Universidade Federal de Sergipe Centro de Cincias Biolgicas e da Sade Departamento de Fisiologia

Manual das aulas prticas de Bioqumica

Professor: Paulo de Tarso Gonalves Leopoldo Roberta P. Miranda Fernandes

So Cristvo, 2009

Sumrio
1. Medidas de segurana, vidraria de laboratrio e normas para elaborao de relatrio. 2. Uso de pipetas e medidas de volume utilizadas em bioqumica 3. Preparo de solues 4. A qumica de pH e tampes 5. Espectrofotometria 6. Determinao da concentrao de protenas pelo mtodo do Bradford

Introduo ao laboratrio de Bioqumica Objetivos:

o Desenvolver habilidades para manipulao de reagentes e equipamentos utilizados em Bioqumica; o Reconhecer por meio das reaes efetuadas algumas das propriedades qumicas das biomolculas; o Ler intrues, execut-las e interpretar resultados experimentais.

Execuo dos experimentos

Antes das aulas prticas ser feita uma exposio do assunto. Pede-se que o estudante leia e estude o manual das aulas prticas em casa, toda semana antes de vir para a aula prtica. Caso contrrio executar os experimentos mecanicamente, sem entende-los acarretando um baixo aproveitamento na aula prtica. Anote os dados experimentais num caderno protocolo. o Anote dados como temperatura em que o experimento foi executado, pH das solues, assim como concentrao e volumes utilizados. o Anote alteraes de cor, formao de precipitados e tempo necessrio para ocorrer o fenmeno. o Anote os resultados, preferencialmente em tabelas curtas. o Faa uma discusso final sobre a prtica executada.

Reagentes
o Ao iniciar uma experincia verifique se a concentrao da soluo dada em porcentagem, molaridade ou normalidade. o Verifique a temperatura a ser executada e ordem de adio dos reagentes. o Aps uso o reagente deve ser recolocado no seu lugar para que outro colega possa utiliz-lo. o Cuidados a serem tomados com os reagentes e solues, a fim de evitar estragos e contaminaes: 1) No trocar tampas; 2) No introduzir pipetas sujas;

Material do estudante
Cada estudante dever trazer para a aula prtica: o Avental. No ser permitido assistir a aula sem o avental. o Manual de aulas prticas. o Caderno protocolo. o Pincel atmico para marcar a vidraria. o Lpis, borracha, rgua e papel milimetrado.

Execuo dos trabalhos prticos e limpeza

o Para a execuo de trabalhos prticos exige-se ateno, rigor tcnico, responsabilidade e disciplina. o Para maior eficincia necessrio que o aluno seja pontual, assduo, ordeiro, asseado e tenha o prvio conhecimento terico da prtica a ser executada. o Clculos e anotaes devem ser efetuados no caderno de protocolo. o Ao finalizar os trabalhos prticos, o aluno dever proceder a limpeza do seu local de trabalho, deixando-o limpo em condies de ser usado novemente. o A vidraria usada deve ser colocada em bacias localizadas nas oias do laboratrio.

1a Prtica
Medidas de segurana, vidraria do laboratrio e regras para elaborao do relatrio
1. Objetivos: Identificar medidas de segurana no laboratrio; Identificar e nomear a vidraria de uso corrente no laboratrio, correlacionando-as s suas respectivas funes. Elaborar relatrios das aulas prticas.

2. Normas gerais e medidas de segurana no laboratrio Trate educadamente todas as pessoas que freqentam o laboratrio, comportamentos como este, tornam a convivncia mais fcil e agradvel; No ser permitido fumar no laboratrio, por causa das substncias inflamveis em uso ou em estoque, e tambm pelo respeito aos no fumantes; O uso de jaleco obrigatrio, pois esta vestimenta protege a sua pele e a sua roupa, do contato de substncias que podem respingar sobre voc, causando queimaduras, como as substncias corrosivas, manchas na sua roupa, como os corantes, etc; indispensvel o seu roteiro para acompanhar as aulas prticas, bem como a leitura da prtica com antecedncia, para obter um melhor aproveitamento das aulas; Procure conhecer os reagentes qumicos usados no laboratrio, isso evitar acidentes. Assim, antes de trabalhar com algum reagente que voc no conhea, procure ler seu rtulo ou tire dvidas com o professor, ou consulte livros especializados, como o Index Merck, que uma enciclopdia dos reagentes qumicos; Siga sempre as instrues do roteiro e do professor, poupa tempo e material e mais seguro; Procure conhecer o nome e a funo do material permanente (vidraria e equipamentos) em uso no laboratrio; Mantenha sua bancada sempre limpa e no final da prtica descarte o material perecvel. No jogue resduos slidos nas pias. Os lquidos usados nos experimentos devem ser despejados na pia com a torneira aberta, bem prximo ao ralo. Isso facilita a diluio e escoamento, evitando assim o risco de corroso dos canos; Prximo a chamas, nunca abra nem deixe frascos contendo substncias inflamveis (ter, acetona, lcool clorofrmio, etc). substncias inflamveis devem ser aquecidas em banho-maria ou chapa eltrica. Nunca as exponha a chama direta; Nunca leve as mos boca ou aos olhos quando estiver manuseando produtos qumicos; Evite o contato de qualquer substncia com a pele, seja particularmente cuidadoso quando manusear substncias corrosivas, como cidos e bases concentrados; Evite encostar-se em pias e bancadas, pois resduos de lquidos corrosivos podem causar danos pele e vestimenta; No se deve usar lentes de contato no laboratrio, pois se alguma substncia qumica respingar no seu olho, a possibilidade da leso causada ser

aumentada, j que se ter dificuldade em manter o olho aberto para que seja feita sua limpeza; Rotule imediatamente qualquer reagente ou soluo preparada, isso evita dvidas ou desperdcios na hora de realizar os experimentos; Nunca retorne aos frascos restos da soluo que deles foram retirados , pois voc pode contaminar o reagente original; Antes de usar uma pipeta, certifique-se de que ela esteja limpa; No use a mesma pipeta para pipetar solues diferentes, isso evita a contaminao dos reagentes; O uso de pipetas absolutamente individual. Aps o uso, elas devem ser depositadas com o bocal virado para baixo nas provetas (contendo uma soluo detergente), distribudas ao longo das bancadas; Nunca cheire diretamente qualquer frasco, diversos reagentes do laboratrio so txicos ou nocivos, muitos podendo mesmo causar srios danos as mucosas nasal, ocular e oral. Muitos compostos em uso no laboratrio podem comprometer o sistema respiratrio; Antes de retirar uma soluo de um frasco, agite-o suavemente para homogeneizar o contedo; A tampa do frasco no deve ser colocada sobre a bancada, pois poder ser contaminada com alguma substncia que tenha respingado sobre ela. Segure-a numa das mos e recoloque-a no frasco imediatamente aps a retirada do material; Tendo qualquer dvida, solicite ao professor os devidos esclarecimentos; Acostume-se a ter apreo pelas coisas pblicas, pois elas so um patrimnio da comunidade; Finalmente lembre-se de que o laboratrio um lugar em que se desenvolvem trabalhos srios e no um ambiente para brincadeiras ou bate-papos . Tenha conscincia desse comportamento no s para o laboratrio de Bioqumica, mas em qualquer laboratrio que voc venha a freqentar durante seu curso universitrio e carreira profissional. 2.1 Socorros de emergncia Em qualquer acidente no laboratrio, identifique a causa e procure imediatamente assistncia mdica. a) Substncias qumicas nos olhos: Soluo alcalina (bsica): lavar imediatamente com bastante gua e depois com soluo saturada de cido brico 2% ou de cido pcrico 1%. Soluo cida: lavar abundantemente com gua e depois com uma soluo de cido brico 2%. O cido brico usado em queimaduras por causa de suas aes bactericida e fungicida. b) Queimaduras: Pelo calor: tratar a queimadura com lcool ou com soluo de cido pcrico 1%. Por cidos: lavar rapidamente com uma soluo de bicarbonato de sdio 5% e depois com gua.

Por bases: lavar rapidamente com uma soluo de cido actico 5% ou cido brico 2% ( gua boricada) e depois com gua. Estas regras de segurana no devem ser vistas como um manual de proibies, mas como orientaes que devem ser observadas para um melhor desempenho do aluno no laboratrio. 3. Vidraria de laboratrio de fundamenta importncia para quem trabalha em laboratrio distinguir e usar convenientemente cada vidraria. A vidraria de laboratrio pode ser usada para armazenar material slido ou lquido, preparar solues, fazer reaes, medir lquidos, etc. Quanto a exatido ou no de suas medidas, a vidraria pode ser de dois tipos , a saber: as que so calibradas para transferir um certo volume, aproximado, mas no exato ( exibem a sigla TC, to contain, gravada no vidro) e as que so calibradas para transferir volumes dentro de certos limites de exatido (exibem a sigla TD, to deliver , gravada no vidro). Qualquer vidraria apresenta o problema da aderncia do fludo nas suas paredes internas, mesmo estando limpa e seca. Por isso, um frasco construdo para conter um determinado volume de lquido (TC), sempre escoar um volume menor. A vidraria do tipo (TD) tem seu volume corrigido para a aderncia do fluido, e por essa razo, escoar o volume indicado. Ainda assim necessrio saber que a quantidade do lquido escoado por essa vidraria depender, principalmente, da sua forma, de sua limpeza, do tempo de escoamento, da viscosidade e da tenso superficial do lquido. Antes de passarmos ao conhecimento dos recipientes de vidro do laboratrio, necessrio conhecer o significado de trs termos freqentemente aplicados a eles, quais sejam, calibrado, volumtrico e graduado. Calibrado um termo que indica a capacidade mxima de volume que uma vidraria capaz de medir. Volumtrico refere-se a capacidade da vidraria de fazer medidas de volumes exatas. Pipetas volumtricas e balo volumtrico so exemplos de recipientes volumtricos. Graduado indica a marcao da frao de volume ao longo da vidraria. Pipetas graduadas, provetas, buretas, beckers e erlenmeyers so exemplos de vidraria graduada. 3.1 Os recipientes mais comumente usados no laboratrio so: Becker - copo de vidro graduado ou no, de vrios tamanhos. O becker tem funes diversas como preparar solues, pesar substncias slidas, etc. O becker no uma vidraria de medida exata, por isso no deve ser usado para fazer medidas precisas de volume. Balo volumtrico - vidraria volumtrica, possui a forma de uma pra, um fundo chato, um gargalo longo e provido de uma tampa de vidro esmerilhada ou de teflon. O gargalo apresenta um trao fino gravado na sua parte superior, que indica at onde o nvel do lquido deve ser elevado para completar o volume da soluo. usado tanto na preparao de solues de concentrao conhecida como na diluio de solues j preparadas.

Erlenmeyer - frasco de vidro de forma cnica, com gargalo, graduado ou no. usado em titulaes, agitao e aquecimento de lquidos; a sua forma evita respingos. Pipeta - tubo de vidro graduado de dimetro reduzido e tamanhos variados, com bico e bocal. utilizada para medir e transferir pequenos volumes de lquidos, ou seja, pipetar. Proveta - cilindro de vidro graduado, com p. encontrada em tamanhos diversos e serve para medidas exatas de lquidos. Tubo de ensaio - tubo de vidro de tamanhos variados, fundo redondo ou chato. Alguns possuem tampa rosqueada. utilizado para fazer reaes em pequena escala, ensaios biolgicos e cultura de microrganismos. Kitassato ou kitazato - frasco cnico de vidro, com paredes espessadas e gargalo com sada lateral. usado em filtrao a vcuo. Vidro de relgio - tipo de "pires" cncavo, de vidro, de diversos tamanhos. usado para pesar substncias, receber pequenos organismos e rgos. Frasco estoque - frasco de vidro ou de plstico, com tampa esmerilhada ou no. Serve para guardar substncias qumicas e solues; pode ser claro ou escuro ( este ltimo adequado para as substncias e solues fotorreativas). Funil de vidro ou de plstico - Serve para filtraes simples e transferir lquidos de um recipiente para outro. Basto de vidro - haste de vidro usada para agitar solues e auxiliar na transferncia de lquidos de um recipiente para outro. Placa de Petri - tipo de prato, de vidro ou de plstico transparente que encaixa com outro um pouco maior. usada para cultivar microrganismos e em preparaes histolgicas. Funil de separao - Utilizada para separar lquidos no miscveis. Gral e pistilo - Recipiente e macerador de porcelana. Servem para pulverizar ou macerar slidos e preparar pastas. Bureta - Tubo de vidro graduado provido de uma torneira para escoamento controlado do lquido. Serve para medir lquidos com preciso e usado em titulaes. 4. Classificao dos reagentes qumicos quanto ao risco que oferecem no manuseio Corrosivos - substncias que em contato com os materiais de tubulaes, equipamentos e com o tecido vivo (pele, mucosas) exercem uma ao destrutiva. Precauo: ao manipular reagentes corrosivos deve-se evitar o respingo deles em sua vestimenta, pele e olhos. Os reagentes corrosivos so representados por um smbolo de

um cido ativo. Exemplos: Hidrxido de sdio, cido fosfrico, cido sulfrico, cido clordrico. Inflamveis - substncias que em temperatura ambiente, podem entrar e combusto espontaneamente em contato com o ar. Em geral emitem gases e vapores. Precauo: ao trabalhar com esse tipo de substncia deve-se evitar contato com materias ignitivos (ar, gua). As substncias Inflamveis so representadas por uma chama ou letra F. Exemplos: Hexano (solvente de extrao), etanol, acetona, etc. Explosivos - substncias muito sensveis ao fogo, ao calor e frico (choques, atritos). Ao trabalhar com esses reagentes deve-se evitar batida, empurro, frico, fasca e calor Exemplos: nitroglicerina metano, propano, butano, etc. Comburente so as substncias que podem acender ou facilitar a combusto, impedindo o combate ao fogo. Ao manipular esses reagentes deve-se evitar o contato deles com materiais combustveis. Exemplos: oxignio, nitrato de potssio, perxido de hidrognio, etc. Irritantes substncias no corrosivas que, por contato imediato, prolongado ou repetido com a pele ou com as mucosas, podem provocar uma reao inflamatria. Precauo: Os gases no devem ser inalados, quanto aos lquidos deve-se evitar respingos dessas substncias com a pele e olhos. As substncias irritantes so representadas por uma cruz de Santo Andr ou pelas letras X i, Exemplos: Cloreto de clcio, carbonato de sdio, formol, etc. Nocivo - substncias que por inalao, ingesto ou penetrao atravs da pele, podem produzir doenas. Precauo: deve ser evitado o contato dessas substncias com o corpo humano, assim como sua inalao. As substncias nocivas so representadas por uma cruz de Santo Andr ou pelas letras Xn. Precauo: Deve-se evitar qualquer contato dessas substncias com o corpo humano. Exemplos: Clorofrmio, etanal, diclorometano, cloreto de potssio, etc. Txico - so aquelas substncias qumicas que, em determinadas concentraes podem causar danos graves sade, podendo inclusive levar uma pessoa morte. Precauo: Deve-se evitar qualquer contato dessas substncias com o corpo humano. A representao por pictograma de uma caveira sobre tbias cruzadas ou pela letra T. Ex. Metanol, cloreto de brio, monxido de carbono, etc. Perigosa para o ambiente so os reagentes que liberados no meio ambiente, podem provocar danos a curto ou longo prazo. Precauo: devido ao seu risco em potencial, no deve ser liberado em encanamentos, no solo ou no ambiente. Tratamentos especiais devem ser tomados. A representao por pictograma uma cena mostrando um ambiente degradado em que se v peixe e rvore mortos. A letra N representa esse risco Exemplos de reagentes que oferecem riscos ao ambiente benzol, cianureto de potssio, o inseticida lindan (hexaclorociclohexano), etc. 4.1 Smbolos de segurana utilizados em reagentes de laboratrio A identificao do grau de risco de um reagente deve ser feita tanto por seus nomes como pelos smbolos, como descrito acima, e ambos descritos em etiquetas ou rtulos dos reagentes. Os smbolos de risco so pictogramas representadas em forma

quadrada, impressos em preto e fundo laranja-amarelo, utilizados em rtulos ou informaes de produtos qumicos. Eles servem para lembrar o risco do manuseio do produto, representando nos pictogramas os primeiros sintomas com o contato com a substncia. Tabela 1 representao com pictogramas e letras dos riscos de reagentes de laboratrio Risco Corrosivo Pictograma Letra C

Inflamvel

Txico

Irritante

Xi

Nocivo

Xn

Explosivos

Comburentes

Perigosa para o ambiente

10

(4) (3) (1) (2)

(6) (5) (7) (8) (9)

(10)

11

(11) (12) (13) (14)

(15)

Figura 1 Vidraria comum no laboratrio de Bioqumica. 1- Grau e pistilo; 2Pregador ou pina de madeira; 3- Balo de fundo chato; 4- Balo volumtrico; 5Becker; 6- Bureta; 7- Erlenmeyer; 8- Suporte para tubos, bancada ou grade; 9- Proveta; 10- Tubo de ensaio; 11- Funil de Buchner;12- Funil de vidro; 13- Pisseta; 14- Vidro de relgio; 15- Suporte.

5. Normas para redao do relatrio de aulas prticas de bioqumica A elaborao de um relatrio uma etapa de importncia crucial no trabalho cientfico, pois ele relata os resultados finais do trabalho, quer seja de um estudo de levantamento bibliogrfico, de pesquisa laboratorial, etc. Dever ser um relato completo que possa permitir a qualquer pessoa que o leia adquirir uma viso global do estudo realizado, proporcionando uma consulta fcil e fornecendo de modo objetivo a informao mais relevante. A forma para se redigir o relatrio deve ser respeitada, uma vez que a avaliao do mesmo feita de acordo com esta orientao. Assim todo relatrio devera conter os seguintes itens: 5.1 Capa Esse item dever conter um cabealho, em que se identifica a universidade, o departamento e a disciplina. No centro da pgina o ttulo da prtica e alguns espaos abaixo do ttulo o nome do aluno. Na margem inferior desta pgina deve conter o local e ano, sem qualquer necessidade de especificar dia e ms. A capa desse manual de bioqumica oferece um bom modelo de como deve ser esta capa.

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5.2 Objetivos o item do relatrio que descreve de forma precisa as metas a que a prtica pretende atingir. 5.3 Introduo Esse item deve conter informaes tericas sobre o assunto da aula do laboratrio explorando vrias literaturas que devem ser citadas a medida em que so usadas no texto atravs de nmeros ou por nome dos autores e relacionadas no item Referncias Bibliogrficas. Devem-se usar referncias no texto sempre que se cita ou se usa resultados de outros autores. A referncia deve ser referenciada apenas pela sua indicao, sem explicitar a palavra referncia, exceto quando se usam referncias numricas e se est no incio de uma frase: No meio de uma frase, referencia-se assim [4], sem citar o autor ou a palavra referncia. A referncia [3], no entanto, mostra que h casos em que se precisa explicitar a palavra referncia. 5.4 Materiais e mtodos Descrever os materiais utilizados na prtica, quais sejam: a vidraria, os regentes, material biolgico e os equipamentos. Neste item descreve-se de forma detalhada os procedimentos executados na realizao da prtica. Essa descrio deve ser precisa, de forma que algum que veia a ler o que est escrito seja capaz de repetir a prtica 5.5 Resultados e discusso: O item resultados parte do relatrio em que se apresenta de forma concisa os resultados obtidos nos experimentos prticos. Os resultados podem ser apresentados em forma de texto descritivo, figuras, tabelas ou grficos. Eles so numerados seqencialmente e em seguida discutidos. Quando possvel os resultados experimentais obtidos devem ser comparados com dados de literatura e suas diferenas (quando houver) discutidas. Uma boa discusso necessita de bases tericas (pode-se utilizar referncias bibliogrficas) e devem ser relacionadas aos resultados obtidos avaliando a prtica com relao aos objetivos propostos. Um erro freqentemente cometido na discusso repetir dados tericos constantes da introduo. A discusso exige que os seus dados sejam comparados ao de outros grupos de pesquisa, publicados na literatura, o que dessa forma enriquece os seus resultados. Em diversos trabalhos cientficos como artigo cientfico, dissertao, tese, a discusso um item parte. 5.6 Concluso: Nesse item deve-se destacar de modo claro e objetivo as concluses que puderam ser observadas da aula pratica. . Muito comumente a concluso vem descrita na forma de itens. Ateno, a concluso no deve ser confundida com um resumo dos resultados do trabalho.

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5.7 Referncias bibliogrficas: Nesse item se deve mencionar toda a bibliografia consultada, descrita de acordo com as normas da ABNT. Os exemplos abaixo descrevem como deve ser feita a referncia bibliogrfica. Como citar referncias de artigos de peridicos, revistas cientficas: Descreve-se primeiro os nomes dos autores pelos ltimos sobrenomes, seguidos das iniciais dos primeiros nomes e dos sobrenomes intermedirios. Escreve-se em seguida o ttulo do artigo e em seguida o nome abreviado da revista, o ano da publicao, nmero do volume e as pginas do artigo. Costa VP, Vasconcelos JP, Comegno PEC, Jose NK. O uso de mitomicina C em cirurgia combinada. Arq Bras Oftalmol 1999;62:577-84. Como citar referncias de livros: Descreve-se o nome do autor pelo ultimo sobrenome, seguido das iniciais do primeiro nome e dos sobrenomes intermedirios. Escreve em seguida o ttulo do livro, logo aps o nome da cidade de publicao e a editora, seguido do ano da publicao. Bicas HEA. Oftalmologia: fundamentos. So Paulo: Contexto; 1991. Captulos de livros. Descreve-se o nome dos autores pelos ltimos sobrenomes, seguidos das iniciais dos primeiros nomes e dos sobrenomes intermedirios. Em seguida o ttulo do livro, logo aps o nome da cidade de publicao e a editora, seguido do ano da publicao e das pginas do captulo. Gmez de Liao F, Gmez de Liao P, Gmez de Liao R. Exploracin del nino estrbico. In: Horta-Barbosa P. editor. Estrabismo. Rio de Janeiro: Cultura Mdica; 1997. p. 47-72. Documentos Eletrnicos: Monteiro MLR, Scapolan HB. Constrio campimtrica causada por vigabatrin. Arq Bras Oftalmol [peridico online] 2000 [citado 2001 Jan 31]; 63(3): [9 telas]. Disponvel em: URL: http://www.cbo.com.br/abo/abo63511.htm

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2a Prtica Uso da pipeta e medidas de volume usadas em bioqumica

1. Objetivos: Familiarizar o aluno com os diversos tipos de pipetas usadas no laboratrio; Diferenciar pipetas graduadas ao dcimo de pipetas graduadas ao centsimo; Utilizar a tcnica correta no uso de pipetas; Conhecer as medidas de volume utilizadas no laboratrio em Bioqumica.

2. Fundamentao terica: Uma das tcnicas mais comumente utilizadas nos laboratrios, a de pipetar lquidos, ou seja, fazer transferncias quantitativas de lquidos de um recipiente para outro, utilizando a pipeta. Sendo indispensvel o domnio dessa tcnica no laboratrio, importante conhecer seus princpios, para um melhor desempenho das atividades laboratoriais. As pipetas so tubos de vidro com as extremidades afiladas, em que se recolhe, por suco, um lquido, para medir-lhe com exatido o volume. Se a transferncia de um volume especfico e acurado necessria, algum tipo de pipeta calibrada deve ser usada. As pipetas calibradas so de dois tipos a saber, volumtrica e graduada. 3. Pipetas volumtricas. So tubos de vidro expandido cilindricamente na parte central. Elas no so graduadas e trazem a marca de calibrao gravada na sua parte superior, acima do bulbo (s vezes essa marca vem gravada no bulbo). So utilizadas para transferncia de volumes especficos, em ensaios em que se necessitam de medidas precisas de volumes. Essas pipetas podem transferir volumes em mililitros de: 1, 2 , 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 e 100 mL. Para usar essa pipeta, deve-se introduzi-la no recipiente que contm o lquido a ser transferido. Faz-se a suco com a boca ou com um dispositivo de segurana ( pra ou bulbo de suco), a depender da substncia que se vai pipetar, preenchendo-a com o lquido at 2 ou 3 cm acima da marca 0(zero), gravada na extremidade superior da pipeta. Deixe o lquido em excesso escorrer at o menisco chegar a essa marca. Prenda a extremidade superior da pipeta com seu dedo indicador para o lquido no escoar. Seque a ponta da pipeta com um pedao de papel limpo (leno de papel), leve-a para o recipiente em que se deseja transferir o lquido. Para deixar o lquido escorrer basta afrouxar o dedo indicador que obstrui a extremidade superior da pipeta. Toque a ponta da pipeta no interior do recipiente, para que a ltima gota escorra. Algum lquido pode ficar ainda na ponta da pipeta, mas no necessrio sopr-la, pois a maioria das pipetas volumtricas vem calibrada como TD (to deliver), que significa que o volume transferido j vem corrigido para essa quantidade que resta na pipeta. O tempo de escoamento do lquido de 5 a 10 segundos. 4. Pipetas graduadas. So tubos cilndricos com uma escala numerada por todo o tubo, de cima a baixo, at a sua capacidade mxima.. Podem ser tambm usadas para

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transferir fraes de seu volume total. As pipetas graduadas so de dois tipos: Pipeta de Mohr e pipeta sorolgica. 4.1 As pipetas de Mohr so encontradas de duas formas a saber, as de ponta longa e as de ponta curtas. As de pontas longas so teis em transferncia de volumes de um frasco de abertura estreita para outro de igual forma. Todas as pipetas de Mohr so TD e tm capacidade para transferir lquidos de: (0,1-10,0mL). Elas podem ser graduadas ao dcimo ( as subdivises so 0,1) ou ao centsimo ( as subdivises so 0,01). A escolha do tamanho da pipeta fundamental. Por exemplo, no tente pipetar 0,2 mL com uma pipeta de 5 ou 10 mL graduada ao dcimo. Para pipetar volumes entre 0 e 1mL, deve-se usar pipetas de 1mL graduada ao centsimo. Para pipetar volumes entre 1e 2 mL, deve-se usar pipetas de 2 mL graduada ao centsimo. Para pipetar volumes entre 2 e 5 mL, deve-se usar pipetas de 5 mL graduada ao dcimo. Para pipetar volumes entre 5 e 10 mL, deve-se usar pipetas de 10 mL graduada ao dcimo. O lquido no interior da pipeta forma menisco. A leitura deve ser feita na parte inferior do menisco e na altura dos olhos.(ver figura ) O uso da pipeta de Mohr idntico ao da pipeta volumtrica. Para preench-la com lquido, deve-se introduzi-la no recipiente que contm o lquido a ser transferido. Faz-se a suco com a boca ou com um dispositivo de segurana ( pra), a depender da substncia que se vai pipetar, preenchendo-a com o lquido at 2 ou 3 cm acima da marca 0 (zero) gravada na extremidade superior da pipeta. Deixe o lquido em excesso escorrer at o menisco chegar a essa marca. Prenda a extremidade superior da pipeta com seu dedo indicador para o lquido no escoar. Seque a ponta da pipeta com um pedao de papel limpo (leno de papel), leve-a para o recipiente em que se deseja transferir o lquido. Para deixar o lquido escorrer basta afrouxar o dedo indicador que obstrui a extremidade superior da pipeta. No preencha a pipeta de forma que a soluo medida ultrapasse a ltima marca graduada na parte inferior da pipeta. Para que a ltima gota escorra, no necessrio soprar. Toque a ponta da pipeta no interior do recipiente. 4.2 Pipetas sorolgicas. so graduadas at a ponta da pipeta. So encontradas na forma TD, que no precisam ser sopradas no final da titulao e na forma TC, calibrada para ser soprada no final da pipetagem. Para preench-la com o lquido deve-se usar o mesmo procedimento usado na pipeta de Mohr. Se a pipeta no for TD, deve-se deixar escoar o lquido que restou na pipeta e soprar aps 15 a 20 segundos do lquido ter escorrido. 5 Pipetas Pasteur. Utilizadas para transferncia no quantitativa de uma pequena quantidade de volume de lquido( 1 a 10mL) de um recipiente para outro. As pipetas Pasteur so disponveis em dois tamanhos ( 15 e 23cm). Elas transferem cerca de 2 mL, sendo conveniente para transferncia de quantidades no medidas de um tubo de ensaio para outro. Como as pipetas Pasteur tm uma ponta de vidro muito longa e fina, conveniente usar uma proteo de borracha nela para evitar que ela se quebre. Deve-se usar tambm uma pra no bocal para fazer a suco e o escoamento do lquido. 6. Pipetas automticas. Utilizadas em transferncias quantitativas de lquidos, principalmente transferncias idnticas de pequenos volumes. Essa pipeta permite transferncias acuradas, precisas e rpidas de volumes de 1 a 10.000l. As pipetas automticas podem ser de dois tipos: 6.1 Volume fixo. Calibradas para medir um volume determinado. Por exemplo um pipeta de 10l s ir medir 10l.

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6.2 Volume ajustvel Calibradas para medir volumes variveis, dentro de uma faixa pr-determinada. Por exemplo uma pipeta de 200l usada para se medir volumes de 20l a 200l. 7. Uso da pipeta automtica Para pipetar lquidos com uma pipeta automtica necessrio acoplar uma ponteira de plstico (tip) na parte inferior da pipeta e pressionar o mbolo localizado na parte superior da pipeta quando ela estiver imersa no recipiente contendo o lquido que se vai pipetar. O mbolo deve ser apertado de uma s vez para a suco do lquido. Durante a suco solta-se lentamente o boto. Para transferir o lquido pipetado da ponteira para um tubo de ensaio, por exemplo, deve-se pressionar o mbolo mais uma vez, at sentir que ele chega a um obstculo. Dessa forma o lquido vai escoar da ponteira para o tubo de ensaio. 8. Medidas de segurana no uso de pipetas O uso do bulbo de suco (ou pra) no necessrio para pipetar substncias inofensivas sade, como por exemplo, uma soluo de NaCl 0,15M. Nesses casos, o lquido pode ser aspirado com a boca. Entretanto, como precauo e por uma questo de hbito, deve-se incentivar o uso do bulbo de suco nas prticas de laboratrio. H situaes em que o uso de um dispositivo de segurana indispensvel quando for usar a pipeta, por isso deve se usar uma pra ou uma pipeta automtica quando estiver trabalhando com as seguintes substncias: 1. Lquidos biolgicos que oferecem riscos de contaminao como por exemplo, o sangue de animais e urina, quando ingeridos. 2. cidos e bases fortes, pois so corrosivos, e quando aspirados pela boca pode causar leses no trato digestivo, se ingeridos. Exemplo: H2SO4 98% , HCl 38%, NaOH, KOH, etc. 3. Metais pesados, como o chumbo, mercrio, entre outros, podem causar intoxicao, quando ingeridos. Exemplo : acetato de chumbo. 4. Radioistopos. Eles podem causar radiaes ionizantes em clulas humanas. Exemplo: Fsforo 32 (32P). Tabela 1: Unidades de volume Unidades de volume Litro Decilitro Mililitro Microlitro Abreviatura L dL mL L Fator de multiplicao ( relativo ao litro) 1 10-1 10-3 10-6

Para converter mililitro em microlitro, multiplica-se o valor do mililitro por 1000. Exemplo: 2 mL correspondem a 2000l ( 2 x 1000 = 2000). Para converter microlitro em mililitro, dividi-se o valor do microlitro por 1000. Exemplo: 2000l correspondem a 2 mL ( 2000 /1000 = 2).

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3a Prtica
Preparo de solues e diluies
1. Objetivos: Expressar corretamente a concentrao das solues; Efetuar clculos de normalidade, molaridade e porcentagem e diluies; Utilizar a tcnica e a vidraria corretas no preparo de solues e de diluies.

2. Solues As solues so, provavelmente, o mais comum dos sistemas qumicos encontrados em laboratrios. As solues so definidas como misturas homogneas de duas ou mais substncias puras, em geral, o componente de uma soluo presente em maior quantidade chamado de solvente e o que est em menor quantidade, de soluto. Entretanto, esses termos podem ser trocados quando for necessrio. Este o caso das solues de slidos em lquidos, em que o lquido tomado, comumente, como solvente e o slido como soluto, independente das propores relativas de cada um. Assim, podemos ter solues de sacarose em gua a 10% e 60%, e em ambos os casos, a gua considerada como solvente e a sacarose como soluto. 3 Maneiras de expressar a concentrao das solues A concentrao de uma soluo pode ser expressa em funo da quantidade de soluto num volume definido de soluo, ou como a quantidade de soluto numa massa definida de soluo ou solvente. As convenes mais comuns so definidas abaixo: 3.1 Molaridade (M) o nmero de moles de soluto por litro de soluo, ou seja, o nmero de moles igual ao peso (em grama) do soluto/ PM. O Peso Molecular(PM) a soma de todos os pesos atmicos dos tomos da molcula. Concentraes molares so normalmente expressas entre colchetes, por exemplo, a concentrao molar do on hidrognio representada dessa forma, [H+]. Solues diludas so representadas em termos de milimolaridade, micromolaridade, nanomolaridade, picomolaridade, etc. 1 mmol = 10-3 moles 1 mol = 10-6 moles 1 nmol = 10-9 moles 1 pmol = 10-12 moles Portanto: 1 mM = 10-3 moles = 1mmol/litro = 1mol/mL 1 M = 10-6 moles = 1Mol/litro = 1nmol/mL 1 nM = 10-9 moles = 1nmol/litro = 1pmol/mL

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3.2 Normalidade(N) o nmero de equivalentes do soluto por litro de soluo. Para calcular a normalidade precisamos conhecer o peso do soluto dissolvido e seu equivalente-grama, ou seja, seu nmero de equivalente. O nmero de equivalentes igual ao peso do soluto(em grama)/ Eq.g. Equivalente-grama (Eq.g ) de um cido o peso molecular do mesmo que contm um tomo-grama de hidrognio substituvel. Por exemplo, o Eq.g do HCl igual ao mol (mol PM expresso em gramas) e do H2SO4 igual ao mol/2. Eq.g = PM n em que n o nmero de H+ ou OH- substituveis por molcula, isso para cidos ou bases, respectivamente, Eq.g, o equivalente grama e PM, o peso molecular A molaridade e a normalidade so relacionadas por; N = n x M. Em que n o nmero de H+ ou OH- substituveis por molcula, isso para cidos ou bases, respectivamente, N, a normalidade e M, a molaridade. Por exemplo, uma soluo 0,01M de H2SO4 corresponde a uma soluo 0,02N. 3.3 Porcentagem peso/volume (% p/v) o peso em grama de um soluto por 100 mL de soluo. Exemplo: Uma soluo de NaCl 0,9% contem 0,9 g de NaCl em 100 da soluo 3.4 Porcentagem peso/peso (% p/p) o peso em grama de um soluto por 100g de soluo. Exemplo: Os cidos comerciais como HCl e H2SO4 esto disponveis com concentrao em peso/peso. Uma soluo de HCl 37% contem 37g de HCl em 100g da soluo. 3.5 Porcentagem volume/volume (% v/v) o volume em mililitro (mL) do soluto em 100 mL de soluo. Exemplo: Uma soluo hidroalcolica 70% contm 70 mL de lcool etlico absoluto (100%) em 30 mL de gua destilada. Tabela 2: Unidades de massa Unidades de massa Quilograma Grama Miligrama Micrograma Nanograma Picograma Abreviatura Kg g mg g ng pg Fator de multiplicao ( relativo ao grama) 103 1 10-3 10-6 10-9 10-12

Para converter miligrama em micrograma, multiplica-se o valor do miligrama por 1000. Exemplo: 2 mg correspondem a 2000g ( 2 x 1000 = 2000). Para converter micrograma em miligrama dividi-se o valor de micrograma por 1000. Exemplo: 2000g correspondem a 2mg( 2000 /1000 = 2).

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4. Diluio Diluio uma tcnica utilizada para preparar solues, em que se adiciona um diluente a uma soluo estoque, para diminuir a sua concentrao. Soluo estoque uma soluo com concentrao conhecida e a partir dela pode-se preparar outras. 4.1 Diluio de solues com concentrao expressa em molaridade Para diluir solues cujas concentraes so expressas em molaridade, deve-se usar umas das seguintes frmulas abaixo: M1 x PM = 1000 x d x T Sendo: M1 - a molaridade da soluo estoque PM - o peso molecular do soluto 1000 - o fator de converso da densidade expressa em g/mL para g/L T - o ttulo percentual da soluo d = a densidade Esta frmula utilizada para encontrar o valor da molaridade da soluo estoque, M1. Em seguida utiliza-se a frmula de diluio abaixo: M1 x V1 = M2 x V2 Sendo: M1 a molaridade da soluo estoque V1 o volume que deve ser retirado da soluo estoque M2 a molaridade da soluo que se quer preparar V2 o volume da soluo que se quer preparar 4.2 Diluio de solues com concentrao expressa em normalidade Para diluir solues cujas concentraes so expressas em normalidade, deve-se usar umas das seguintes frmulas abaixo: N1 x Eq-g = 1000 x d x T Sendo: N1 - a normalidade da soluo estoque Eq-g - o equivalente grama do soluto 1000 - o fator de converso da densidade expressa em g/mL para g/l T - o ttulo percentual da soluo d = a densidade Esta frmula utilizada para encontrar o valor da normalidade da soluo estoque, N1. Em seguida utiliza-se a frmula de diluio abaixo: N1 x V1 = N2 x V2 Sendo:

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N1 a normalidade da soluo estoque V1 o volume que deve ser retirado da soluo estoque N2 a normalidade da soluo que se quer preparar V2 o volume da soluo que se quer preparar 4.3Diluio direta Podemos obter diretamente diluies altas de uma soluo com concentrao conhecida sem que seja necessrio fazer diluies seriadas ou sucessivas, como por exemplo diluir uma soluo 100 vezes. Para isto basta pipetar 10l da soluo desejada em 990l de gua. 5. Exerccios de preparo de solues 1) Que massa de NaCl deve ser pesada para preparar 250 mL de uma soluo de NaCl 1,5M? PM NaCl = 58,45 2) Que volume da soluo estoque de HCl 37% (p/p) deve ser retirado para preparar 500 mL de uma soluo de HCl 2,3N ? Dados PM HCl =36,6, densidade (d) = 1,19g/mL 3) Quantos mililitros de H2SO4 5M so necessrios para preparar 200 mL de uma souo de H2SO4 1,5M? Expresse os seus resultados tambm em normalidade. 4) O cido Clordrico (HCl) encerra 37 % de HCl em peso e tem uma densidade de 1,19 g/mL. a) Calcular a molaridade do cido concentrado. b) Descrever a preparao de 400 mL de HCl 3 M c) Descrever a preparao de 300 mL de HCl 1,5N 5) Que massa de glicose deve ser pesada para preparar 30 mL de uma soluo de glicose 0,13 mM? PM da glicose = 180. 6) Que massa de NaOH deve ser pesada para preparar 600 mL de uma soluo de NaOH 2,5N? PM NaOH =40 7) Que volume da soluo de NaOH 10N deve ser retirado para preparar 900 mL de uma soluo de NaOH 0,3N? 8) Que volume da soluo de HCl 5N deve ser retirado para preparar 500 mL de uma soluo de HCl 0,7N? 9) Que massa de NaCl deve ser pesada para preparar 1L de uma soluo de NaCl 0,9%. (p/v)? 10) Que volume de etanol absoluto (100%) deve ser retirado, para preparar 70mL de uma soluo hidroalcolica a 70% (v/v)?

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11) Que volume de etanol absoluto (100%) deve ser retirado, para preparar 250 mL de uma soluo hidroalcolica a 40% (v/v)? 12) Que massa de cido pcrico deve ser pesada para preparar 100 mL de uma soluo de cido pcrico 2% (p/v)? 13) Descreva a diluio de 45 vezes de uma soluo do corante cristal de violeta em 300 mL de gua destilada. 14) Qual o volume da soluo de cido pcrico 1% deve ser usado para se preparar uma soluo 10 vezes mais diluda num volume final de 100 mL. 15) Converter em Normalidade das seguintes solues: a) NaOH 0,5M b) HCl 2 M c)H2SO4 5M

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4a Prtica
A Qumica de pH e tampes
1. O produto inico da gua e pH O qumico dinamarqus S. L. P. Sorenson props uma forma de representar a concentrao de H+ de solues. Ele definiu o logaritmo negativo da concentrao de hidrognio como pH. (pH = - log[H+]) Uma soluo de HCl 0,01M, apresenta um valor de pH: pH = -log [10-2] (2) pH = 2 (3) A equao 1 no pode ser aplicada na determinao do pH de uma soluo 0,001M de NaOH, base forte que apresenta a seguinte rao de dissociao: NaOH Na+ + OH
+

(1)

(4)

No entanto, a concentrao do on hidroxila (OH-) pode ser relacionada com a de H , atravs da equao de dissociao da gua: H2O H+ + OHA constante de equilbrio para essa reao : Keq = [H ] [OH ] [H2O]
+ + -

(5)

[H ] [OH ] Keq = 7 55,5M Nas equaes (6 e 7) o colchete significa concentrao molar. Como a concentrao molar da gua 55,5M, ela pode ser substituda nessa equao: Multiplicando os termos da equao 7 teremos: 55,5M x Keq = [H+] [OH-] (8) A constante de equilbrio da gua conhecida, sendo determinada a partir de medidas da sua condutividade eltrica, dada pelos ons H+ e OH-. Portanto, a Keq = 1 x 10-18. Substituindo esse valor na equao 8 teremos: 55,5M x 1 x 10-18 = [H+] [OH-] Multiplicando os termos obteremos: 99,9 x 10-16 = [H+] [OH-] Aproximando o resultado obteremos:: 0,999 x 10-14 = [H+] [OH-] ou 1,0 x 10-14 = [H+] [OH-]
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(9) (10)

(11)

Esse o valor que corresponde ao produto inico da gua, o Kw. Como o produto de [H+] [OH-] 1,0 x 10-14 , a concentrao de cada um deles encontrada elevando-se a concentrao de [H+] ou [OH-] ao quadrado , conforme descreve a equao 13 abaixo: [H+] [OH-] = Kw = 1 x 10-14 (12) + 2 -14 [H ] =1,0 x 10 Portanto: (13) [H+] = 1,0 x 10-14 = 1,0 x 10-7 (14) [OH-] = 1,0 x 10-14 = 1,0 x 10-7 (15) Como esses nmeros so de difcil manuseio, Sorenseon estabeleceu a escala do pH, que uma forma mais conveniente de se lidar com a concentrao de H + em lquidos, ento: pH = log 1,0 x 10-7 (16) pH = 7,0 (17) A partir do valor do Kw podemos calcular agora o valor do pH da soluo NaOH 0,01M, uma vez que [H+] [OH-] = Kw [H+] [OH-] = 1 x 10-14 Kw [ H+] = substituindo os termos conhecidos teremos: 19 [OH-] [ H+] = (18) (21) pH = 12 2. A Escala do pH Solues que apresentam pH = 7,0 so neutras, as que apresentam pH abaixo de 7,0 so cidas e as que tm pH acima de 7,0 so alcalinas ou bsicas. A figura abaixo descreve a escala de pH, destacando o valor de pH de algumas solues.
1

x 10-14 1 x 10-2

20

24

3. Conceito de cidos e Bases Muitas das reaes qumicas que ocorrem nas clulas so influenciadas pelos ons H+ e OH-, oriundos da hidrlise da molcula de gua. Variaes nas concentraes celulares desses ons podem alterar diversos processos biolgicos, como a desnaturao de protenas e cidos nuclicos. Os organismos multicelulares desenvolveram estratgias qumicas sofisticadas para evitar essas alteraes, atravs da ao dos tampes, que so sistemas qumicos que mantm o valor do pH constante. Antes de entendermos a ao dessas substncias, necessrio compreender o conceito de cidos e bases definidos por Bronsted e Lowry. Um cido um doador de H+ enquanto a base um aceptor de H+. Portanto: 1) AH A- + H+ 2) A- + H+ AH Na reao 1 AH o cido, pois se dissocia liberando + H+ e na reao 2 A- a base, pois capta H+ , formando AH. As reaes 1 e 2 podem ser combinadas, dando uma terceira reao: 3) AH A- + H+, AH e A- formam o par cido base conjugado. Utilizando agora a dissociao de uma substncia qumica, o cido clordrico (HCl), temos: HCl H+ + Cl- , em que o H+ o cido e o on cloreto (Cl-) a base. De acordo com o grau de dissociao em seus ons, os cidos e bases so classificados em fortes e fracos. Os cidos e bases fracas so os que parcialmente dissociam em seus ons, enquanto os fortes esto completamente dissociados em seus ons, quando em soluo. O HCl se dissocia completamente em H+ + Cl- , portanto, um cido forte. O hidrxido de sdio (NaOH) uma base forte porque dissociado totalmente em seus ons: Na+ e OH. A tabela 1 abaixo apresenta alguns exemplos dos cidos e bases fracos. Tabela 1: cidos e bases fracos cidos CH3COOH (cido actico) H2CO- 3 (cido carbnico) NH4+ (on amnio) 4. Tampes e ao tamponante Os fluidos celulares apresentam um pH constante e especfico, geralmente prximo de 7,4. Nos organismos multicelulares, o pH dos lquidos extracelulares (sangue, por exemplo) tambm estreitamente regulado atravs da ao dos tampes biolgicos. Tampes so misturas de cidos fracos e suas bases conjugadas, que evitam variaes bruscas de pH de em solues, quando so adicionadas quantidades relativamente pequenas de cido (H+) ou base (OH-). Por exemplo, quando se adiciona 1 mL de uma soluo de HCl 0,1N a 99mL de gua destilada o pH cai abruptamente Se fizermos um outro experimento, adicionando 1mL de NaOH 0,1N a 99mL de gua destilada, observaremos que o pH se elevar consideravelmente. Se experimentarmos agora adicionar 1mL da soluo de HCl 0,1N a 99mL da soluo tampo de acetato de sdio, que consiste de uma mistura de cido actico e acetato, verificaremos que o pH dessa soluo no se alterar, devido a forma bsica
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Bases conjugadas CH3COO -(on acetato) HCO- 3 (on bicarbonato) NH3 (amnia)

desse tampo (CH3COO-) captar o on H+, como demonstra o esquema abaixo. Quando se adicionar 1mL da soluo de NaOH 0,1N a 99mL da soluo tampo de acetato de sdio, o pH dessa soluo no se alterar, devido a forma cida do tampo (CH 3COOH) liberar o on H+, que reagir com a hidroxila (OH-), produzindo H2O. Portanto o papel de um sistema tampo neutralizar as aes de H+ e OH-, conforme o a equao 22 :
-

OH

H2O CH3COO on acetato (base conjugada) H

+ -

CH3COOH cido actico (cido)

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5. Tampes Fisiolgicos O tampo bicarbonato O sangue apresenta valores de pH em torno de 7,4 rigidamente controlados, graas a ao de trs sistemas de tampo: o bicarbonato (HCO -3/CO2-), o fosfato (H2PO-4/HPO2-4) e o tampo protico hemoglobina. O tampo bicarbonato atua no lquido extracelular e um dos mais importantes tampes sangneos, j o tampes fosfato e hemoglobina so intracelulares. Se o pH sangneo cair para valores em torno de 7, 2, como pode acontecer logo aps o trmino de uma corrida de 100 metros ou em pessoas que apresenta uma diabetes no tratada, verifica-se um aumento na concentrao do on H+. Nesse caso o on bicarbonato (a forma bsica) capta o H+, corrigindo assim a sua variao de concentrao. O cido carbnico formado dissociado, liberando H2O. e CO2, que por sua vez exalado na respirao. Se o pH sangneo atingir valores em torno de 7, 6, ocorrer um aumento na concentrao do on hidroxila (OH -). Nesse caso o cido carbnico libera um H+, que reagindo com a hidroxila formar gua, corrigindo assim a sua variao de concentrao, conforme demonstra a equao 23: H2O OH H2CO3 HCO3 CO2 + H2O 23 cido carbnico on bicarbonato (cido) (base conjugada) + H O tampo bicarbonato nico, por que a forma cida dele eliminada pelos pulmes na forma do gs carbnico CO2, como tambm a concentrao de CO2 e do on bicarbonato podem ser reguladas na clula. Esses fatores explicam o fato desse ser o mais importante tampo sangneo. 6. Determinao potenciomtrica do pH As medidas mais exatas na determinao do pH so feitas atravs de tcnicas potenciomtricas, em que se utiliza o pH metro, instrumento que consiste de: um eletrodo de referncia, um eletrodo de vidro, cujo pH depende da soluo em que ele est imerso e um sistema para medida de voltagem, que capaz de medir diferenas potenciais mnimas num circuito de resistncia extremamente elevada.

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A funo bsica do eletrodo de referncia manter um potencial eltrico constante contra o qual variaes podem ser medidas. Os dois eletrodos de referncia mais largamente utilizados so o de calomelano (cloreto mercuroso em contato com soluo saturada de KCl) e o de prata metlica-cloreto de prata. Esse ltimo o mais freqentemente utilizado em instrumento. Ele consiste de uma pea de prata metlica envolvida por cloreto de prata, imersa numa soluo saturada de cloreto de potssio. O potencial desse sistema derivado da reao :
e 24 Ag Cl A equao 24 demonstra que o potencial de referncia dependente da concentrao do on cloreto (Cl-). Para manter sua concentrao constante, em condies instveis de umidade, uma soluo saturada de cloreto de potssio (KCl) utilizada. Se a umidade diminuir, pode ocorrer evaporao do eletrodo do vidro , acarretando em precipitao do excesso de cloreto; por outro lado, se a umidade se elevar, ocorrer pequeno aumento no volume da soluo e o cloreto de potssio se dissolver. A funo do eletrodo de vidro estabelecer um potencial eltrico que responda a variaes na atividade do on hidrognio da soluo a ser testada. Ele consiste de um tubo de vidro de alta resistncia, apresentando na extremidade um bulbo, cujo vidro delgado e de baixa resistncia. Somente a poro do bulbo detecta variaes de pH. O tubo preenchido por uma soluo de HCl 0,1N que entra em contato com o eletrodo de referncia. Quando esse eletrodo imerso em uma soluo de concentrao hidrogenada (H+) desconhecida, cria-se um potencial entre as solues interna e externa. Como a voltagem do eletrodo de referncia constante, a diferena de potencial entre os dois eletrodos diretamente relacionada com a concentrao de ons hidrognio da soluo desconhecida.

Ag

7. Instrues que devem ser observadas no uso do pH Metro 1. Antes de utilizar o pH metro, lave o eletrodo com gua deionizada e seque-o, cuidadosamente, com um leno de papel. 2. Ajuste o boto da temperatura para o mesmo valor de temperatura das solues padres de pH, utilizadas para calibrar o aparelho e da soluo em que se vai medir o pH. 3. Calibre o aparelho mergulhando o eletrodo na soluo padro de pH 7,0. Mude a chave do pH metro para a funo pH. Se o valor registrado no for igual ao pH da soluo padro, gire a chave de ajuste at que seja atingido o pH 7,0. Repita o mesmo procedimento para calibrar o aparelho com uma soluo de pH 4,0. O eletrodo deve ser lavado e secado, quando for mergulhado em solues diferentes. 4. Antes de tirar o eletrodo da soluo, o potencimetro deve ser desligado. 5. Lave e seque o eletrodo e em seguida mergulhe-o na soluo em que se vai medir o pH, girando a chave para a funo de pH. Registre o valor, mude a chave da funo pH, para o modo Standby". Lave e seque o eletrodo. 6. Aps o uso do aparelho, lave o eletrodo e deixe-o mergulhado num recipiente contendo gua destilada limpa. A chave do pH deve estar no modo Standby e em seguida desligue o aparelho.

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08. Exerccios 1. Dada uma soluo de HNO3 0,002 M, responda as questes a baixo: a) Qual a concentrao de H+? b) Qual a concentrao de OH-? c) Qual o pH da soluo-? d) Qual o pOH da soluo-? 2. Calcule o valor de pH quando 1,0 mL de HCl 0,1M adicionado a 99,0 mL de gua pura. Considere em sua resposta a concentrao final de HCl 0,1M em 100 mL da soluo. 3. Calcule o valor de pH quando 1,0 mL de NaOH 0,1M adicionado a 99,0 mL de gua pura. Considere em sua resposta a concentrao final de NaOH 0,1M em 100 mL da soluo. Dado: Kw = 1 x 10-14. 4. Calcule o valor de pH de uma soluo de HCl 10-8 M. 5. Qual a concentrao de HNO3 numa soluo cujo pH 3,4 ? 6. Quantas vezes o pH do suco gstrico mais cido do que o : a) vinagre b) sangue c) Coca-Cola d) alvejantes domsticos

7. Usando a equao de Henderson-Hasselbalch (pH = pKa + log [ aceptor H+]/ [doador H+])
calcule o pKa do cido lctico numa soluo pH 4,8 em que a concentrao de cido lctico 0,010M e a de lactato 0,087M. 8. Um tampo contm 0,010 mol de cido lctico (pKa = 3,86) e 0,050 mol de sodium lactato por L. Calcule o pH deste tampo. Use a equao de Henderson-Hasselbalch

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5a Prtica Espectrofotometria
1. Introduo: A espectrofotometria (medida da absoro ou transmisso de luz) uma das mais valiosas tcnicas analticas de que dispem os bioqumicos. Essa tcnica consiste no uso do espectro radiante na inspeo de sistemas biolgicos, especialmente solues. Um feixe de energia atravessa a soluo, e a sua absoro oferece tanto informaes qualitativas como quantitativas dos componentes do sistema.

Figura 1 Representao esquemtica do espectro eletromagntico. Compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros caractersticos ao visvel, ultravioleta ou infravermelho. As concentraes de solues de compostos conhecidos podem ser determinadas medindo-se a absoro de luz em comprimentos de ondas especficos. As reaes enzimticas podem ser freqentemente seguidas medindo-se no espectrofotmetro o aparecimento de produtos ou desaparecimento de substrato. O instrumento usado nas medidas de absorbncia ou transmitncia o espectrofotmetro que apresenta os seguintes componentes: a - Fonte de luz - Para medida de absorbncia no ultravioleta (250 - 340 nm) usa-se uma lmpada de deutrio ou de hidrognio; no visvel (340 - 800 nm) usa-se uma lmpada de tungstnio-halognio. b - Colimador ou dispositivo de focalizao - Sistema ptico com que se colima um feixe de raios luminosos, ou seja torna-os paralelos, transmitindo assim um intenso feixe de luz. c - Monocromador (prisma ou grade) - Tanto a lmpada de deutrio quanto a de tungstnio-halognio produzem emisses contnuas de todos os comprimentos de onda correspondentes a suas faixas. Para se trabalhar com um comprimento de onda determinado, o espectrofotmetro dispe de um dispositivo ptico para selecionar o comprimento de onda. O monocromador um prisma que divide o raio de luz nos seus comprimentos de ondas respectivos. d - Dispositivo para seleo do comprimento de onda desejado e - Compartimento no qual colocada a amostra - A amostra a se inspecionada colocada numa cubeta de vidro ou de quartzo e posicionada num compartimento apropriado de maneira que por ela possa atravessar o feixe de luz que emitido por uma fenda localizada na parte interna do espectrofotmetro.

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f - Detector fotoeltrico - A intensidade da luz que passa atravs da amostra sob estudo depende da quantidade de luz absorvida pela amostra. A intensidade medida por um detector sensvel luz, usualmente um tubo fotomultiplicador. O fotomultiplicador detecta pequena quantidade de energia luminosa, amplifica g - Um medidor eltrico para registrar as sadas do detector 3 - A Lei de Lambert-Beer Muitos aspectos da espectrofotometria so baseados em duas leis a de Lambert e Beer. A lei de Lambert afirma que a frao de luz incidente que absorvida por uma soluo depende do comprimento do caminho ptico (da cubeta), enquanto a lei de Beer afirma que a absoro de luz dependente da concentrao do composto que a absorve na soluo e da natureza qumica deste composto. A transmitncia de luz no uma funo linear, e sim exponencial. A relao entre a concentrao, o comprimento do caminho tico e a quantidade de luz absorvida por uma certa substncia expressa matematicamente pela equao de Lambert-Beer . A quantidade de luz que atravessa a soluo [transmitncia (T)] ou a luz que absorvida pela amostra [absorbncia (A)] so detectadas pelo espectrofotmetro.

Transmitncia = I % transmitncia = I X 100 Io Io Absorbncia = log Io = 1 A (D.O) = -log T Log Io = acl I T I Em que: Io feixe de luz incidente I feixe de luz emergente (transmitida) a absorbncia c concentrao l espessura da cubeta

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Fonte de luz Monocromador detector branca (grade de difrao) com mostrador digital Figura 2 Esquema de um espectrofotmetro.

Cubeta com amostra

4 - Ilustrando a Lei de Lambert-Beer A natureza exponencial da transmitncia da Lei de Lambert-Beer ilustrada na situao descrita em seguida. Considere um raio de luz atravessando uma cubeta de 1 cm contendo um composto na concentrao de 1 m que absorve luz. Suponha que 80% da luz incidente seja transmitida e 20% dela absorvida. I0 = 1,0 - [c=1mg/l] I1 = 0,8 Se uma segunda cubeta, nas mesmas condies da primeira for colocada no mesmo caminho luminoso, diretamente atrs da primeira cubeta, qual ser a intensidade de luz transmitida atravs das duas cubetas? A Lei de Lambert-Beer no uma relao linear. Assim I2 no 0,6. Cada centmetro do comprimento do caminho ptico no absorve uma quantidade constante de luz, mas 20% da luz incidente. Portanto I0 = 1,0 - [c=1mg/l (1cm)] I1 = 0,8 - [c=1mg/l (1cm)] I2 =0,64 De modo semelhante, se colocarmos trs cubetas de 1 cm em srie, cada uma absorve 20% da luz incidente e transmite 80% I0 = 1,0 - [c=1mg/l (1cm)] I1 = 0,8 - [c=1mg/l (1cm)] I2 = 0,64 [c=1mg/l (1cm)] I3 =0,512 Poderamos obter o mesmo resultado se usssemos cubetas nicas com 2 e 3 cm I0 = 1,0 - [c=1mg/l (2cm)] 0,64 I0 = 1,0 - [c=1mg/l (3cm)] 0,512 ou se aumentssemos a concentrao do composto que absorve luz, mantendo o comprimento ptico constante I0 = 1,0 - [c=1mg/l (1cm)] I1 = 0,8 I0 = 1,0 - [c=2mg/l (1cm)] I2 = 0,64 I0 = 1,0 - [c=3mg/l (1cm)] I3 = 0,512

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5. Determinao do espectro visvel ou do ultravioleta e o seu comprimento de onda mximo Para determinar a concentrao de uma substncia a luz de um comprimento de onda deve ser escolhida, para isso necessrio o espectro de uma substncia pura, ou seja sua absorbncia como funo do comprimento de luz deve ser determinada. Isto obtido no espectrofotmetro medindo a absorbncia da amostra em diversos comprimentos de onda. Todas as medidas de absorbncia devem ser feitas em relao a um branco, que uma soluo que contm todos os componentes do meio reacional, exceto o composto que est sendo medido. A cada mudana do comprimento de onda, deve ser feita uma leitura com o branco e s depois mede-se a absorbncia da amostra. O comprimento de onda que der a absorbncia mxima usado para obter as medidas mais acuradas de variaes de absorbncia de acordo com a concentrao. 6 - Aplicaes da espectrofotometria do ultravioleta e do visvel A mais comum das aplicaes da espectroscopia do ultravioleta e do visvel a determinao da concentrao de uma substncia em soluo, se o coeficiente de extino molar conhecido e a Lei de Lambert-Beer obedecida. O limite de sensibilidade dessas anlises determinado pelo valor do coeficiente de extino. Quanto mais alto este for mais baixa a concentrao que pode ser medida. Se o coeficiente for 10.000 l.mol-1 e a absorbncia mnima detectvel 0,01 em uma cubeta de 1 cm a concentrao molar mnima que pode ser medida de 1,0 x 10-6 M. A atividade de uma enzima pode ser determinada atravs da medida da quantidade de produto formado ou da quantidade de substrato que desapareceu. Por exemplo a -galactosidase catalisa a hidrlise do o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo, que incolor, resultando no o-nitrofenol, que possui cor amarela, e absorve luz maximamente a um comprimento de onda 405nm e pode dessa forma ser determinado atravs do espectrofotmetro. Medidas de absorbncia pode ser usado na identificao de substncias. Por exemplo, as protenas absorvem luz em 280 nm, os cidos nuclicos em 260 nm e a forma reduzida NADH em 340 nm. 7 - Como utilizar o Espectrofotmetro 7.1 - Ligue o aparelho em tomada de (observar a voltagem se 220 ou 110V) 7.2 - Aps a estabilizao do aparelho, selecione o comprimento de onda com que se vai fazer as medidas espectrofotomtricas, pressionando a tecla comprimento de onda (wavelength). A faixa de visvel de 325-1000 nm. 7.3 - Selecionar as operaes TRANSMITNCIA ou ABSORBNCIA, 7.4 - Calibrar o aparelho, ou seja, deixar a TRANSMITNCIA em 100% e a ABSORBNCIA com leitura 0.000. 7.5 - Para fazer as medidas espectrofotomtricas do Branco, selecione a funo absorbncia. Preenche-se a cubeta com o contedo do Branco e leva-a para o aparelho para registrar o valor encontrado. Aperte a tecla 0ABS/100%, para evitar que a leitura do Branco seja adicionada a das suas amostras. Em seguida lave a cubeta e seque-a cuidadosamente, evitando tocar na parte por onde passa o feixe de luz, a que apresenta vidro transparente.

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7.6 - Para fazer as medidas espectrofotomtricas das amostras selecione a funo absorbncia. Coloca-se o contedo das amostras na cubeta e registra-se o valor encontrado. Para ganhar tempo, evitando lavar a cubeta a cada medida feita, faa as anlises partindo da amostra mais diluda para a mais concentrada. 7.7 - Aps a prtica, desligue o aparelho, lave as cubetas e entregue-as ao professor. Se tiver alguma dvida no uso do espectrofotmetro, solicite do professor esclarecimentos, isso evitar que voc possa cometer erros na prtica ou avaria ao equipamento. Tenha muito cuidado no manuseio das cubetas, pois esse material caro. 7.8. Ao terminar a prtica deixe o aparelho e as cubetas limpas, seja cuidadoso ao manusear o aparelho e cubetas, pois so materiais caros e de difcil aquisio. Evite brincadeiras na hora do trabalho, isso vai evitar que voc cometa erros, ou que possa cometer alguma avaria. 8 - Protocolo experimental 8.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotmetro com cubetas - Pipetas de 5 mL graduadas - Estante com tubos de ensaio 8.2. Reagentes - Alaranjado de Metila: Concentrao: 0,001% - Azul de Bromofenol : Concentrao: 0,0001% 8.3. Procedimento: A. Coleta de dados para a construo do espectro de absoro do Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo). Usando gua destilada como referncia, efetuar as leituras de Absorbncia (ou D.O.) do Alaranjado de Metila ( nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550, 600, 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm) Preencher os dados da tabela 1 abaixo, de acrdo com o corante escolhido pelo grupo: Alaranjado de Metila Azul Bromofenol (nm) T (%) Absorbanc. (nm) T (%) Absorbanc. 400 400 420 440 440 490 460 520 480 540 500 565

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520 550 600 650 700

580 590 620 660 700

Utilizando os dados da tabela acima preparar um grfico ( x = comprimento de onda nm) e (y = leitura em absorbncia), encontrando qual o comprimento de onde refere-se ao pico de absoro do corante usado em aula. Qual o comprimento de onda correspondente ao Pico de absoro da luz?

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6a - Prtica

Determinao da concentrao de protenas pelo mtodo do Bradford

5.1 Introduo H diversos mtodos na literatura utilizados na dosagem de protenas em soluo, entre eles destacamos o de Bradford, o do Biureto e o de Lowry. Todos eles apresentam vantagens e desvantagens. A escolha pelo melhor mtodo dependente de vrios fatores como: a quantidade de material de que se dispe para fazer a dosagem, o tempo requerido para realizar o ensaio e as substncias que interferem com o ensaio. 5. 2. Mtodo de Bradford O mtodo de Bradford um dos mais rpidos e sensveis na quantificao de protenas. O limite de deteco da concentrao protica desse mtodo de 0-20 ug de protena. Ele se fundamenta na ligao da protena ao corante Coomassie brilliante blue G-250, ligao essa que causa a mudana na absorbncia mxima do corante de 495 nm para 595 nm. por isso que as leituras de absorbncias devem ser feitas nesse comprimento de onda (595nm). Este ensaio bastante reproduzvel , apresentando boa estabilidade de cor por cerca de 1 hora. Existe pouca ou nenhuma interferncia de ctions como sdio ou potssio. Os principais componentes que causam interferncia de cor neste ensaio so: Dodecilsulfato de sdio (SDS), triton X-100 e detergentes comerciais. 5.3 - Preparo do reagente de Bradford I - Pesar 142,85mg do corante Coomassie brilliante blue G-250 e dissolver em 50 mL lcool etlico 95% agitando at completa dissoluo. II - Transferir para proveta para observar se houve diminuio do volume do lcool, que deve ser completado com lcool etlico 95% para um volume final de 50 mL. III - Transferir a soluo do item II para um balo volumtrico e adicionar 100 mL de cido fosfrico e completar o volume para 1000 mL com gua destilada. IV - Filtrar a soluo do item III duas vezes ou mais, caso ela apresente precipitado 5.3 - Elaborao da curva padro de BSA Construa uma curva padro utilizando concentraes conhecidas de BSA (albumina bovina srica ). Para tanto, necessrio preparar uma soluo estoque de 1mg/1mL, ou seja, pesa-se 1mg de BSA e o dissolve em 1mL de gua destilada ou uma soluo de NaCl 0,15M. A concentrao desta soluo em micrograma por microlitro 1000 g de BSA em 1000 L de gua destilada.

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BSA (g/100L)

gua destilada (L)

Soluo estoque de BSA (L)

Reagente de Bradford (mL)

A595nm

0 100 2,5 10 90 2,5 10l 20 80 2,5 20l 30 70 2,5 30l 40 60 2,5 40l 50 50 2,5 50l A partir das leituras de absorbncias encontradas, deve-se construir uma curva padro no programa Excel. Plotar no eixo X as concentraes de protena e no eixo Y as absorbncias correspondentes. Adicionar a linha de tendncia linear, equao da reta e R2. 5.4 - Ensaio de Bradford - Proceder como para a curva padro, no entanto adicionar 100 l de amostra. Se necessrio fazer diluies da amostra. - Aps ter feito a leitura das absorbncias, determina a concentrao de protenas presentes na amostra (leite ou outro produto qualquer que apresente protena) usando a equao da curva padro.

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