MICROBIOLOGIA

Rosngela C. Alves Leal. Engenheira de Alimentos

ANLISE MICROBIOLGICA DE GUA

MICRO-ORGANISMOS INDICADORES
Sua presena indica que o alimento esteve exposto a condies que pudessem afetar sua qualidade higinica, inocuidade ou vida til. Indicadores da qualidade e/ou vida til dos alimentos, ex. contagem de bactrias mesfilas, coliformes totais; Indicadores da inocuidade dos alimentos, ex. E. coli, S. aureus.

MICRO-ORGANISMOS INDICADORES
Principais razes do uso de organismos indicadores Aparecem em grande quantidade nas fezes humanas; So encontrados apenas nas fezes de animais de sangue quente, classe que inclui o homem e todos os mamferos; Do ponto de vista da resistncia s condies ambientais (temperatura e outros agentes desinfetantes), so muito semelhantes aos microorganismos patognicos intestinais;

MICRO-ORGANISMOS INDICADORES SANITRIOS

So micro-organismos que podem causar doena no ser humano, sendo classificados de acordo com a sua patogenicidade, podendo tambm indicar a presena de outros patgenos; Indicam risco sade.

GRUPO COLIFORME
Sua identificao, do ponto de vista laboratorial, requer tcnicas simples e econmicas, ao contrrio daquelas necessrias identificao dos microorganismos patognicos. Os organismos mais comumente utilizados como indicadores de contaminao so as bactrias do grupo coliforme. A presena de coliformes na gua ou alimento indica poluio com risco potencial da presena de organismos patognicos. H dois subgrupos de coliformes: coliformes totais e fecais.

COLIFORMES TOTAIS
Indicadores da qualidade higinica (higiene do processo, limpeza de superfcies, qualidade da gua, efetividade do processo trmico); Habitam o ambiente; Bactrias bacilos Gram negativas; No esporuladas; Anaerbias facultativas; Fermentam a lactose com formao de gs, aldedo e cido a 35C em 24-48 horas.

COLIFORMES FECAIS
Indicadores de contaminao fecal; Indicadores de inocuidade; Habitante normal do trato intestinal de humanos e outros animais de sangue quente; Apresentam resistncia aproximadamente similar maioria das bactrias patognicas intestinais; Fermentam a lactose com formao de gs, aldedo e cido a 44,5 0,2C em 24-48 horas;

SIGNIFICADO DAS ENTEROBACTRIAS E DOS COLIFORMES TOTAIS EM ALIMENTOS

Falhas no processamento do alimento; Contaminao ps-processamento cruzada, equipamentos sujos, inadequada, gua de m qualidade); (contaminao manipulao

Sem relao direta com contaminao fecal nem presena de patgenos; gua - indicador qualidade e tratamento.

COLIFORMES FECAIS
Coliformes fecais ou Coliformes a 45C ou Coliformes Termotolerantes Grupo de bactrias pertencentes ao grupo coliformes, fermentam a glicose, porm utilizam a lactose com produo de gs a 44,5C/45C no meio de cultura EC. Fazem parte do intestino do ser humano e dos animais de sangue quente. So indicadores sanitrios devido sua presena nas fezes e tambm por constiturem espcies patognicas.
Inclui principalmente Escherichia coli Mas tambm algumas cepas de: Enterobacter e Klebsiella

SIGNIFICADO DOS COLIFORMES FECAIS EM ALIMENTOS

Possibilidade da presena de micro-organismos patognicos entricos (Salmonella, Shigella); Contaminao ps-processamento; Em nmeros elevados falta de higiene, estocagem ou manipulao inadequada; gua: indicadores de poluio fecal indicadores de possveis riscos da presena de patgenos.

HISTRICO DA ESCHERICHIA COLI

1887 Escherich observou que o micro-organismo que hoje conhecemos como Escherichia coli estava sempre presente em fezes. Este micro-organismo foi originalmente denominado Bacterium coli. 1920 foi designado Escherichia coli. 1940 constatao do primeiro surto.
Theodor Escherich 1857 - 1911

PADRO MICROBIOLGICO DE POTABILIDADE DA GUA PARA CONSUMO HUMANO De acordo com o anexo I da Portaria n 2914 do Ministrio da Sade, a gua potvel deve estar em conformidade com o padro microbiolgico conforme Tabela, a seguir:
Tabela 1.1 Padro microbiolgico de potabilidade da gua para consumo humano.

Parmetro

Valor Mximo Permitido

gua para consumo humano (1) Escherichia coli Coliformes totais Ausncia em 100 mL Ausncia em 100 mL

(1) gua para consumo humano em toda e qualquer situao, incluindo fontes individuais como poos, minas, nascentes, dentre outras.

Estudo dos Mtodos Convencionais e Mtodos Rpidos para anlise de gua.

MTODO CONVENCIONAL

Mtodos oficiais descritos em publicaes consideradas de referncia, internacionalmente aceitas. As tcnicas de determinao de coliformes baseadas na fermentao da lactose so trabalhosas, requerem duas temperaturas de incubao (35,5 0,2C para coliformes totais e 44,5 0,2C para coliformes termotolerantes) e sucessivas repicagens, podendo totalizar 72 h para leitura conclusiva.

MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

1. SEMEAR

gua 10 mL

gua 1 mL

gua 0,1 mL

Mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)

2- Incubar a 35C 48h. 3- Proceder leitura e contagem dos tubos positivos (bolhas de ar).

4- Consultar a tabela do NMP Exemplo: GUA Tubos positivos: 5/10 mL 5/1 mL 4/0,1 mL Tabela NMP 5-5-4 = 1600 coliformes em 100 mL de amostra.

Tabela NMP

MTODOS RPIDOS
Alguns mtodos rpidos para a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E. coli em gua:

SimPlate; Membrana filtrante; Petrifilm; Colilert.

SIMPLATE

Contagem de coliformes totais e E. coli; Trata-se de um mtodo enzimtico de substrato definido CPRG-MUG. O kit constitudo por meio de cultura desidratado e placas plsticas estreis, contendo 84 cavidades (SILVA, 2002).

SIMPLATE

galactosidase coliformes totais

O composto vermelho clorofenol -Dgalactopiranosdeo (CRPG), quando hidrolisado pela enzima galactosidase, produz o composto vermelho clorofenol (CRP) que possui colorao laranja a prpura

- glicuronidase E. coli
composto 4-metilumbeliferil -D-glicurondeo (MUG), quando hidrolisado pela enzima glicuronidase, produz o composto 4metilumbeliferona (4-MU) que apresenta cor azul fluorescente quando exposta a luz UV a 365 nm
(SILVA, 2002; OLIVEIRA, 2005).

SIMPLATE

SIMPLATE
Resultados

SIMPLATE
Vantagens do mtodo Facilidade de preparo, j que o meio liofilizado s necessita de adio de gua destilada e esterilizada, dispensando esterilizao do meio e pesagens; Facilita a contagem; Permite maior rapidez na obteno dos resultados; Facilidade de interpretao dos resultados, pois as cavidades apresentam colorao diferenciada podendo ser facilmente submetidas luz UV se tornando fluorescentes.

SIMPLATE

Desvantagens do mtodo No se podem determinar os nmeros reais de unidades de colnias que se formaram, por se tratar de uma tcnica essencialmente NMP; No se pode distinguir a predominncia de um microorganismo sobre o outro; Alguns alimentos podem acusar falso - positivo por apresentarem enzimas que causa a fluorescncia do meio (Ex. iogurte, nozes, fgado, farinha de trigo entre outros); Invivel a deteco de cepas de E. coli, incluindo cepas entero-hemorrgicas (cerca de 6% do total das cepas), pois estas no produzem glicuronidase.

MEMBRANA FILTRANTE

O mtodo das membranas filtrantes um mtodo de alta reprodutibilidade e tornou-se um mtodo comum e normalmente prefervel para avaliar as caractersticas microbiolgicas da gua Este mtodo especialmente empregado para amostras com baixa contagem microbiana. Embora, relativamente grande volume de gua (100mL) pode ser passado pela membrana sem obstru-la. (JAY, 1998).

MEMBRANA FILTRANTE

As membranas utilizadas so de celulose, com poros de tamanhos capazes de reter bactrias (geralmente 0,45m), mas permitem que gua ou diluentes passem por ela (JAY, 1998). VANTAGENS E DESVANTAGENS

MEMBRANA FILTRANTE
VANTAGENS

A membrana pode ser transferida para vrios meios, visando-se seleo ou a diferenciao dos microorganismos (PELCZAR et al, 1981); Os resultados quantitativos podem ser obtidos mais rapidamente que os mtodos convencionais (PELCZAR et al, 1981); Custo total mais baixo que o mtodo dos tubos mltiplos (PRESCOTT et al, 1996);

MEMBRANA FILTRANTE

DESVANTAGENS As guas com alta turbidez limitam os volumes amostrados; Elevadas populaes de bactrias de fundo causam um crescimento excessivo; Metais e fenis podem adsorver os filtros e inibirem o crescimento. (PRESCOTT et all, 1996)

MEMBRANA FILTRANTE
TCNICA RESUMIDAMENTE

A amostra passa por um filtro membranar, que retm as bactrias (PRESCOTT et al, 1996). Depois da filtrao, as membranas contendo as bactrias das amostras filtradas so transferidas para a placa com o gar escolhido para posterior incubao adequada; Depois de incubadas, as colnias so enumeradas.

MEMBRANA FILTRANTE
AMOSTRA coleta preparo para filtrao FILTRAO Simples e rpida; Equipo utilizado: Kitassato, filtro, membranas filtrantes, compressor vcuo.

MEMBRANA FILTRANTE
PESQUISA DE COLIFORMES

FILTRO

KITASSATO

MEMBRANA FILTRANTE

EQUIPO UTILIZADO PARA FILTRAO

MEMBRANA FILTRANTE

Aps a filtrao de 100mL da amostra, a membrana transferida para a superfcie do meio Endo Agar e incubada a 35C por 24 horas. Aps esse perodo, efetua-se a contagem das colnias tpicas de coliformes (com colorao vermelhoescura e/ou com brilho metlico superficial). Para confirmao da presena de E. coli e outros coliformes na amostra, repica-se algumas colnias caractersticas do Endo Agar para as provas bioqumicas.

PROVAS BIOQUMICAS
Os isolamentos so identificados pelo teste de IMVIC
Indol, Vermelho de Metila, Reao de Voges Proskauer e Citrato Simons.

PROVAS BIOQUMICAS

Resultado: IMVC Indol - positivo Vermelho de metila - positivo Voges Proskauer - negativo Citrato - negativo

PETRIFILM

As placas Petrifilm consistem de cartes de papel quadriculado revestido de polietileno recoberto com nutrientes desidratados e um gel hidrossolvel a frio, protegido por um filme plstico superior transparente revestido internamente pelo mesmo gel e um corante indicador 2, 3, 5 cloreto de trifeniltetrazlio (TTC).

PETRIFILM

Ao adicionar a amostra em teste os nutrientes se hidratam, o gel solidifica a mistura, e a placa est pronta para ser incubada. O TTC um corante amplamente utilizado em meios de cultura para a enumerao de bactrias, em amostras contendo interferentes. Os microorganismos vivos reduzem o TTC atravs de enzimas, originando formazano que fica acumulado no interior dos grnulos das clulas e se torna vermelho (SANT'ANA, 2002).

PETRIFILM

O Petrifilm (EC) para contagem de coliformes e E. coli usa o meio de cultura VRB (Violet Red Bile) adicionado de substrato cromognico para -glicuronidase; indicador TTC; goma guar; Utiliza-se 1 mL da amostra entre os 2 filmes e espalha-se por presso.

PETRIFILM

Aps a incubao de 24h a 37C, o crescimento de micro-colnias no Petrifilm de coliformes totais so vermelhas associadas com bolhas de gs. E. coli produz a enzima glicurosidase que reage com o corante indicador formando um precipitado azul. Tambm ocorre a formao de gs
(HAJDENWURCEL, 1998).

O resultado quantitativo, expresso em unidades formadoras de colnias por mililitro (UFC/mL) ou por gramas (UFC/g).

COLILERT

Aplicao: deteco de coliformes totais e E.bcoli em gua; Formulaes comercialmente conhecidas: Colilert e Colilert-MW (Labotatrios Idexx); Disponveis em dois formatos: - tubos descartveis (mtodo dos tubos mltiplos) - recipientes para o armazenamento de 100mL da amostra (teste de presena-ausncia).

COLILERT
Tecnologia de Substrato Definido (DST)

Defined Substrate Technology Formulao desenvolvida especificamente para os micro-organismos os quais se quer analisar; pH e o ambiente qumico de crescimento so otimizados; Nutrientes indicadores especficos: ONPG e o MUG .

COLILERT

Princpio do Mtodo
Teste do Substrato Cromognico e Fluorognico: utiliza substratos hidrolisveis para deteco simultnea das enzimas de coliformes totais e Escherichia coli; Substratos: - ONPG (orto-nitrofenil--D-galactopiranosideo) - MUG (4-metilumbeliferil- -D-glicurondeo)

COLILERT Coliformes totais

Enzima -D- galactosidase + ONPG Orto-nitrofenol

Mudana de cor (AMARELO) Indica teste positivo para coliformes totais

COLILERT
Escherichia coli
Enzima -glicuronidase + MUG 4-metilumbeliferona
(fluorescente sob luz ultravioleta (UV) 366 nm) Indica teste positivo para E. coli

COLILERT

Teste de presena-ausncia
Procedimento: Adicionar o reagente de Colilert assepticamente amostra de 100mL de gua e incubar por 24 h a uma temperatura de 35C; Interpretao dos resultados: - cor amarela = gua contaminada com coliformes totais - cor azul fluorescente na presena de luz UV = gua com presena de E. coli - incolor = no h coliformes nesta amostra

COLILERT

COLILERT
Quanti-Tray

Adicionar o reagente de Colilert ao frasco contendo 100mL de amostra, agitar e despejar todo o contedo na cartela QuantiTray; Incubar a 35C/ 24 h; Interpretao dos resultados: - Cavidades incolores = resultado negativo - Cavidades amarelas = presena de coliformes - Cavidades amarelas/fluorescentes = presena de E. coli Consultar a tabela do NMP para a quantificao.

COLILERT
Quanti-Tray

Obs: Uma cpula positiva equivale a uma bactria em 100mL de gua.

Mesmas placas amarelas submetidas a luz ultra-violeta (UV) Resultado Azul Ecoli 2 amarelo C. Total

Tabelas de NMP Resultados em numeros/100 mL

COLILERT
VANTAGENS

Especificidade: Detecta seletivamente coliformes totais e E. coli, reduzindo ao mnimo os resultados falsos positivos; Rapidez: Detecta coliformes totais e E. coli, simultaneamente, em 24 horas ou menos; permite aes rpidas de controle nos casos de acidentes com redes de distribuio de gua.

COLILERT

Sensibilidade: Detecta desde um micro-organismo vivel (1UFC/100mL) na amostra; recupera bactrias injuriadas; Convenincia: Resultados claros e fceis de ler; melhor mtodo para uso de campo; sempre pronto em casos de emergncia.

COLILERT

Economia: Reduz os custos de mo de obra; no h desperdcios de meio de cultura; Aprovado: AOAC e aceito pelos Mtodos Padro para Exames de gua e Esgoto (Standard Methods forthe Examination of Water and Wastewater).

COLILERT
Desvantagens: Ser aprovado s para gua;

Leitura aps 28h fornece resultado no confivel devido ao efeito limitado do antibitico Solanium: leitura deve ser efetuada entre 24 -28h aps a incubao.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

PELCZAR, M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia, Conceitos e Aplicaes Vols. 1, 524 p. e 2, 517 p., 2 ed., So Paulo, Malron Books, 1996 PELCZAR, MJ.; REID, R.E, CHAN, ECS. Microbiologia. So Paulo: McGraw-Hill, vol.1 e vol 2, 1981. 1072 p. 3M DO BRASIL LTDA. Petrifilm placa para contagem de aerbios; folheto de instruo de uso. USA, 1997. PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; and KLEIN, D. A. Microbiology. McGraw-Hill, 1999. SILVA Neusely da e Colaboradores do Ital, Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos 3 ed., So Paulo, Editora Varella, 2007. JAY, JAMES M. Microbiologia de Alimentos. 6 ed., Editora Artmed., 2005. 712p.