Manual Microbiologia

MANUAL MICROBIOLOGIA Revisin: 1 Fecha: 30/04/2.
009 CODIGO: MANUAL MICROB
Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio
Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio
Aprob: SALVI socio Gerente
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MANUAL MICROBIOLOGIA Revisin: 1 Fecha: 30/04/2.009 CODIGO: MANUAL MICROB
INTRODUCCION 1. OBJETIVO Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad. 2. ALCANCE este procedimiento especifico se aplica para el anlisis microbiolgico de muestras. 3. DEFINICIONES 4. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA Protocolo especifico del medio utilizado 5. RESPONSABILIDADES Del microbilogo: cumplir con todas las normas de seguridad, generar los registros y enviar los resultados al cliente. 6. DESARROLLO Normas generales de uso del laboratorio Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. No tacar con las manos y menos con la boca los productos qumicos. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: cido sobre agua. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 2 de 3
Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro. Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada de lquido. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullicin rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de haberlos calentado con el fin de evitar roturas. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen. DETERMINACIN CATALASA 1) OBJETO Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. La prueba de la catalasa est relacionada con la vida aerobia y permite la rpida diferenciacin de diversos microorganismos, sobre todo Gram positivos, en funcin de la reaccin positiva (aparicin de efervescencia) o negativa de sus colonias en contacto con el reactivo. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) La catalasa es un enzima que acta sobre el perxido de hidrgeno dando lugar a agua y oxgeno. El perxido de hidrgeno es un metabolito de la degradacin aerbica de los hidratos de carbono. Si se acumula, es txico para los microorganismos, llegando a provocar su muerte. Por ello, la catalasa es un enzima necesario para el desarrollo de los microorganismos aerobios. La mayora de facultativos (Enterobacterias...) tambin son catalasa positivos. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 3 de 3
2) ALCANCE Este procedimiento especfico se aplica para el anlisis microbiolgico de muestras 3) SEGURIDAD Este mtodo entraa el uso de diversas sustancias biolgicas peligrosas y procedimientos que pueden ocasionar un aumento del riesgo para quien los aplica. En caso de duda, consultar siempre con el asesor de seguridad competente. No utilizar asa de platino, ya que ste cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno, pudiendo dar lugar a falsos positivos. Mantenga el reactivo a 2-8 C y absolutamente protegido de la luz, que lo descompone. Reactivo inestable: No utilizar cuando deja de burbujear con un control positivo (Microcuccus luteus). 4) Precauciones generales Se llevara en todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado, gafas y guantes de seguridad. Los analistas se conocern cualesquiera de los riesgos atribuibles a las sustancias que usan Se debern mantener cerca la hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso. La exclusin de otros compuestos de esta lista no implica que sean seguros. 5) DESARROLLO Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: Mtodo del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Mtodo del tubo de ensayo: Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo
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Burbujas (arriba, izquierda) en Micrococcus luteus, prueba positiva
6) UTILIDAD: Sus aplicaciones ms interesantes son la diferenciacin inmediata de colonias de: Staphylococcus y Micrococcus (+) Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio de Streptococcus y Enterococcus (-), aunque curiosamente muchos de stos Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 5 de 3
pueden (o slo pueden) crecer en presencia de aire. Bacillus (+) Listeria monocytogenes (+) de Clostridium (-), anaerobio estricto. de Lactobacillus (-), a menudo microaerfilo.
7) MODO DE EMPLEO: Aadir una gota de reactivo sobre la colonia, que previamente puede haberse colocado en un portaobjetos mediante un palillo. No aadir la colonia sobre el reactivo. Observar la inmediata (segundos) aparicin de burbujas (prueba positiva) o no (prueba negativa).
MICROBIOLOGIA DE VINOS
1.
OBJETO
El desarrollo de microorganismos en vinos durante el aejamiento o embotellado, es una de las alteraciones ms frecuentes, siendo las levaduras uno de los principales agentes responsables. La posibilidad de desarrollo microbiano en el vino est determinado por el tipo de cepa y especie presente en el mismo, as como tambin por la composicin qumica del vino y las condiciones de su almacenamiento. Se ha demostrado que la inestabilidad del vino puede ser causada por un ilimitado nmero de especies. ALCANCE Este procedimiento especfico se aplica para el anlisis microbiolgico de muestras liquidas.
2. 3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA Folleto de los medios de cultivo. 4. Precauciones generales Se llevara en todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado, gafas y guantes de seguridad. Los analistas se conocern cualesquiera de los riesgos atribuibles a las sustancias que usan Se debern mantener cerca la hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso. La exclusin de otros compuestos de esta lista no implica que sean seguros.
5.
CULTIVOS AEROBICOS introduccin
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Se basa sobre la propiedad de un agregado un medio de cultivo para desarrollar el organismo que estamos investigando (levaduras y mohos, bacterias o recuento total), se requieren los siguientes recuentos e investigaciones: Recuento de colonias aerbicas mesfilas (31 1 C) TGE con TTC Recuento de mohos y levaduras MEDIO RESISTENTE A CONSERVANTES PRY Muestreo. Las drogas sern retiradas del droguero y cargadas en el formulario MAG 1. Las muestras sern enviadas al laboratorio con todos los cuidados microbiolgicos de extraccin y en envases estriles, provisto por MAG o en envases del cliente. APARATOS Pizeta con agua destilada Alcohol de 80 Algodn estril Medio de cultivo especifico Equipos Monitor de 100 ml estril. VER FIGURA Estufa de cultivo. Cmara de flujo laminar VER FIGURA Microscopio REACTIVOS
6. PROCEDIMIENTO En un monitor de 100 ml colocar la muestra extrada del envase estril, en casos especiales y a pedido del cliente se filtrara el volumen solicitado y el resultado se expresado sobre el volumen filtrado. Realizar el vaco para filtrar la muestra. Agregar el medio de cultivo por la parte trasera del monitor (2 ml) con jeringa o por medio de la ampolla cuando es plstica (1 monitor por medio a desarrollar) Colocar la tapa en la parte inferior y llevar invertido a la estufa (la tapa superior debe esta hacia abajo). Llevar a estufa de cultivo por 48 h. a 31 C. 1 C Retirar la muestra de estufa y observar las colonias desarrolladas. Si tenemos duda de lo formado llevar al microscopio. Hacer un raspado y colocar sobre porta objeto junto a una gota de agua estril, cubrir con un cubreobjeto y agregar aceite de inmersin. Ver en el microscopio con 100 x 10 por inmersin
Interpretacin DEL RESULTADO. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 7 de 3
Aerobios a 22 C
Aerobios a 37 C
Figura Cpsulas ensayo en blanco y de hongos filamentosos y levaduras
EQUIPAMIENTO UTILIZADO Las campanas de flujo laminar permiten realizar el ensayo microbiolgico en un ambiente con menores riesgos de contaminacin (Ver figura), al tener una ligera sobrepresin que evita el paso de atmsfera externa. Pueden estar equipadas de lmparas ultravioleta para esterilizar previamente el ambiente de trabajo.
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Figura. Campana de flujo laminar con material de ensayo microbiolgico
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Monitor de filtracin
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Proceso de filtracin de muestras liquidas
1er.paso: destapar el monitor
2do. Agregar la muestra, tapar y filtrarla.
3ero. Enjuagar con agua estril las paredes (opcional)
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Medios de cultivo
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OBSERVACION MICROSCOPICA 1. OBJETO El poder realizar una buena observacin microscpica nos dar un diagnostico, de una de las alteracin interna o externa. 2. ALCANCE Este procedimiento especfico se aplica para observacin microscpica las muestras de clientes, a analizar por laboratorio microbiolgico. As, este documento aborda los distintos aspectos a tener en cuenta al momento de recibir muestras de los interesados para ser analizadas por el laboratorio microbiolgico o por el laboratorio general de la firma Mag SRL. 3. DEFINICIONES Observacin : 4. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA No corresponde. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 14 de 3
5. DESARROLLO 5.1. ALCANCE Se basa en la observacin directa o despus de una centrifugacin del deposito por medio de un microscopio sobre un porta objeto por observacin directa o por inmersin. 5.2. MATERIALES Pizeta con agua destilada Algodn estril porta y cubre objetos tubo de centrifuga de 10ml cnico 5.2.1.Equipos microscopio centrifuga 5.2.2. REACTIVOS aceite de inmersin Alcohol 96 G.L. 5.3. PROCEDIMIENTO De acuerdo a la muestra recibida en el da de hoy, hemos realizado la observacin microscpica de la muestra, siguiendo la siguiente metodologa: Centrifugado de la muestra durante 10 minutos a 4500 r.p.m. Colocacin del fondo del tubo de centrfuga en un portaobjeto y colocndole un cubre objeto. El preparado fue colocado en el microscopio ( CARL ZEIZZ MODELO KF2) realizando observacin por contraste de fase y por inmersin con objetivos de 40 x y PLAN 100 X. La observacin se realizo recorriendo 10 campos. 5.4. INTERPRETACION DEL RESULTADO.
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bacterias
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5.5.EQUIPAMIENTO UTILIZADO
[Fotografa y esquema de un Microscopio de luz (M.L.)]
EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO Se realiza a partir de muestras obtenidas de lesiones. Es el mtodo ms simple y ms rpido para establecer un diagnstico presuntivo de micosis, ya que no necesita de incubacin. Si la muestra no es abundante hay que dar prioridad al cultivo, frente al examen directo. Preparacin de la muestra: En el caso de tejidos: cortar, trocear, machacar, etc. En el caso de lquidos: concentrar por centrifugacin. En el caso de uas: trocear, repartir en fragmentos, etc. Si son otras muestras como escamas, pelos, etc., no es necesaria una preparacin previa, sino que se hace directamente el examen. TCNICAS Y TINCIONES PARA EL EXAMEN DIRECTO Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 18 de 3
Examen Directo con Solucin Salina Colocamos una gota de la muestra lquida en un porta y aadimos una gota de solucin salina. Ponemos el cubre y observamos al microscopio con poca luz y variando el aumento. Los hongos se observan refrctiles o brillantes, ligeramente verdosos. En el caso de las levaduras pueden aparecer inclusiones. Tambin se pueden observar burbujas de diferentes tamaos. No debemos confundir las levaduras con hemates y con burbujas de aire. Se diferencian porque las levaduras presentan pequeas inclusiones en la clula y las burbujas van a ser siempre de diferentes tamaos. Hidrxido Potsico con Dimetil Sulfxido No es necesario calentar la preparacin, de esta forma no aparecen precipitados. Las muestras de pelos, escamas y biopsias se observan con poca luz. Es importante no confundir artefactos como fibras de tejidos, granos de polen, etc., con hongos. Otra causa de error es lo que se denomina hongos en mosaico, que suele aparecer cuando las muestras estn muy queratinizadas. Suelen ser cmulos lipdicos que desaparecen cuando se calienta la preparacin. Colocamos la muestra en pequeas porciones sobre un porta y aadimos varias gotas de KOH + Dimetil y ponemos el cubre. Observamos los elementos fngicos (hifas, levaduras, etc). Si la muestra observada son uas muy queratinizadas, el tiempo que acta del KOH es de varias horas. Es conveniente dejar el porta en una cmara con ambiente hmedo (placa de petri con un algodn empapado en agua dentro). Azul Algodn de Lactofenol Se realizan las preparaciones a partir de cultivos. El fenol destruye la flora acompaante y organismos; el cido lctico conserva las estructuras fngicas y el azul algodn tie la quitina de las paredes fngicas. Aadimos una gota de la muestra o una porcin del hongo en un porta. Sobre ella colocamos una gota de azul algodn y ponemos el cubre. Observamos al microscopio. Para hongos y levaduras Coloque cerca al mechero el alimento con hongos y con ayuda de cinta pegante, recoja muestra de la superficie. Marque la lmina con cinta de enmascarar: nmero del grupo y coloracin. Coloque en el centro de la lmina portaobjetos una pequea gota de azul de Lactofenol, y luego pegue la cinta a la lmina. Presione ligeramente para eliminar burbujas de aire. Observe en el microscopio en los objetivos de 10x y 40x. Realice una posible identificacin del hongo El lactofenol se prepara con: 20 g de cristales de fenol, 16 ml cido lctico, 31 ml glicerina y20 ml de agua. Para preparar el azul-lactofenol se reemplaza el agua por una solucin acuosa de azul de algodn al 0,05 % p/v
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BRETTANOMYCES OBJETIVO El desarrollo de microorganismos en vinos durante el aejamiento o embotellado, es una de las alteraciones ms frecuentes, siendo las levaduras uno de los principales agentes responsables. La posibilidad de desarrollo microbiano en el vino est determinado por el tipo de cepa y especie presente en el mismo, as como tambin por la composicin qumica del vino y las condiciones de su almacenamiento. Se ha demostrado que la inestabilidad del vino puede ser causada por un limitado nmero de especies. Entre ellas, el gnero Dekkera/Brettanomyces es el agente de deterioro aislado con mayor frecuencia y ha sido encontrado en diferentes vinos de distintas regiones geogrficas del mundo. Brettanomyces y su forma esporulada Dekkera son capaces de producir un defecto comnmente denominado olor a ratn y/o sudor de caballo, los mismos son consecuencia de la produccin de ciertos compuestos qumicos voltiles a partir de compuestos originalmente presentes en el vino (de la familia de las acetil tetrahidropiridinas y etil fenoles). Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 20 de 3
Figure 2: Pathway a la formacin de 4-etil fenol y 4-etil guayacol en vino ALCANCE este procedimiento especifico se aplica para el anlisis microbiolgico de muestras. DEFINICIONES 4-etil fenol 4-etil guayacol Brettanomyces y su forma esporulada Dekkera: son capaces de producir un defecto comnmente denominado olor a ratn y/o sudor de caballo DOCUMENTACIN DE REFERENCIA Protocolo especifico del medio utilizado DESARROLLO INTRODUCCION Se basa sobre la propiedad den un agregado que tiene el medio de cultivo para bloquear todos los desarrollos menos el de Brettanomyces. MUESTREO. Las muestras sern enviadas al laboratorio con todos los cuidados microbiolgicos de extraccin y en envases estriles, APARATOS Pizeta con agua destilada Alcohol de 80 Algodn estril Medio de cultivo especifico EQUIPOS Monitor de 100 ml estril. Bomba de vaco. Estufa de cultivo. Cmara de flujo laminar Microscpio . con cmara fotogrfica REACTIVOS Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 21 de 3
MEDIO ESPECIFICO PARA BRETTANOMYCES PROCEDIMIENTO En un monitor de 100 ml colocar la muestra extrada del envase estril. Realizar el vaco para filtrar la muestra. Agregar el medio de cultivo especifico Llevar a estufa de cultivo por 5 das a 25 C. Retirar la muestra de estufa y observar la colonias desarrolladas de color crema. Si tenemos duda de lo formado, llevar al microscopio un raspado sobre cubreobjeto, colocar un porta y aceite de inmersin. INTERPRETACION DEL RESULTADO.
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PROTOCOLO DE ANALISIS DE COLIFORMES FECALES PROTOCOLO DEL PROCEDIMIENTO Muestreo: realizado por el cliente. Lugar de extraccin: desconocido Materiales: Recipiente de estril de 250 ml. Cmara de flujo laminar Monitores estriles de 100 ml Sistema de filtracin Medio de cultivo PARA COLIFORMES TOTALES CON MUG Medio de cultivo para coliformes totales Micropipetas P1000 Estufa a 37 C Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 23 de 3
Hipoclorito sodio, alcohol 80 GL y algodn Marcador indeleble Guardapolvo Guantes Cooler, Bolsa roja para descarte de patognicos Desarrollo: las muestras mantenidas en el recipiente de muestreo es trasvasado a el monitor cuidando todos los cuidados microbiolgicos dentro del flujo laminar con los filtros de aire encendidos y el UV apagado. Una vez filtrada la muestra sembrar el medio de cultivo, tapar el lugar de ingreso del medio especifico, marcar con la denominacin de la muestra. Incluir un control negativo con un caldo Brila que no muestre crecimiento (o agua estril). Incubar a 37 C durante 48 hs. Mirar los positivos con luz UV. Si se observa fluorescencia azul (producida por un producto de clivaje del MUG) se consideran positivos para coliformes fecales y Escherichia coli. De acuerdo a la muestra recibida el resultado microbiolgico es con los siguientes resultados: CALDO m-MUG-2008 PARA LA DETECCION DE COLIFORMES Y E. COLI SIMULTANEOS CALDO PARA RECUENTO POR MEMBRANAS Se utiliza caldo con MUG para la determinacin cuantitativa para coliformes y E. Coli. Por el mtodo de filtracin por membrana. Luego de 24 horas se cuentan las colonias que sern coliformes totales y bajo la luz ultravioleta aquellas que muestren fluorescencia se contarn como E. Coli. El caldo con MUG esta indicado por USEPA para determinar coliforme y E. Coli por el mtodo de membrana ,presencia / ausencia y el del numero ms probable. La determinacin cuantitativa de coliformes y E.Coli se lleva a cabo por el mtodo de filtracin por membrana. El reactivo MUG reacciona nicamente con E. Coli y permite la identificacin rpida y econmica de E.Coli, inclusive la deteccin de sepas de E. Coli que no producen gas y se tiene una respuesta selectiva sobre los E. Coli aun cuando se encuentren presentes muchos organismos competitivos. Da una respuesta positiva entre las 4 y 24 horas contra los mtodos tradicionales que llevan hasta cuatro das. LECTURA DE RESULTADOS Poner 9 ml de producto en el tubo, agitarlo para desplazar el aire de la campanita Durham y homogeneizar la muestra Incubar el tubo a 37 C durante 16-24 horas. La presencia de burbuja en la campanita y turbidez indica presencia de coliformes totales Exponiendo el tubo a la luz ultravioleta, la fluorescencia indica E. Coli Filtrar otros 100 ml., por monitor con membrana de 0,45 m. y 47 mm., de dimetro agregarle medio cultivo COLI con MUG e incubar invertido 24 a 48 hs a 37 C., Otro proceder usar frascos con ausencia presencia. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 24 de 3
MANUAL MICROBIOLOGIA Revisin: 1 Ver power point Accesorios Monitores, con membrana y pads incluido Frascos con campanita. Frascos ausencia presencia Estufa de cultivo Microscopio Fecha: 30/04/2.009 CODIGO: MANUAL MICROB
CERTIFICADO DE CALIDAD Medio: Caldo m-MUG para Coliformes totales y e: coli con MUG N Art.: Lote: Fecha de fabricacin: 2.007 Fecha de vencimiento:2.009 Aspecto del producto: pH: CONTROL DE ESTERILIDAD No se observa crecimiento luego de 100 horas de cultivo Crecimiento E. Coli ATCC25922 E. Coli ATCC11775 Citrobacter freundii ATCC 8090 Stafylococcus aureus ATCC 6538-P Bacillus Cereus ATCC 11778 Lactobacillus plantarumATCC8014 Fotos de cultivo endo RECUPERACION 80 % 80 % 80 % inhibido inhibido inhibido
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foto de cultivo con MUG
foto de tubos presencia Ausencia con MUG
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COLORACION GRAM OBJETO El objeto de estas tcnicas es conocer los mtodos de coloracin para realizar observaciones microscpicas en diferentes tipos de microorganismos. Gram . Se puede discriminar entre dos grandes grupos de bacterias : Gram positivas ( se tien de violeta ) Gram negativas (se tien rosadas) ALCANCE Este procedimiento especfico se aplica para el anlisis microbiolgico de muestras liquidas. DEFINICIONES No corresponde. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA RESPONSABILIDADES Del responsable del anlisis: CUMPLIR CON LAS NORMAS DE SEGURIDAD MENCIONADAS MAS ABAJO SEGURIDAD Precauciones generales Se llevara en todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado, gafas y guantes de seguridad. Los analistas se conocern cualesquiera de los riesgos atribuibles a las sustancias que usan Se debern mantener cerca la hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso. La exclusin de otros compuestos de esta lista no implica que sean seguros. Mtodo
Tincin Gram
Material Necesario Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra Cubeta de tincin Cultivo bacteriano Frasco lavador Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio
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MANUAL MICROBIOLOGIA Revisin: 1 Cristal violeta Alcohol- acetona Safranina REALIZACIN Preparar los frotis bacterianos. Teir con cristal violeta 1min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teir con safranina 1min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin. Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. ANALISIS DE CORCHOS OBJETO El desarrollo de microorganismos en tapones de vinos durante el almacenamiento o embotellado, es una de las alteraciones ms frecuentes, siendo las levaduras uno de los principales agentes responsables. La posibilidad de desarrollo microbiano es una de las causas de rechazo de los mismos. ALCANCE Este procedimiento especfico se aplica para el anlisis microbiolgico de tapones de corchos. DEFINICIONES No corresponde. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA Folleto de los medios de cultivo. RESPONSABILIDADES Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 30 de 3 Fecha: 30/04/2.009 CODIGO: MANUAL MICROB
Del responsable del anlisis: CUMPLIR CON LAS NORMAS DE SEGURIDAD MENCIONADAS MAS ABAJO Precauciones generales Se llevara en todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado, gafas y guantes de seguridad. Los analistas se conocern cualesquiera de los riesgos atribuibles a las sustancias que usan Se debern mantener cerca la hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso. La exclusin de otros compuestos de esta lista no implica que sean seguros. introduccin ANLISIS MICROBIOLGICO. El anlisis microbiolgico nos informa del grado higinico de los tapones. Para evitar un incremento del nivel microbiano en las muestras de ensayo, deben mantenerse en condiciones que eviten su contaminacin y/o proliferacin. Esto se consigue mediante utilizacin de materiales estriles y ambientes con temperaturas bajas. El anlisis se efecta para bacterias, hongos filamentosos y levaduras. Tambin se contemplan, en algunos casos, los lactobacillus y streptomycces. Deben realizarse ensayos paralelos en blanco, es decir, con la solucin de extraccin exclusivamente, siguiendo todos los pasos para que se garantice que no existe contaminacin cruzada. Los resultados se dan en UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por tapn. Los especficos de streptomycces y lactobacillus con ausencia o presencia. El equipo para la determinacin microbiolgica consta de: Autoclave (Ver figura 21). Mechero u otro medio que permita esterilizar ambiente. Agitador mecnico. Membranas filtrantes de 0.45 m. Sistema de filtrado. Cpsulas petri. Estufas de cultivo o incubadora Solucin de extraccin, Ringer (agua peptonada)1/4 o solucin salina al 0.9% en NaCl. Medios de cultivo especficos para: -Bacterias. -Hongos filamentosos y levaduras. -Streptomices. -Lactobacillus.
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Figura 21. Balanza analtica de 0,0001 gr. de sensibilidad Las campanas de flujo laminar permiten realizar el ensayo microbiolgico en un ambiente con menores riesgos de contaminacin (Ver figura 2), al tener una ligera sobrepresin que evita el paso de atmsfera externa. Pueden estar equipadas de lmparas ultravioleta para esterilizar previamente el ambiente de trabajo. Mtodo de ensayo: Toma de muestra: Con la ayuda de una pinza esterilizada o guantes, retirar la cantidad de tapones que se desea controlar ( no mas de 10 por medio que se va a utilizar) y colocarlos en una bolsa de muestreo estril de 500 ml, cerrar la bolsa y llevarlos al lugar donde se va a analizar. En el laboratorio y con la debida asepsia, volcar 100 ml de solucin de extraccin dentro de la bolsa que contiene los tapones. Cerrar debidamente la bolsa y agitar el contenido de modo tal que el agua peptonada bae totalmente la superficie de los tapones. Sobre un monitor de 47 mm de dimetro con membrana de 0,45 m de poro. Con la debida asepsia volcar el agua peptonada dentro del monitor, toda esta tarea se realiza en la cmara de flujo laminar o entre dos mecheros , luego filtrar aplicando vaco. Cortar el vaco cuando termina de pasar todo el liquido, retirar el monitor del equipo y por la parte inferior ingresar la ampolla que contiene el medio de cultivo (recuento total, bacterias o hongos y levaduras). Llevar a estufa de cultivo a 30 - 32C durante 48 horas. Hacer el recuento de las colonias. Establecer el nivel de contaminacin a travs de un estudio aplicando la siguiente formula: N = C x1.250 mm2 / 10 x 9,61 mm2 N = C x 13 Donde: N: Es el numero de colonias contenidas en el agua filtrada o en cantidad de tapones de de retiro el agua peptonada. C: Es el numero de colonias contadas en 10 cuadritos de la membrana. 1.250 mm2: Es la superficie efectiva de filtrado en una membrana de 47 mm de dimetro. 9,61 mm2: Es la superficie de un cuadrito de la membrana. Otra forma de toma de muestra: Se realiza en condiciones de esterilidad. En frasco de boca ancha de 500 ml con 100 ml de solucin estril ( 1 frasco para cada medio). Si realizo bacterias y levaduras necesitara 2 frascos y 8 tapones, donde en cada frasco habr 10 tapones y 100 ml de solucin estril. Se llevan a agitacin magntica los frascos cerrados durante 1 hora a 150 oscilaciones por minuto o a 120 r.p.m durante 30 minutos o 24 horas con homogenizaciones espordicas. Posteriormente cada frasco se somete a filtracin en monitor con membrana de 0,45 . Se cultivan a: 37 C 2 C durante 72 horas para el recuento de bacterias aerobias mesfilas totales. 28 C 2 C durantes 72 horas para el recuento de mohos y levaduras. Calculo y expresin de resultados: El numero de unidades formadores (ufc) por tapn se calcula por la siguiente formula Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 32 de 3
MANUAL MICROBIOLOGIA Revisin: 1 Ufc/tapn = ufc total observadas/10. Tipos de desarrollos obtenidos: En algunos casos hemos observado sporendonema sp y pelicillium sp, deberemos hacer la observacin con contraste de fase y coloracin con azul de lactofenol Fecha: 30/04/2.009 CODIGO: MANUAL MICROB
Figura 22. Campana de flujo laminar con material de ensayo microbiolgico
Figura 23. Cpsulas petri del ensayo en blanco y con tapones, de hongos filamentosos y levaduras
Anlisis Microbiolgico de Hielo Potable Metodologa empleada: Cultivo en medios selectivos y de enriquecimiento especficos. Volumen y tipo de muestra requerida: 100 gr o mL de producto a analizar. Indicaciones para muestra: Remitir las muestras en frasco estril o bolsa de estril (nueva), en caja con refrigerante. Indicar condiciones de toma de muestra. Contactar al laboratorio para ms detalles. Tiempo de entrega: 6 a 10 das Mesoflicas aerobias (UFC/mL): Menos de 100 Coliformes totales (UFC/mL): Negativo Coliformes fecales (NMP/mL) Negativo Cloro residual (p.p.m.): 1.0 a 3.0 pH: 7.6 Nota: Las metodologas empleadas se basan en los manuales de la A.P.H.A., F.D.A Fundamento de la Tcnica La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza y caractersticas de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante- mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloracin con alcohol acetona se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la clula. Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante- mordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces fcilmente teida por el colorante secundario o de contraste. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 33 de 3
Resultados de la coloracin Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente se refiere difieren en el color con el que finalmente se tien las bacterias. Gram positivas se observarn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial con los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la Safranina. La diferencia esta determinada por la composicin de su envoltura celular, las bacterias Gram. positivas poseen una malla de pptido glicano en su parte mas externa ,mientras que las Gram. negativas recubriendo una fina capa de peptidoglicano y presentan una membrana externa . Reactivos y Colorantes La tincin de Gram. requiere cuatro soluciones: 1. Primer colorante. Un colorante bsico (+) que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El mas utilizado es el cristal violeta. 2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes usados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como por ejemplo, una sol. diluida de yodo. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico; por ejemplo alcohol acetona (1:1). 4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina. Procedimiento Tcnico 1) Realizar el extendido de la muestra 2) Fijacin del extendido Mtodos fsicos: accin del calor Mtodos qumicos: metanol 5) Primer colorante: cristal violeta 6) Mordiente: Lugol (sc I2/KI) 7) Decoloracin: mezcla alcohol-acetona 1:1 8) Segundo colorante: safranina Procedimiento Tcnico Diferencias entre Gram (+) y (-) Morfologa Bacteriana Tincin de Ziehl-Neelsen La tincin de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clnicas de pacientes es otra muy importante tincin diferencial. La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: BAAR positivas y BAAR negativas. BAAR: bacilos cido alcohol resistentes Fundamento de la Tcnica Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias. contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul. Procedimiento Tcnico 1) Hacer un frotis 2) Secar al aire y fijar por calor 3) Cubrir todo el portaobjetos con fucsina fenicada 4) Calentar suavemente con el mechero hasta la emisin de vapores. 5) El colorante no debe secarse ni hervir, aadir ms si es necesario. 6) Mantener la emisin de vapores durante 5 minutos. 7) Lavar con un chorro suave de agua. 8) Decolorar con alcohol cido 9) Lavar con agua 10) Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante un minuto. 11) Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 34 de 3
Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire Observar al microscopio con el objetivo de inmersin Las bacterias ZN+ o BAAR se observarn teidas intensamente de color rojo. Mycobacterium tuberculosis Tinciones Selectivas Las tinciones selectivas nos permiten observar estructuras de las clulas gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados Se pueden observar estructuras como la pared celular, cpsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depsitos de materiales de reserva de poli--hidroxibutirato, glucgeno y grnulos metacromticos Coloracin de esporas Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecacin, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas \"germinan\" y vuelven a generarse formas vegetativas. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tincin, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teir. Sin embargo, las endosporas se pueden teir aplicando calor a la preparacin previamente cubierta con una solucin de colorante que en la tcnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las clulas vegetativas y la aplicacin de un colorante de contraste permitir distinguir claramente a las esporas de color verde. Endosporas en las bacterias Coloracin de la cpsula Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cpsula. Est compuesta de azcares y protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencillsima, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color. Procedimiento Tcnico Mtodo de la tinta china para cpsula 1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla suavemente sin extender. 2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensin y se presiona suavemente evitando que queden burbujas. 3.-Observar inmediatamente al microscopio. 4.Desechar la preparacin en un recipiente con antisptico. La cpsula se observa como una gran estructura alrededor de la clula delimitada por los pequeos fragmentos de carbn de la tinta china. Cpsulas bacterianas 1. OBJETO El poder realizar una buena observacin microscpica nos dar un diagnostico, de una de las alteracin interna externa. ALCANCE Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 35 de 3
2.
Este procedimiento especfico se aplica para observacin microscpica las muestras de clientes, a analizar p aboratorio microbiolgico. As, este documento aborda los distintos aspectos a tener en cuenta al momento ecibir muestras de los interesados para ser analizadas por el laboratorio microbiolgico o por el laborato general de la firma Mag SRL. DEFINICIONES
3.
3.1 Observacin : DOCUMENTACIN DE REFERENCIA
4.
No corresponde. RESPONSABILIDADES
5.
1.1 nforme
Del Responsable de Laboratorio: Observar en el microscopio la preparacin para realizar e Del Personal de Laboratorio: Realizar la preparacin de la muestra para ser observada. DESARROLLO
1.2
6.
6.1. SEGURIDAD Este mtodo no entraa el uso de sustancias biolgicas peligrosas y procedimientos que pueden ocasionar un aumento del riesgo para quien los aplica. En caso de duda, consultar siempre con el asesor de seguridad competente.
6.1.1. Precauciones generales Se llevara en todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado, gafas y guantes de seguridad. Los analistas se conocern cualesquiera de los riesgos atribuibles a las sustancias que usan Se debern mantener cerca la hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso. La exclusin de otros compuestos de esta lista no implica que sean seguros. 6.1.2. Primeros auxilios.
Toda herida debe notificarse, todos los accidentes e incidencias se notificaran
6.2. ALCANCE Se basa en la observacin directa o despus de una centrifugacin del deposito por medio de un microscopio sob un porta objeto por observacin directa o por inmersin. 6.3. MUESTREO. Las drogas sern retiradas del droguero. Las muestras sern enviadas al laboratorio con todos los cuidados microbiolgicos de extraccin y en envases estriles, provisto por MAG o en envases del cliente. Confeccion: ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 36 de 3
6.4. MATERIALES Pizeta con agua destilada Algodn estril porta y cubre objetos tubo de centrifuga de 10ml cnico 6.4.1. Equipos 6.5. 1. INTERPRETACION DEL RESULTADO.
6.5.3. EQUIPAMIENTO UTILIZADO
Fotografa y esquema de un Microscopio de luz (M.L.)] Confeccion: bacterias ACANGI Director Tcnico laboratorio Revis: QUIROS Bromatlogo Laboratorio Aprob: SALVI socio Gerente Hoja: 37 de 3
6.5.4. RECUENTO CON CAMARA DE THOMA O NEUBAUER
6.5.4.1.PROCEDIMIENTO: El liquido que contiene las se agita vigorosamente, se toma 3 ml y se lleva a un tubo de ensayo, se le aade 1 ml de cido sulfrico (1 +99 ), despus de y homogenizacin buena se toma una gota y se carga la cmara, se debe hacer rpidamente . Leer en 16 cuadros en el cual no debe superarse las 20 clulas por cada cuadro, esto lo denominamos a, sino hacer diluciones, tener en cuenta esto Calculo: a X 10.000 x 4/3 .
Hoja: 38 de 3

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MANUAL MICROBIOLOGIA Revisin: 1 Fecha: 30/04/2.

009 CODIGO: MANUAL MICROB

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