AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL Y EL RECONOCIMIENTO DE NUESTRA DIVERSIDAD

PREPARADOS Y COLORACIONES

Nombre:

Castillo checa javier

Curso:

Microbiologa General

Profesor:

Mblgo. Jorge Bermejo Benites

Escuela:

Ing. Agroindustrial e Industrias Alimentarias

 Ciclo:

4 ciclo II Semestre 2011 - PRODEUNP SULLANA

Sullana, 20/01/2012

INTRODUCCIN:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de observar a simple vista e incluso con el microscopio ptico, esto, debido a la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. La forma ms simple de aumentar este contraste es mediante la utilizacin de COLORANTES. Los colorantes se pueden utilizar para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para mostrar la presencia de ciertos constituyentes celulares como flagelos, cpsulas, esporas, paredes celulares, entre otros. La mayora de ellos son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad por los materiales celulares a tratar. Los ms utilizados son molculas cargadas positivamente y tienen a combinarse con constituyentes celulares cargados negativamente, tales como cidos nucleicos y polisacridos cidos. Ejemplos de este tipo de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta, la violeta de genciana y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Se debe tener en cuenta que algunos colorantes teirn mejor slo despus de haber tratado la muestra con alguna otra sustancia qumica muy distinta a los colorantes, a esta sustancia se le denomina mordiente. ste se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar al colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. EI azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.

PRCTICA N 02: PREPARADOS Y COLORACIONES

1. OBJETIVO DE LA PRCTICA: * Conocer y aplicar los diferentes mtodos de coloracin.

2. MARCO TERICO: 2.1 OBSERVACIONES MICROSCPICAS DE BACTERIAS: El examen microscpico de microorganismos constituye una de las tcnicas caractersticas de la Microbiologa y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (por ejemplo los protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloracin de las muestras para aumentar el contraste con el fondo. 2.2 PREPARADOS PARA MICROSCOPA OPTICA: PROCED. GENERAL Los pasos fundamentales para una coloracin son: a) Extendido: se coloca parte de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el asa microbiolgica. Para muestras provenientes de medios slidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos.

b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente o flamearlo sobre la llama de un mechero de alcohol. c) Fijado: la fijacin se realiza para evitar el desprendimiento de la muestra y para mantener la forma original de los microorganismos. Observacin: El procedimiento ms comn es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta tcnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos ms suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetrxido de osmio, cido pcrico, etc.

2.3 COLORACIONES: Las coloraciones en microbiologa se utilizan para observar la morfologa de las bacterias. 2.4 TIPOS DE COLORACIONES: De acuerdo a su complejidad se dividen en:
a) TINCIN SIMPLE:

Esta coloracin permite la observacin de la morfologa y agrupacin de los microorganismos y se llama as porque nada ms usa un solo colorante, que puede ser: - Azul de metileno. - Cristal violeta. - Safranina. - Violeta de genciana. Tcnica. 1- Extender, secar y fijar por calor. Soluciones acuosas al 1%

2- Aplicar solucin de colorante durante alrededor de 1 minuto. En general, el tiempo de la coloracin depende de la concentracin y del colorante utilizado. 3- Lavar con agua corriente. 4- Secar al aire libre o por calor. 5- Observar al microscopio.

Esquemas:
1. Esterilizar el asa:

2. Tomar la muestra con el asa

3. Extensin de la muestra

4. Fijacin con mechero:

5. Coloracin: Azul de metileno

6. Secado y lavado:

7. Observar al microscopio:

b) TINCIN COMPUESTA O DIFERENCIAL:

Es aquella donde se usa ms de un colorante, esta tincin es ms especfica ya que se puede observar no slo la morfologa sino tambin el tamao, organizacin de las bacterias; adems se puede categorizar los microorganismos en varios grupos segn su afinidad con el colorante que se est utilizando. Existen varios tipos de coloracin diferencial, pero los ms empleados son: la tincin o coloracin GRAM, la coloracin de ZIEHL NEELSEN, la coloracin de ESPORAS o WIRTZ, la coloracin de CAPSULA o NEGATIVA. b.1. COLORACIN GRAM: Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Cristhian Gram, quien desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Se debe tener en cuenta que: Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos.

Tcnica de la tincin GRAM: 1. Fijar un frotis: -Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. -Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. -Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos. -Proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina.

-Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo ya que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar.

2. Tincin: Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. 3. Enjuague: Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra. El enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo. 4. Mordiente: Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias. 5. Decoloracin: Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75-95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. 6. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. 7. Tincin de contraste:

Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. 8. Nuevo enjuague: Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

Bacterias resistentes a la tincin Gram: La siguientes gramnegativas: bacterias de naturaleza grampositiva, tien como

Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

Utilidades: En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: -Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin. -A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el

contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibriones.

Causas que alteran la tincin de Gram -A pesar de la gran utilidad, este mtodo debe ser valorado con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas y la tcnica empleada, por ella junto a la muestra deben teirse controles con grampositivas y gramnegativas.

A. CRISTAL VIOLETA - LAVAR B. LUGOL - LAVAR C. ALCOHOL ACETONA - LAVAR D. SAFRANINA (30 60) - SECAR E. OBSERVAR

Esquemas: 1.Esterilizar el asa: 2. Tomar una gota de muestra:

3.Extender la muestra:

4. Fijar la muestra:

5.coloracin:
Safranina + Lavado Lugol + lavado Alc. Acetona +

6. secado

7.Observacin:

b.2 COLORACIN DE ZIELH NEELSEN: La pared celular de los bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) est compuesta por una gran cantidad de lpidos tanto libres como covalentemente unidos: los cidos miclicos y los micsidos. La alta proporcin lipdica otorga a estas bacterias una gran hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para captar colorantes que hace necesaria la utilizacin de mtodos drsticos. Se utiliza fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloracin con cidoalcohol y una contra coloracin con azul de metileno. La mezcla decolorante no podr extraer el colorante de los BAAR que permanecern rojas mientras que las dems bacterias se vern azules. Bacterias resistentes: -Mycobacteria: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae.

Tcnica.

A. Colorante de ZIELH NEELSEN + vapores

B. Lavar C. Alcohol cido para decolorar los Bacillus D. Lavar E. Azul de metileno F. Lavar secar observar

*Los Bacillus de tuberculosis no se decoloran, se ponen azules Esquemas:

1. Esterilizacin del asa:

2. Sacar una muestra con el asa:

3. extensin:

4. Fijacin

5. coloracin

y vapores

6. Secado y observado:

ZIELHZ NEELSEN +VAPORES + LAVADO + AC ACIDO + LAVADO +AZUL DE ETILENO +

b.3 COLORACION DE ESPORAS O DE WIRTZ:

Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a travs de un proceso llamado esporulacin. Los gneros de bacterias capaces de esporular hasta ahora descritos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina. Tcnica: A. Verde de malaquita B. 3 4 vapores C. Lavar D. Safranina 30 60 E. Lavar secar observar

b.4. COLORACON DE CAPSULA O NEGATIVA: Algunas bacterias son capaces de formar por fuera de la pared celular, una envoltura polimrica llamada cpsula que las protege de la fagocitosis e interviene en fenmenos de adherencia a diversos sustratos. Pueden encontrarse cpsulas de variada composicin qumica: polmeros de glucosa y cido glucurnico (Streptococcus pneumoniae), polmeros de cido D-glutmico (Bacillus anthracis) y polmeros mixtos de protenas y carbohidratos (Bacillus megaterium). Las cpsulas pueden observarse como un halo alrededor de las bacterias cuando se realizan tinciones negativas con nigrosina o tinta china pero pueden colorearse especficamente. La tcnica de Novelli, utiliza un colorante especfico para las cpsulas glucdicas que es el Azul Alcin. Para teir la bacteria se utiliza fucsina. Se vern bacterias teidas de rojo rodeadas de la zona capsular azul. Tcnica: 1- Hacer un extendido del material sobre un portaobjetos, secar y fijar a la llama. 2- Cubrir con solucin de Azul Alcin* durante 2,5 minutos.

3- Lavar y escurrir completamente el agua o, mejor an, dejar que se seque. 4- Cubrir con solucin de fucsina diluida (0,1 %) durante 1 minuto. 5- Lavar y secar. A. NIGROSINA O TINTA CHINA

RECOMENDACIONES:

Para el uso correcto de las coloraciones es necesario tomar en cuenta que el alumnos (a) que trabajaran tenga una correcta vestimenta, que tenga previa preparacin referente al tema a tratar y que mantenga la seriedad adecuada durante todo el trabajo. Debe adems conocer los diferentes tipos de coloracin y a qu se aplica cada uno de ellos. Para trabajar con coloraciones se debe tener presente que el colorante no debe alterar bajo ninguna circunstancia la estructura del organismo a utilizar. BIBLIOGRAFIA:

Libro genoma - 4 tomo

www.labtcnico.com