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ISSN 00347272

Efeitos antibacterianos de um novo medicamento o leo ozonizado - comparados s pastas de hidrxido de clcio
Antibacterial effects of a new medicament- the ozonized oil- compared to ca lei um hydroxide pastes
Jos F. Siqueira Jr
Coordenador da Disciplina d Endodontia da Universidade Estcio de S, RJ

Introduo
Tem sido relatado que, em cerca de 40 e 50% dos casos, bactrias sobrevivem aos efeitos do preparo qumico-mecnico de canais radiculares de dentes com necrose pulpar e portadores de leso perirradicular. Bactrias remanescentes representam um potencial para o fracasso a longo prazo do tratamento endodntico. Por estas razes, uma estratgia antimicrobiana deve ser direcionada para eliminao de microorganismos residuais, erradicando a infeco e reduzindo os riscos de fracasso. Tem sido revelado que o emprego de uma medicao intracanal entre as sesses do tratamento endodntico induz desinfeco do sistema de canais radiculares, atuando, particularmente, sobre as bactrias remanescentes no afetadas pelo preparo qumico-mecnico (18,22). Vrias substncias tm sido preconizadas para o uso como medicao intracanal. As mais utilizadas so os derivados fenlicos e aldedicos, o hidrxido de clcio e a dorexidina (6). O hidrxido de clcio, em funo da baixa solubilidade, tem sua atividade antibacteriana restrita s bactrias em contato direto com essa substncia. Assim, para uma atividade antibacteriana mais pronunciada e em maior extenso no interior do sistema de canais radiculares, o hidrxido de clcio tem sido associado dorexidina ou a compostos fenlicos e aldedicos (6,17). Muitos trabalhos tm recomendado como medicao intracanal a assodao hidrxido de cldo/paramonodorofenol canforado (PMCC)/glicerina, em razo de sua atividade antibacteriana e de preenchimento do canal radicular (18,19,21). Todavia, existe um interesse dentfico permanente de se buscar substndas mais efetivas, com ao mais rpida e de melhor comportamento biolgico diante dos teddos perirradiculares.

Isabela N. Roas
Professora da Disciplina de Endodontia da Universidade Estcio de S, RJ

Claudia C. Cardoso
Pesquisadora do Centro de Estudos do Qznio. Universidade de Alfenas, MG

Srgio B. Macedo
Coordenador da Disciplina de Cirurgia Bucomaxilofacial, Universidade de Alfenas MG

Hlio P.Lopes
Coordenador do Curso de Especializao em Endodontia da ABE-RJ

Sinopse
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana do leo ozonizado e do hidrxido de clcio, associado ao paramonoclorof enol c anforado (PMCC)/glicerna ou ao tricresol formalina/glicerina contra bactrias, comumente envolvidas na etiopatogenia das doenas perirradiculares. A metodologia empregada foi o teste de difuso em gar. A maior eficcia de atividade antibacteriana foi observada para o leo ozonizado. UNITERMOS: Edicao intracanal; atividade antibacteriana; tratamento endodntico.

Abstract
The purpose of this study was to evaluate the antibacterial activity ofthe ozonized oil and calcium hydroxide pastes against bactria! species commonly associated with the etiology of periradicular pathoses. The method used was the agar diffusion test. Ofthe medicaments tested, the ozonized oil was the more effectve against the bacterial species tested. UNITERMS: Intracanal medication; antibacterial activity; root canal therapy

O oznio veiculado em leo vegetal, dentre as possveis substndas com o intuito de alcanar os objetivos mencionados, apresenta algumas caractersticas biolgicas interessantes: ao bacteridda, inativao de fungos e vrus, efeito debridante e estmulo angiognese (1,9,23). O gs oznio, descoberto por Schonbein, em 1840, uma variedade alotrpica do oxignio, constitudo por molculas triatmicas deste elemento qumico. Em medicina, sua utilizao conhecida como ozonoterapia, onde o oznio, sintetizado por geradores medicinais a partir de oxignio puro, utilizado em concentraes trinta vezes inferiores quelas para fins industriais (1,23). Devido sua alta instabilidade, o gs oznio deve ser incorporado a fluidos, como, por exemplo, a leos vegetais (oliva ou girassol) (4,24). Os primeiros trabalhos desenvolvidos sobre a ozonoterapia tratavam de infeces superficiais como lceras, abscessos e fstulas, onde os efeitos antimicrobianos e debridantes do oznio foram observados (9,10). Estudos revelaram resultados satisfatrios quando da utilizao do oznio no tratamento de leses da boca e dos dentes (10,12,13). Baseado nestas premissas, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana do hidrxido de caldo, assodado ao paramonodorofenol canforado, hidrxido de caldo, assodado ao tricresol formalina, e do leo ozonizado contra bactrias comumente envolvidas na etiopatogenia das doenas perirradiculares.

Material e Mtodo
Foi testada a atividade antibacteriana dos seguintes medicamentos: a) leo ozonizado (Bioperoxoil, Barcelona, Espanha); b) Pasta de hidrxido de caldo (Rea-

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gen, Rio de Janeiro, RJ) associado glicerina; c) Pasta de hidrxido de clcio asso ciado ao tricresol formalina (TCF) e gli cerina. A proporo de TCF e glicerina foi de 1:10 (v:v); d) Pasta de hidrxido de clcio asso ciado ao PMCC e glicerina. A pasta foi testada nas propores de PMCC e gli cerina de 1:1 e 1:2 (v:v). As pastas foram preparadas em consistncia cremosa. As seguintes espcies bacterianas foram utilizadas neste experimento: Fusobacterium nudeatum subespcie (ATCC10953) F.nudeatum subespde (ATCC 25586) Streptococcus sobrinus (isolado dnico) Streptococcus pyogenes (isolado dnico) Streptococcus oral is (isolado dnico) Streptococcus mitis (isolado clnico) Streptococcus intermedius (isolado dnico) Streptococcus constellatus (isolado dnico) Enterococcus faecalis (ATCC 29212) Lactobadllus casei (isolado dnico) Pseudomonas aeruginosa (isolado dnico) Tambm testou-se a eficcia dos medicamentos contra uma cultura mista, consistindo de saliva humana. Os inculos consistiram de culturas de 24 horas das espdes bacterianas cresddas em caldo "brain heart infusion" (Difco, Detroit, MI, USA), pr-reduzido, esterilizado em anaerobiose (BHIPRAS), suplementado com hemina (5 mg/l) e menadiona (0,5 mg/l). A saliva foi coletada imediatamente antes do experimento e diluda em soluo salina estril na proporo de 1:10 (v:v). A metodologia empregada para se avaliar os efeitos inibitrios dos medicamentos foi o teste de difuso em gar. Placas de gar-sangue com base de "Triptycase-Soy Broth" (TSB) (Difco, Detroit MI, USA), suplementado com hemina e menadiona, foram inoculadas com saliva e as bactrias testadas. Para a semeadura, 0,1 ml de inoculo foi distribudo por toda a superfde do meio com o au-

xlio de swabs estreis. Em seqnda, furos no gar-sangue, com 6 mm de dimetro e 5 mm de profundidade, foram confecdonados com o auxlio de um furador metlico esterilizado, visando deposio das pastas testadas. Discos de papd de filtro estrds saturados com leo ozonizado foram depositados sobre a superfde do gar. Todo o experimento foi realizado em duplicata. Todas as placas foram depositadas no interior de jarras de anaerobiose, nas quais um ambiente anaerbico foi gerado atravs de envdopes do sistema GasPak (BBL, GasPak Plus, Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA). A seguir, foram incubadas a 37C por 72 horas. Ao trmino do perodo de incubao, os dimetros dos halos de inibio do cresdmento bacteriano, em volta dos medicamentos, foram registrados, sendo que, dos valores obtidos, subtraiu-se os 6 mm equivalentes ao dimetro dos furos, com exceo do leo ozonizado. A presena ou no de colnias bacterianas sobre os halos de difuso das pastas de hidrxido de caldo foi examinada com o auxlio de lupa estereoscpica.

Notar crescimento bacteriano em contato com a pasta.

Discusso
Todas as espcies bacterianas utilizadas neste experimento tm sido assodadas a processos patolgicos de origem endodntica (6,22). A saliva foi utilizada em funo de ser composta por uma microbiota mista, representando o que usualmente encontrado no microambiente endodntico. Os resultados do presente trabalho demonstraram que a pasta de hidrxido de caldo com glicerina foi ineficaz contra todas as bactrias testadas. Estes dados corroboram aqueles de estudos prvios (19, 20) e reforam a necessidade de se assodar o hidrxido de caldo a um veculo biologicamente ativo, ou seja, dotado de atividade antimicrobiana. Por ser uma base forte, o hidrxido de caldo exerce um efeito letal sobre clulas bacterianas (17). Entretanto, este efeito observado apenas quando o hidrxido de caldo entra em contato direto com bactrias, gerando uma concentrao de ons h idroxi 1 a mxima que atinge nveis incompatveis com a sobrevivnda bacteriana. Todavia, vrios estudos, utilizando o teste de difuso em gar, demonstraram que pastas de hidrxido de caldo em veculos inertes (gua destilada, soro fisiolgico, glicerina e outros) foram ineficazes em inibir o crescimento de vrias espdes bactria na anaerbias estritas e facultativas (2,21). Para LEONARDO et ai. (5), a pr-incubao das placas com a finalidade de permitir a difuso da pasta de hidrxido de caldo com veculo inerte no meio gar, por perodos curtos de tempo (aproximadamente 2 horas), assim como a otimizao do meio com doreto de trifenil-tetrazlio (TTC), aps o perodo de incubao, influendam a leitura dos resultados, possibilitando visualizar a ao antimicrobiana do medicamento. Todavia, as modificaes sugeridas apresenRBO - v. 57, n. 4, Jul./Ago., 2000

Resultados
As mdias dos dimetros dos halos de inibio de crescimento bacteriano observados para cada medicamento testado so mostradas na Tabda 1. Discretos halos de inibio de crescimento bacteriano foram associados pasta hidrxido de cldo/ICF/ glicerina. Os maiores halos de inibio foram observados para o leo ozonizado. As pastas de hidrxido de cldo/PMCC/glicerina tambm apresentaram eficda antibacteriana pronundada, prindpalmente na proporo PMCC/glicerina de 1:1. Por sua vez, a pasta de hidrxido de caldo em glicerina apresentou ausncia de efeito inibitrio sobre todas as cepas bacterianas testadas (Figura 1).

I Ausncia de efeito inibitrio induzido pela Pasta de Hidrxido de Clcio/Glicerina.

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tam alguns inconvenientes, os quais a tomam bastante propensa a falhas. A princubao no , na maioria das vezes, vivel, quando se trabalha com bactrias anaerbias estritas fastidiosas (principais patgenos endodnticos), as quais podem no resistir ao perodo de pr-incubao, o qual parece curto para bactrias facultativas, mas que, para anaerbias, usualmente longo demais, mesmo no interior de um ambiente anaerbio (jarras ou cmaras), podendo inviabilizar o crescimento aps a incubao. Todavia, podemos admitir que, em nosso estudo, um perodo bem menor de pr-incubao (aproximadamente 30 minutos) pode ter ocorrido, durante o preparo e a manipulao dos medicamentos testados. O cloreto de trifenil-tetrazlio, utilizado na otimizao, serve para permitir uma melhor visualizao do halo de inibio promovido contra bactrias aerbias e facultativas. Sua eficcia em relao a bactrias anaerbias no comprovada e sua praticidade quando se utiliza gar-sangue (usualmente utilizado para a maioria dos anaerbios) bastante questionvel, uma vez que a visualizao pode tornar-se difcil. Alm disso, falsos resultados podem advir em virtude da possvel reatividade do TTC com componentes dos materiais testados (inclusive substncias alcalinas, as quais oxidam o TTC, alterando sua cor e provavelmente suas propriedades). A visualizao dos halos por microscpio estereoscpico inquestionavelmente um procedimento muito mais seguro e confivel para a visualizao dos bordos do halo de inibio (se presente) ou de colnias bacterianas sobre um halo de difuso (como observado neste estudo para a pasta de hidrxido de clcio em veculo inerte). A Figura 1 mostra claramente colnias bacterianas crescidas sobre o halo de difuso do hidrxido de clcio. Outrossim, o teste foi realizado no presente estudo da mesma forma, tradicionalmente utilizada e amplamente difundida na literatura. Assim, o teste de difuso dos materiais em gar da forma realizada em nosso estudo, mesmo com as limitaes inerentes j conhecidas e apesar do risco de extrapolaes, parece o mais adequado e suportado pela maioria dos trabalhos publicados na literatura especializada, nacional e internacional. A pasta de hidrxido de cldo/TCF/ glicerina apresentou discretos halos de
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inibio de crescimento bacteriano. Estudos tm demonstrado a excelente ao antibacteriana do tricresol formalina (8, 16). Este produto, apresenta concentrao de formalina em torno de 90%. O outro constituinte o tricresol, que est em suspenso aquosa na forma de trs ismeros do metil-fenol (orto, mera e para). O efeito bactericida da formalina se d pela ao alquilante sobre protenas e cidos nudicos microbianos, que se caracteriza pela substituio do tomo de hidrognio de uma hidroxila ou sulfidrila por um radical hidroximetil, causando dano e perda de atividade destas biomolculas (22). No presente estudo, o tricresol formalina foi diludo em glicerina, na proporo de 1:10, o que propiciou uma concentrao de formalina em tomo de 9%. Provavelmente, esta diminuio de concentrao de formalina, assim como possveis reaes qumicas do tricresol formalina com o hidrxido de clcio, possam ter contribudo para os discretos resultados obtidos. O hidrxido de clcio associado ao PMCC e glicerina apresenta pronunciada eficcia antibacteriana, como tem sido demonstrado por diversos trabalhos (18,19,21). Para SIQUEIRA et ai (20), nesta associao, o hidrxido de clcio funciona como veculo, permitindo uma liberao lenta e controlada de PMCC para o meio, o suficiente para ter ao contra bactrias localizadas em reas mais distantes da luz do canal principal. Isto importante pois o PMCC na forma pura extremamente citotxico. Contudo, esta associao biocompanvel quando em contato com os tecidos perirradiculares (17). A glicerina associada dilui a concentrao do paramonodorofenol existente no paramonodorofenol canforado. Abiocompatibilidade da assodao H/P/G pode ser devido ao fato de que os efeitos sobre os teddos perirradiculares sejam provavelmente assodados ao efeito antimicrobiano da pasta, o qual permite que o reparo natural ocorra sem irritao infecdosa persistente. Se a rea da ferida estiver isenta de microorganismos, quando a irritao qumica de baixa intensidade e transitria ocorrer, no h razes para se acreditar que o reparo teddual no ir ocorrer, quando tal agresso for reduzida em intensidade (quando da remoo da medicao) (17). No presente estudo, a assodao do hidrxido de caldo, com volumes iguais

de PMCC e glicerina, apresentou, em mdia, halos de inibio significativamente maiores do que a proporo 1:2 das mendonadas substndas. Isto ratifica o fato de que a atividade antibacteriana da associao proporcional concentrao de PMC existente (21). O leo de girassol ozonizado foi o medicamento que apresentou maior halo de inibio de crescimento bacteriano. Estudos tambm revelaram resultados satisfatrios quando o leo ozonizado foi submetido a testes de toxiddade, tais como LD 50 (oral e intra-peritoneal), irritao oftlmica e drmica e fototoxiddade, alm dos ensaios de teratogeniddadeemutageniddade(3,11,14). O leo de girassol rico em cidos linolico e olico, que possuem ligaes duplas em maior proporo na posio nove da cadeia carbnica. Estas ligaes apresentam alta afinidade pelo oznio. A ozonizao dos ddos insaturados (linolico e olico) do leo de girassol forma os ozondeos. A hidrlise do leo ozonizado pode gerar aldedos, cetonas e perxido de hidrognio (25). Embora no seja um radical livre, o perxido de hidrognio se comporta como tal. Ele atua como oxidante por gerar radicais hidroxila, os quais atacam componentes celulares essendais, como lipdios, protenas e ddos nudicos. Assim, seu efeito antimicrobiano pode se dar ao nvel de membrana dtoplasmtica bacteriana, por oxidao de enzimas e por danos ao DNA (7). Aldedos possuem atividade antimicrobiana, devido induo de ligaes cruzadas em protenas, inibindo vrios sistemas enzimticos essendais para a sobrevivnda da clula. Sua atividade antibacteriana tambm pode ser resultado do efeito alquilante sobre carboxilas, sulfidrilas e hidroxilas, presentes em ddos nudicos e/ou protenas. ddos graxos insaturados possuem efeitos antimicrobianos, os quais podem ser devido incorporao na membrana dtoplasmtica, induzindo perturbaes estruturais letais, por romperem a integridade da membrana e permitir o vazamento de constituintes intracelulares, alm de inibir a aquisio de substrato (aminoddos) (15). Assim, a atividade antimicrobiana do leo de girassol ozonizado pode resultar da ao de aldedos, ddos graxos insaturados e, prindpalmente, do perxido de hidrognio formado.

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Outro mecanismo de ao proposto para o leo ozonizado baseado no paradoxo da participao do oxignio nas funes vitais, pois, apesar do oxignio ser fundamental para algumas clulas e alguns tipos de microorganismos (principalmente no metabolismo energtico), para outras, desprovidas de sistemas de proteo anti-oxidante, este pode apresentar efeitos letais (22). Mesmo

para os microorganismos que possuem tais sistemas, o excesso de oxignio e de seus derivados pode tambm ser altamente lesivo. Tal fato poderia explicar a susceptibilidade de bactrias anaerbias estritas testadas neste experimento. Destarte, o leo ozonizado apresentou excelente atividade antimicrobiana quando comparado com as demais substncias testadas. Tais achados geram um

potencial para a sua utilizao como medicao intracanal. Todavia, outros estudos, avaliando biocompatibilidade, tempo de atuao e propriedades fsicoqumicas, alm do teste de uso, so necessrios para que esta substncia seja efetivamente indicada para uso clnico. Estudos de nossos laboratrios encontram-se em andamento tencionando avaliar muitas destas propriedades.

Tabelai- Dimetros dos halos de inibio doicrescimento bacteriano dos medicamentos testados (em milmetros).
leo ozonizado S.sobrinus S.pyogenes E.faecalis S.mitis S.intermedius ____ S.conste Ilatus F.nucleatum 10953 F.nucleatum 25586 ... P.aeruginosa______

Medicamentos"" H/P/G
1 1 4 NT 1 1
NT 7 5 NT NT NT NT NT

H/T/G
9 8 NT 9 9 16 12 NT 11 11 0 0 10 7 0 0
NT

11 14 13 15 11 16 27 15 18
12 13 14 14,9

S. oralis L. casei Mista MDIAS

1 1 NT 1,4

4
7

NT
6,7

3 8 NT

9,6

0 0 0 0

* H: hidrxido de clcio; T: tricresol formalina; G: glicerina; P: paramonoclorofenol canforado; NT: no testado.

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