LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PRACTICA N 1-2 Normas, tcnicas de cultivo asptico, materiales y equipos bsicos.

Tcnicas de estudio de los microorganismos; principios de microscopia. Caracterizacin micro y macroscpica. Grupo A: No 3 Fabian Muoz Danna Bolaos Ingrid Collazos Ingeniera Agroindustrial

1. FUNDAMENTO TERICO El estudio de las bacterias, virus, hongos y otros agentes infecciosos pueden ser patgenos para el hombre, los animales y otras formas de conformar riesgo que varan segn el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas de seguridad biolgica pretenden reducir a nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso y son muy rigurosas para los agentes ms peligrosos, se han establecido 4 niveles segn la patogenicidad de los microorganismos presentes en las muestras procesadas en el laboratorio. En el laboratorio de microbiologa todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de tal modo que se impida la contaminacin en el rea de trabajo. Los procedimientos utilizados para conseguirlo se conocen con el nombre de "Tcnica asptica", el objetivo de esta tcnica es evitar que el operador se contamine con las muestras y evitar que el cultivo se contamine con microorganismos procedentes del ambiente o del mismo operador, para cumplir estos objetivos se debe Trabajar siempre al lado de una llama. Esta llama crea a su alrededor una atmsfera estril y adems se utiliza para esterilizar o flamear parte del material que se utilizara durante la siembra. El aislamiento es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que lo acompaan, el mtodo ms usual es la siembra por estras en el cual se utiliza un asa bacteriolgica que se pasa por una porcin de la muestra a la superficie de un medio de cultivo a base de agar (existen medios de cultivos especficos para cada tipo de microorganismos). Para la obtencin de las colonias y la conservacin de los cultivos es esencial incubarlos y mantenerlos a una temperatura adecuada por ejemplo para las bacterias mesfilas 35c y para los mohos y levaduras 25c. 1.1 Microscopa Un microscopio, es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una

lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia. Su manejo es realmente sencillo y presenta una gama muy amplia de usos, existen microscopios tan sencillos como una lupa, o con accesorios sofisticados que funcionan con base en programas de computacin y tienen sistemas automatizados para el anlisis de las muestras, siendo hoy en da un instrumento indispensable en todo laboratorio de investigacin y enseanza de las ciencias. 1.2 Tcnicas de tincin Estas tcnicas nos permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos: Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina. Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina. Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: negro sudn. Las tinciones pueden ser: Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

1.3 Anatoma microbiana Las tcnicas de coloracin y estudio microscpico son tiles para identificar forma, tamao, agrupacin, comportamiento tintorial y la presencia de estructuras subcelulares, conocido como anatoma o citologa microbiana Formas bacterianas; redondas o esfricas (cocos agrupados), bastones (bacilos cortos, largos cadenas, fusiformes, flagelados), diplococos, estafilococos (agrupaciones irregulares de bacterias), tetrados (cuatro bacterias), sarcinas (ocho bacterias), espirios, vibriones y espiroquetas. Formas de hongos: esporas y conidias (estructura de reproduccin asexual), esporangios y conidiofoforos (producen esporas o conidias), multicelulares (hifas septadas), multinucleados, unicelulares-levaduras.

2. PROCEDIMIENTO

Figura 1. Diagrama de flujo Tincin de Gram

Figura 2. Diagrama procedimiento general de la prctica de laboratorio.

3. LOGROS Recordar manejo y funcionamiento del microscopio. Analizar las caractersticas macro y microscpicas que demuestran presencia de microorganismos. Conocer, identificar y describir las distintas formas de alguna bacteria y hongo. Conocer la importancia y aplicar las normas de bioseguridad en los laboratorios. Realizar siembras por superficie en medio solido. Aislar bacterias por siembra de estras. Caracterizar bacterias por sus colonias.

5. ANLISIS DE RESULTADOS Al realizar la siembra por estra en la caja de Petri AN y PDA, obtuvimos colonias separadas de individuos que proceden por divisin de nica clula, aunque el cultivo no fue del todo puro, ya que no realizamos aislamiento de un microorganismo en la mezcla de varios para la obtencin. En cuanto al crecimiento de ambos cultivos realizados en la prctica de laboratorio cabe decir que la proliferacin de los hongos se lleva a acabo a una mayor velocidad, esto es, en base a las colinas formadas que observamos al da siguiente de la siembra, claro est, que ello tambin depende de varios factores como:

El microorganismo en s. La composicin del medio de cultivo. Condiciones de incubacin. Procedencia y caractersticas del inoculo.

El distinto comportamiento en la Tincin de las bacterias Gram + y Gram - se piensa que es debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos de Clulas). Capas formadas por un menor contenido de lpidos y mayor de peptidoglicano en las Gram +, caso inverso en las Gram negativas, la composicin en dichas clulas permite la extraccin o no del complejo CV-I cuando se trata con alcohol. Existen ciertos inconvenientes de la Tincin que dificultan conseguir un resultado deseado estos son los errores del tcnico y/o la persona quien prepara o manipula la muestra. Para evitar dicha situacin es conveniente realizar una eleccin ideal de los reactivos y ser muy cuidadoso al ejecutar la tcnica. Los siguientes puntos son unas de las posibles fuentes de error: Impurezas en los reactivos de Tincin. Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin. pH inadecuado. El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si el pH no es el apropiado. Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros. Temperatura suficiente. La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas Gram +. Tiempo de Tincin incorrecto.

Nota: en cultivos de mayor edad, de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo CV-I.

Tabla 1. Descripcin de morfologa de bacterias Origen de la muestra: aguas residuales de industria lctea (en la cuidad de Popayn). Fecha de aislamiento: 27 de septiembre del 2012. Fecha de descripcin: 11 de octubre del 2012. Cdigo: AGROI N 3 Morfologa macroscpica Descripcin

En caja de Petri Medio: AN

Forma: puntiforme Elevacin: convexo Textura: cremosa. Pigmentacin: claro. amarillo

Superficie: lisa brillante. Luz traslucida. transmitida:

Luz reflejada: brillante

Generalidades encontradas en la literatura: Posible genero/grupo o Nombre Cientfico (si ya est clasificada)

Tabla 2. Descripcin morfologa de Hongos Origen de la muestra: hoja de planta, nombre vulgar (gloxinia), nombre comn (sinningia speciosa). Fecha de aislamiento: 27 de septiembre del 2012. Fecha de descripcin: 11 de octubre del 2012. Cdigo: AGROI N 3 Morfologa macroscpica Descripcin

En caja de Petri Medio: PDA

Forma: puntiforme. Elevacin: pulvinado. Textura: afelpada. Pigmentacin: oscuro. Topografa: lisa verde

Nota: el crculo rojo muestra la colonia de hongos con la que se trabaj. Generalidades encontradas en la literatura: Posible genero/grupo o Nombre Cientfico (si ya est clasificada)

En el laboratorio de microbiologa se desarrollaron ciertos procesos tanto para el hongo como para la bacteria, inicialmente se tom con ayuda de una cinta una muestra, la cual era esparcida sobre el portaobjetos que previamente tena una gota de azul de metilo para realizar la tincin y observacin en el microscopio. En cuanto a las caractersticas macroscpicas, observadas en el estereoscopio se encontr que el hongo, presentaba ramificaciones de color blanco que al observar directamente en la caja de petri pareca tener una textura (afelpado), el lugar donde se haba puesto la muestra, el hongo haba crecido hacia los lados y hacia arriba uno pocos milmetros (elevacin pulvinado), de forma irregular. Las caractersticas microscpicas: filamentos delgados y cortos.

Tabla 3. Morfologa microscpica del hongo. Morfologa microscpica Tipo de hifa: Tipo de conidias/esporas: Otras observaciones: Tincin empleada: Color sin tincin: Gram: Tincin empleada: Generalidades encontradas en la literatura: Posible genero/grupo o Nombre Cientfico (si ya est clasificada) Descripcin

6. CUSTIONARIO a.

b.

c. En qu aspectos fisicoqumicos y biolgicos se basa el proceso de coloracin celular? Por ejemplo la tcnica de tincin de gram se basa en la habilidad que tienen algunos microorganismos (bacterias gram positivas) para retener el complejo cristal violeta-yodo y las gram negativas no. Una de las explicaciones dadas, est relacionada con la naturaleza qumica de la pared celular de las bacterias gram positivas que previenen la remocin del complejo con el alcohol, debido a que su contenido en porcentaje de lpidos es menor que las gram negativas. Otra teora mantiene que la gruesa envoltura celular de las gram positivas, especficamente la capa gruesa de peptidoglucano, se deshidrata y al encogerse por el efecto del alcohol, ocasiona el cierre de los poros lo cual impide la salida del complejo cristal violeta-lugol. En definitiva la pared celular es la barrera para la decoloracin. Si se altera la pared celular de las bacterias gram positivas se transforman en gram negativas.

Figura 3. Esquema de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva

d. Tcnicas de tincin de esporas, capsulas y microorganismos acido resistentes. Tincin capsulas Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cpsula. Est compuesta de azcares y protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La deteccin de cpsulas en las bacterias tambin puede orientarnos en el diagnstico de laboratorio, y es especialmente importante en el diagnstico de meningitis producida por Cryptococcus neoformas. La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencillsima, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y

mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color. Existen otras tcnicas de tincin que ponen de manifiesto ms estructuras bacterianas. Es el caso por ejemplo de las tinciones de flagelos. No obstante no tienen demasiado inters desde el punto de vista del diagnstico, y suelen realizarse ms a menudo en investigacin bsica.

Figura 4. Tincin de capsulas. Tincin de esporas (wirtz-conklin) Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters. Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.

Figura 5. Tincin de esporas (wirtz-conklin) Tincin acido resistentes Tincin ZIEHL-NEELSEN (BAAR) (microorganismo acido resistentes)

Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos con alcohol cido si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. A estos microorganismos se denominan cidoalcohol resistentes. Una vez realizada la decoloracin con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las clulas sensibles a la decoloracin con alcohol cido. Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la composicin de su pared celular (tiene cidos miclicos). Esta tincin tiene inters desde el punto de vista del diagnstico clnico puesto que algunos microorganismos patgenos son cido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra). e. Caractersticas, aplicaciones y alcances de microscopios de luz, electrnicos de transmisin, electrnico de barrido y de fluorescencia.

Microscopio de luz

Figura 6. Microscopio ptico o de luz

Es una de las herramientas bsicas de un laboratorio de Microbiologa es un microscopio de luz. Caractersticas: permite el paso de luz no alterada a travs de un sistema de lentes de manera de producir un campo brillante donde se pueden observar pequeos objetos. El

microscopio de luz es un aparato ptico usado para amplificar y resolver detalles finos de un objeto microscpico. Est compuesto de diferentes partes: mecnica, ptica y de iluminacin. Parte mecnica: a. b. c. d. e. f. g. h. i. Base o pie Columna Tubo Brazo Platina Pinzas Revolver Tornillo macromtrico Tornillo micromtrico Parte ptica: a. Oculares b. Objetivos Sistema de iluminacin: a. b. c. d. Fuente de luz Espejo Condensador Diafragma

Aplicaciones: observar y estudiar microorganismos como bacterias, hongos, algas, parsitos, etc. Alcances: un buen ocular (10 X) puede permitir un aumento total de 1000 x. Microscopio electrnico de transmisin: es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. Caractersticas: uso de una muestra ultra fina y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la muestra. Estructura: Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son:
a. b. c. d. e.

Can de electrones. Lentes magnticas Sistema de vaco Placa fotogrfica o pantalla fluorescente Sistema de registro

Aplicaciones: la principal funcin del microscopio electrnico de transmisin es estudio de los metales y minerales y el estudio de las clulas a nivel molecular. Siendo as un papel muy importante en la industria de la metalurgia. A su vez se utiliza en la microbiologa, para observar la estructura de los virus. Tambin es usado en Anatoma patolgica, para diagnosticar partiendo de la ultra estructura celular.

Alcances: los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

Microscopio electrnico de barrido

Figura 6. Microscopio electrnico de barrido. Es aquel que utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen. Tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. Tambin produce imgenes de alta resolucin, que significa que caractersticas espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificacin. Caractersticas: Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV o una imagen digital. Su resolucin est entre 4 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metlicamente antes de su observacin. Solamente pueden ser observados organismos muertos, y no se puede ir ms all de la textura externa que se quiera ver. Slo pueden ofrecer imgenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz. Permite la observacin y caracterizacin superficial de materiales inorgnicos y orgnicos, entregando informacin morfolgica del material analizado. A partir de

l se producen distintos tipos de seal que se generan desde la muestra y se utilizan para examinar muchas de sus caractersticas.

Aplicaciones: Son ampliamente utilizados en la biologa celular. Alcances: permite una menor capacidad de aumento que el microscopio electrnico de transmisin siendo, pero, es capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV o una imagen digital. Su resolucin est entre 4 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Microscopio de fluorescencia

Figura 7. Microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia es una variacin del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y remitido una luz con mayor longitud de onda. Caractersticas: la fuente luminosa (lmpara de mercurio o halgena) debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin de la misma forma en que lo hace un microscopio ptico comn. La luz de iluminacin (excitacin) no est involucrada en la formacin de la imagen. En este sentido la microscopa de fluorescencia difiere de la microscopa normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminacin. Aplicaciones: 1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por molculas de la muestra misma. Fluorescencia inducida: Partes especficas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante mtodos de tincin.

2.

Ejemplo: substancias especficas como organelos celulares, protenas, anticuerpos, DNA, RNA, etc. 3. Sobre objetos bastante ms pequeos que la limitacin del poder de resolucin, siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa.

Ejemplo: molcula de DNA, un virus.

7. CONCLUSIONES Las bacterias difieren mucho qumicamente, y es esta diferencia la que permite distinguir bacterias por tincin, ya que generalmente el colorante reacciona con la clula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior. La tincin es importante en la microbiologa porque proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfolgicos. Tambin permite el estudio de las estructuras internas de la clula bacteriana, tales como paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares, y finalmente permite el empleo de mayores amplificaciones. Aunque la tincin de clulas es una tcnica muy utilizada en la microscopia ptica, presenta el inconveniente de que mata a las clulas y puede alterar sus propiedades morfolgicas. Los caldos de cultivos nutritivos con gelatina constituan un buen medio para el aislamiento y estudio de la bacteria, aunque este medio nutritivo fue reemplazado por el Agar (polisacrido derivado de algas rojas) que presentaba mejores propiedades como solidificante, a diferencia de la gelatina que no permaneca solida a 37 C (permaneca liquida hasta 45 C) y adems de ello, el Agar no es degradado por la mayora de microorganismos.

La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. El aceite de inmersin es usado porque tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.

8. BIBLIOGRAFA [1] BROCK. Biologa de los microorganismos. Duodcima edicin. Pearson ED, S.A. Madrid Espaa. 2009. Pg. 19, 20, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37. [2] http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos%20e n%20Linea/Apuntes/2_microscopia.pdf [3] http://www.acuanatura.com/cursosonline/tiposdemicroscopios/tiposdemicroscopios. pdf [4] http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morf olog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.pdf