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Evaluacin de la calidad y cantidad de cidos nucleicos a partir de extractos de ADN y ARN de ostectios
Rodrguez Castillo, Emanuel

Resumen:
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los estudios en biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. Los mtodos de extraccin nos permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de cuantificacin, calidad entre otros. Se hicieron dos estudios de evaluacin, el primero para ADN donde se usaron 3 tipos de muestras: pejerrey fresco y fijado y enlatado de caballa y el segundo para ARN con el uso de tilapia la cual estuvo expuesta a dieta variable. Una previa extraccin a base de separadores qumicos y fsicos y una posterior medicin por espectrometra nos permiti determinar la cantidad de g por gramos de tejido en cada caso, un anlisis electrofortico en gel de agarosa nos permiti comprobar la calidad de nuestra muestra y de los protocolos usados en cada caso. Key Words: extraccin DNA, RNA, muestras enlatadas, muestras frescas buffer CTAB

Materiales y Mtodos:
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos celulares. En nuestro caso se realizaron 2 experiencias cuantificacin y cualificacin de cidos nucleicos, la primera era para cuantificar y cualificar DNA a partir de 3 muestras diferentes siendo estas pejerrey fresco, pejerrey fijado en alcohol 70o y conserva de caballa; en la cual se obtuvieron pequeas porciones de tejido (30~50 mg) que fueron pesados, separados en tubos autoclavados y rotuladas (ver Anexo). Posteriormente se agreg 300 L CTAB, se disgrego mecnicamente por trituracin y

se incubo por 30 min a 60 oC. Luego se adiciona 600 L de un solvente orgnico cloroformo: alcohol isoamilico en proporcin 24:1 invirtiendo el tubo varias veces por 5min. Centrifugar en frio (4o C) a 10000 RPMx 5min. Luego se retir 400L de la fase superior y colocarlo en un tubo conteniendo 30L acetato de sodio: 600L etanol absoluto frio, homogenizar y reposara temperatura ambiente x30min. Centrifugar en frio a 10000 RPMx20min. Decantar el sobrenadante y al precipitado (DNA) lavar con 500L de etanol absoluto frio y centrifugar en frio a 10000 RPMx 2min. Se retira el etanol y se deja secar el pellet para luego

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resuspenderlo con 100L de buffer TE y almacenarlo a 70oC. En la segunda experiencia, se us RNA de tilapia, la cual ha estado sometida a una dieta de 3 tipos de alimento, del cual se obtuvieron porciones de tejido de aproximadamente 50mg a los cuales fueron pesados, separadas en tubos autoclavados conteniendo Trizol y rotuladas (ver Anexo). Despus se disgrego mecnicamente e incub a temperatura ambiente por 10min. Se le aadi 200L de cloroformo, se agito por inversin y se dej reposar por 5min. Centrifugar en frio a 10000 RPM x 15min. Luego se tom 200L de la fase acuosa y transfiri a un tubo con 500 L de alcohol isoproplico donde se homogeniz por inversin y se dej reposar x 10min. Centrifugar a 10000 RPM x10 min. Se retir el sobrenadante y el lavado se hizo con 1 mL de etanol 80o y se centrifugo a 10000 RPM x5min. La resuspension del pellet es similar a con DNA con la diferencia que se us agua bidestilada. Se procesaron 24 tubos para DNA y 23 tubos para RNA, de los cuales se procedi a cuantificar la cantidad de cidos nucleicos por medio de anlisis espectrofotomtrico en un espectrofotmetro UNICO-2100UV tomando datos de Absorbancia 230nm, 260nm y 280nm para determinar la pureza de la muestra y su posible contaminacin. La evaluacin de calidad e integridad del proceso de extraccin tanto de RNA como DNA se hizo mediante una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1% en una cmara electrofortica conteniendo buffer de carga (glicerol y azul de bromofenol y cinanocenol) y buffer TBE 1x a pH 8,3 a 100 voltios por 30 minutos. La visualizacin del gel se hizo tiendo con bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y fluoresce con luz UV, y un transiluminador con lmpara de luz UV, las imgenes fotografiadas pueden verse en la zona de anexos.

Resultados y Discusin:
Para una exitosa extraccin de cidos nucleicos, estos deben separarse de cualquier otro compuesto proveniente de las clulas o del ambiente al que estuvo expuesta la muestra. El espectro de absorcin caracterstico para los cidos nucleicos presenta un mximo en ~260nm; as tambin es posible obtener mediante reglas empricas que el valor para una unidad de absorbancia a 260 nm es aproximadamente 50g/mL de dsDNA. Del mismo modo estas reglas tambin nos permiten proporcionar un valor a las impurezas de naturaleza proteica mediante el cociente A260/A280, dado que el mximo de absorbancia de protenas se encuentra en ~280nm. La presencia de protenas har que este cociente sea mentor que el valor esperado para cidos nucleicos puros (valor esperado<2). Ocasionalmente tambin se pueden obtener otros contaminantes de naturaleza orgnica como carbohidratos, residuos de solventes y compuestos fenlicos producto de los reactivos usados durante el proceso de extraccin. Estos absorben a 230 nm; por lo que se estima que la relacin A260/A230 deba tener un valor optimo superior a 2 para garantizar Laboratorio de Gentica Molecular

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la pureza de la muestra (Sambrook y Russel, 2001; Falcn y Valera, 2007). Cuando los valores no cumplen los estndares estipulados se considera que no entran en el intervalo de aceptabilidad. Los resultados obtenidos por el espectrofotmetro pueden verse en el cuadro #01 para DNA y #02 para RNA. El anlisis espectrofotomtrico de la tabla #01 nos indica mediante las lecturas de Absorbancia 230nm e ndices de A260nm/A230nm que las muestras de extraccin de DNA no estn aptas para un posterior estudio con PCR al tener valores que no se ajustan a los valores matemticos mnimos permitidos (A260nm/A230nm>2.0) debido posiblemente a una alta tasa de contaminacin producto del proceso de trabajo y/o el protocolo. Ahora si se tiene en cuenta los ndices de A260/A280, estos no estaran indicando que la cantidad de DNA presente en las diferentes tubos estara posiblemente contaminado con una cantidad considerable de RNA (como por ejemplo muestras 20-22, 23-24; muestras enlatadas) o que incluso el DNA posiblemente este demasiado fragmentado (valores muy superiores a 2; por ejemplo muestras 1-6) ya que una mayor concentracin de nucletido libres y fragmentos pequeos estar enturbiando el medio y la lectura de absorbancia estara muy elevada. Se hizo la corrida electrofortica para 22 muestras de DNA (muestra 7 fue excluida) y 23 para RNA. La Figura #01 y Figura #02 muestra una comparacin de los rendimientos de las extracciones de todas las muestras juntas. En la figura #01 para las muestras de DNA podemos darnos cuenta que solo 12 carriles dieron un resultado fluoromtrico positivo, de los cuales solo 4 (carril 8, 12, 14, 15) dieron un resultado parcialmente positivo a la presencia de bandas de DNA de alto peso molecular las cuales se usan como indicador de DNA en buen estado (no degradado) para usos posteriores en PCR. En los carriles 22-24 se puede evidenciar unas bandas ubicadas al final lo que posiblemente estara indicando una contaminacin con fragmentos pequeos de DNA e incluso con sustancias aromticas y/o protenas posiblemente producto del proceso de extraccin y del origen de la muestra. Como se puede ver el material aislado mediante este protocolo para extraccin de DNA nos indica inicialmente que no es viable para los 3 tipos de muestreo (muestras frescas, fijadas en alcohol y enlatados) ya que la cantidad de material purificado detectado electroforticamente es bajo. As solamente las muestras fijadas en alcohol muestran ligeramente una respuesta a este mtodo de extraccin usado como puede verse a partir de que 3 de los 4 carriles que respondieron al mtodo pertenecen a las muestras fijadas en alcohol. As tambin, podemos aadir que la mayor cantidad de nucletidos/gramos de tejido obtenidos por el protocolo usado ha sido justamente en las muestras en alcohol (Promedio: 389.946g/g de tejido) lo que estara confirmando que el protocolo es ms productivo al ser usado en muestras previamente fijadas en alcohol. Por ultimo tambin se necesita resaltar que los datos de los ndices de Laboratorio de Gentica Molecular

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A260/A280 para los 3 muestreos presentan un amplio rango yendo desde el 1 hasta ms de 3. As las muestras frescas (carriles 1-10) son las que presentan un ndice elevado sobre las otras indicando una alta presencia de DNA fragmentado y RNA como puede verse en la Fig#01 donde solamente el carril 8 presente respuesta fluorescente apreciable aun as es posible que sea un falso positivo ya que su valor de absorbancia a 260nm es muy bajo (0.084) y su nivel de absorbancia a 230nm es ms elevado (0.205). Las muestras fijadas en alcohol, como se dijo lneas arriba, son las que mejor han respondido al protocolo usado, ya que sus ndices de A260/A280 no estn disparados hacia los extremos (exceptuando la muestra 20 que posiblemente sea producto de un mal manejo del material) sino ms bien fluctan cerca de 2 aun y se puede ver en el gel su fluorescencia (carriles 12,14,15) donde muestran muy levemente bandas pertenecientes s dsDNA. Sin embargo es posible que no se haya tenido el cuidado respectivo durante el protocolo de extraccin de DNA para estas muestras ya que no todas respondieron como se esperaba segn sus ndices de Absorbancia (cuadro #01) y las que lo hicieron son visibles levemente; lo que se podra deducir que el material tambin estara degradado. Los resultados de las muestras provenientes de caballa enlatada (muestras 21-24) nos permiten sugerir que durante el proceso de enlatado y/o por los aditivos empleados para este fin, el material gentico del producto alimenticio ha sufrido algn proceso de degradacin previa. As con esta consideracin se sugiere que se debera hacer una corrida ms pero con un patrn para poder determinar el grado de degradacin de los cidos nucleicos presentes en los tejidos de la caballa destinada al consumo y determinar su verdadero potencial alimenticio. Para determinar el grado de pureza del RNA, sus ndices de A260nm/A280nm deben estar alrededor 1,80~2. Ahora teniendo en cuenta lo anterior, el anlisis espectrofotomtrico de la tabla #02 nos indica que los carriles 17, 22, 24, 25, 35 y 42 se esperaran que tuviesen la mayor cantidad de RNA puro y los otros carriles con muestras tuviesen en menor cantidad o no presentasen por estar contaminados con DNA u solventes orgnicos producto de protocolo. As podemos ver en las Figuras #01 (parte inferior) y #02 en los carriles anteriormente mencionados (excepto 25) que se corrobora lo anteriormente predicho corroborndose con la visualizacin en la zona media inferior de los carriles un par de bandas coloreadas que hacen referencia a las bandas ribosomales (sealados con una flecha rojo en Figura #01 y negra en Figura#02). En el carril 25 no se cumple lo predicho y esto es fcilmente explicable si se ve en la tabla #02 el dato de absorbancia de dicha muestra donde su Absorbancia a 230nm es alta respecto a la Absorbancia a 260nm para cidos nucleicos dando un falso positivo.

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En aquellas muestras cuyo ndice de A260/A280 es muy elevado (sobre 3) como en los carriles 30-34 y 39-41 y cuyos ndices de A260nm para nucletidos es alto indicara presencia de RNA pero esto no se evidencia en el gel, lo cual es explicable por 2 sucesos, el primero es posible que haya ocurrido una contaminacin por RNAasas en los carriles 30-34 por eso que prcticamente no se evidencia nada ya que todo se difuminado al medio al estar tan degradado. El otro suceso es lo que ocurre en la Figura #02 en los carriles 39-14 donde se ve muy fluorescente el carril pero no se puede evidenciar las bandas ribosomales claramente y es que si se ve sus valores de Absorbancia a 230nm y a 260nm estn elevados, lo cual es posiblemente producido por una mala colecta de la fase acuosa durante la extraccin de RNA; al tomar pipetear seguramente las otras fases (fase orgnica con DNA y fase no soluble) junto a la de la muestra (fase acuosa) y se puede evidenciar en la figura #02 ya que todo el carril est teido intensamente por la corrida uniforme del DNA contaminante. instrumentos al realizar el protocolo ya que esto afecto mucho en los datos. Considerando que los productos enlatados atraviesan diferentes mecanismos de procesamiento como calentamiento y/o adicin de diversas sustancias no siempre indicadas en la etiqueta del producto, estas pueden filtrar en el tejido heterogenizando el producto llevando an bajo rendimiento en el aislamiento de los cidos nucleicos. Esta posibilidad debe confirmarse, ya que podra sugerir algn tipo de engao a nivel comercial, ya que se altera la calidad del material que se est comercializando, y adems puede dificultar la correcta identificacin de la materia prima. Para la extraccin de RNA, el protocolo estuvo acertado sin embargo como para DNA, la mala manipulacin y trabajo sobre la muestra afectan demasiado el obtener un anlisis valido as como una posterior utilizacin de la muestra para un estudio ms avanzado.

Bibliografa:
Bibliografa virtual

Conclusiones:
Si bien el protocolo de extraccin de DNA utilizado para los 3 tipos de muestreo no ofreci los resultados esperados, se espera que el protocolo se pueda ajustar segn a cada muestreo ya que tener las muestra colectadas en agua, en alcohol o en aceite y persevantes afecta el procesamiento posterior para estudios, as tambin no se descarta que se debera mejorar la manipulacin de los

http://www.geocities.ws/pedrojroc ha/pr/rocha23_3.pdf http://www.firp.ula.ve/archivos/cua dernos/S201A.pdf http://www.evrogen.com/technolo gies/RNA-isolation.shtml http://openwetware.org/wiki/Main_ Page

Bibliografa escrita RNA

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AMARU, RICARDO, PENALOZA, ROSARIO, MIGUEZ, HORTENCIA ET AL. UMSAgen, mtodo para la extraccin simultnea de RNA y DNA para diagnstico molecular. Cuad. Hosp. Cln., 2008, vol.53, no.1, p.3843. ISSN 1652-6776. CAMACHO.; OCHOA; WALLING & A.BRAY. An improved Method for Isolating RNA from dehydrated and nondehydrated Chili pepper (capsicum annuum L.) plant Tissues. Plant Molecular Biology reporter 20:407-414. December 2002 CHOMCZYNSKI P, MACKEY K. Short technical report. Modification of the TRIZOL reagent procedure for isolation of RNA from Polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 19(6): 942-5. (1995) CHOMCZYNSKI; SACCHI. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1, 581-585. 2006 GOMEZ; SAMBUCCETTI; DEL REAL; BERMUDEZ. Obtencin del RNA total de hipfisis de rata mediante el mtodo guanidinio/CsCl modificado. Revista Colombiana de Qumica. Vol 22, n2. Bogot-Colombia 1993. Bibliografa escrita DNA AGUILAR; ALONSO; BARRERO. Estandarizacin del mtodo de extraccin de cidos nucleicos en muestras comerciales enlatadas de atn (Thunnus sp,) Revista Venezolana de Ciencia y Tecnologa de Alimentos. 2 (1):061072. Enero-Junio. 2011 Falcn, Luisa I. y Valera, Aldo. 2007. Extraccin de cidos nucleicos (Captulo 16). Las herramientas moleculares (Quintaparte). En Ecologa Molecular. (pp. 499-516). Mxico, D. F., Mxico: Secretara del Medio Ambiente y Recursos Naturales Instituto Nacional de Ecologa Universidad Nacional Autnoma de Mxico. ARMAS; CAP; GONZALEZ; MEDEROS; DAZ. Extraccion de ADN de tejidos embebidos en parafina por Chelex-100. VIII Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatoma Patolgica - Patologa Molecular. Octubre 2006 NARDELLI; I. TNEZ; CENTRN; H. CASSINI. Tcnicas de muestreo no invasivas aplicadas al estudio gentico de mamferos. INTERCIENCIA. Vol 36 n 6. Junio 2011. ARMAS; CAP; X. LPEZ; MEDEROS; DAZ. Comparacin de tres mtodos de extraccin de ADN de tejidos embebidos en parafina. Biotecnologa Aplicada Vol 28 n1: 40-43. 2011

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CERVANTES GONZALES. Obtencin de ADN til para anlisis gentico, a partir de uas recortadas. Rev. Medica Herediana Vol14 n4. 2003.

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[Escriba el ttulo del documento] Anexos:

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Figura#01: Gel conteniendo corridas electroforticas de DNA y RNA (DNA parte superior y posillos 22- 24 parte inferior; RNA parte inferior)

DNA 22 23 24 16 17 18 19 20

muestras de RNA 21 22 23 24 25 26 27 28 30 32 33 34

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9
Muestras de RNA 35 39 40 41 Muestras de DNA 42

1 2 3 4 12 13 14 15 21

5 6 8 9 10 11 16 17 18 19 20

Figura#02: Gel conteniendo la continuacin de la corrida electrofortica de RNA(ntese que solo los posillos 35 y 42 sealan bandas rismicas; flechas negras)

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Tabla #01 .-datos de Extraccion de Dna # # muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA FRESCA ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ALCOHOL ENLATADO ENLATADO ENLATADO ENLATADO

10
peso tejido (g)
0.051 0.060 0.045 0.048 0.045 0.055 0.052 0.041 0.034 0.033 0.033 0.020 0.027 0.023 0.023 0.026 0.057 0.020 0.032 0.046 0.058 0.060 0.068 0.053

DATOS dilucin A230 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

0.154 0.197 0.119 0.212 0.251 0.184 0.299 0.205 0.307 0.207 0.259 0.144 0.261 0.226 0.203 0.188 0.336 0.173 0.192 0.098 0.180 0.207 0.190 0.223

ABSORBANCIAS A260
0.080 0.138 0.031 0.169 0.163 0.113 0.092 0.084 0.097 0.072 0.197 0.037 0.132 0.070 0.056 0.045 0.169 0.031 0.041 0.013 0.083 0.145 0.130 0.185

A280
0.023 0.044 0.011 0.044 0.054 0.034 0.043 0.035 0.061 0.039 0.054 0.017 0.052 0.033 0.030 0.016 0.057 0.014 0.019 0.013 0.054 0.073 0.073 0.105

RESULTADOS INDICES CONCENTRACION A260/A230 A260/A280 ug/mL ug/g Tej. 0.519 3.478 120 235.294 0.701 3.136 207 345.000 0.261 2.818 46.5 103.333 0.797 3.841 253.5 528.125 0.649 3.019 244.5 543.333 0.614 3.324 169.5 308.182 0.308 2.140 138 265.385 0.410 2.400 126 307.317 0.316 1.590 145.5 427.941 0.348 1.846 108 327.273 0.761 3.648 295.5 895.455 0.257 2.176 55.5 277.500 0.506 2.538 198 733.333 0.310 2.121 105 456.522 0.276 1.867 84 365.217 0.239 2.813 67.5 259.615 0.503 2.965 253.5 444.737 0.179 2.214 46.5 232.500 0.214 2.158 61.5 192.188 0.133 1.000 19.5 42.391 0.461 1.537 124.5 214.655 0.700 1.986 217.5 362.500 0.684 1.781 195 286.765 0.830 1.762 277.5 523.585

339.118

389.946

346.876

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Tabla #02.- Datos de Extraccion de Rna # # muestra 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 32 33 34 35 39 40 41 42
PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY PEJERREY

peso tejido (g)

0.0497 0.0374 0.0612 0.0388 0.0459 0.0409 0.0377 0.0500 0.0553 0.0450 0.0402 0.0457 0.4840 0.0306 0.0363 0.0333 0.0423 0.0370 0.0470 0.0521 0.0411 0.0630 0.0396

DATOS dilucin A230 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

0.419 0.244 0.509 0.327 0.330 0.322 0.677 0.802 0.487 0.548 0.206 0.311 0.553 0.193 0.553 0.328 0.352 0.194 0.303 0.483 0.701 0.547 0.168

ABSORBANCIAS A260
0.235 0.201 0.824 0.372 0.326 0.614 0.269 0.541 0.276 0.348 0.365 0.656 0.464 0.064 0.574 0.430 0.599 0.192 0.272 0.888 0.553 0.603 0.161

A280
0.104 0.102 0.263 0.120 0.147 0.176 0.151 0.195 0.135 0.180 0.121 0.190 0.135 0.040 0.175 0.100 0.168 0.064 0.135 0.250 0.158 0.169 0.094

RESULTADOS INDICES CONCENTRACION A260/A230 A260/A280 ug/mL ug/g Tej. 0.561 2.260 282 567.404 0.824 1.971 241.2 644.920 1.619 3.133 988.8 1615.686 1.138 3.100 446.4 1150.515 0.988 2.218 391.2 852.288 1.907 3.489 736.8 1801.467 0.397 1.781 322.8 856.233 0.675 2.774 649.2 1298.400 0.567 2.044 331.2 598.915 0.635 1.933 417.6 928.000 1.772 3.017 438 1089.552 2.109 3.453 787.2 1722.538 0.839 3.437 556.8 115.041 0.332 1.600 76.8 250.980 1.038 3.280 688.8 1897.521 1.311 4.300 516 1549.550 1.702 3.565 718.8 1699.291 0.990 3.000 230.4 622.703 0.898 2.015 326.4 694.468 1.839 3.552 1065.6 2045.298 0.789 3.500 663.6 1614.599 1.102 3.568 723.6 1148.571 0.958 1.713 193.2 487.879

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[Escriba el ttulo del documento] Actividades Complementarias: Extraccion de DNA

1. Explicar los principios de los reactivos utilizados para la extraccin de DNA
Bromuro de etidio.- Conocido tambin como Bromuro de hexadeciltrimetilamonio ((C16H33)N(CH3)3Br), es una sal cuaternaria, que es ampliamente usada en tcnicas de biologa molecular en los laboratorios debido a su propiedad de agente intercalaste entre las hebras del ADN. Emite fluorescencia cuando es irradiado con luz UV. Es conocido tambin por ser un agente altamente mutaren al contacto con la piel o el tracto respiratorio. TRIS (Hidroximetil amino metano).- Tris es el nombre abreviado del compuesto orgnico conocido como tris(hidroximetil)aminometano, de frmula (HOCH2)3CNH2. Se utiliza ampliamente en bioqumica y biologa molecular en particular para preparar disoluciones tampn. Es una amina primaria, con la reactividad tpica, por ejemplo la condensacin con aldehdos y el establecimiento de un equilibrio cido-base (responsable de su capacidad tamponante). El Tris tiene un pKa de 8,06, lo que le aporta capacidad tamponante efectiva en un intervalo de pH entre 7,0 y 9,2.
EDTA Acido etilendiaminotetraactico.- es una sustancia comercializada en forma de polvo blanco, soluble en agua de

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peso molecular 292,24 g/mol y de formula global C10H16N208 y usada como agente quelante en biologa molecular debido a su capacidad de crear complejos con iones de metales pesados en solucin que tengan una estructura de coordinacin octadrica, formando complejos coordinados cclicos no inicos virtualmente no disociable y solubles en agua. Tambin tienen importancia farmacolgica debido a que el EDTA y sus sales sdicas derivadas se utilizan para precipitar metales pesados txicos de manera que puedan ser excretados por la orina, as tenemos que forman fuertes quelatos con el plomo, el cadmio y el nquel. Cabe resaltar que pare que tenga una ptima funcin quelante debe actuar bajo un estrecho margen de pH alcalino, dentro del cual est la sangre y los lquidos tisulares. Buffer CTAB.- conocido tambin como bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB), es una sal de amonio cuaternario cuya frmula es ((C16H33)N(CH3)3Br), con un grupo alquilo de gran longitud con actividad surfactante catinica. Su uso en los diversos protocolos de extraccin en biologa molecular, radica en su capacidad de precipitar cidos nucleicos y polisacridos cidos en soluciones de baja concentracin catinica, haciendo que las protenas y polisacridos

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permanezcan neutros; sin embargo en soluciones de con alta concentracin inica, el CTAB forma complejos con las protenas y los polisacridos pero no precipita cidos nucleicos. Es por esta razn que su uso es ampliamente adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales, derivados de estas y de bacterias que producen grandes cantidades de polisacridos y compuestos fenlicos (Murray y Thompson, 1980), que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y por lo tanto, su calidad. Buffer TE.- es una solucin buffer comnmente usada en biologa molecular, especialmente para procedimientos que envuelven a DNA o RNA. TE es la abreviatura de sus componente Tris, un tampn de pH comn, y EDTA, una molcula que quela cationes como el Mg+2. El propsito de este buffer es solubilizar el DNA o el RNA, mientras lo protege de la degradacin. Estudios realizados con nucleasas en los aos 80s, se dio a ver que los rangos de pH podan ajustarse a diferentes aplicaciones, por ejemplo a pH 8 el DNA puede guardarse para reducir la depurinizacion la cual es catalizada en medios cidos, mientras el RNA guardado a pH 7,5 debido a la catalizacin degradativa de las bases del RNA. Cabe aadir que las nucleasas se ven inactivadas por el EDTA debido a que este secuestra los cationes divalentes necesarios como cofactores para el funcionamiento de las nucleasas. Mercaptoetanol.- llamado tambin -mercaptoetanol o 2-HGidroxietanol, es un tioglicol liquido incoloro; de masa molecular 78,1 g/mol y de formulacin C2H6OS/HSCH2CH2OH. Su uso en bioqumica as como en biologa molecular est muy extendido debido a su habilidad de disociar puentes de disulfuro, una caracterstica muy apreciada cuando se emplea en protocolos de aislamiento de RNA, donde se busca eliminar las ribonucleasas liberadas durante la lisis celular; es aqu donde el mercaptetanol desestabiliza la estructura terciaria de las ribonucleasas por ruptura de puentes S-S previniendo la digestin del RNA durante su extraccin. Cloroformo: alcohol isoamlico.- la adicin de cloroformo alcohol isoamlico (24: 1) durante la extraccin tiene como fin una combinacin de efectos obtenidos por ambos compuestos, ya que por separado cada uno se utiliza para separar protenas y polisacridos de los cidos nucleicos, pero la utilizacin de ambos juntos permite la agregacin de los complejos protena-polisacrido- El cloroformo es ms denso que el agua, por lo que luego de una centrifugacin se forman dos fases, la inferior en donde se encuentra el cloroformo-alcohol isoamlico con las protenas y los polisacridos, y una fase superior en la cual se mantiene el DNA.

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2. Determinar la diferencias entre los detergentes aninicos, catinicos y no inicos, su aplicacin en las 14 extracciones
Los detergentes conocidos tambin como surfactantes o sustancias anfiflicas son bsicamente molculas con una parte lipofilica (L) que generalmente es un radical hidrocarbonado y otra parte hidroflica (H) o polar de la molecular, que es en general un grupo oxigenado. Segn el tipo e disociacin del grupo hidroflico en fase acuosa los detergentes pueden ser aninicos, catinicos, no inicos o anfteros. As tenemos que los detergentes aninicos al disociarse en fase acuosas un in cargado negativamente aporta las propiedades de actividad superficial, como por ejemplo los derivados del ion sulfato o de sulfonados como el dodecil sulfato de sodio o dodecil bencensulfonato de sodio; los detergentes catinicos actan de igual forma slo que en este caso es el in cargado positivamente el que aporta las propiedades de actividad superficial, como los derivados de compuestos cuaternarios de amonio como el Hexadecil trimetil bromuro de amonio (CTAB). Los tensioactivos no inicos no pueden disociarse en iones, pero son solubilizados en agua debido a la presencia de grupos polares. En algunos casos los tensioactivos no inicos no poseen una cola claramente definible como hidrofbica, pero aun as, las propiedades tensioactivas continuarn dependiendo del balance de las caractersticas hidrofbicas e hidroflicas de los diferentes grupos en la molcula, as tenemos a los alcoholes grasos o fenoles. Los tensioactivos anfteros son sustancias en las que los grupos hidroflicos pueden tener una carga positiva, negativa o ambas en disolucin acuosa, dependiendo del pH, generalmente en medio bsico son aninicos y en medio cido catinicos. Sin embargo a pesar de la amplia gama de detergentes que se pueden aplicar a los protocolos de extracciones estos estn limitados al tipo de adsorcin que tiene las molculas del surfactante con la macromolcula a querer retirar, as tenemos que se necesitan detergentes de origen aninico para retirar protenas o membranas como el SDS (dodecil sulfato de sodio) o el Sarkosyl (lauril sarcosina), o detergentes catinicos para solubilizar polisacridos como el CTAB.

3. Investigar otros protocolos. Funcin y principio del Chelex. Aplicaciones

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Metodologa a usar en caso de muestras enlatadas (modificacin hecha por Amarys Aguilar et al. para Thunnus sp. Universidad Central de Venezuela 2011) o Se homogeniza 2g de tejido muscular en 5mL de buffer 1 (tris-HCL 50mM; ph 8; EDTA 0,1M; SDS al 1% y NaCl 0,2M) empleando el Mixer Homogenizer (Omni Internacional). o Se trat con 200L de protena K 5mg/mL a 55 C por toda una noche en agitacin constante. o A la maana siguiente se incuba x30min en hielo y se centrifuga a 13400 x g/1 min. o El sobrenadante se trat 2 veces con un volumen igual de fenol/cloroformo (1: 1), centrifugando a 13400 x g/5 min en cada tratamiento. o Se precipitan los cidos nucleicos con 2 volmenes de etanol puro y centrifugando a 13400 x g/10 min. o Se resuspende el sedimento en 100L de agua destilada estril. Metodologa de extraccin de DNA de tejidos embebidos en parafina o Se lava cortes el tejido con xilol, y luego 2 veces con etanol de manera similar a lo estipulado por Lench y col.(*) o Los cortes de tejido se resuspenden en 300L de solucin amortiguadora TEN (Tris-HCl 0.04M, pH 8.3; NaCl 0.2M, pH 8.0; EDTA 1mM) con 5 L de proteinasa K y 5.25 L de SDS al 20%, como reportan Ghossein y col. (**) o La solucin se incuba a 55 oC durante 4 horas, y se calienta a 100 oC durante 10 min para inactivar la proteinasa K. o El sobrenadante tras la centrifugacin a 13000 g x10min, se precipita con 2 volmenes de etanol absoluto, en presencia d NaCL 0.2M. o La solucin se incuba a temperatura ambiente x 30min, se recentrifuga a 13000 RPM x 30min, y el precipitado se resuspende en 40 L de agua destilada estril. (*) Lench N, Stainer P, Williamson R. Simple non-invasive method to obtain DNA for gene analysis. Lancet 1988; 1(8599): 1356-8 (**) Ghossein RA, Ross DG, Salomon RN, Rabson AR. A search for mycobacterial DNA in sarcoidosis using the polymerase chain reaction. Am J Clin Pathol. 1994; 101:733-7

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Metodologa aplicada a tcnicas de muestreo no invasivas en mamferos: heces

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o Las heces se resuspenden en solucin 1 : 2 de etanol absoluto y buffer CTAB (Tris-HCl 0.1M pH8; NaCl 1.4M; EDTA 0.02M; CTAB 2%) teniendo en cuenta que el volumen de heces a resuspender debe contener el suficiente material para una extraccin exitosa de DNA. Las muestras se incuban x 2horas a 70oC, se las deja enfriar a temperatura ambiente y se las centrifuga 14000 RPM x10 min. El sobrenadante se somete a extraccin por fenol- cloroformo (*Sambrook et al. 1989). El pellet obtenido se resuspende en 180L de buffer ATL (Qiagen), completndose la extraccin con el kit de Qiagen DNeasy Blood and Trissue Kit siguiendo las especificaciones del fabricante. El DNA obtenido se seca a temperatura ambiente, se resuspende en 50-100L de agua destilada estril, pudindose guardar a -20oC. (*) Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T . Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a Ed-Cold Spring Harbor Press. New York- EEUU 1989.

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Metodologa aplicada a tcnicas de muestreo no invasivas en mamferos: pelos modificacin del protocolo de (*)Anderson et al. (2006) por Maximiliano Nardelli y col. Universidad Nacional de Lujan 2011 o Se toma 0.5 cm del extremo proximal de unos 10-20 pelos, incubndolos una noche a 55oC en 50L de buffer TNES (Tris-HCl 50mM pH 8; NaCl 100mM, EDTA 2mM; Nonidet P-40 1%) y proteinasa K 2mg/ml. o Se calienta la mescla a 94oC para desnaturalizar la enzima. La eliminacin de protenas se sigue segn lo propuesto por Anderson et al (2006)* y se implementa a esto al extraccin por fenol-cloroformo (Sambrook et al. 1989)**. o El ADN se resuspende en 50-100L de agua destilada estril y se puede almacenar a -20oC. (*)Anderson HM, McCAfferty DJ, Sacchers IJ, McCluskie AE. Non-invasive genetic sampling of Eurasian otter (Lutra lutra) using hairs-2006. Hystrix It. J. Mamin 17;65-77 (**)Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T . Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a Ed-Cold Spring Harbor Press. New York- EEUU 1989.

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Metodologa aplicada a la extraccin de DNA por uas recortadas en humano o Se obtienen las uas (utilizando un cortaas ordinario) y se las sumerge en alcohol, de 70%. o Se incuban las uas (150mg aproximadamente) a 55oC x72horas en solucin lisis conteniendo EDTA 2mL (0.5M, pH8.0- Nacalai tesque Inc, Japan), 200mL de protena K (20mg/mL-Boehringer Mannheim, Germany) y 200mL de SDS al 10% (Valley Biomedical Inc, EEUU). o Se extrae el DNA del sobrenadante por medio de columnas conteniendo una matriz de fibra de vidrio de GFX Genomic Blood Purification Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Funcin y Principio del Chelex: El Chelex ( Chelex-100 nombre comercial) es una resina preferentemente capturadora de iones metlicos polivalentes en soluciones, muy usada en el campo de la gentica molecular, ciencias forenses, deteccin molecular de diferente especies de bacterias y estudios virolgicos, dada la simplicidad y rapidez con la que permite trabajar las muestras. El efecto del Chelex es de prevenir a travs de su accin quelante la ruptura del DNA a altas temperaturas catalizada por iones involucrados en las muestras de trabajo. Una aplicacin prctica es por ejemplo para extraer DNA a partir de muestras embebidas en parafina (TEP), a continuacin se detalla el protocolo donde se trabaja con Chelex-100 para extraer DNA de Mycobacterium tuberculosis de tejidos en TEP: o (*)El procesamiento de extraccin de ADN del corte histolgico del bloque de parafina fue llevado a cabo utilizando 150uL de una solucion de Chelex-100 al 5% y calentando a 100oC por 30 minutos. Luego se centrifugo a 13000 rpm por 10 min y se transfiri el sobrenadante a un microtubo estril de 0.5 mL limpio, sin tomar la resina quelante para evitar inhibicin de la RCP (reaccin en cadena de la polimerasa). (*)tomado de: Yaxsier de Armas y col. Extraccion de ADN de tejidos embebidos en parafina por Chelex100. VIII Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatoma Patolgica- Octubre 2006, seccin Patologa molecular. http://conganat.cs.urjc.es

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Actividades Complementarias: Extraccin de RNA

1. Explicar los principios de los reactivos usados para extraccin de RNA

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Trizol.- es una solucin qumica usada en la extraccin de RNA. El Trizol o Tri-reagent es el nombre comercial que se le da a una solucin monofsica de fenol e isotiocianato de guanidina que se le adiciona a la muestra durante la homogenizacin mecnica (lisis celular) para una lisis rpida, solubilizacin de los componentes celulares, inactivacin de las RNAasas, separar el RNA ribosomal de los ribosomas y a la vez mantener la integridad del RNA durante el proceso. Cloroformo.- la adicin de cloroformo al proceso de extraccin es para poder limpiar la muestra de cualquier resto lipdico aun presente y a la vez generar las fases diferenciadores: fase acuosa con el RNA y una fase orgnica (donde se encuentran las protenas desnaturalizadas), el DNA se queda en una interfase Alcohol isopropilico.- es un alcohol incoloro, inflamable, de olor intenso y miscible en agua. Este alcohol secundario es usado ampliamente en tcnicas de extraccin de cidos nucleicos ya que ayuda a precipitar estos ya que no son solubles frente a alcoholes, sin embargo a diferencia del etanol, no es necesario que el isopropanol este frio.

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2. Funcin del DEPC, Tiocinato de guanidina, urea

DEPC.- el dietil pirocarbonato (DEPC), es un eficiente inhibidor no especifico de las RNAasas. Es tpicamente usado para tratar agua y soluciones donde es necesario trabajar con RNA no degradado. El DEPC reacciona con los grupos amino, hidroxy y tiol de las protenas con actividad enzimtica como las RNAasas. Cuando se va a trabajar con agua con DEPC, se tiene que autoclavar la misma (120oC x30min) para eliminar cualquier traza el DEPC ya que produce modificaciones qumicas a los residuos de purinas (A+G) en el RNA por carboxymetilacion. Tiocinato de guanidina.- este compuesto es ampliamente usado en gentica molecular por ser un excelente agente caotrpico, desestabilizante de protenas en general. Su uso durante los protocolos de extraccin de cidos nucleicos incluye una funcin de lisador celular as como de prevenir la digestin por RNAasas y DNAasas mediante la denaturacin de las mismas.

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Urea.- usualmente se le suele acompaar, para las extracciones de cidos nucleicos, junto a cloruro de litio dando lugar a la inactivacin de las RNAasas y permitiendo la desnaturalizacin con proteinasa K. Despus de esto se les suele eliminar en una sola extraccin, y los cidos nucleicos se precipitan con etanol absoluto frio o isopropanol.

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3. Investigar otros protocolos y aplicaciones

Metodologa aplicada a la extraccin de RNA y DNA simultneamente a partir de medula sea en humanos por el kit UMSagen Protocolo, usado para extraer RNA y DNA aprovechando las diferentes caractersticas de solubilidad en fase orgnica y acuosa. o Las muestras deben estar almacenadas a 4oC. o Descongelar la muestra y agitar en vortex y agregar 30L de acetato de sodio, 330L de Fenol acido, 100L de Cloroformo: alcohol isoamlico (49: 1), mezclar en vortex y dejar 10min a -20oC. o Centrifugar a 13000 rpm x15min a 4oC. Recuperar el sobrenadante en otro tubo eppendorf y agregar 500L de isopropanol y mezclar suavemente por inversin. Extraccion de DNA Sacar el DNA precipitado con la punta de la micropipeta en un tubo eppendorf que contenga 500L de etanol frio 70%. Centrifugar a 13000 RPMx5min, desechar el sobrenadante y secar el sedimento a temperatura ambiente. Agregar 200L de agua destilada estril y dejar a temperatura ambiente hasta que se disuelva el DNA. Almacenar a 4oC. Extraccion de RNA Dejar a -20oC x60min. El tubo que contiene RNA. Centrifugar a 13000 RPM x15min a 4oC y decantar el sobrenadante. Agregar 500L de etanol frio 70%, mezclando por inversin.

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Centrifugar a 13000 RPM x5min a 4oC. Resuspender el sedimento con 50L de agua DEPC fra, 5L de acetato de sodio, 100L de etanol absoluto frio; mezclar por inversin y dejar a -20oC por una noche. Centrifugar a 13000 RPM x15min a 4oC y decantar el sobrenadante. Secar totalmente el sedimento a temperatura ambiente y resuspender el sedimento con 30L de agua DEPC. Preservar a -20oC.

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Metodologa de extraccin de RNA aplicada a plantas Capsicum annuum L. o o El tejido vegetal elegido debe haber estado previamente fijado en nitrgeno lquido a -70oC Colocar 500L del buffer de extraccin (tiocinato de guanidina 4M; citrato de sodio 25mM pH 7; Sarcosyl 0,5%solucin preparada con agua trata con DEPC y pH ajustado a 8) y 500L de fenol saturado con TE en un tubo microcentrfuga. Aadir 3,5L de 2-mercaptoetanol y 50L de acetato de sodio 3M. Moler 200 mg del tejido, y transferirlos al tubo preparado anteriormente. Agitar en vortex la muestra e incubar a temperatura ambiente x5min. Aadir 200L de cloroformo- alcohol isoamlico (24: 1), llevarlo al vortex x1min y dejar reposar por 12min a temperatura ambiente. Centrifugar al mximo por 15min. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Adicionar 500L de isopropanol y mezclar por inversin. Reposar la muestra x7min a temperatura ambiente. Centrifugar al mximo x10min. Descartar el sobrenadante. Lavar el pellet con 1mL de etanol 75%. Centrifugar al mximo por 5min a 4oC. Descartar el sobrenadante, Dejar secar el pellet x10min a temperatura ambiente. Disolver el pellet en 200L de TESAR (10mM Tris-HCl ph7,6; 1mM EDTA; 1% Sarcosyl todo preparado con agua tratada con DEPC). Aadir 200L de aq/CTAB y 200L de bu/CTAB. Agitar 2 min en el vortex, luego centrifugar a mxima velocidad por 5min a temperatura ambiente. Se observaran fases, remover la fase superior que contiene bu/CTAB y reservar en un tubo nuevo. Re-extraer la capa inferior con 200L de bu/CTAB.

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o o o o o o o o o Remover la capa superior y combinarla con el bu/CTAB reservado. El RNA ahora esta con la sal de CTAB y es soluble en butanol. Aadir 150L de 0.2M NaCl para combinar las fases. Agitar en vortex x30 segundos y centrifugar x5min. Transferir la capa superior conteniendo butanol a un tubo nuevo. Ahora el RNA es una sal de sodio y esta soluble en la fase acuosa (fase inferior). Reservar la fase acuosa. Re-extraer la capa de butanol con 150L y 0.2M de NaCl. Colectar la capa inferior y combinar con la fase acuosa reservada anteriormente. Aadir 300L de cloroformo para combinar las fases. Agitar en vortex por 30 segundos. Centrifugar a mxima velocidad a 4oC x5min, transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Aadir 1/10 volmenes de acetato de sodio y 2,5 volmenes de etanol a la fase acuosa para precipitar el RNA. Incubar la muestra a -20oC por al menos 1 hora. Centrifugar a velocidad mxima a 4oC x5min. Secar el pellet a temperatura ambiente y resuspenderlo con agua tratada con DEPC.

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Metodologa usada para extraccin de RNA en la hipfisis de huesos o o o o Tomar muestras de aproximadamente 250mg y homogenizar con 3mL de solucin a pH7 (isotiocinato de guanidina 4M; citrato de sodio 5mM; Sarcosil 0,5% y mercaptoetanol 0,1M) por 2min. Centrifugar a 12000 g x10min a 12oC. Calentar el sobrenadante a 65oC por 2 min. Adicionar CsCl solido hasta alcanzar una concentracin de 0,1mg/mL Transferir a un tubo de ultracentrfuga junto a 3mL de solucin a pH7 compuesta por CsCl 5,7M en EDTA 0,1M. observar fases. Centrifugar a 60000 g x 12h a 22oC, retirar el sobrenadante y el precipitado lavarlo con etanol 70% (3x300L) Redisolver en un buffer EDTA 5mM-Sarcosil 0,5%-mercaptoetanol 0,1M (600L) y extraer (3x 600L) con cloroformo: alcohol isoamlico (24: 1). Observar fases. Precipitar el RNA con acetato de sodio 3M(57L) y etanol absoluto frio (1,5mL; 2,5 vol) Lavar el RNA separado con etanol 79% (2x 100L) y disolver en agua el pellet en agua tratada con DEPC (160L).

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