ppm em 1 a 5 min-1 para estacas lenhosas) na base da estaca. Espcies herbceas e regies jovens das plantas geralmente enrazam mais facilmente que espcies lenhosas e regies mais maduras. 8.1. ENRAIZAMENTO IN VITRO A vantagem deste tipo de enraizamento o melhor controle das condies em que se trabalha e, com isso, a obteno de um alto percentual de enraizamento. Por outro lado, a desvantagem do mtodo que as razes formadas in vitro nem sempre so eficientes na absoro de gua e de nutrientes, no momento da passagem das mudas para o substrato. Razes produzidas in vitro podem possuir poucos plos radiculares e conexes vasculares, e s comearem a desenvolver o cmbio secundrio quando so removidas do frasco de cultura. O enraizamento in vitro pode ocorrer de duas formas: quando as razes so formadas a partir de brotaes sendo chamado de processo direto, e quando so formadas a partir de calo, denomina-se de processo indireto. Em ambos os casos, se no houver uma ligao vascular eficiente entre a parte area e a parte subterrnea, a aclimatizao da muda dificultada, podendo comprometer sua sobrevivncia. A rizognese est associada ao de reguladores de crescimento (internos e externos), principalmente nas fases iniciais da induo da formao das razes. Algumas espcies, contudo, j possuem um nvel endgeno de fitormnios suficiente e s enrazam na ausncia de qualquer tipo de regulador, podendo ou no necessitar apenas de uma pequena leso na base da estaca.

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Auxinas como o AIB (cido indolbutrico), AIA (cido indolactico) e ANA (cido naftalenoactico) so os principais reguladores envolvidos no processo de enraizamento in vitro. Em alguns casos, a concentrao de auxina que promove bom enraizamento no a mesma que promove uma alta sobrevivncia ex vitro. As concentraes mais utilizadas para induzir rizognese normalmente esto entre 1,0 - 10,0 mg.L-1 para AIA, 0,05 - 1,0 mg.L-1 para ANA e 0,5 - 3,0 mg.L-1 para AIB (Soares et. al., 2001). A anlise do mtodo de enraizamento deve levar em considerao o relutado final, ou seja, o nmero de mudas produzidas e a qualidade fisiolgica das plntulas, que na maioria das vezes dependente do mtodo de induo e fitorregulador usado. A auxina deve ser aplicada no meio de cultura ou anteriormente inoculao do explante (no caso de enraizamento ex vitro), levando-se em conta que a sua concentrao inversamente proporcional ao tempo de permanncia com o regulador. Associadas s auxinas, outras substncias tambm interferem de forma direta ou indireta no enraizamento dos explantes. Poliaminas, cido sulfrico, cloreto de magnsio e compostos fenlicos, como o floroglucin, atuam, por exemplo, estimulando a sntese de AIA ou liberando a auxina existente no explante. J as citocininas, geralmente utilizada para estimular a formao de brotaes, costumam inibir o enraizamento. Existem poucos casos em que uma citocinina no interfere ou estimula a formao das razes. As giberelinas funcionam como as citocininas, inibindo, na maioria das vezes, a rizognese. Fatores ambientais, tais como tamanho dos recipientes de inoculao, meio de cultura, gases, substratos, luz, temperatura e o prprio explante, tambm afetam a formao de razes. O tamanho dos frascos onde os explantes so colocados ajuda ou dificulta a formao e o crescimento das razes, no momento em que se tornam uma barreira fsica (Soares et. al, 2001). Em frascos maiores se torna mais fcil conseguir o enraizamento. A concentrao de sais no meio de cultura pode ser regulada de acordo com cada espcie, de forma que a reduo da concentrao inica dos meios (50% ou 75% da fora total do meio) pode favorecer esta etapa do processo de micropropagao. 8.2. ENRAIZAMENTO EX VITRO A tcnica de enraizamento ex vitro consiste em destacar brotaes e plant-las no substrato desejado, que pode ser: turfa, areia, vermiculita, perlita, bandejas de espuma fenlica e ou substratos comerciais, ainda solo esterelizado. As estacas no podem ser nem muito grandes, nem muito pequenas, pois esses extremos so de difcil manuseio, dificultam o enraizamento e demandam mais tempo para formar mudas. Estacas de tamanho entre 2 e 5 centmetros so as ideais. Se possvel, o plantio deve ser em grupos, ao invs de isoladas, o que favorece o enraizamento, que, geralmente, ocorre em 2 a 5 semanas. A principal vantagem do enraizamento ex vitro o menor custo financeiro que esta tcnica proporciona. As estacas brotadas, ao invs de serem inoculadas em meios de cultura com reguladores propcios ao enraizamento, so enraizadas fora das condies asspticas dos frascos de cultura, j fazendo parte da etapa seguinte, a aclimatizao. Calcula-se que os recursos economizados por esta tcnica, cheguem a 75% dos gastos totais, o que corresponde justamente aos gastos com mo-de-obra e materiais apenas para esta etapa da micropropagao. Como um dos grandes problemas da cultura de tecidos de plantas so os gastos com a produo, esta alternativa muito importante para obter uma produo com baixos custos. O enraizamento ex vitro reduz o tempo de cultivo e de comercializao da muda, pois elimina uma etapa do processo de micropropagao, misturando as etapas de enraizamento e aclimatizao. No entanto, o enraizamento ex vitro no possui apenas vantagens. Em algumas espcies, a taxa de enraizamento ex vitro to baixa, que a utilizao deste processo invivel. Em outras, a estaca, antes do enraizamento, necessita de passar por uma etapa chamada de "endurecimento", para conseguir sobreviver ao ambiente adverso da fase de aclimatizao. A alta sensibilidade das estacas requer cuidados especiais para enraizar. As condies de aclimatao que favoream o endurecimento sempre so positivas para o nmero final percentual de enraizamento. Devido ao substrato ser mais poroso e melhor arejado, as razes formadas so mais funcionais e eficientes na absoro de gua e nutrientes. Isso aumenta o nmero de sobreviventes na aclimatizao e tambm diminui o tempo de formao da muda. Se necessrio e de acordo com a espcie micropropagada, pode-se enriquecer o substrato com sais, do meio de cultura nutritiva ou reguladores de crescimento como auxinas, que aumentam a intensidade e a velocidade do enraizamento. Estes reguladores podem ser aplicados diretamente no substrato ou na passagem das estacas do tubo de cultura para o substrato.

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8.3. FATORES DEPENDENTES DA PLANTA a) Gentipo em muitas espcies um fator controlada genticamente. Na prtica, este fator pode ser manipulado ou diminudo, mediante uma srie de mediadas aplicadas, visando a manifestao de atividades bioqumicas e fisiolgicas do explante, provocando variaes ambientais para as condies de enraizamento. b) Estresse hdrico provoca o aumento do contedo de ABA e etileno nas folhas, compostos inibidores de enraizamento. Tambm afeta o nveis endgenos de citocinina, uma vez que o interesse nas razes. Um fator para diminuir o estresse hdrico diminuir gradativamente a umidade relativa do ar nos frascos in vitro. c) Carboidratos a maior influncia dos carboidratos est ligada a relao C/N. valores entremos desta relao so desaconselhveis (Torres, 1998). Assim, a reduo da disponibilidade de nitrognio na maioria dos casos aumenta consideravelmente o taxa de enraizamento. Tambm em algumas espcies lenhosas um pr tratamento com elevadas doses de acar tambm favorecem. d) Nutrio mineral o estado nutricional da planta influencia diretamente a taxa de enraizamento. Restrio em potssio, fsforo, magnsio e clcio tendem a afetar os processos de rizognese. O clcio um ativador de peroxidases, uma enzima que parece ser essencial para os processos de enraizamento (Hassig, 1986; Torres, 1998). Normalmente, plantas deficientes em nitrognio tendem a enraizar melhor. e) Condies de crescimento da planta fatores de estiolamento fazem a induo de sinalizao de auxinas. O estiolamento conseqncia de cultivos em ambientes com baixa luminosidade. Apesar de que o local de enraizamento deva ser escuro, necessrio que a parte area tenha um bom padro de luminosidade para a produo de auxinas promotoras de enraizamento. f) Idade fisiolgica explantes juvenis apresentam maior facilidade de enraizamento, uma vez que, os tecidos novos so mais responsivos. 8.4. FATORES RELACIONADOS AO EXPLANTE a) Estao do ano certas espcies apresentam propenso ao enraizamento o ano todo, porm, principalmente plantas que apresentam estgios hibernais o processo facilitado nos perodos que acontece a quebra de dormncia seguido de pouco espao de tempo aps. b) Presena e nmero de folhas algumas espcies so dependentes da presena de folhas, funcionam como reserva de compostos nitrogenados, sacarose e auxinas. O nmero de folhas influencia a velocidade de enraizamento. c) Posio do explante na planta matriz o teor endgeno de hormnios, promotores ou inibidores, varia com a idade fisiolgica e cronolgica dos tecidos. Deste modo tecidos de um mesma planta pode apresentar respostas morfogenticas diferentes. d) Meio nutritivo na fase de multiplicao efeito de GA3 e BAP do meio de cultivo, podem provocar baixas taxas de enraizamento, por outro lado pr tratamentos com auxinas podem reverter este fator. e) Inibidores endgenos substncia fenlicas produzidas pela resposta aos ferimentos e liberadas nestas regies podem diminuir sensivelmente a taxa de enraizamento. 8.5. FATORES LIGADOS AO MEIO DE ENRAIZAMENTO a) Reguladores de crescimento auxinas sintticas e naturais podem sozinhas promover o enraizamento. Contudo, a concentrao a ser aplicada varivel de espcie para espcie, em algumas no h necessidade. Os reguladores de crescimento mais utilizados so: AIB e ANA, em menor grau de uso, 2,4 D e 2,4,5 T. b) Outras substncias compostos fenlicos apresentam relao sinrgicas com a as auxinas (Torres, 1998). Os carboidratos fornecem energia, existindo a disponibilidade no meio, h a necessidade de formao de razes para a receptao destes. O fornecimento de sais minerais sempre necessria, principalmente P, K, Ca e Mg. O boro tem sido considerado muitas vezes, um dos mais importante fator de crescimento para muitas espcies. Espcies lenhosas so beneficiadas com o usos de carvo ativado quando do enraizamento in vitro. c) Estado fsico da cultura a passagem de um gradiente lquido para slido-poroso dramtico para a cultura, um balao mais adequado do estado fsico dos meios favorece o processo. d) pH o mais adequado para as maioria das culturas que seja prximo de 6,5 a 7,0, porm sempre necessrio estar prximo daquele que se encontrava na fase anterior,caso a cultura estiver desenvolvendo bem. e) Condies de incubao a luz influncia na regulao da morfognese e atua com fonte de energia para a realizao da fotossntese (Hartmann & Kester, 1983; Torres, 1998). Na rizognese a irradincia e o fotoperodo so determinantes, vale aplicar este balano de acordo com cada espcie. A luz favorece o desenvolvimento de partes areas e o escuro a rizosfera.
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9. APLICAES DAS TCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS PARA O MELHORAMENTO As principais aplicaes das tcnicas de cultura de tecidos vegetais podem ser sumarizadas nas seguintes: a) Cultura de meristemas Tcnica mais antiga para a propagao clonal massal e para a obteno de plantas livres de virus, principalmente quando combinada com a tcnica de termoterapia. Esta tcnica relativamente simples e aplicvel a um grande nmero de espcies. Tambm considerando o fato de que as clulas do meristema apical caulinar so menos diferenciadas que as demais, a cultura de meristemas permite a obteno de uma prognie clonal geneticamente idntica planta matriz, permitindo a captura e fixao de ganhos genticos. Alm disto, considerando os atributos destes meristemas eles tornam-se alvos ideais para a conservao in vitro de germoplasma e o intercmbio internacional de germoplasma. b) Avaliao rpida de suscetibilidade A cultura de clulas, tecidos e rgos pode ser empregada para a avaliao de suscetibilidade/tolerncia vrias molstias ou estresses abiticos. Esta avaliao somente ser til quando tecidos e rgo responderem de forma similar s respostas da planta inteira. c) Induo de florescimento precoce Esta tcnica empregada para reduzir o longo perodo de juvenilidade que ocorre principalmente nas plantas perenes, permitindo uma reduo substancial de tempo nos programas de melhoramento gentico. d) Reverso de fases de desenvolvimento Em plantas arbreas, florestais e frutferas, a seleo de plantas elite baseada nos espcimes mais velhos e comprovadamente sadios e produtivos. A propagao vegetativa convencional destas plantas torna-se dificultada. O cultivo in vitro continuado pode restaurar a juvenilidade nestes gentipos facilitando a propagao clonal massal. e) Embriognese somtica Clulas vegetais so consideradas totipotentes uma vez que possuem o potencial de regenerar uma planta completa. O padro ideal de produo de plantas a partir de clulas simples por meio da embriognese somtica, onde, as clulas so objeto de mudanas de estrutura e organizao, similares aquelas que ocorrem durante a embriognese zigtica. Embries somticos so produzidos em um grande nmero de espcies, mas ainda no h segurana quanto estabilidade gentica e uniformidade fenotpica das plantas regeneradas por esta tcnica. A embriognese somtica tm sido a tcnica empregada como sistema regenerativo preferencial para a transformao gentica (figura 17).

Figura 17 - Integrao de embriognese somtica em um programa conservao e ou melhoramento gentico


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f) Haplodiploidizao A descoberta de Guha e Maheshwari (1964) de que anteras de Datura inoxia cultivadas in vitro podiam regenerar plantas haplides trouxe grande impacto para a aplicao de tcnicas biotecnolgicas ao melhoramento de plantas. Esta tcnica baseia-se na rediferenciao de clulas gametofticas gerando embries ou calos. Embora preferindo-se a formao de embries somticos como rota regenerativa para a obteno de haplides geneticamente estveis, a formao de calos tambm pode ocorrer, particularmente em cereais. Aps a obteno dos haplides a di-haploidizao pode ocorrer espontaneamente ou como resultado do tratamento com colchicina. A principal vantagem a obteno de linhas homozigotas homogneas rapidamente. g) Variao somaclonal O ambiente da cultura in vitro pode induzir variabilidade nas culturas e este fenmeno, primeiramente observado por Larkin & Scowcroft (1981), foi denominado de variao somaclonal. A variabilidade gerada desta maneira pode ser importante para o melhoramento gentico. h) Cruzamento amplos A ampliao da base gentica para o melhoramento de plantas pode envolver cruzamentos interespecficos e intergenricos. Por exemplo, Atylosia, um gnero taxonomicamente prximo Cajanus, apresenta espcies com caractersticas desejveis, como resistncia a molstias e insetos e tolerncia salinidade e seca. Alguma espcies de Atylosia hibridizam com Cajanus, enquanto que outras no. Mesmo aps cruzamentos bem sucedidos, ocorrem barreiras de ps-fertilizao, como o no desenvolvimento do endosperma e a subseqente degenerao do embrio hbrido. Nestes casos, o resgate e a cultura de embries pode facilitar a obteno de hbridos viveis. Alm de permitir uma nova fonte de variabilidade gentica, a hibridizao ampla tem se mostrado como tcnica promissora para a produo de plantas haplides via eliminao seletiva de cromossomos, sendo conhecida como tcnica bulbosum. Assim, quando Hordeum vulgare empregada como me em cruzamentos com H. bulbosum, aps a polinizao e fertilizao, o embrio resultante pode ser haplide uma vez que o conjunto cromossmico de H. bulbosum pode ser seletivamente eliminado. i) Hibiridizao somtica/fuso de protoplastos Esta tcnica, descrita inicialmente por Carlson et al. (1972), pode ser considerada uma forma de engenharia gentica. Nela, protoplastos so isolados e fundidos, envolvendo interaes nucleares e citoplasmticas. A hibridizao somtica produz hbridos nucleares ou hbridos citoplasmticos (cbridos) e sua eficincia depende do controle dos vrios estgios da tcnica: isolamento e fuso, identificao e seleo dos heterocariontes e clulas hbridas e a regenerao de plantas. A fuso de protoplastos de diferentes origens pode ser quimicamente induzida com o a auxlio de um agente indutor, como o polietileno glycol (PEG) ou eletricamente induzida (eletrofuso). A fuso somtica tambm pode permitir aos melhoristas a manipulao de caractersticas extracromossmicas, como a macho-esterilidade. O procedimento resulta na unio do citoplasma dos genitores, enquanto que nos cruzamentos sexuais apenas a me contribui com o citoplasma. Assim, a fuso de proptoplastos pode permitir a obteno hbridos contendo diferentes tipos de citoplasma, o que no pode ser obtido pelos mtodos convencionais. A hibridizao somtica tambm pode ser empregada para superar algumas das limitaes inerentes aos cruzamentos amplos que ocorrem entre espcies ou gneros divergentes. A maior restrio desta tcnica refere-se, contudo, ao desbalanceamento genmico, perda de cromossomos no pareados ou falta de fuso nuclear. Mesmo quando a fuso ocorre, pode ocorrer a perda seletiva de cromossomos e o desbalanceamento nuclear resultante pode reduzir a viabilidade e o potencial regenerativo. Esta tem sido a principal limitao para a aplicao desta tcnica para o melhoramento gentico de plantas.

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10. PERSPECTIVAS PARA A APLICAO DAS TCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS a) CURTO PRAZO: Propagao massal de gentipos superiores a partir de: - Pequena quantidade de sementes - Gentipos-elite - Material limitado de plantas raras ou ameaadas de extino - Hbridos obtidos em cruzamentos Conservao de germoplasma in vitro b) MDIO E LONGO PRAZO: - Aumento do ganho gentico por capturar ou explorar a varincia total em comparao ao componente aditivo dos programas convencionais de melhoramento (baseados principalmente em seleo recorrente). - Melhoria dos protocolos para a embriognese somtica visando o "scale-up", a obteno de sementes sintticas e a diminuio do custo em comparao ao seedling obtido por mtodos convencionais. - Propagao massal de plantas a partir de:hibridao somtica, variantes somaclonais e por tcnicas de DNA recombinante. 11. ESPCIES E TECNOLOGIAS EMPREGADAS A seguir so listados alguns exemplos de espcies vegetais e respectivas tecnologias cujo emprego j corrente: - Dendezeiro: primeiro projeto no qual plntulas originadas a partir de embriognese somtica foram cultivadas a campo, (Unilever, Malasia, 1975). - Coniferas: primeiro projeto no qual tecnologias de poliembriognese somtica desenvolvidas e patenteadas pela Universidade da Cailfornia-Davis foram transferidas para empresas de reflorestamento (Weyerhaeuser, Washington, USA), para a clonificao de gentipos superiores resultantes de programas convencionais de melhoramento gentico. - Eucaliptos: organognese, embriognese somtica (USA, Europa). Microestacas (Brasil): aumento de 135% na produtividade de polpa a partir de clones selecionados em comparao a populao base. - Pyrus, Malus, Prunus: Limpeza viral e micropropagao (cultura de meristemas e de segmentos nodais) para a propagao massal de porta-enxertos e para o estabelecimento de variedades-copa matrizes sadias. - Videira: embriognese somtica e organognese para a propagao massal de porta-enxertos e variedades-copa isentas de molstias. - Bananeira: regenerao em larga escala de mudas isentas de pragas molstias. Obteno de variantes somaclonais e de mutagnese in vitro para resistncia ao mal do Panam e Sigatoka-negra. Atualmente a maior parte dos bananais da Amrica Central e do Caribe so instalados com mudas micropropagadas produzidas em Biofbricas desenvolvidas para este fim, principalmente em Cuba. - Moranguinho, abacaxizeiro, alho, cebola, batatinha, mandioca: Obteno de plantas matrizes isentas de viroses, pela aplicao da tcnica de cultura de meristemas e subsequente micropropagao massal. Induo e obteno de variantes somaclonais e mutagnese in vitro para ampliao da base gentica e melhoramento gentico. -Tomateiro: variantes somaclonais e transformao gentica para colorao e conservao. DNAP e Calgene (USA). Primeira autorizao de liberao para cultivo comercial de produto transgnico dada pelo FDA americano, em 1994. - Citros, mamoeiro e mangueira: modelos embriogenticos. Melhoramento e plantas isentas de molstias. - Brassica sp: resgate de embries resultantes de cruzamentos incompatveis, ativao de embriognese somtica e encapsulamento para a obteno de sementes sintticas. Sakata Seed Co., Japo. - Cacau e caf: embriognese somtica para a propagao massal de variedades melhoradas e resistentes a molstias (EUA e Costa Rica). 12. VANTAGENS DA MICROPROPAGAO EM PLANTAS PERENES Tcnicas de cultura de tecidos vegetais, podem se transformar em ferramentas auxiliares eficazes para o melhoramento de plantas perenes. Algumas vantagens so listadas a seguir: a) Como a multiplicao massal de um gentipo superior possvel em qualquer estgio de um programa de melhoramento, a micropropagao tem o potencial de promover o aumento de ganhos genticos em apenas uma gerao; b) A propagao massal pela clonificao de gentipos superiores captura os componentes aditivos e no aditivos da varincia gentica;
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c) Genes desejveis de clones selecionados podem ser mantidos em um banco gentico na forma de pomares clonais, onde podem ser recombinados atravs de cruzamentos dirigidos; d) Interaes gentipo-ambiente podem ser melhor estudadas em populaes clonais; e) A seleo clonal in vitro e a micropropagao podem ser utilizadas para a produo de gentipos superiores e o tempo necessrio para produzir grandes quantidades de plantas menor no programa clonal do que em um programa baseado nos pomares clonais; f)Tcnicas de micropropagao possibilitam a produo de um grande nmero de progenitores genticamente uniformes para a produo de sementes hbridas. 13. LIMITAES Mesmo considerando-se as diversas aplicaes, ainda existem limitaes para a aplicao mais ampla destas tcnicas no melhoramento de plantas: a) Em muitos sistemas de cultura de tecidos a variao introduzida epigentica e, portanto, limitante para o melhoramento de plantas. b) Variaes deletreas como reduo na fertilidade e fixao de frutos e sementes e outras variaes morfolgicas ocorrem em variantes somaclonais, com vrias implicaes no melhoramento de plantas, principalmente quando a uniformidade gentica o objetivo. c) O sucesso de um sistema regenerativo in vitro substancialmente dependente da adequao de um meio de cultura apropriado para cada espcie. d) O desenvolvimento de eixos caulinares, gemas e embries somticos no , em geral, sincronizado, dificultando a aplicao de sistemas-biofbricas. 14. CONSIDERAES FINAIS A possibilidade de uma adequada manipulao da morfognese in vitro para a obteno de processos regenerativos via organognese ou embriognese somtica parece ser dependente de condies determinativas e permissivas. Nas primeiras salientam-se a "condio fisiolgica do explante" e o tipo e concentrao do regulador de crescimento a ser utilizado como sinal qumico para a induo/ativao da morfognese. De maneira geral, quanto mais juvenil for o tecido doador de explantes e quanto mais meristemtica for sua condio, maiores sero as possibilidades de se orientar a morfognese in vitro. Para a embriognese somtica, restam poucas dvidas de que tecidos embrionrios so os mais adequados para a extrao de respostas nesta rota, apesar de que nem sempre estes tecidos so os mais interessantes para os propsitos a serem obtidos. Com respeito aos reguladores de crescimento, a sua ao para a obteno de respostas organogenticas relaciona-se aos padres apontados por Skoog e Miller (1957), isto , balanos favorveis as citocininas tendem a induzir organognese area enquanto que balanos favorveis as auxinas favorecem a rizognese. Para a ativao/induo da embriognese somtica a adio de auxinas fortes ao meio de cultura primrio parece ser uma condio essencial para o desencadeamento de reaes metablicas associadas com esta rota, apesar de que o balano entre fontes nitrogenadas orgnicas e inorgnicas, oxidadadas e reduzidas parece exercer considervel influncia. As chamadas condies permissivas incluem a composio geral dos meios de cultura e as condies fsicas, tais como temperatura e fotoperodo. A utilizao de tcnicas de cultura de tecidos para a regenerao e propagao massal de gentipos superiores via organognese e embriognese somtica prtica rotineira em muitos laboratrios. Algumas limitaes dizem respeito a necessidade de melhoria geral dos protocolos utilizados e a definio e estabelecimento de protocolos para as chamadas espcies "recalcitrantes". nfase especial deve ser dada a possibilidade de estabelecimento de suspenses celulares morfogenticas. Um maior detalhamento das tcnicas de biologia celular e molecular vem permitindo um maior refinamento das tcnicas de cultura de tecidos vegetais e a conseqente aplicao para tecnologias de protoplastos e transformao gentica.

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15. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Ammirato, P. G. V. 1993. Embryogenesis, in: Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Ammirato, P. G. V.; Yamada, Y. Handbook of plant cell culture. New York: MacMilam Publischer Company, v.1, 123p. Button, J. & Kochba, J. 1977. Tissue culture in the citrus industry. In: Plant cell, tissue and organ culture. Reinert, J. & Bajaj, Y.P.S. (eds.). pp. 70-92. Springer-Verlag. Berlin. Cocking, E.C. 1960. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature, 187:962-963. Christianson, M.L. 1985. An embryogenic culture of soybean: towards a general theory of somatic embryogenesis. In: Tissue Culture in Forestry and Agriculture. Henke, R.R.; Hughes, K.W.; Constantin, M.J.; Hollaender, A. (eds). pp. 83-103. Plenum Press. New York. Debergh, P.C. & Read, P.E. 1991. Micropropagation. In: Micropropagation Technology and Application. Debergh, P.C. & Zimmermann, R.H. (eds.). pp. 3-13. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Durzan, D. & Gupta, P.K. 1988. Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in conifers. In: Biotechnology in Agriculture. Mizrahl, A. (ed.). pp. 53-81. Allan Liss. New York. George, E. F. 1996. The derivation, preparation, and use of culture media, In: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. X, p. 344-419. George, E. F. 1996. Embryogenesis: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. VII, p. 612623. George, E. F. 1996. Plant grow regulators: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. XI, p. 420-479. George, E. F. 1996. Plant propagation and micropropagation: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. II, p. 37-66. George, E. F. 1996. Plant tissue culture techeniques: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. I, p. 3-36. Guerra, M.P. and Handro, W. 1988. Somatic embryogenesis and plant regeneration in embryo cultures of Euterpe edulis mart. (palmae). Plant Cell Reports, 7:550-552. Guerra, M.P.; Torres, A.C.; Teixeira, J.B. 1999. Embriognese Somtica e Sementes Sintticas. In: Torres, A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. (eds.). Culturas de Tecidos e Transformao Gentica de Plantas. Braslia, Embrapa-CBAB. pp. 533-568. V.2. Gupta, P.K. & Durzan, D.J. 1986. Somatic polyembryogenesis from callus of mature sugar pine embryos. Biotechnology, 4:643-45. Haccius, B. 1978. Question of unicellular origin of non-zigotic embryos in callus cultures. Phytomorphology, 28:74-81. Harmann, H.T. & Kester, D. 1975. Plant propagation:principles and practices. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.J. Hartmann, T.H.; Kester, D.E.; Davies, F.T. 1990. Plant Propagation, Principles and practices. Prentice Hall. New Jersey. 647 p. Krikobian A. D., 1993. Prpagacion clonal in vitro. In Roca W., Mroginski L. A. (eds) Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT Cali, Colombia. Cap 11, p. 95-117. Litz, C. 1987. Application of tissue culture to tropical fruits. In: Plant Tissue and Cell Culture. Green, C.C.; Somers, D.A.; Hackett, W.P.; Biesboer, D.D. (eds.). pp.407-18. Allan R. Liss. New York. Lutz, J.D.; Wong, J.R.; Rowe, J. 1985. Somatic embryogenesis for mass cloning of crop plants. In: Tissue culture in forestry and agriculture. Henke, R.R.; Hughes, K.W.; Constantin, M.J.; Hollaender, A. (eds). pp.105-16. Plenum Press. New York. Miller, C.O.; Skoog, F.; Okumura, F.S.; Von Saltza, M.; Strong, F.M. 1955. Structure and synthesis of Kinetin. J. Am. Chem. Soc. 77:2662-63 Mullins, M.G. 1987. Propagation and genetic improvement of temperate fruits, the role of tissue culture. In: Plant Tissue and Cell Culture. Green, C.C.; Somers, D.A.; Hackett, W.P.; Biesboer, D.D. (eds.). pp.395406. Allan R. Liss. New York. Murashige, T. 1974. Plant propagation through tissue cultures. Ann. Rev. Plant Phys., 25:135-66. Murashige, T. 1977. Clonal crops through tissue culture. In: Tissue Culture and its bio-technological application. Barz, W.; Reinhard, D.E.; Zenk, M.H. (eds). pp. 392-403. Springer-Verlag. Berlin. Neumann, K. H. 2000. Some study on somatic embryogenesis, a tool in plant biotechnology. 87 th. Indian Science Congress. http://bibd.uni.grtessen.de/gdoc//2000/uni/poooo4.pdf. Acessado 10 ago. 2004. Pence, V.C.; Hasegawa, P.M.; Janick, J. 1979. Asexual embryogenesis in Theobroma cacao L. Jour. Amer. Soc. Hort. Sci., 104(2):145-48. Peters, J. A. 1986. Utilizao de biotecnologia no melhoramento de fruteiras. Revista Brasileira de Fruticultura, 8(3):19-22.
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Sobre nossas reas de atuao: As reas de atuao do LFDGV abrangem a Biotecnologia Vegetal, a Fisiologia do Desenvolvimento Vegetal e a Gentica Vegetal. As principais linhas de pesquisa em andamento vinculam-se induo e controle da morfognese in vitro, a cultura de tecidos e micropropagao de plantas, a conservao in vitro de germoplasma, a caracterizao da variabilidade gentica por meio de marcadores moleculares, a seleo assistida por marcadores, a genmica e protemica, o sequenciamento gentico, a gentica de populaes e dinmica da movimentao de alelos. Vrios projetos de pesquisa se encontram em andamento destacando-se aqueles relacionados com espcies nativas, tais como Euterpe edulis, Acca sellowiana, Araucaria angustifolia, Bactris gasipaes, Bromlias, Lipia Alba e Dicksonia sellowiana. Espcies exticas frutferas tambm tm sido alvo de estudos e entre essas se destacam os projetos com Malus domestica, Prunus domestica e Vitis sp. As fontes financiadoras incluem agencias federais e internacionais de fomento a C&T, bem como a agencia estadual de SC (FAPESC) e empresas privadas, destacando-se o Projeto GenoMalus conduzido em parceria com a Associao Brasileira de Produtores de Ma (ABPM).

LAB. F ISIOLOGIA DO DESE NVOLVIME NTO E GE N TICA VE GE TA L

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