Estado del arte de las tecnologas reproductivas avanzadas en ovinos.

Prof. H William Vivanco Mackie. BS, MS, PhD Ingeniero Zootecnista Consultor, reproduccin y gentica animal La Rosas 255 El Remanso de La Molina, Lima 12, Per williamvivanco@vivancoint.com

I. Introduccin:
La utilizacin de artificios en la reproduccin de los animales domsticos tiene diversos objetivos tales como el control de enfermedades transmisibles por la copula, facilitar el manejo, etc., pero el ms importante objetivo es sin lugar a dudas el de incrementar la tasa reproductiva ( obtener el mximo numero posible de cras) de animales selectos y a la ms temprana edad posible para lograr la masiva diseminacin de genes favorables ( genes responsables de alta productividad) en la poblacin de animales productores y lograr el mximo progreso gentico por unidad de tiempo al reducir el intervalo generacional. La inseminacin artificial (IA), la induccin de ovulacin mltiple para la produccin de embriones in vivo y subsecuente lavado y transferencia de embriones (MOET) y la recoleccin de ovocitos (OPU) subsecuente maduracin y fertilizacin in vitro y el cultivo de embriones in vitro hasta el estadio transferible (IVP), son hoy biotecnologas reproductivas de uso cada vez mayor no solo en el mbito de investigacin sino tambin comercialmente. Otras tecnologas tales como la clonacin y la transgenesis estn aun en etapa de desarrollo. El siguiente grafico, ilustra los efectos en el progreso gentico de las poblaciones ganaderas del uso de la inseminacin artificial y transferencia embrionaria (ya sea por MOET o por IVP) y en comparacin con el sistema de monta natural.

II. Revisin de las principales reproductivas en ovinos: 1. La Inseminacin Artificial (IA):

tecnologas

A. El estado actual de la tecnologa de inseminacin artificial en el ovino. reas que requieren solucin y mayor desarrollo tecnolgico. A pesar de que la reproduccin del ovino ha sido tal vez la mas estudiada ya que se ha usado el ovino como modelo para muchos estudios de funciones reproductivas, esto no se ha traducido en avances tecnolgicos al ritmo suficiente, contrariamente a lo que ha sucedido en el vacuno. La razn fundamental esta tal vez en las barreras anatmicas (por ejemplo tortuosidad y estrechez del lumen cervical de las ovejas) y funcionales (por ejemplo alta susceptibilidad al "shock fro" de los espermatozoides ovinos) encontradas en el ovino pero tambin probablemente debido a la falta de atractivo econmico para inversiones en el desarrollo tecnolgico. Entre todos los avances realizados en las ultimas dcadas en el rea de inseminacin artificial ovina, paradjicamente (ya que ahora es el mtodo bajo escrutinio), la inseminacin laparoscopia es el avance ms importante. Esta tecnologa ha permitido un dramtico incremento (alrededor de 10 veces mas) en el numero de borregas inseminadas por eyaculado, ha hecho factible el uso de semen congelado con aceptables niveles de fertilidad y la utilizacin de sincronizacin del celo dentro de programas de inseminacin artificial sin afectar la fertilidad. Otros avances han contribuido en cierta medida a la optimizacin del manejo reproductivo en programas de inseminacin ovina, tales como la utilizacin del "efecto de hembra en celo" para mantener reproductivamente activos a los carneros durante todas las estaciones, la utilizacin del "efecto del macho" para estimular actividad estral y ovulacin en las hembras, el uso de melatonina para avanzar la estacin reproductiva, el desarrollo de la sincronizacin del celo y la induccin de la actividad ovrica en el anestro, etc. En el rea de conservacin seminal a pesar de la enormidad de trabajos efectuados en este campo, aun no se dispone de un mtodo de congelacin de semen que permita la inseminacin cervical con semen congelado y que resulte en un aceptable nivel de fertilidad ni tampoco se ha logrado conservar satisfactoriamente el semen a temperatura ambiental ( como se ha logrado para el vacuno). Tanto el semen ovino refrigerado como congelado pueden ser aplicados solo por laparoscopia si se desean niveles satisfactorios de fertilidad. Indudablemente una de las barreras ms grandes es la imposibilidad de atravesar la cervix con la pipeta de inseminacin y depositar el semen al final de la cervix o el inicio del tero. Esto demanda que las dosis de inseminacin para la inseminacin cervical sean de altsima concentracin espermtica (100 millones de espermatozoides motiles) y de bajo volumen. Los mtodos de preservacin seminal (congelamiento, refrigeracin, etc.) usando altas concentraciones (baja dilucin) espermticas no han sido exitosos, de all la necesidad del

uso de inseminacin laparoscopica que permite la utilizacin de semen de ms alta dilucin ( 10 millones de espermatozoides motiles por dosis). Afortunadamente, despus de un largo periodo de rodeos sin salida, recientemente muy importantes descubrimientos hechos por los investigadores de la Universidad de Sydney y anunciados por C. Maxwell en el Symposium sobre Reproduccin en Rumiantes Domsticos realizado en Colorado Springs, Estados Unidos, en Junio de 1998, han dado nuevas luces sobre los fenmenos relacionados con la inseminacin con semen congelado ovino lo cual permitir un reenfoque de los programas de desarrollo tecnolgico en esta rea. Los ms importantes descubrimientos de Maxwell y colaboradores son: Esta demostrado que el proceso de congelamiento seminal causa la espontnea reaccin del acrosoma del espermatozoide, o sea el espermatozoide ha sufrido el proceso de capacitacin prematuramente por lo tanto su tiempo de vida en el tracto reproductivo es muy inferior al del semen no congelado lo cual demanda que el semen congelado sea inseminado muy prximo al momento de la ovulacin. El uso de inhibidores de la respiracin del espermatozoide (por ejemplo rotenona o rodamina 123) incrementa grandemente la habilidad de los dilutores para preservar la vida espermtica e incrementa la fertilidad del semen congelado. Los efectos negativos del congelamiento seminal sobre la fertilidad del semen son debidos mayormente (adems de su efecto en la prematura capacitacin) a que afecta la actividad de las mitocondrias y desnaturaliza el DNA y a que incrementa la perdida espermtica por retroflujo hacia la vagina. Mas del 70% de los espermatozoides inseminados se pierde por "retroflujo" hacia la vagina despus del servicio, esto se observa en la misma intensidad o mayor aun para el caso de la inseminacin intrauterina laparoscopica. Es mas marcada cuando se inseminan mayores volmenes y cuando se insemina semen congelado. Estos hallazgos sugieren cambios en el momento de inseminacin de acuerdo al tipo de semen, la necesidad de estabilizar membranas celulares en el espermatozoide para reducir o controlar la capacitacin prematura, ensayar nuevas formas de preservacin seminal haciendo uso de diferentes inhibidores de la respiracin y metabolismo, evaluar formas de prevencin del dao a las mitocondrias, reducir la perdida espermtica por retroflujo (tal vez la utilizacin de relajantes uterinos, bloqueo de oxitocina, tapones cervicales). Es evidente que una nueva y excitante etapa para el desarrollo tecnolgico de la inseminacin artificial ovina ha comenzado. Los instrumentos y los mtodos analticos de mayor precisin y sofisticacin que se disponen hoy en da, la enorme riqueza de informacin y la gran facilidad de comunicacin para intercambio de la informacin, la revaloracin del rol de los pequeos rumiantes en la economa de los pases en desarrollo y desarrollados, debe traducirse en mas frecuentes xitos en la solucin de las limitaciones y en el desarrollo de mas avanzados y efectivos mtodos para la inseminacin artificial y otras tecnologas reproductivas en ovinos. B. Aspectos tcnicos de la IA en ovinos:

a) El semen, su produccin, manejo y preservacin: . a.1. Factores que afectan la produccin seminal y sus caractersticas: La produccin del semen y sus caractersticas esta afectada por factores genticos y ambientales ( Desjardins C. , 1981). En carneros varias condiciones hereditarias asociadas con defectos testiculares, espermatogenesis anormal y morfologa espermtica anormal han sido encontradas; estas condiciones son mayormente controladas por un solo par de genes (Foote, R.H., 1974). Con respecto a la "calidad " del eyaculado el componente gentico es relativamente pequeo con baja heredabilidad ( Rollinson, 1955), sin embargo en estudios con mellizos idnticos Bane (1954) colecto evidencia de que varias caractersticas del comportamiento reproductivo eran altamente heredables. La heredabilidad del tamao testicular en carneros es alrededor de 0.4 ( Land y Lee, 1976) y existe una alta correlacin entre tamao testicular y produccin total de espermatozoides (Foote, et al. 1970). La circunferencia escrotal en carnerillos esta altamente correlacionada con ritmo de crecimiento ( Kilgour y Blockey, 1980; r=0.28 a 0.42) y con peso vivo ( Vivanco H.W., 1988; r= 0.53 a 0.83). Los cambios estacionales en la secrecin de LH y/o testosterona en carneros estn tambin influenciados por la raza ( Schanbacher y Lunstra, 1976). Hay una variable respuesta de la pituitaria a las inyecciones de GnRH entre diferentes razas de carneros ( Stelmasiak, et al.; 1977). Muchos tipos de anormalidades espermticas han sido descritas y algunas son de carcter hereditario, estas pueden ser tanto anormalidades primarias (por ejemplo anormalidades acrosomicas) como secundarias (anormalidades de la cola). ( Johanson, 1960; Fechheiner, 1970). Los parmetros de mayor importancia descritos en los estudios de calidad seminal incluyen el volumen seminal, motilidad y concentracin espermtica y se observa una gran variacin entre razas en estos parmetros. La interaccin significativa entre raza y ambiente es tpica en la mayora de estudios ( Vivanco H. W., 1983). La edad de los animales influencia la produccin seminal siendo las caractersticas mayormente influenciadas el volumen seminal y la concentracion espermatica, no as la motilidad ( Vivanco H.W., 1988). Diversos factores ambientales pueden afectar la produccin espermtica y calidad seminal en carneros, la nutricin es uno de los factores ms importantes. Los carneros pueden aparentemente tolerar un considerable rango de ingestin energtica y proteica sin mostrar mayores efectos en la calidad seminal ( Tilton et al., 1964). Sin embargo, un bajo nivel energtico ha sido identificado como uno de los factores que puede reducir la produccin espermtica sobre todo en animales en crecimiento. En general tambin hay un efecto positivo de la suplementacion proteica sobre las caractersticas seminales y la fertilidad de los carneros pero aparentemente el efecto de la suplementacion puede variar de acuerdo al estado nutricional previo ( Kadirov et al., 1974; Oldham et al., 1978; Sutherland y Martin, 1980). El manejo de los animales para la produccin seminal y los mtodos de coleccin son los factores ms importantes que afectan la produccin y calidad seminal. la coleccin por electroeyaculacion ofrece una considerable variacin en calidad seminal entre carneros y entre colecciones del mismo carnero ( Tiwari y Sahni, 1977), en comparacin con la

vagina artificial. Sin embargo tambin han sido observadas diferencias en la calidad de semen dependiendo del tipo de vagina artificial utilizada para la coleccin del semen de los carneros ( Burov, 1974). La frecuencia de coleccin del semen afecta significativamente la calidad del eyaculado. En general hay una reduccin en el volumen y concentracin espermtica pero un incremento en la motilidad del espermatozoide a medida que se incrementa la frecuencia de coleccin seminal (Bearden y Fuquay, 1980). Diferencias observadas entre anos en la produccin y calidad seminal son prcticamente al azar y son explicadas por variaciones en clima y disponibilidad de alimentos especialmente en sistemas pastoriles. Los efectos de los meses , si es que no estn ligados a efectos estacionales, son tambin bastante arbitrarios y dependen mayormente de influencias de la regin geogrfica y reflejan variaciones climticas. Las interacciones de razas con meses en caractersticas seminales denotan la diferente capacidad adaptativa de las diferentes razas a los diferentes medio ambientes (Vivanco, 1983; 1988). Entre todas las especies domesticas, la fertilidad en los carneros es particularmente afectada por las altas temperaturas ambientales. La calidad del eyaculado y la capacidad del testculo para producir andrgenos es afectada por altas temperaturas corporales producidas por altas temperaturas ambientales u otras causas (Hafez, 1980). Estudios comparando razas introducidas y locales en ambientes tropicales demuestran una produccin seminal pobre para todas las razas durante los meses ms calurosos del ano, pero adems en las razas introducidas se observo una marcada disminucin del libido (Tiwari y Sahni, 1976; Sinha et al. 1980). La motilidad del semen se ve significativamente afectada a alturas sobre 3,800 m.s.n.m.( Vivanco, et al., 1985). En general cualquier tipo de "stress" (climtico, de manejo, psicolgico, nutricional, etc.) afecta la produccin y calidad del semen debido a la relacin "stress" - eje hipotalamico hipofiseal- ACTH - glucocorticoides- LH-andrgenos- libido- espermatogenesis (Moberg, 1984 ). Los ovinos son caracterizados como especie de reproduccin estacional. En regiones temperadas sin embargo, los carneros generalmente permanecen sexualmente activos a travs con ciertas variaciones no muy marcadas en el nivel de actividad mas debida a variaciones de temperatura o disponibilidad de alimentos durante estaciones que a factores relacionados con fotoperiodo ( Hulet y Shelton, 1980; Vivanco, 1983). En latitudes mas extremas los carneros experimentan una casi total reduccin de la actividad sexual en ciertos periodos del ano. Pelletier y Ortavant (1975) y Lincoln y Short (1980); plantearon que el fotoperiodo produca cambios en el sistema que gobierna la secrecin tnica de gonadotropinas siendo por lo tanto responsable de la transicin de actividad sexual a quiescencia. Lincoln et al. (1980) sugiri que la respuesta al fotoperiodo en al carnero involucra una interrelacin entre la actividad secretora de la glndula pineal y un establecido ritmo circadiano en el cerebro. La hormona involucrada en esta interrelacin es la melatonina que es secretada por la pineal en proporciones variables entre el da y la noche. Inyecciones de melatonina a intervalos apropiados imita los efectos normalmente inducidos por los cambios en duracin del da ( Turek y Campbell, 1979). Una gran cantidad de trabajos han sido efectuados sobre el uso de la melatonina para regular la

actividad reproductiva de los carneros desarrollndose protocolos para su aplicacin ( Hanif M. y Williams H.Ll.; 1988; Fitzherald J.A. et al.; 1988) pero su practicidad y efectividad no han sido del todo satisfactorias. El uso de fotoperiodo artificial imitando das cortos por un mes y alternado con das largos por otero mes mantuvo los carneros con produccin constante de semen todo el ao, la misma respuesta fue obtenida reemplazando los das largos por un tratamiento de 7 horas de luz, 8 horas de obscuridad, 1 hora de luz, 8 horas de obscuridad. Este "flash" de una hora de luz deba darse a las 1516 horas desde el amanecer (Lindsay D.R. y Thimonier, J. 1988). No hay duda de que la manipulacin del fotoperiodo puede ser usada exitosamente para la mantencion de la actividad reproductiva de carneros todo el ano, sin embrago su practica es muy costosa, demanda instalaciones especiales, consumo de energa, mano de obra, etc. En LambXL en Nueva Zelanda nosotros usamos manipulacin de fotoperiodo en carneros durante una de las operaciones de transferencia de embriones fuera de estacin , las complicaciones de manejo nos indujeron a cambiar de estrategia en las siguientes operaciones fuera de estacin. Encontramos que simplemente exponiendo los carneros a ovejas ovariectomizadas y estrogenizadas (con celo inducido) por lo menos una vez por semana mantiene el libido , la produccin seminal y la fertilidad durante todo el ano, nuestros resultados de fertilidad con semen fresco usado en ovejas superovuladas fue el mismo durante el otoo y la primavera ( Greaney et al. 1991). a.2 Manejo y preservacin del semen ovino: La mayor proporcin de los factores que determinan el nivel de fertilidad obtenible con la inseminacin artificial ocurren en el intervalo desde la coleccin seminal hasta el momento de la inseminacin de la dosis de semen ya sea fresco o preservado. Uno de los ms importantes factores que requiere de un manejo atinado es la temperatura seminal. A la coleccin la temperatura del semen es de alrededor de 38C , si el semen se mantiene a esa temperatura las clulas espermticas manifestaran su mxima motilidad y actividad metablica y consecuente acumulacin de cido lctico y otros residuos metablicos, ocurrir as mismo un agotamiento de los substratos energticos, un rpido cambio de pH y la muerte espermtica. cualquier incremento de temperatura exacerbara esta condicin y si la temperatura llega a 50C se producirn danos estructurales irreversibles. Si por el contrario la temperatura seminal es sbitamente bajada sin aadir ningn protector contra el "shock fro", las clulas espermticas sufrirn igualmente danos estructurales irreversibles y muerte. El semen debe ser pre-diluido (por lo menos 1:1) inmediatamente despus de la coleccin (la dilucin final a efectuarse una vez determinada la concentracin y tasa de dilucin deseada), con el fin de controlar los cambios de pH, incluir agentes protectores del shock frio y de la contaminacin y reducir la alta concentracin espermtica. La temperatura debe ser llevada a un nivel menor que no estimule intensamente el metabolismo y que no produzca "shock fro", por lo general se recomienda una temperatura de pre dilucin de 30C. Desde la pre dilucin hasta el momento de conservacin del semen o de su uso los cambios de temperatura deben ser unidireccionales, es decir si el semen por ejemplo ser conservado por refrigeracin a 4C, la temperatura bebe bajar todo el tiempo desde los 30 grados de pre-dilucin hasta los 4 de refrigeracin y no experimentar subidas y

bajadas, los cambios "sube y baja" de temperatura son la mayor causa de danos estructurales durante el manejo del semen. La misma unidireccionalidad pero en sentido contrario debe observarse cuando se restablece la temperatura despus de la conservacin y antes de la inseminacin. ( ver figuras 2 y 3). En adicin a las precauciones con respecto a la temperatura del semen y el rpido control del pH y la contaminacin, es muy sabido que el semen debe ser protegido del contacto con materiales txicos, desinfectantes, gases, radiacin solar y luz directa. Evitar as mismo la formacin de perxidos de hidrogeno evitando sacudir el semen y la formacin de espuma o burbujas (Bearden y Fuquay, 1980). C oleccion sem en Tem p P rocesam iento C onservacion A plicacion d el sem en

Tiem po Fig ura 2 S tid un ireccion de los cam . en o id al bios d e tem eratu del sem p ra en

Tem p

Coleccion sem en Procesam iento Conservacion

Aplicacion del sem en

Tiem po Figura 3. Altibajos de tem peratura afectan la vida y la fertilidad del esperm atozoide
El manejo del semen desde su coleccin hasta su uso debe tener como mximo objetivo el mantenimiento de la capacidad fertilizante del espermatozoide. Esto se logra mediante la reduccin "reversible" de la motilidad y actividad metablica espermtica. Para ello

usualmente se reduce la temperatura seminal o se usan varios agentes para el control del pH y el metabolismo o se aplica una combinacin de las dos alternativas. Como consecuencia se logran mtodos de conservacin espermtica a temperatura ambiental (tambin llamado semen fresco), refrigeracin y congelamiento. Para incrementar al mximo el numero de ovejas a ser inseminadas por eyaculado se incrementa el volumen del eyaculado y se reduce consecuentemente la concentracin por unidad de volumen hasta llegar al mximo posible sin que se afecte la fertilidad. Ambos objetivos (preservacin de la capacidad fertilizante del espermatozoide y maximizacin del numero de hembras a ser servidas con un eyaculado) son alcanzados mediante la adicin de "dilutores". Los dilutores deben: proveer nutrientes (mayormente substratos energticos) que son importantes solo si el semen se va ha conservar por cierto tiempo y no si se usa inmediatamente despus de la coleccin. Proveer sustancias protectoras contra en "shock fro" solo si el semen se va a refrigerar y si se va a congelar adicionar adems sustancias "crioprotectoras". Proveer un sistema "buffer" o tampn para prevenir cambios bruscos en pH (esto es importante en todos los casos aun cuando el semen va a ser usado rpidamente despus de la coleccin. Proveer un ambiente isotnico para evitar "shock osmtico" (esto tambin es importante en todos los casos). Contener agentes antimicrobianos para controlar el desarrollo de grmenes (importante en todos los casos). a.2.1 Semen fresco para uso inmediato despus de la coleccin: El uso de semen fresco es muy difundido en la inseminacin artificial del ovino. Las inseminaciones con semen fresco se hacen ya sea con: i) Semen puro ( sin diluir, aadir solo el antibitico diluido en un buffer fosfato o citrato para proveer al semen con una concentracin de 100 mil u.i de penicilina y 100 mil ug de dihidroestreptomicina por 100 ml) inmediatamente despus de la coleccin. En este caso la dosis de inseminacin es de 0.05 ml. El semen puro se mantiene en un bao Maria a 30C desde la coleccin hasta su uso. Todo el equipo debe estar a la misma temperatura del semen y el ambiente (sala de inseminacin) no debe bajar de 25C. Este tipo de semen es muy usado para la inseminacin cervical. ( Calle R y Vivanco H. W., 1976). ii) Semen diluido. El dilutor no requiere contener nutrientes y/o protectores celulares, solo debe contener un buen sistema tampn y debe ser isotnico con el semen. El cuadro 6 ofrece las formulas de diferentes soluciones tampn para dilucin del semen. En el Per por muchos anos se uso como dilutor de semen fresco simplemente la secrecin vaginal de borregas en celo con muy buenos resultados ( Pezo-Gonzles, 1967). En LambXL y la ATC hemos usado exitosamente leche uperizada (esterilizada al vapor o "UHT") . La temperatura recomendada para trabajar con semen diluido fresco es tambin de 30C , debiendo el dilutor, el semen y todo el equipo mantenerse a dicha temperatura. La sala de inseminacin debe estar mnimo a 23- 25C. Para las inseminaciones con semen puro o diluido fresco, la coleccin de semen de los carneros debe de hacerse de acuerdo al ritmo de uso del semen. Debe evitarse la espera o demora entre coleccin y dilucin, es decir este sistema es "literalmente" para uso inmediato del semen. Si se mantiene el semen "esperando a ser inseminado" a una temperatura de 30C, se estar incrementando la concentracin de cido lctico muy rpidamente y afectando la motilidad y vida espermtica. En los casos de demora entre coleccin e inseminacin se deber usar mas bien semen refrigerado o enfriado. El cuadro

7 ofrece resultados obtenidos en el Per para inseminaciones cervicales a gran escala hechas con semen fresco .

Cuadro 6. Composicin de algunas soluciones tampn usadas para la dilucin del semen de carnero y su uso como semen fresco. Componente PBS (1) CBS (1) Solucin TRIS Solucin TEST (solucin (solucin (3) fosfato salino) citrato salino) (2) fosfato de sodio fosfato de potasio Agua doblemente destilada en alambique de vidrio Citrato de sodio deshidratado TRIS (hidroximetil aminometano) Acido ctrico monohidratado Dextrosa (glucosa -D(+)) TES-N-TRIS (hydroximetil) metil-2amino etano-cido sulfonico Fructosa Penicilina 2.0 gr 0.2 gr s.c.p. 100.00 cc s.c.p. 100.00cc 2.0 gr 3.605 gr 2.024 gr 9.9 gr 1.0 gr 0.8849 gr s.c.p. 100.00cc s.c.p. 100.00cc

4.9751 gr 100,000 u.i 100,000 u.i 1.488 gr 50,000 u.i 50,000 u.i

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Sulfato dihidroestreptomicina 100,000 ug 100,000 ug 0.050 gr 0.050 gr Fuentes: (1) Bearden y Fuquay , 1980. (2) Vivanco et al., 1983. (3) Nelson E., 1982. a.2.2) Semen enfriado o refrigerado: La reduccin de la temperatura del semen produce la reduccin concomitante de la actividad metablica y de la motilidad, aumentando la vida media del espermatozoide desde la coleccin seminal hasta la inseminacin. La motilidad se detiene totalmente a los 5C pero se puede restituir si se eleva nuevamente la temperatura al nivel normal y siempre y cuando no se hayan producido danos estructurales al espermatozoide en el proceso de enfriamiento ("shock fro"). El espermatozoide ovino es muy susceptible al "shock fro". El rango mas critico durante la refrigeracin es el de los 15C a los 4C por ello el sistema mas recomendado de preservacin seminal ovina en refrigeracin es a 15C. No es recomendable bajar la temperatura hasta los 4C a no ser que se requiera usar el semen mas all de las 15 horas de colectado. La proteccin del espermatozoide ovino del "shock fro" se logra mediante la adicin de yema de huevo al dilutor (del 14 al 20 % V/V) . La yema de huevo contiene lipoprotenas protectoras de las membranas celulares y sustancias que preservan la motilidad ( Watson y Martin, 1973) pero tambin contiene un factor toxico que afecta al acrosoma y que se manifiesta a elevadas concentraciones de yema de huevo en el dilutor. Shannon (1972) encontr una cierta reduccin de la fertilidad cuando el dilutor usado era a base de yema de huevo. Por ello el dilutor preferido para refrigeracin o enfriamiento del semen a 15C es el dilutor de leche, la inclusin de yema de huevo solo se recomienda si el semen ser conservado a temperaturas mas bajas de refrigeracin (4C) o de congelamiento. El dilutor de leche no se debe usar para refrigeracin a 4C o para congelamiento si es que no se le aade un crioprotector como glicerina por ejemplo. Cuando se usa dilutores de leche no esterilizada (leche entera o descremada cruda o pasteurizada) es necesario calentar la leche a bao Maria a 95C por 10 minutos para destruir la enzima lactenin que es toxica al espermatozoide (Rodrguez, 1968; Dauzier et al 1954; Salamon, 1962; Jones, 1969). Una vez calentada se enfra hasta 30C para hacer la dilucin y luego se somete al enfriamiento hasta la temperatura de almacenaje. La leche UHT no necesita tratamiento de calentamiento. La adicin de catalasa ( regulador de la produccin de perxidos) no ha mostrado ser de beneficio en dilutores de leche mientras que si es benfica en dilutores con yema de huevo ( Colas et al., 1968). Los dilutores de leche a 15C han demostrado ser ms eficientes que los de yema de huevo, Colas y Courot (1977), obtuvieron 66.4% de nacimientos con inseminaciones cervicales hechas con semen diluido con dilutor de yema de huevo y 75.4% de nacimientos para dilutor de leche, observacin hecha sobre un numero de 895 ovejas inseminadas. El periodo de preservacin del semen enfriado a 15C es de 14 a 16 horas con porcentajes de nacimiento para inseminacin cervical (una inseminacin por celo) de 65 a 75% (Colas y Courot, 1977). El semen refrigerado a 4C se usa cuando se quiere conservar el semen por mas de 16 horas. El mximo tiempo de preservacin en refrigeracin debe ser de 24 horas. Despus de las 24 horas se observa una dramtica perdida de capacidad fertilizante aun cuando la motilidad sea buena, esto debido probablemente a cambios en la estructura del acrosoma.

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La concentracin espermtica por dosis de semen para inseminacin cervical en borregas con celo natural con semen enfriado o congelado es de 100 a 150 millones de espermatozoides motiles. Si las borregas son de celo sincronizado, debido probablemente a modificaciones en el transporte espermtico u otros factores que afectan la vida del espermatozoide en el tracto reproductivo de ovejas tratadas con progesterona o progestagenos ( Quinlivan y Robinson, 1968; Hawk y Conley, 1971; Colas et al., 1973) , la concentracin espermtica por dosis tiene que ser incrementada a 200 millones o ms (Colas y Courot, 1977). El volumen de la dosis de inseminacin cervical con semen diluido, enfriado o refrigerado es de 0.1 a 0.2 ml. Es muy importante mantener el volumen al mnimo (lo cual resulta en alta concentracin por unidad de volumen de la dosis), mayores volmenes bajan la fertilidad ( Allison y Robinson, 1971; Colas et al., 1973). Recientemente Gillan y Maxwell, 1998 informaron sobre mayor perdida de semen por reflujo hacia la vagina cuanto mayor el volumen inseminado. Esto es uno de los factores ms difciles de compatibilizar ya que por otro lado la sobrevivencia espermtica durante la preservacin y manipulacin es mas baja cuanto mayor sea la concentracin de la dosis ( Amir et al., 1973; Mainpouya, 1973). La concentracin espermtica por dosis de semen enfriado o refrigerado puede ser dramticamente reducida cuando se emplea inseminacin laparoscopica intrauterina. Trabajos iniciales de inseminacin laparoscopica recomendaban entre 25 y 40 millones de espermatozoides motiles inseminados por oveja, hoy en da se ha reducido la concentracin hasta 10 y 15 millones de espermatozoides motiles por dosis. El volumen normalmente inseminado es de 0.25 ml repartidos en los 2 cuernos o inseminados en un solo cuerno uterino. Reciente evidencia de re-flujo seminal a la vagina directamente proporcional al volumen de la dosis inseminada (Gillan y Maxwell C. 1998) sugerira reducir aun ms el volumen de la dosis. El promedio de fertilidad obtenida con inseminacin laparoscopica intrauterina con semen refrigerado es de alrededor de 75% con rangos que varan de 30 a 90% ( Maxwell et al., 1983; Vivanco et at., 1985; Davis et al; 1986). Hay una relacin directa entre la concentracin de espermatozoides motiles en la dosis y el porcentaje de fertilidad, Martin y Watson (1976), demuestran que cuando se reduce la concentracin espermtica por debajo de 25 millones de espermatozoides motiles por dosis la fertilidad se ve comprometida y si la operacin se hace ms vulnerable a cualquier otro factor que comprometa los resultados. El cuadro 8 muestra la composicin de los dilutores ms usados para el enfriamiento o refrigeracin del semen. Las soluciones tampn referidas en dicho cuadro son aquellas cuyas formulaciones han sido dadas en el cuadro 6. El ritmo de enfriamiento depende del dilutor usado. Para dilutor de leche y para el TESTyema de huevo se diluye a 30C y se enfra con "chaqueta de agua" ( frasco del semen diluido inmerso en vaso con agua a determinada temperatura) a 30C en el refrigerador calibrado a la temperatura de refrigeracin ( ya sea 15C o 4C) que se desea alcanzar. Cuando se usa el TRIS, el semen puro se coloca en bao Maria a 25C por 5 minutos, luego a 23C por 10 minutos y luego a 20C por 10 minutos, se hace la dilucin a 20C

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luego se enfra en chaqueta de agua a 20C introducida en refrigeradora calibrada a 4C ( Vivanco y Valera, 1980; Vivanco y Alarcn, 1987).

Cuadro 7. Porcentaje de ovejas que parieron sobre total de ovejas inseminadas por el mtodo cervical con semen fresco, puro o diluido, en las praderas alto andinas del Per. Localidad Ano Numero de Numero de % de borregas borregas borregas que paridas inseminadas parieron Chuquibambila, 1943 500 224 44.81 Puno Puno-Sur 1943 9,000 2,970 33.0 Hda Laive-Junn 1943 100 73 73.0 Hda Laive-Junn 1944 4,500 1,755 39.0 Hda UrcunimuniPuno 1947 280 168 60.0 Juliaca-Puno 1955 90 81 90.0 Juliaca-Puno 1955 500 325 65.0 Servicio IA Banco 1960 70,000 52,668 75.24 Agropecuario 1961 75,000 56,265 75.02 1962 73,000 56,706 77.68 1963 75,000 60,982 81.31 1964 75,000 56,797 75.73
Fuente: Pezo Gonzles N. (1967) Los resultados corresponden a 2 rondas de inseminacin. Todas las ovejas que retornaron al celo despus de la primera inseminacin fueron re-inseminadas. En promedio un 25% a 32% de las ovejas recibieron 2 servicios.

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Cuadro 8. Algunos dilutores empleados para la conservacin del semen ovino por enfriamiento (15C) o refrigeracin (4C). Leche (1) Citrato-yema TEST-yema TRIS-yema (2) (3) (4) Leche entera o descremada, calentada a 95C por 10 minutos o leche 100.00 ml UHT sin calentar Solucin tampn TEST 80.00 ml Solucin tampn TRIS 67.2 ml Agua doblemente 12.8 ml destilada Solucin tampn Citrato 80.00 ml salino Yema de huevo 20.0 ml 20.0 ml 20.0 ml Penicilina 100,000 u.i * * * Estreptomicina 100,000 ug * * * *antibitico ya incluido en la solucin buffer o tampn Fuente: (1) Rodrguez, C. 1968. (2) Modificado de Bearden y Fuquay, 1980. (3) Vivanco H W y Valera, 1980.; Nelson E. 1982. (4) Vivanco H.W. y Alarcn V. 1987.; Alarcn V. 1984. a.2.3) Semen congelado: La utilizacin de semen congelado da una gran flexibilidad al empleo de la inseminacin y posibilita el comercio internacional del semen. La mayor limitacin del uso de semen congelado en ovinos es la baja fertilidad obtenida con la inseminacin cervical usando semen congelado. La gran mayora de los resultados han sido muy pobres entre 25 y 35%

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de concepcin ( Salamon y Visser, 1971; 1974; Fukui y Roberts, 1975). Sin embrago, dependiendo del nivel de fertilidad que sea factible de aceptar como econmicamente eficiente, nuestro mtodo de congelamiento para inseminacin cervical podra considerarse como satisfactorio, ya que nosotros obtuvimos 59% de fertilidad con semen congelado inseminado por va cervical en ovejas ( Vivanco H. W. y Alarcn V., 1987). Los resultados del ensayo se muestran en el cuadro 9. La reduccin de la temperatura seminal por debajo de los 4C enfrenta el problema de la cristalizacin del agua intra y extra celular causando danos estructurales con ruptura celular por el aumento de volumen del agua al cristalizarse y por aumento de la presin osmtica intracelular al aumentarse la concentracin de sales en las fracciones de agua intracelular que aun no se cristalizaron. (Bearden y Fuquay, 1980). El rango mas critico es de los OC a los - 20C, sin embargo, aun se producen danos por cristalizacin de los 20 a los - 75C. Por lo tanto ningn mtodo de congelamiento puede detenerse sino hasta pasar los - 75C. Los protocolos mas recomendados de congelamiento bajan la temperatura muy lentamente (2 a 4hrs) de los + 15C hasta los + 4C para evitar el shock fro y luego bajan la temperatura muy rpidamente ( 3 a 9 minutos) de los + 4C a los 75 C para evitar la prolongada exposicin del semen a temperaturas de cristalizacin, debajo de los -75C se puede pasar muy bruscamente hasta la temperatura final que puede ser de - 79C si se usa hielo seco o - 196C si se usa nitrgeno liquido. La tasa de congelamiento es afectada por la relacin volumen superficie por lo que es ms recomendable ya sea congelar el semen en pellets de bajo volumen o en pajillas de 0.25 ml o menos. (Bearden y Fuquay, 1980). Tan importante como la tasa de congelamiento es la tasa de descongelamiento. El descongelamiento debe ser rpido para evitar cristalizacin durante es descongelamiento. Baos Maria de 37C a 40C por 30 segundos o de 75C por 2 segundos son los mas recomendados ( Nelson, E. 1982; Tung Yung Lin, 1980). La adicin de glicerina al semen antes del congelamiento decrece el punto de congelamiento del agua al mezclarse la glicerina con el agua lo que reduce la cristalizacin y los cambios osmticas bruscos, la glicerina tambin deshidrata parcialmente la clula espermtica reduciendo aun ms el riesgo de cristalizacin del agua dentro de la clula. Otros agentes crioprotectores usados son el dimetilsulfoxido, etilenglicol y sacridos ( Bearden y Fuquay, 1980). Hill et al. (1959) demostraron que en el congelamiento del semen del carnero a -79C niveles de glicerina de 3.5 a 7.0% mantuvieron satisfactoriamente la motilidad post descongelamiento; niveles de 14% decrecieron la motilidad. La mayora de protocolos de congelamiento de semen de carnero recomiendan niveles finales de glicerina no mas altos del 7%, niveles menores del 3.5% son inefectivos para proteger contra los danos del congelamiento ( Watson y Martin, 1975; Colas y Brice, 1975; Colas, 1974; Fukui y Roberts, 1975; Dupenko, 1980) . La adicin de la glicerina al semen en la mayora de los mtodos de congelamiento se hace en forma lenta; normalmente el semen se diluye a la mitad de la dilucin total en un primer dilutor carente de glicerina y luego se aade el segundo dilutor conteniendo el doble de la concentracin final de glicerina, esto sin embargo no es estrictamente necesario existiendo mtodos que usan una sola dilucin directamente con dilutor glicerinado tal como el caso de congelacin en pellets ( Maxwell, et.al.1984). La yema de huevo necesaria para proteger el dao estructural del acrosoma debe estar el los dilutores para congelamiento en un nivel del 15 al 20% mximo; niveles

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muy altos afectan la motilidad y fertilidad (Smirnov et al.,1978). Recientemente Gillan y Maxwell C.(1998) encontraron que la congelacin del semen de carneros a pesar de todos los aditivos convencionales (crioprotectores, yema de huevo, etc.) produce capacitacin prematura del espermatozoide debido a espontnea reaccin del acrosoma, produce tambin desnaturalizacin del DNA y afecta las mitocondrias y sugiere se investiguen otros protectores celulares para lograr la estabilizacin de las membranas. Numerosos mtodos de congelamiento del semen de ovino han sido publicados, Graham et al.(1976) hacen una revisin de todos los mtodos publicados hasta 1975. Las inseminaciones efectuadas por va cervical con semen congelado usaron dosis de una concentracin de 100 millones de espermatozoides motiles al momento de la inseminacin (post descongelamiento) lo cual por lo general requiri alrededor de 200 millones de espermatozoides motiles por dosis al momento del congelamiento. El volumen de la dosis varia con la forma de congelamiento. La forma ms comn de congelamiento fue en pellets de 0.1 a 0.2 ml (Salamon y Visser, 1971; 1974; Visser y Salamon, 1973; 1974; Fukui y Roberts, 1975; Firth, 1977; Maxwell et al., 1984). Nosotros el la Universidad Agraria de La Molina, Per, congelamos en ampolletas de 1.0 ml conteniendo cada ampolleta 3 dosis de inseminacin de 0.2 ml cada una ( Vivanco H.W y Alarcn, 1987) tambin en pellets de 0.1 ml y en pajillas de 0.25 ml ( Vivanco H.W. y Varela J., 1980). El desarrollo de la inseminacin artificial intrauterina por laparoscopia ( Maxwell et al.,1983; Vivanco et al., 1985; Davis et al.,1986) permiti el incremento sustancial de la tasa de dilucin del semen congelado, siendo muy comn en la actualidad usar pajuelas de 0.25ml conteniendo un mnimo de 15 millones de espermatozoides motiles despus del congelamiento (alrededor de 25 a 30 millones de espermatozoides motiles antes de la congelacin). Los resultados con la inseminacin laparoscopica intrauterina de semen congelado son variables pero en general considerados satisfactorios. Evans G. (1991) informa sobre el promedio de fertilidad de inseminaciones efectuadas con semen congelado por va laparoscopica intrauterina en Australia en el periodo 1989-1990 involucrando 268,300 ovejas inseminadas, encontrando que la fertilidad fluctu entre 15% y 92% con un promedio general de 62%. Una de las mayores fuentes de variacin ha sido la variacin entre carneros. Butler y Maxwell (1988) en Western Australia (estudiando comportamiento del semen congelado de 110 carneros inseminando intrauterinamente por laparoscopia) encuentra un rango de fertilidad de los carneros que vario de 20 a 80% con una fertilidad media de 60-70%. Eppleston y Maxwell (1994) en New South Wales, Australia encontraron que el porcentaje de ovejas que parieron vario entre 46 a 77% dependiendo del carnero donante del semen congelado , con un promedio general de 57%, la distribucin normal de la fertilidad de los carneros del trabajo de Eppleston y Maxwell (1994) se muestra en el grafico 4.

Cuadro 9. Porcentaje de ovejas Corriedale en praderas alto andinas del Per que prearon y que parieron como resultado de inseminacin artificial va cervical con semen congelado.

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Ovejas inseminadas

Ovejas que Gestacin parieron (% ) promedio das 34 20 (58.82) 19 (55.88) 149.9 Fuente: Vivanco H.W. y Alarcn V., 1987

Ovejas preadas (%)

Proporcin en Macho:hembra .47: .53

Numero de carneros
30

25

20

15

10

< 20

20-30

30-40

40-50

50-60

60-70

70-80

>80

Figura 4. % de fertilidad del semen congelado de carneros inseminado en forma intrauterina por laparoscopia

El semen congelado en la primavera ( fuera de estacin reproductiva) ha mostrado ser de ms baja fertilidad que el semen congelado en otoo. ( Colas y Courot, 1977). El semen una vez congelado no parece perder su viabilidad con el correr del tiempo. Semen que fue congelado en la estacin reproductiva y que fue descongelado luego de varios anos mostr el mismo nivel de viabilidad y fertilidad que el semen congelado y usado en la misma estacin ( Patt y Nath, 1969; Salamon y Visser 1974; Colas y Brice 1976). b) La inseminacin b.1. Momento oportuno para la inseminacin:

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Los espermatozoides de carnero tienen una vida frtil de 30 a 48 horas despus de ser colocados en el tracto reproductivo femenino. La vida frtil de los ovocitos es de alrededor de 16 horas desde la ovulacin (Bearden y Fuquay,1980). El celo en la oveja dura de 24 a 36 horas, siendo mas corto en borreguillas, la ovulacin ocurre normalmente 24 a 26 horas desde el inicio del celo (Hunter y Nichol, 1983) sin embargo Hulet y Shelton (1980) mencionan que la variacin puede ser desde 11 horas antes del fin del celo hasta 7 horas despus del fin del celo, esto puede ser debido a que el momento de ovulacin y la ocurrencia misma de la ovulacin estn afectados por el nivel de "stress" (Moberg, 1984). La capacitacin espermtica (proceso necesario para darle competencia fertilizante al espermatozoide) dura alrededor de 8 horas ( Bearden y Fuquay, 1980). Los espermatozoides capacitados tienen una vida muy corta, son frgiles, muestran un alto grado de actividad flagelar y experimentan agotamiento metablico, por ello, a pesar de que el transporte espermtico desde la cervix al oviducto es muy rpido (menos de 8 minutos), una vez que los espermatozoides alcanzan la zona caudal del istmo del oviducto son secuestrados en esa regin (para evitar su capacitacin prematura) hasta que muy poco antes de la ovulacin la accin local de hormonas ovricas y una poderosa estimulacin adrenergica desencadenan contracciones stmicas llevando los espermatozoides a la zona ampular donde se capacitan y transforman en clulas hiperactivas. El secuestramiento en el istmo puede durar hasta 18 horas. (Hunter y Nichol, 1983). Los eventos fisiolgicos descritos explican la razn por la que el semen fresco (con acrososma intacto) poder ser inseminado con relativa anticipacin (temprano en el celo) sin mayor detrimento de la fertilidad, en cambio, el semen refrigerado y sobre todo el semen congelado tiene que ser inseminado ms prximo al momento de la ovulacin ya que hay evidencia (Gillan y Maxwell, 1998) de que el semen congelado ha sido ya capacitado (reaccin de acrosoma) en el proceso de congelamiento. En general se recomienda que el momento de inseminacin con semen fresco (ya sea por va cervical o laparoscopica) en ovejas con celo natural sea efectuado ptimamente 6 a 8 horas antes del momento de ovulacin lo que equivale a alrededor de 16 a 18 horas desde el inicio del celo, en forma practica, animales detectados en celo en la maana son inseminados en la tarde del mismo da, animales detectados en celo en la tarde se inseminan la maana siguiente ( Calle y Vivanco, 1976; Bearden y Fuquay, 1980). El momento oportuno para la inseminacin con semen refrigerado y congelado en ovejas de celo natural y por inseminacin cervical fue inicialmente recomendado tambin para ser efectuado entre 15 y 17 horas luego de la deteccin del celo ( Colas y Courot, 1977). Nosotros (Vivanco y Alarcn, 1987) inseminamos alrededor de las 20 horas en el experimento referido en el cuadro 9. La evidencia de que el espermatozoide ya esta capacitado cuando se trata de semen congelado sugiere que el momento de inseminacin debe hacerse mas cerca del momento de ovulacin. En un pequeo ensayo en LambXL, Nueva Zelanda (Vivanco, 1990, datos no publicados) inseminando ovejas superovuladas intrauterinamente por laparoscopia con semen congelado a diferentes intervalos desde el celo obtuvimos 25% de fertilidad para el semen inseminado a las 12 horas de la deteccin del celo y 81.8% de fertilidad para las ovejas inseminadas a las 20 horas desde la deteccin del celo, lo cual concuerda con los hallazgos de Gillan y Maxwell, (1998). El estro y la ovulacin pueden ser inducidos o sincronizados (por diversas razones de manejo) en las ovejas mediante tratamientos hormonales durante la estacin reproductiva o fuera de la estacin reproductiva. Las inseminaciones se pueden hacer sobre celos

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detectados a los mismos intervalos ya descritos para ovejas con celo natural y de acuerdo al tipo de semen usado, sin embargo, uno de los principales usos de la sincronizacin de celos es con el objeto de poder realizar inseminaciones a "tiempo fijo" luego del fin del tratamiento de sincronizacin para reducir costos de mano de obra, carneros marcadores y movimiento de animales, sobre todo cuando se trata de rebaos de miles de animales a ser inseminados, por lo que numerosos trabajos han sido conducidos para determinar el momento adecuado de la "inseminacin a tiempo fijo" en ovejas sincronizadas. En ovejas sincronizadas durante la estacin reproductiva con dos inyecciones del anlogo de prostaglandina F2 alfa (cloprostenol) a intervalos entre inyecciones ya sea de 8, 11 o 14 das se encontr que en promedio solo mostraron celo entre el 66 al 82% de las ovejas tratadas y el celo ocurri entre las 40 a las 64 horas despus de la segunda inyeccin, pero prcticamente todas las ovejas ovalaron, por lo que la recomendacin en ovejas sincronizadas con prostaglandina es de usar deteccin de celo de todas maneras, inseminar al momento recomendable ya descrito para ovejas detectadas y a las ovejas que no mostraron celo hasta las 56 hrs de la segunda inyeccin inseminarlas a las 56 horas y reinseminarlas si muestran celo despus de la inseminacin (Farnie y Wales, 1977). En ovejas sincronizadas con progestagenos y PMSG inyectado a la remocin del progestageno el momento fijo de inseminacin recomendado ya sea con semen fresco o congelado ( Colas y Courot, 1977; Vivanco et al, 1985 y Maxwell, 1983) o para inseminacin cervical ( Colas y Courot, 1977) o laparoscopica ( Vivanco et al, 1985; Maxwell, 1983) ha sido de 55 a 60 horas despus de la remocin del progestageno. Boland et al., (1978) encontr que en promedio las ovejas sincronizadas con progestageno mas PMSG ovulan a las 70 horas de la remocin del progestageno, este intervalo puede acortarse en hasta 12 horas con el uso de CIDR en lugar de progestagenos y esta tambin influenciado por el nivel de la dosis y el momento de administracin del PMSG al final del tratamiento de sincronizacin pudiendo acortarse en hasta 12 horas si el PMSG se administra 24 horas antes de la remocin del progestageno o CIDR y es mas corto aun para ovejas en tratamiento superovulatorio ( Walker et al., 1989). La nueva evidencia con respecto al estado de capacitacin prematura del semen congelado sugiere que este tiempo fijo de inseminacin sea ms cercano al momento de ovulacin para el caso de semen congelado. En todos los casos de sincronizacin usando dispositivos vaginales para tratamiento con progestagenos o progesterona el mtodo de inseminacin artificial ms recomendado es el de la va intrauterina por laparoscopia y no por va cervical ya sea que se trate de semen fresco, refrigerado o congelado ya que inseminaciones cervicales en celos sincronizados con progestagenos resultan en menor fertilidad la cual puede estar relacionada a la ocurrencia de secreciones y reacciones vaginales causadas por las esponjas o CIDRs o a otros factores. Recientemente Chimeneau et al. (1998) ha encontrado en cabras que son tratadas repetidamente con progestagenos un gradual incremento en el intervalo entre la remocin de la esponja y el celo y una gradual disminucin de la fertilidad, esto no ha sido todava demostrado en ovejas pero es lgico asumir que se presente un fenmeno similar.

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b.2. La deteccin del celo: Las ovejas cuando estn separadas del macho no muestran muy claramente signos externos del celo. Por lo que es necesario usar machos marcadores del celo que llevan un "chaleco marcador" o llevan el pecho pintado y que son carneros a los que se les ha prevenido de alguna forma que puedan depositar un eyaculado frtil en la hembra. Los carneros vasectomizados o los carneros castrados ("capones") inyectados o implantados con testosterona son los que se usan mas frecuentemente ya que producen eyaculados sin espermatozoides, mejor aun si a estos se les ha cambiado la posicin de la abertura prepucial para evitar tambin que haya copula previniendo en esa forma la transmisin de enfermedades va comulacin. El uso de "mandiles pecto-ventrales" que cubren todo el vientre y la parte posterior del pecho del carnero es tambin otro mtodo para prevenir la comulacin. Tanto la desviacin peniana-prepucial como los mandiles permiten usar carneros enteros como marcadores pero es mas seguro si se trabaja con machos vasectomizados o con capones. La proporcin recomendada de machos marcadores depende de la concentracin de ovejas por unidad de superficie y de la proporcin de ovejas que se espera entren en celo por da lo cual es funcin del tipo de celos ( natural o sincronizados). En praderas al pastoreo y con celos naturales la proporcin recomendada de marcadores sobre borregas es del 3 al 4%. Esto puede ser reducido al 1 o 2% si las borregas estn en reas ms pequeas o confinadas. La proporcin de ovejas que se espera entren en celo natural diariamente es de 6 % de la poblacin total, si esto no se esta logrando quiere decir que la nutricin no debe estar optima o hay algn factor de "stress" afectando el rebano o los carneros marcadores no estn trabajando o las pinturas o crayolas de los chalecos no son lo suficientemente frescas para dejar las marcas. Si se trata de celos sincronizados la proporcin de carneros marcadores requeridos se eleva considerablemente requirindose un 10% sobre la poblacin de hembras sincronizadas para una fecha especifica. Normalmente se aconseja que la introduccin de machos marcadores en rebaos no sincronizados se haga 17 a 18 das antes de la fecha programada de inseminacin de tal manera que las ovejas no sean inseminadas al celo inducido por el efecto de macho (que produce cuerpos luteos de vida muy corta) sino al siguiente celo a no ser que las ovejas sean tratadas con progestageno antes de la introduccin de los machos en cuyo caso se pueden inseminar al celo inducido por el efecto del macho. Los machos marcadores deben ser reemplazados peridicamente (cada 15 das) para evitar agotamiento y el rebano debe ser observado dos veces al da para separar a las ovejas marcadas y asignalarlas a los grupos de inseminacin. b.3 La inseminacin propiamente dicha: La inseminacin cervical a la que nos hemos referido en todo este articulo se refiere a la "inseminacin cervical superficial" ya que la pipeta de inseminacin penetra solo hasta topar con el primer anillo cervical (figura 5), el mtodo es muy simple y no invasivo, simplemente se introduce un especulo (7.5 pulgadas de largo x 1 pulgada de dimetro) a la vagina para visualizar la entrada de la cervix ayudados por una linterna frontal o incorporada al especulo y una vez localizada la cervix se introduce la pipeta (de 12 pulgadas de largo y 1/8 de pulgada de dimetro) la cual para mejor manipulacin tiene la punta doblada, hasta sentir resistencia del primer anillo cervical y se deposita el semen descargando la jeringa o pistoleta conectada a la pipeta ( Morrant y Dun , 1960; Calle y Vivanco, 1976).

2 0

Debido a la barrera natural ofrecida por las caractersticas anatmicas de la cervix uterina de la borrega, la inseminacin cervical profunda o intrauterina-transcervical (llegando al tero a travs de la vagina) requiere de artificios o mtodos no convencionales, el pasaje a travs de la cervix ha sido intentado en diversas formas tratando de forzar el pasaje de catteres o incluso envolviendo cortes de la pared vaginal ( Fukui y Roberts, 1976; Morant and Dun, 1960; Bruckerell, B; 1989 (The Guelp System for Transcervical A I); todos estos sistemas producen dolor en el animal, son muy laboriosos, de gran riesgo para la vida de las ovejas y de practicidad y tica cuestionables aun cuando sus autores reclamen resultados comparables a la inseminacin laparoscopica. La inseminacin intrauterina depositando el semen directamente en la porcin superior de los cuernos uterinos fue aplicada inicialmente va laparotoma ventral exteriorizando los cuernos uterinos y aplicando el semen usando una pipeta de vidrio con la punta en aguja hecha al fuego, el mtodo fue usado para fertilizar ovejas superovuladas (Boland y Gordon, 1978), obviamente este mtodo solo poda justificarse en cierta forma para experimentacin con ovejas superovuladas . Una evolucin del mtodo sin embargo fue la aplicacin del mismo principio (deposicin del semen directamente en la parte superior del cuerno uterino) pero por va laparoscopica (Maxwell et al., 1983). Nosotros en nuestra primera inseminacin laparoscopica en el Per (Vivanco et al., 1985) usamos en lugar de pipetas de vidrio pipetas plsticas de inseminacin de vacunos a las cuales adherimos en una de las puntas una aguja hipodrmica de 21gx1/2" (este mismo concepto fue desarrollado posteriormente por los franceses produciendo los "aspics" comercialmente), en dicho ensayo inseminamos 980 ovejas sincronizadas con esponjas de progesterona (30 gr) hechas por nosotros y PMSG producido tambin por nosotros, el semen fue semen Corriedale congelado (pellets) importado de Australia, se obtuvo 46% de ovejas paridas y un promedio de 1.39 corderos por borrega que pari. Desde esos inicios de la inseminacin laparoscopica a la fecha la tcnica en si no ha variado pero se tienen ahora productos comerciales estandarizados tanto para la sincronizacin del celo, laparoscopia, instrumental de inseminacin, etc. y se han definido con mas precisin los requerimientos de semen (numero de espermatozoides por dosis), momento de inseminacin, etc., dando como resultado una tcnica eficiente y que en promedio produce alrededor de 75% de fertilidad tanto con semen fresco o congelado (Evans, G. 1991). La figura 6 muestra el diagrama esquemtico de la inseminacin laparoscopica. Los recientes hallazgos de Gillan y Maxwell C. (1998) como mencione anteriormente identifican reas de investigacin y desarrollo que al resolverse sin duda resultaran en mayor eficiencia de la inseminacin artificial ovina.

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especulo

pipeta

anillo cervical obstaculo

Figura 5. Diagrama del metodo de inseminacion cervical superficial

Pistoleta con "aspic"

Barreta de manipulacion

Laparoscopio canulas Cuernos uterinos Figura 6. Diagrama del metodo de inseminacion intrauterino por laparoscopia

2. Transferencia embrionaria en ovinos

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A. El estado actual de la tecnologa de transferencia de embriones en el ovino. reas que requieren solucin y mayor desarrollo tecnolgico El principal objetivo de la transferencia embrionaria es el incremento de la tasa reproductiva de las hembras en forma similar al rol de la inseminacin artificial en el aumento de la tasa reproductiva de los machos. El incremento de la tasa reproductiva de las hembras permite utilizar al mximo las madres de alto valor gentico como instrumento de mejora gentica. La transferencia embrionaria en ovinos es una tecnologa reproductiva bastante exitosa y de uso muy comn en programas de introduccin de genotipos exticos en diferentes ambientes. El desarrollo de mtodos efectivos de sincronizacin del ciclo estral del ovino, el desarrollo de la laparoscopia que permite el uso de la inseminacin intrauterina y la recoleccin y transferencia laparoscopica de embriones, el desarrollo de mtodos mas adecuados de induccin de superovulacion y el manejo reproductivo fuera de estacin han contribuido grandemente a llevar la transferencia embrionaria a niveles de eficiencia que justifican su aplicacin econmica en los programas de mejoramiento gentico ovino. Son sin embargo aun limitantes que se deben resolver las respuestas superovulatorias variables y el relativo bajo numero de embriones obtenidos por recoleccin. B. Aspectos tcnicos de la transferencia embrionaria en ovinos: a) Control del ciclo estral y sincronizacin del celo; el momento de inseminacin artificial en las dominantes con respecto al celo sincronizado. Los tratamientos en donantes deben ser efectuados en das especficos del ciclo estral, esto requiere que el ciclo estral de las donantes sea controlado, por otro lado, si los embriones sern transferidos frescos ( no congelados), las donantes y recipientes debern tener los ciclos estrales sincronizados de manera que el embrin sea transferido a un ambiente intrauterino similar al de la donante. En el caso de embriones congelados si las operaciones de transferencia embrionaria de los embriones congelados se requieren efectuar en un numero determinado de recipientes al mismo tiempo, dichas recipientes debern tener el celo sincronizado para recibir embriones de una determinad edad al mismo tiempo. El control del ciclo y sincronizacin del celo son tambin ayudas de manejo para facilitar las operaciones de inseminacin artificial de donantes y la recoleccin de embriones. El ciclo estral de la oveja dura 16 a 17 das, la longitud del estro receptivo en la borrega es de 24 a 36 horas, el pico ovulatorio de LH se produce entre las 4 y 6 horas de iniciado el estro y la ovulacin ocurre a las 20-24 horas del pico ovulatorio de LH ( Bearden y Fuquay, 1980). La figura 7, muestra la secuencia de los diferentes eventos fisiolgicos del ciclo estral de la oveja.

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La sincronizacin del celo se logra afectando y controlando la vida funcional del cuerpo luteo del ovario ya sea mediante la induccin de luteolisis (solo durante la estacin reproductiva) aplicando protaglandina F2 alfa o sus anlogos durante el diestro (por ejemplo una inyeccin de 50 a 100 ug de cloprostenol) entre los 9 das del celo si se conoce la fecha del celo anterior o dos inyecciones a un intervalo de 7 das si no se conoce la fecha del celo anterior ( Willadsen, S.M., 1979; Baril et al. 1993), o mediante la induccin de una fase luteal artificial lograda en base a la aplicacin va pesarios intravaginales de progesterona (por ejemplo CIDR-G,) o progestagenos (como F.G.A, M.A.P, Norgestomet) para imitar la fase luteal del ciclo estral . La progesterona y progestagenos pueden administrase tambin en forma de inyecciones diarias o como implantes subcutneos pero es menos practico. En la oveja 10 a 12 das de tratamiento son suficientes. ( Corteel et al., 1988; Crosby et al.,1991; Ainsworth y Wolynetz, 1982).

Progesterona Estrogeno PG F2alfa FOLL Ovul

FOLL

Ovul

CL

FSH

LH 16 17 1 CELO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 CELO 1 2 Dias B orrega

Figura 7. Representacion diagramatica de las diversas fases del ciclo ovarico y estral de la oveja (re dibujado de Chemineau et al. 1991.)

Tratamientos prolongados de progesterona o progestagenos estn asociados con menor fertilidad por lo que es ms recomendado usar tratamientos cortos (Corteel et al., 1988). Los progestagenos son mucho ms potentes y efectivos que la progesterona. En LambXL y la ATC los programas de sincronizacin usando CIDR (progesterona) en donantes tenan que utilizar 2 CIDR por borrega, reemplazando la primera a los 8 das despus de la insercin del primer CIDR y antes de iniciar las inyecciones de gonadotropinas de lo contrario muchas ovejas presentaban signos de celo aun estando con el CIDR insertado debido a la marcada baja en el nivel de progesterona en la sangre a partir del da 8 despus

2 4

de la insercin. Cuando se reemplaza el CIDR el da 8 este problema queda resuelto restablecindose un alto nivel de progesterona. En el caso de recipientes, en que no se usan altos niveles de gonadotropinas, con un solo CIDR por oveja es suficiente. La ventaja de los CIDRs estriba en que son ms fciles de aplicar y el porcentaje de perdidas de CIDRs es muy bajo comparado al de las esponjas vaginales de progestagenos. As mismo se observa menos incidencia de adherencias vaginales, hemorragias, secreciones ptridas, etc. en el caso de CIDR que de esponjas. La concentracin del principio activo varia de acuerdo al producto usado y la estacin y edad determina que concentracin es la mas adecuada. El cuadro 10 muestra las concentraciones por producto y su uso recomendado. Cuadro 10. Algunos productos usados para la induccin de fase luteal en ovejas. Sustancia Producto comercial concentracin uso recomendado Progesterona CIDR_G 40 gr Ovejas adultas, pesario vaginal borreguillas M.A.P pesario vaginal F.G.A pesario vaginal F.G.A pesario vaginal Repromap Chronogest Chronogest 60 mg 30 mg 40 mg Ovejas adultas, borreguillas Ovejas adultas fuera de estacin Ovejas adultas, borreguillas en estacin reproductiva Ovejas jvenes y adultas, cabras

Norgestomet, Crestar implante subcutneo en la base de la oreja

3mg

A la remocin del pesario vaginal, el cuerpo luteo ha regresionado por efecto de la progesterona exgena y se suceden las fases del pro-estro, el estro y la ovulacin en la secuencia normal pero con ciertas variaciones en la duracin de algunos eventos fisiolgicos. El intervalo de tiempo desde la remocin del pesario vaginal o suspensin del tratamiento con progesterona/progestagenos a la presentacin del celo receptivo es la caracterstica mas afectada y es mas corto en el caso de CIDR en comparacin a los progestagenos existiendo adems variaciones en la duracin de este intervalo entre los progestagenos (cuadro 11). El intervalo desde la terminacin del tratamiento progestacional y el inicio del celo esta tambin influenciado por el uso de gonadotropinas al final de la fase luteal artificial, el tipo , dosis y momento de aplicacin de gonadotropinas antes de la suspensin del tratamiento de progesterona/progestagenos, siendo mas corto cuando se aplican gonadotropinas que cuando no , cuando la actividad de LH en la gonadotropina es mas elevada, cuando la dosis de gonadotropina es mas

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elevada y cuando la aplicacin de la gonadotropina se hace con mayor anticipacin a la finalizacin del tratamiento progestacional. (Walker, S.K. et al. 1989). Cuadro 11. Intervalo desde el fin de tratamiento progestacional hasta el inicio del celo receptivo y ovulacin en la borrega dependiendo del producto usado para la induccin de la fase luteal artificial Producto Intervalo promedio desde Intervalo promedio desde la la finalizacin del finalizacin del tratamiento tratamiento hasta el inicio hasta el momento de del celo receptivo ovulacin Progesterona, CIDR, pesario vaginal 27 hrs 51 hrs Norgestomet, Crestar, implante subcutaneo 30 hrs F.G.A., Chronogest, 38 hrs esponja vaginal M.A.P, Repromap, esponja 45 hrs vaginal 55 hrs 63 hrs 69 hrs

Fuente: LambXL y ATC, resultados 1987-1994; Walker et al., 1989. Es importante notar que el intervalo entre el pico ovulatorio de LH y el momento de ovulacin es prcticamente una constante fisiolgica de una duracin de 20 horas en la borrega ( Cognie et al.,1987; Jabbour et al. 1991). El intervalo entre el momento de inicio del celo y el pico ovulatorio de LH es tambin casi constante en animales que no han recibido ningn tratamiento superovulatorio, sin embargo en animales tratados con gonadotropinas este intervalo (normalmente de 4 a 6 horas) es ms variable ya que esta influenciado por el nivel de estrgeno producido y por el nivel de "stress" que se haya impuesto. La adopcin de inseminaciones a "tiempo fijo" con miras a reducir costos de mano de obra se basan en los tiempos promedios desde la suspensin de los tratamientos progestacionales a la ovulacin y normalmente se hacen entre 6 y 8 horas antes del momento esperado de ovulacin. El momento de inseminacin debe ser aun ms cercano al momento de ovulacin cuando se trata de semen congelado. Personalmente yo no uso "inseminacin a tiempo fijo" en mis programas, ya que la variacin individual en el intervalo desde la finalizacin del tratamiento progestacional a la iniciacin del celo receptivo es muy grande, mucho ms aun cuando interacciona con la dosis y tipo de gonadotropinas usadas. La variacin es mucho ms marcada si los regmenes hormonales son deficientes. En LambXL luego de muchos anos de experimentacin alcanzamos a lograr un rgimen hormonal que nos dio distribuciones mas predecibles pero aun as continuamos usando inseminaciones en base a celo detectado. En promedio el intervalo de inicio de celo despus de la remocin de los CIDR en ovejas donantes tratadas con gonadotropinas para superovulacion en los programas de transferencia embrionaria en

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LambXL y la Australian Texel Corporation (ATC) mostraron la tendencia referida en el cuadro 12. Cuadro 12. Tpica distribucin del inicio del celo desde la remocin del CIDR en ovejas tratadas para superovulacion en LambXL y la ATC durante el otoo.
Hora de deteccin de celo despus de la remocin del CIDR(8 AM del da cero) Intervalo desde la remocin del CIDR a la deteccin del celo % de ovejas en celo al momento de la deteccin % acumulativo de ovejas en celo Momento de la inseminacin intrauterina laparoscopica basada en la hora de presentacin del celo Momento esperado ovulacin de Eventual momento de inseminacin si se hubiera hecho a "tiempo fijo" a las 48 horas despus de la remocin de CIDR

8 PM, da 0 8 AM, dia 1

12 hrs 24 hrs

2.5 % 30.0 % 60.0 % 5.0% 2.5%

2.5% 32.5% 92.5% 95.0% 100.0%

8 AM, da 1 5 PM , dia 1 8 PM, dia 1 8 AM, dia 2 5 PM, dia 2

8 PM, da 1 8 AM, dia 2

8 AM da 2 8 AM dia 2

Medio Dia, 28 hrs dia 1 8 PM, dia 1 8 AM, dia 2 36 hrs 48 hrs

Medio Dia, 8 AM dia 2 dia 2 8 PM , dia 2 8 AM, dia 3 8 AM dia 2 8 AM dia 2

Como se aprecia en el cuadro 12, una inseminacin a "tiempo fijo" a las 48 horas de la remocin del CIDR que es lo que se usa tradicionalmente (Vallet y Baril, 1990; Brevion et al., 1992) hubiera sido 12 horas despus de la ovulacin para el primer grupo, justo al momento de ovulacin para el segundo grupo, 4 horas antes de la ovulacin para el grupo en celo a medio dia, 12 horas antes de la ovulacin para el cuarto grupo y al inicio del celo (24 horas antes de la ovulacin) para el ultimo grupo. Por lo que antes de decidir en usar un "tiempo fijo de inseminacin" mas optimo es primero aconsejable conocer la propia distribucin de celos del rgimen hormonal que uno usa. En este caso el "tiempo fijo" hubiera sido mas optimo a 36 horas desde la remocin del CIDR. Debe tenerse en cuenta que el "tiempo o momento fijo" de inseminacin optimo para vejas no superovuladas no es igual al momento fijo optimo para ovejas superovuladas pues los niveles de estrgenos, numero de folculos a ovularse, etc. modifican totalmente los intervalos observados en ovejas no superovuladas. En recipientes bajo rgimen de CIDR y que reciben entre 200 a 500 u.i. (unidades internacionales) de PMSG al momento de la remocin del CIDR, el pico de actividad estral se presenta a las 36 horas (alrededor del 50% de la poblacin) de la remocin y un 25 a 35% entra en celo a partir de las 48 horas pero por lo menos un 15 a 20% de los animales muestran celo a las 24 horas de la remocin, este porcentaje de celos tempranos se incrementa si la aplicacin del PMSG se hace 24 horas antes de la remocin del CIDR. Tanto en LambXL como en la ATC se uso siempre carneros vasectomisados con chalecos marcadores para la deteccin de celos tanto en ovejas donantes como recipientes. El uso

2 7

de machos marcadores tiene la ventaja adicional de estimular secrecin de LH como consecuencia del efecto de macho (ver Cognie Y. 1990) lo que favorece la maduracin folicular y ovulacin. Los programas de "tiempo fijo" de inseminacin o de uso de recipientes a tiempo fijo para transferencia son muy riesgosos y solo deben ser utilizados cuando se conoce bien la distribucin de celos de la poblacin para el rgimen y estacin en la cual se trabaja. b) Estimulacin de la superovulacion: Muchos trabajos de investigacin se han publicado en relacin a regmenes de estimulacin hormonal para superovulacion en ovinos. Los tratamientos ms simples han sido los basados en una sola inyeccin de PMSG (debido a su larga vida media) de alrededor de 1500 a 2000 u.i, variando de acuerdo a razas y edades, aplicada 48 horas antes de la suspensin del tratamiento progestacional (Armstrong y Evans, 1983; Armstrong et al., 1983). Los resultados con PMSG fueron muy variables y se observo alta incidencia de folculos no ovulados lo cual esta ligado a baja fertilizacin y pobre "calidad " de embriones tal como veremos mas adelante. Otros tratamientos ensayados incluyeron HAP ( extracto de pituitaria anterior de equino) y HMG ( gonatotropina menopausica humana) con resultados variables (Moore y Eppleston, 1979; Schiewe et al., 1985;). La purificacin y disponibilidad comercial de FSH de pituitarias de porcino ( FSH-P; Folltropin V; Stimufol; Super -Ov) y ovino ( Embryo-S; Ovagen) marcaron la iniciacin de nuevas estrategias superovulatorias. Las inyecciones de FSH se efectan mayormente en dosis repetidas cada 12 horas (debido a la corta vida media de la FSH) ya sea en niveles constantes o decrecientes, inicindose por lo general 3 das antes de la suspensin del tratamiento progestacional, siendo la ultima inyeccin dada ya sea al momento de la suspensin del tratamiento progestacional o 12 horas mas tarde (Maxwell et al., 1990). Los niveles de tratamiento varan entre razas. Usando los tradicionales " mg Unidades Armour" ( un miligramo Armour es una unidad de actividad biolgica correspondiente a 10-14 ug de hormona FSH pura) , los regmenes para ovinos usados en LambXL y la ATC emplearon en promedio 25 a 28 mg Armour para Finnish Landrace, 30 a 32 mg Armour para Texel de origen finlands y 34 mg Armour para Texel de origen dans. Algunos autores han encontrado una perdida de sensitividad (o desarrollo de refractoriedad) con disminucin en respuesta ovulatoria en ovejas sometidas a repetidos tratamientos superovulatorios con FSH de origen porcino debido a la aparicin de anticuerpos anti pFSH (Remy et al., 1991) y mencionan que esta disminucin no ha sido observada cuando las ovejas han recibido tratamientos sucesivos con FSH de origen ovino ( Baril et al., 1992). Nosotros en LambXL y la ATC hemos tratado cada oveja 7 veces al ano por hasta 6 anos consecutivos con FSH mayormente de origen porcino y no hemos observado disminucin alguna en la tasa ovulatoria, el numero de previos tratamientos no tuvo efecto significativo en la tasa de ovulacin como se aprecia mas adelante en el cuadro 21. Otro de los puntos de gran discusin en el mundo cientfico ha sido el referente a la forma de aplicar el FSH ( inyecciones constantes o decrecientes) siendo ms recomendable inyecciones decrecientes ( Torres S. et al., 1987) y al nivel de contaminacin de LH presente en la fuente de FSH. Numerosos trabajos preconizaron el uso de determinada relacin LH/FSH, mientras ms bajo el nivel de LH mejor (ver revisin por Maxwell et al.,

2 8

1990; Chupin D. et al., 1987). Nuevos productos en el mercado ( por ejemplo Ovagen) prcticamente no contienen LH y Folltropin-V tiene un nivel mximo de 5%. Sin embargo, cuando se usan estos productos bajos en nivel de LH como nica droga para la superovulacion, la respuesta es bastante pobre ( McMillan W. H. y Hall, D.R.H. 1990) y peor aun si hay factores que causen "stress" en los animales. Esto indujo la introduccin "paradojica" de PMSG en los tratamientos basados en FSH de bajo nivel de contaminacin de LH , es decir se introdujo un producto de alta actividad de LH para combinarse con tratamiento de FSH pura o de baja contaminacin de LH. Los primeros ensayos recomendaron administracin del PMSG a la primera inyeccin de FSH lo cual no incremento substancialmente los resultados (McMillan W. H. y Hall, D.R.H 1990; Greaney K. B. et al., 1991; Rangel-Santos R, 1991; ver tambin el cuadro 15 mas adelante) . Una estrategia ms satisfactoria fue la de inyectar PMSG 48 horas antes de la terminacin del tratamiento progestacional, en combinacin con dosis repetidas de FSH o una sola dosis de FSH al momento de la aplicacin de PMSG (Maxwell y Wilson, 1989). Otras estrategias han incluido la aplicacin (adems del tratamiento superovulatorio al final del diestro inducido) de una dosis de FSH temprano ("priming") en el ciclo durante la fase luteal ( 4 das despus de la insercin del CIRD ) imitando el pico en FSH que se produce en forma natural en la fase temprana del diestro, esta practica fue preconizada por los distribuidores de FSH sin embargo nuestros resultados usando esta estrategia fueron contraproducentes. El uso de GnRH al momento del celo dio resultados variables (Walker, S.K. et al., 1989; Rangel-Santos R, 1991), nuestros experimentos en LambXL no resultaron en mejora significativa de los diversos parmetros (cuadro 13), sin embargo dado a que nuestros ensayos sobre uso de GnRH se hicieron antes de que llegramos a un rgimen gonadotropico optimo, pensamos que su efecto debe ser estudiado nuevamente dentro de nuestra nueva estrategia de superovulacion. Nuestros experimentos en el uso de vacunacin contra inhibina en animales superovulados, tuvo efecto solo en animales jvenes (cuadro 14) y ensayos de vacunacin contra esteroides sexuales en ovejas superovuladas (Rangel-Santos, R., 1991) tampoco resultaron en incrementos sustanciales. Nuestros ensayos con Neutra PMSG en ovejas tratadas con PMSG tampoco resultaron en mejoras significativas ( Vivanco H. W. et al., 1992).

Cuadro 13. Efecto de la inyeccin de GnRH al momento del inicio del celo sobre los diferentes parmetros medidos en ovejas superovuladas GnRH * Control N Promedio SE N Promedio SE
No de ovulaciones/oveja

65

3.96 0.28 (a)

68

3.55 0.28 (a)

2 9

No de Folculos no eclosionados/oveja Tasa de recoleccion % Tasa de fertilizacin % % embriones de calidad transferible Embriones transferibles/oveja

65 40 38 34 38

0.69 0.13 (a) 63.81 4.73 (a) 84.70 5.40 (a) 89.37 4.98 (a) 2.12 0.26 (a)

68 39 34 34 29

0.69 0.13 (a) 57.37 4.79 (a) 81.60 5.97 (a) 83.86 0.28 (a) 1.54 5.50 (a)

* 1 ml Fertagyl ( Intervet, Holland) al momento de deteccin del celo Promedios con igual letra en parntesis no son diferentes estadsticamente (p>0.05) Fuente: LambXL. 1991.

Cuadro 14. Efecto de la vacunacin contra inhibina en la produccin de embriones transferibles por oveja Finnish Landrace bajo tratamiento superovulatorio. Embriones transferibles por oveja programada n Promedio Ovejas adultas, vacunadas Ovejas adultas, control Borreguillas, vacunadas Borreguillas, control
Fuente: ATC.1993.

31 33 37 29

10.48 (a) 10.06 (a) 10.78 (a) 7.00 (b)

c) La nueva estrategia hormonal usada en LambXL y la ATC: La gran variabilidad en las respuestas a los tratamientos superovulatorios es considerada como el factor ms limitante de la transferencia embrionaria en todas las especies. Despus de varios anos de experimentacin, en los anos 1992 y 1993 en LambXL y durante nuestros trabajos en la ATC en 1993 y 1994, modificamos totalmente la estrategia construyendo hiptesis basadas en una observacin ms minuciosa de la fisiologa del ciclo ovrico y estral. En primer lugar, es conocido que es la FSH y no la LH la que es necesaria para desarrollar los folculos primarios (Driancourt, M.A. y Fry R.C., 1988; Driancourt, M.A. et al. 1993) por lo que planteamos que el reclutamiento de folculos del grupo de folculos sensitivos a gonadotropina y su desarrollo tiene que estar basado en la utilizacin de FSH con muy bajo nivel o completamente libre de contaminacin de LH. La utilizacin de inyecciones de PMSG al momento de la primera inyeccin de FSH (tal como era recomendada por algunos investigadores (McMillan W.H. y Hall, D.R.H.1990) y que fuera adoptada por nosotros inicialmente (cuadro 15) estara induciendo una maduracin y/o luteinizacion folicular muy temprana. Una vez que el foliculo alcanza cierto grado de desarrollo es que hay un cambio de dependencia del foliculo de FSH hacia LH (Draincourt, M.A y Fry R.C, 1988; Driancourt, M.A. et al. 1993), por lo tanto la

3 0

inyeccin de una fuente de LH debera hacerse al final del periodo de desarrollo folicular, es decir prcticamente a la 6ta inyeccin de FSH. La fuente de LH debe imitar la secrecin pulstil o incremento gradual de LH que se observa en el pro estro y no producir una especie de pico que estara mas bien imitando el pico ovulatorio, por ello es mejor usar PMSG y en bajo nivel y no HCG , o LH directamente o GnRH como fue usado por otros autores (Wright, R. W. et al., 1981; Chupin D. et al., 1987; Walker, S.K. et al., 1989). Nosotros probamos esta hiptesis (imitar nivel creciente de LH durante el proestro) en un pequeo ensayo para observar las tendencias (cuadro 16), confirmando nuestra expectativa de mejores resultados si el PMSG se aplica al momento de la remocin del tratamiento progestacional. Es conocido que la aplicacin exgena de FSH y PMSG decrecen la secrecin endgena de FSH y los pulsos endogenos de LH (Bevers, M.M. et al., 1988) , el pico ovulatorio de LH sin embargo, ya que es producido como respuesta a los altos niveles de estrgeno que se generan en el pro estro e inicio del estro y que son aun ms altos en el caso de superovulacion ( Jabbour H.N., et al., 1986) tendra menos chance de ser bloqueado por el tratamiento exgeno de gonadotropinas. Todo esto sugiere que una vez que uno inicia el tratamiento superovulatorio uno debe desestimar los niveles endogenos de FSH y proporcionar apoyo de FSH exgeno todo el tiempo. Los tratamientos tradicionales de superovulacion sin embargo estn basados en la aplicacin de un determinado numero fijo de inyecciones de FSH aplicadas todas durante el diestro (antes de remover el tratamiento progestacional), poniendo la ultima dosis al momento de suspender el tratamiento progestacional o mximo 12 horas despus, esto esta privando de FSH a los folculos en la fase mas critica de su desarrollo ( el pro-estro), las inyecciones de FSH deben continuar hasta que la donante inicia el celo receptivo. Nosotros probamos nuestra hiptesis comparando donantes que fueron inyectadas con FSH hasta el inicio del celo inclusive, hasta 12 horas antes del inicio del celo (no inyectadas al momento de la deteccin) y otras que recibieron la ultima inyeccin 12 horas despus de la remocin del progestageno y no volvieron a ser inyectadas y que entraron en celo despus de 24 y 36 horas de la ultima inyeccin de FSH. Los resultados se muestran en el cuadro 17. Cuadro 15 . Promedio de produccin de embriones transferibles por oveja donante (Ovejas Danish Texel de 1.5 anos de edad) obtenido para algunos regmenes hormonales ensayados en LambXL el periodo 1990-1992.*
FSH-P :34 mg Armour, 7 inyecciones decrecientes OVAGEN: 15.2 ml en 7 inyecciones decrecientes, 300u.i PMSG a la primera inyeccin de Ovagen FOLLTROPIN: 12.8 ml en 7 inyecciones decrecientes, 100 u.i PMSG a la primera inyeccin de Folltropin

No de ovejas tratadas No de ovejas operadas Embriones transferibles por oveja operada SD

14 13 (92%)

54 47 (87 %)

100 85 (85%)

4.0 3.08

2.6 5.2

4.45 3.1

3 1

Embriones transferibles por oveja tratada SD

3.71 2.8

2.3 5.0
Fuente: LambXL

3.78 2.65

* CIDR removida a la 6ta inyeccin

Cuadro 16. Efecto de la aplicacin de PMSG a diferentes tiempos en relacin al inicio del tratamiento con FSH y la terminacin del tratamiento progestacional en ovejas Romney Marsh superovuladas con Folltropin-V* 200 u.i PMSG al 200 u.i PMSG a la 100 u.i al inicio del inicio del 6ta inyeccin de tratamiento con tratamiento con FSH al momento FSH y 100 u.i a la FSH de remocin del 6ta inyeccin de CIDR FSH al momento de remocin del CIDR N Promedio N Promedio N Promedio SD SD SD Intervalo remocin del CIDR al inicio del celo Hrs 5 21.6 9.90 5 25.6 9.90 5 19.2 9.90 Ovulaciones por Oveja Tasa de recoleccin % Tasa de fertilizacin % 5 4 4 3.6 1.88 5 5 9.6 1.88 5 5 5 7.6 3.9

76.3 30.80 93.8 72.16

54.8 52.67

88.3 59.04 90.9 64.03

4 100.0 72.16

3 2

Embriones transferibles por oveja operada Embriones transferibles por borrega tratada Porcentaje de embriones transferibles

3.0

0.72

7.0 1.63

5.4

3.49

2.4

0.64

5.6

1.47

5.4 3.49

100.0 72.16

4 100.0 72.16

80.0 64.03

*rgimen: Cidr-In dia cero, PMSG en los momentos sealados, Folltropin-V: 2.8,2.8,1.4,1.4,1.0,1.0 ml, CIDR-removida, continuacion 0.8 ml Folltropin cada 12 hrs hasta el comienzo del celo (exclusive). Fuente: LambXL 1991.

Cuadro 17. Efecto de la continuacin de las inyecciones de FSH hasta el momento del inicio del celo en ovejas Texel superovuladas con Ovagen. Inyectadas con suspensin de suspensin de Numero fijo de Ovagen hasta las inyecciones las inyecciones inyecciones, el momento de de Ovagen al de Ovagen al ultima inyeccin presentacin momento del momento del 12 hrs despus del celo inicio del celo inicio del celo de remocin del inclusive CIDR Intervalo entre ultima 0 hrs 12 hrs 12 hrs 24 hrs inyeccin de Ovagen y el inicio del celo Numero total de inyecciones 8 7 8 8

3 3

Intervalo remocin del CIDR al inicio del celo

12 hrs

12 hrs

24 hrs

36 hrs

N Prom. SD Numero total de embriones transferibles por oveja tratada

N Prom. SD

N Prom. SD

N Prom. SD 0.3 0.3 (b)

19 3.4 0.6 (a) 24 (b)

1.1 0.3 43 (b)

1.3 0.3 6

Letras diferentes entre parntesis indican diferencia significativa (P 0.05) Fuente: LambXL 1991. Como producto de todos estos ensayos que confirmaron nuestra hiptesis reformulamos nuestra estrategia definiendo nuestro rgimen de 1992 en adelante en la siguiente forma: Nuestro rgimen en LambXL y ATC aplica el PMSG al final del tratamiento progestacional y sigue aplicando FSH, no importa cuantas dosis se requieran, hasta que la donante es marcada en celo ( si es encontrada en celo al momento de la deteccin ya no recibe mas FSH). Estos cambios en la estrategia de tratamientos hormonales constituyeron uno de los ms importantes avances en nuestro programa de transferencia embrionaria. El porcentaje de ovejas que entraron en celo y que ovularon despus del tratamiento se elevo de un 80-85% a prcticamente 100% y el numero de embriones producidos por donante prcticamente se duplico, no mostr ninguna variacin en respuesta entre estaciones, todas las razas respondieron satisfactoriamente as como fue efectivo tanto en adultas como en borreguillas de primer celo ( ver cuadros 18, 19 y 20).

Cuadro 18. Resultados obtenidos en la ATC durante las estaciones de primavera y otoo aplicando la nueva estrategia superovulatoria. Todas las razas confundidas (Danish Texel, Finnish Texel, Finnish Landrace) Primavera 1993 Otoo 1994 N Promedio SD N Promedio SD No de ovulaciones/oveja Tasa de recoleccin % Tasa de fertilizacin % 1544 1385 1363 10.16 5.63 77.02 26.70 94.27 16.89 1190 1139 1089 9.45 5.71 76.10 30.11 90.87 23.81

3 4

Embriones transferibles por oveja tratada 1596 Porcentaje de embriones de calidad transferible 1339
Fuente: ATC.

6.30 85.55

5.23 25.12

1213 1039

6.13 5.39 88.27 22.79

Cuadro 19. Comportamiento de ovejas donantes en diferentes parmetros de la superovulacion y transferencia de embriones de acuerdo a la raza durante la estacin reproductiva (otoo) usando la nueva estrategia de tratamiento hormonal Razas Danish Texel Finish Texel Finnish Landrace Variables N Promedio SD N Promedio SD N Promedio SD No de CL/oveja donante Tasa de coleccin (%) Tasa de fertilidad (%) Embriones transferibles/donante Porcentaje de embriones transferibles sobre embriones totales 523 508 480 536 7.1 4.1 78.0 30.8 90.7 24.0 4.7 3.97 433 415 407 438 11.0 5.5 72.9 29.1 93.2 20.4 7.0 5.4 234 11.9 7.0 216 77.7 30.0 202 86.5 28.7 239 7.8 7.0

458

88.0 23.18

393

90.0 20.4

188

85.1 26.0

Fuente: Australian Texel Corporation (ATC), Resultados Otoo 1994.

Cuadro 20. Comportamiento de borreguillas de primer celo nacidas en Nueva Zelanda en la primavera de 1992 y usadas como donantes

3 5

superovuladas en la estacin de otoo de 1993 en Australia ( 7 meses de edad) bajo la nueva estrategia de tratamiento hormonal. Danish Texel Finnish Texel Finnish Landrace N Promedio SD N Promedio SD N Promedio SD No de ovulaciones por borreguilla 42 6.71 27 9.3 12 6.16 Tasa de recoleccin % Tasa de fertilizacin % Embriones transferibles por borreguilla tratada 37 37 74.08 28.63 95.27 11.70 25 24 64.38 32.76 96.70 10.78 9 8 75.11 34.25 100.00 0.00

45

4.02 3.71

27

5.55 4.01

12

4.00 3.74

Porcentaje de embriones de calidad transferible 37

Fuente: ATC. 1993.

85.93 22.49

24

94.00 20.46

86.45 18.00

El rgimen hormonal se aplico en forma consecutiva por 4 veces durante la estacin reproductiva (otoo) y 3 veces en la primavera cada ano (sin mayores diferencias entre estaciones). La estrategia de ptimos resultados para nosotros consisti en: Insertar el CIDR e inyectar prostaglandina F2 alfa (da cero), reemplazo de CIDR (da 8), inyecciones de FSH (decreciente) cada 12 horas da 8, 9 y 10; remocion del CIDR a la 6ta inyeccion de FSH, aplicacion de PMSG al momento de la remocion del CIDR, introduccion de machos vasectomisados marcadores al momento de remocion del CIDR, observacion de celos cada 6 a 12 horas, continuacion de inyecciones de FSH (al mismo nivel del de la inyeccion dada al momento de la remocion del CIDR) cada 6 a 12 horas a todas las donantes no marcadas en celo . suspensin de FSH a las ovejas encontradas marcadas en celo. Inseminacin intrauterina laparoscopica con semen fresco ( mnimo 50 millones de espermatozoides motiles por oveja, optimo de 75 a 80 millones) inseminando en ambos cuernos uterinos, 8 a 12 horas despus de la deteccin de celo. Recoleccin de embriones 7 das despus del inicio del celo. Inyeccin de prostaglandina al momento de recoleccin de los embriones, repeticin de prostaglandina si la donante no entro en celo hasta 5 das despus de la inyeccin de prostaglandina inyectada al momento de la recoleccin, insercin de CIDR para la siguiente ronda de transferencia 7 a 9 das despus de la recoleccin de embriones. aplicacin de otra dosis de prostaglandina a las donantes que recibieron el CIDR sin haber entrado en celo desde la recoleccin anterior. Repeticin del ciclo descrito.

3 6

Esta nueva estrategia aplicada mayormente a Texel y Finnish Landrace (ver resultados cuadro 19), la usamos tambin para ovinos Ramboullet, Romney, y Merino con muy buenos resultados y pensamos que es un nuevo patrn de superovulacion a ser usado no solo en ovinos sino en otros rumiantes.

d) Factores que afectan la produccin de embriones transferibles: El cuadro 21 muestra los resultados del anlisis de cerca de 9 mil superovulaciones hechas en LambXL durante 6 anos, lo que constituye talvez la ms grande cantidad de informacin en transferencia embrionaria ovina a nivel mundial. Los resultados estn expresados como porcentaje de la variacin corregida total que es explicado por el efecto del factor especifico analizado. En nuestra poblacin y bajo nuestras condiciones de manejo y regmenes hormonales, el numero de ovulaciones o tasa de ovulacin estuvo afectado en forma altamente significativa por la raza de las donantes dentro de cada ano analizado (ver tambin cuadro 22 ), el intervalo entre la remocin del CIDR y el inicio del celo ( intervalo muy corto ovulacin pobre, intervalo medio ovulacin alta, intervalo largo ovulacin pobre), la estrategia hormonal de la superovulacion (ver tambin Cuadros 15 y 16) , la granja ( en LambXL tenamos 5 granjas en lugares diferentes y manejadas por diferentes personas), la "calidad del cuerpo luteo" ( animales mostrando cuerpos luteos de aspecto diferente del normal tienen bajo numero de ovulaciones), presencia de folculos de mas de 5 mm al momento de la recoleccin de embriones ( mayor numero de folculos estrogenicos y no eclosionados presentes al momento de la recoleccin, menor tasa de ovulacin. Este factor fue responsable del 65% de la variacin observada en tasa de ovulacin), el inseminador ( ciertos inseminadores, probablemente los que aplicaban mayor "stress" en los animales afectaban la tasa de ovulacin). Ninguno de los siguientes factores analizados afecto la tasa de ovulacin: el intervalo entre inicio del celo y el momento de ovulacin, la estacin reproductiva y el numero de veces que la donante recibi anteriormente tratamientos hormonales y fue operada (esto ultimo indica que en nuestro caso no existi refractoriedad a los tratamientos hormonales). La tasa de recoleccin de embriones ( numero de embriones colectados en relacin al numero de ovulaciones registradas) esta afectada en forma significativa por la raza de la donante dentro de cada ano, el intervalo desde la remocin del CIDR hasta la presentacin del celo (siguiendo la misma tendencia referida para el caso de tasa de ovulacin), el rgimen hormonal para la superovulacion, las granjas donde se mantuvieron los animales, la estacin del ano, el numero de veces que la oveja fue sometida a tratamientos y operaciones anteriormente (ver tambin figura 8), la "calidad de cuerpo luteo" (misma tendencia que la referida para tasa de ovulacin, y fue el factor que ms explico la variabilidad total observada en tasa de recoleccin, siendo responsable de 34% de la variacin total observada), la presencia de folculos de mas de 5mm de dimetro al momento de la coleccin ( mas folculos menor tasa de recoleccin), el cirujano haciendo la recoleccin. Los factores analizados que no afectaron la tasa de recoleccin fueron: el

3 7

inseminador, la tcnica de coleccin de embriones, el intervalo del inicio del estro a la inseminacin, la edad del embrin, el embrilogo. Los factores que afectan en forma significativa la tasa de fertilizacin ( numero de embriones recolectados en relacin al numero total de embriones mas ovocitos no fertilizados recolectados) son: el intervalo desde la remocin del CIDR hasta el inicio del celo (siguiendo la misma tendencia descrita para los otros factores, explicando 35% de la variacin), el rgimen hormonal de superovulacion, el numero de veces que la donante fue tratada y operada anteriormente (este factor fue el que ms afecto la fertilidad, explicando 43% de la variancia, ver tambin figura 9). Los factores analizados y que no afectaron la tasa de fertilidad fueron: la raza de la donante dentro de cada ano, la granja, la estacin del ano, la calidad del cuerpo luteo, la presencia de folculos de mas de 5mm, el inseminador, el carnero usado. Los factores que afectan en forma significativa la tasa de embriones de calidad transferible ( numero de embriones transferibles o de buena calidad sobre el numero total de embriones recolectados) son: la raza de la donante dentro de cada ano (fue el factor que ms afecto esta variable, explicando 30% de la variancia), el intervalo desde remocin del CIDR hasta el inicio del celo ( misma tendencia que la ya descrita), el rgimen hormonal de superovulacion, la calidad del cuerpo luteo, el numero de folculos de mas de 5 mm en dimetro presentes al momento de la recoleccin ( mas folculos, menos calidad transferible del embrin), el intervalo del inicio del celo al momento de inseminacin ( en la misma tendencia ya descrita), la edad del embrin ( menor edad, menor calidad transferible), el embrilogo ( probablemente debido a diferencias en apreciacin de la calidad de los embriones). No hubo efecto significativo de las granjas, estacin del ano, numero de tratamientos y operaciones anteriores y de carneros. Es importante anotar que algunos factores pueden ser significativos en otras condiciones o para otras poblaciones, por ejemplo en nuestro caso no encontramos efecto del mtodo de recoleccin de embriones y de cirujanos en la tasa de coleccin, esto refleja que todos nuestros mtodos estaban optimizados y nuestros tcnicos estaban al mismo nivel de experiencia, esto puede no ser cierto en otras poblaciones. Es tambin muy importante sealar que a pesar de la gran cantidad de detalle que se registro, tomndose en cuenta prcticamente todo parmetro medible, el coeficiente de determinacin del modelo (R2) fue solo de 14 a 24 % dependiendo del factor analizado lo cual indica que existen una serie de factores que influyen los resultados y que no han podido ser medidos, probablemente la mayora de efectos son debidos a complejas interacciones entre todos los factores.

3 8

Cuadro 21. Factores que afectan los diversos parmetros de la transferencia embrionaria en el ovino. Valores expresados como proporcin de la varianza corregida total observada para cada caracterstica que es explicada por el respectivo factor analizado. Factores Tasa de Tasa de Tasa de Porcentaje de ovulacin Recoleccin Fertilizacin embriones Variables transferibles
Raza de donante dentro de ano Intervalo remocin del CIDR al estro rgimen hormonal Granja Estacin del ano Numero de tratamientos y operaciones previas Calidad del Cuerpo Luteo Presencia de folculos de mas de 5mm Intervalo inicio de celo a momento de Inseminacin Inseminador Mtodo de coleccin de embriones Carnero Edad de embrin Embrilogo Cirujano Numero de observaciones

8.90 11.37

26.41 6.60

NS 34.94

29.90 15.96

1.35 2.36 NS NS

1.86 7.64 1.21 4.19

11.93 NS NS 43.03

4.04 NS NS NS

10.02 65.26

33.57 12.57

NS NS

17.90 12.36

NS 0.51 4789

NS NS NS NS NS 4.69 4041

7.88 NS NS 4577

7.37 NS 7.37 10.16 3768

3 9

R2

24.7

11.6

20.50

14.10

Fuente: H W Vivanco, et al. 1994

Tasa de recoleccion 100 Quirurgica Laparoscopica

50

Numero de colecciones previas Tasa de recoleccin de acuerdo al numero de operaciones previas Tcnica Promedio SD Y= a bx valor de P 2141 Laparoscopica 55.75 32.54 58.55 - 1.63 0.011 1 2 3 4 5 6 7 2172 Quirurgica 54.05 34.00 55.07 - 0.57 0.474

Figura 8. Tasa de recoleccin de acuerdo al mtodo y el numero de operaciones previas Tasa de Fertilizacion 100

50

Quirurgica

Laparoscopica 0 Numero de 1 2 3 4 5 6 7 colecciones previas Tasa de Fertilizacin de acuerdo al numero de colecciones previas Tcnica Promedio SD Y= a bx 1953 Laparoscopica 55.75 32.54 58.55 - 1.63 1789 Quirrgica 54.05 34.00 55.07 - 0.57

valor de P 0.011 0.474

Figura 9. Tasa de fertilizacin de acuerdo al numero de colecciones previas

4 0

En adicin a todos los factores analizados, el estado nutricional del animal y su condicin general son muy importantes (SEIT CF. y Steward, R.D.1990). Las donantes y recipientes deben estar en buena condicin y recibiendo una nutricin balanceada. Como medida practica de manejo tanto en LambXL como en la ATC las ovejas tanto donantes como recipientes eran sometidas a esquila, desparasitacion y vacunaciones por lo menos 8 semanas antes de la recoleccin de embriones. El plano nutricional era elevado del nivel de mantenimiento (100%) hasta un nivel de 130% es decir 30% sobre el nivel de mantenimiento. Esta elevacin se hacia en forma gradual y en un lapso de 6 semanas generalmente ofreciendo suplementos de granos (maz, lupinos). Un problema frecuente, es la regresin temprana del cuerpo luteo en donantes, esto ha sido ligado a deficiencia energtica y se corrigi con suplementacion con granos de lupinos (Jabbour et al., 1991). Nuestras observaciones en ovinos ( subjetivas ya que no hemos tabulado informacin) sugieren que el nivel de stress es el factor ms responsable de la regresin luteal temprana. El stress puede ser exacerbado por el hecho de tener que poner en ayuno pre operatorio a la donante por un periodo prolongado ocasionando una brusca cada del nivel de glucosa en la sangre. Cualquiera que sea el factor desencadenante , la regresin luteal al final depende de la secrecin de prostaglandina F2 alfa. Algunos autores han usado bloqueadores de la protaglandina (Flunixina 2,2 mg/Kg) para corregir exitosamente esta situacin ( Battye et al. 1988). En Australia observamos cierta incidencia de regresin temprana del cuerpo luteo tanto en donantes como en recipientes durante larga exposicin a forrajes secos (no verdes) la que fue asociada a bajos niveles de Vitamina A en la sangre y corregida con una inyeccin de 3000 u.i de Vitamina A. De todos los factores de mayor impacto en los resultados, el factor de mayor importancia es un factor difcil de medir y es el nivel de stress al que son sometidos los animales. La produccin de glucorticoides y ACTH es el ms poderoso bloqueador de LH, afectando la maduracin folicular ( que depende de la secrecin pulstil de LH en el pro estro), la presentacin del celo (que depende de la maduracin folicular y por ende del nivel de estrgeno), el pico ovulatorio de LH (que depende del nivel de estrgeno), la ovulacin y la formacin del cuerpo luteo, que dependen del pico ovulatorio de LH ( ver revisin Moberg G.P., 1984). Animales que no estn acostumbrados a manejo rutinario, no estn familiarizados con las instalaciones, manipuleo, contacto con humanos, etc. darn muy pobres resultados. Es muy importante reducir al mximo el nivel de stress si se quieren obtener resultados satisfactorios. Esto es importante tanto para donantes como para recipientes. e) La tasa de sobrevivencia de los embriones Una serie de factores influyen la proporcin de embriones que se vern representados como corderos nacidos vivos y normales. Las fuentes de variacin mas frecuentemente

4 1

identificadas como de mayor importancia para la tasa de sobrevivencia de los embriones son: las donantes ( sobre todo su edad y raza), los tratamientos recibidos por donantes que afectan la calidad de los embriones, la manipulacin de los embriones (medios de lavaje y transporte o mantenimiento, temperaturas, ingredientes, etc.), la edad del embrin y estado de desarrollo al momento de la transferencia, las tcnicas y eficiencias en la coleccin y transferencia de embriones, la condicin, nutricin, raza y manejo de las recipientes (ver revisin en Rangel-Santos, R. 1991; Baril, G. et al. 1993). Datos de LambXL muestran los efectos de la raza del embrin y el numero de embriones transferidos por recipiente (cuadro 22), la edad de la donante (cuadro 23), la edad del embrin y el estado de desarrollo de acuerdo a la edad del embrin (cuadro 24), la "calidad" del embrin calificada subjetivamente ( cuadro 25), la condicin de la recipiente (cuadro 26), el mtodo de sincronizacin de la recipiente (cuadro 27), el lado uterino de la transferencia (cuadro 28) el intervalo al estro en la recipiente (cuadro 29) y el grado de sincronizacin entre donante y recipiente (cuadro 30). Cuadro 22. Tasa de sobrevivencia embrionaria de acuerdo a la raza del embrin y el numero de embriones transferidos por recipiente. Un embrin por Dos embriones por Total por raza recipiente recipiente Raza de Donante N Promedio SE N Promedio SE N Promedio SE Danish Texel Finnish Texel Finnish Landrace Gotland P. Oxford Down White Headed Marsh Total
Fuente: LambXL, 1987.

45 25 22 14 54 12

48.9 7.5 56.0 10.1 54.6 10.9 50.0 13.9 44.4 6.8 50.0 15.1

237 130 305 111 260 53

45.6 2.8 55.0 3.8 50.8 2.6 46.0 4.3 41.5 2.7 34.9 5.6

289 45.2 2.6 155 55.2 3.6 344 51.0 2.4 125 46.4 4.1 317 41.6 2.5 65 37.7 5.4

172 49.4 3.8

1096 46.7 1.3

1295 46.8 1.25

Cuadro 23. Sobrevivencia embrionaria de acuerdo a la edad de la oveja donante. Edad de la donante N Promedio ajustado SE Borreguillas de 1 ano 312 49.4 (b) Ovejas de 2 anos Ovejas de 3 anos 583 214 59.0 (a) 60.1 (a)

4 2

Ovejas de 4 anos Ovejas de 5 anos

130 28

57.8 (a) 38.6 (b)

Promedios con diferente letra en parntesis son significativamente diferentes (P 0.05) Fuente: LambXL, 1987.

Cuadro 24. Sobre vivencia embrionaria en ovinos de acuerdo al estado de desarrollo del embrin a una edad embrionaria determinada al momento de la transferencia. Embrin de 5.0 Embrin de 5.5 Embrin de Embrin de 6.5 Edad das das 6.0 das das
Estado desarrollo 16 clulas Morula temprana Morula Morula compacta Blstula Blstula expandida Blstula eclosionada de

N Prom. SE N Prom. SE 13 34.6 8.7 8 12.5 12.5 36 41.7 6.8 79 38.0 5.0 151 52.3 3.8 29 4 69.0 8.4 62.5 23.9

N Prom. SE 17 20.6 6.2 53 36.8 5.2 102 39.2 4.2 188 54.5 3.2 67 53.0 5.5 9 61.1 16.2

N Prom. SE 15 26.7 9.6 12 45.8 9.6 41 43.9 6.6 55 44.6 5.6 45 58.9 6.8 50 66.0 6.0 9 12.1 72.2

15 16.7 9.3 23 58.7 9.8

Edad del embrin contada a partir del momento de inseminacin. Fuente: LambXL. 1987.

Cuadro 25. Influencia de la calidad del embrin en la tasa de preez y en la supervivencia embrionaria de ovinos Texel de acuerdo al numero de embriones transferidos por recipiente. Tasa de preez Sobre vivencia embrionaria Transferencia: N Promedio N Promedio 1 embrin Grado 1 181 78.00 (b) 142 78.00 (a)

4 3

2 embriones Grado 1 1 embrin Grado 2 2 embriones Grado 2

239 73 90

92.00 (a) 68.00 (b) 80.00 (b)

478 73 180

70.00 (b) 68.00 (b) 51.00 (c)

Promedios con diferente letra en parntesis son diferentes (P 0.05) Fuente: LambXL. Kiwitea. 1990

Cuadro 26. Influencia de la condicin de la recipiente en la sobre vivencia embrionaria Peso vivo de la recipiente N Promedio SE 39 - 50 Kg 112 40.1 3.7 (d) 51 - 60 Kg 61 - 70 Kg 71 - 80 Kg 81- 90 Kg 271 401 186 18 54.7 2.4 (b) (c) 55.4 2.0 (b) (c) 70.0 2.9 (a) 47.7 9.3 (c)

Recipientes fueron ovejas adultas de la raza Romney Marsh. Fuente: LambXL.1987. Promedios con letras diferentes entre parntesis son estadsticamente diferentes (P 0.05)

Cuadro 27. Efecto del mtodo de sincronizacin de la recipiente en la sobre vivencia embrionaria. N Sobre vivencia promedia SE Sincronizadas con MAP 108 70.6 5.7 (a) Sincronizadas con CIDR 104 74.5 66.2 5.0 (a)

Transferencia hecha en ovejas de ciclo natural 52

Promedios con igual letra son iguales (P>0.05) Fuente: LambXL.1987.

6.9 (a)

Dos embriones implantados ipsilateralmente al sitio de ovulacin ocurrida en el lado derecho

Cuadro 28. Efecto del lado del tero de la recipiente en que se efectu la transferencia sobre la sobre vivencia de los embriones ovinos transplantados. N Promedio de sobrevivencia SE 74 66.2 5.3 (a)

4 4

Un embrin implantado ipsilateral al sitio de ovulacin y un embrin contralateral al sitio de ovulacin (total 2 embriones uno a cada lado) Dos embriones implantados ipsilateralmente al sitio de ovulacin ocurrida al lado izquierdo Promedios de igual letra no son diferentes (P>0.05) Fuente: LambXL.1987.

108 48

63.2 4.8 (a) 67.7 6.5 (a)

Cuadro 29. Efecto del intervalo entre la remocin de la esponja o el CIDR y el inicio del celo en la recipiente. Intervalo en das N Sobrevivencia promedio SE 1 - 1.5 103 69.5 4.6 (a) 2 - 2.5 3 - 3.5
Promedios con igual letra no son diferentes (P>0.05) Fuente: lambXL 1987.

162 32

72.9 3.8 (a) 76.4 8.1 (a)

Cuadro 30. Efecto de la sincronizacin entre donante y recipiente sobre la supervivencia embrionaria. Intervalo en das entre el celo de la recipiente y el celo de la donante N Sobrevivencia promedio SE 0 578 56.4 1.4 (a) 0.5 - 1 1.5 - 2
Promedios con igual letra no son diferentes (P>0.05) Fuente: LambXL. 1987.

725 9

55.9 6.6 (a) 38.8 27.9 (a)

Tal como se menciono para el caso de las donantes, la reduccin del "stress" y una balanceada nutricin son aspectos de gran importancia para obtener la mxima sobrevivencia embrionaria hasta el parto. Esfuerzos hechos en LambXL y la ATC para incrementar la tasa de sobrevivencia embrionaria, adems de tratar de optimizar todos los factores que influencian esta variable, incluyeron tratamientos hormonales a las recipientes tal como se muestra en el cuadro 31. La conclusin de esos ensayos es que la suplementacion de progesterona ( CIRD insertada en la recipiente inmediatamente despus de la transferencia, reemplazada el dia 13 despus de la transferencia y mantenida hasta el dia 56 de gestacin) no tuvo ningn efecto mejorador de la tasa de sobrevivencia. Los otros tratamientos son promisorios pero el numero de observaciones tan pequeo no permiti determinar si la superioridad observada en los grupos tratados fueron debidas al tratamiento.

4 5

Al final, el parmetro de mayor importancia en la transferencia embrionaria es el numero de cras logradas por donante tratada y el numero total de cras por donante que se pueden generar en un ano. Con miras a incrementar estos parmetros desarrollamos e introdujimos como practica rutinaria en LambXL la biseccin de embriones con resultados altamente satisfactorios incrementando la produccin de corderos en un 30% (cuadro 32; ver tambin Vivanco H.W.et al., 1991; Rangel-Santos R., 1991; Vivanco H.W. y Greaney K. 1992). La eficiencia en produccin de corderos va transferencia embrionaria evidentemente incrementa con la experiencia. Sin incluir biseccin de embriones, el numero de corderos producidos por oveja tratada por sesin o ronda en el otoo de 1987 en LambXL fue en promedio de 1.26 corderos, en la Australian Texel Corporation en el otoo de 1994 el promedio fue de 3.98 corderos por oveja tratada. El numero total de recolecciones por oveja al ano para el ano 1994 fue de 7 colecciones produciendo un total promedio de 27.86 corderos por oveja tratada por ano. Este numero pudo ser incrementado en un 30% (total de 36 corderos) si se hubiera usado biseccin de embriones en la ATC. .

Cuadro 31. Evaluacin de tratamientos hormonales aplicados incremento de la tasa de sobrevivencia embrionaria. Experiment Tratamientos No de No de o No dentro de recipientes embriones experimentos transferidos 300 u.i. HCG al I
momento de la transferencia 91 181

a ovejas recipientes para el No de fetos obtenidos

65

Porcentaje de sobrevivencia

35.91

Control II CIDR a la transferencia Control CIDR a la transferencia

89 645 727 640

177 1180 1279 1024

51 747 801 736

28.80 63.33 62.65 71.87

III

4 6

Control IV CIDR a la transferencia Control 200 u.i PMSG al momento de la transferencia

643 993 49

1157 1787 80

804 1004 40

69.05 56.16 50.00

22

44

29

66.00

Fuente: LambXL , ATC. ver tambin Vivanco H W. 1996

Cuadro 32. Sobrevivencia embrionaria de mitades embrionarias resultado de biseccin su comparacin con embriones enteros y su impacto en el incremento de la sobrevivencia embrionaria total
Tipo de embrin Numero de embriones transferidos 1410 1252 Numero de fetos generados 710 771 Sobrevivencia de los semi embrin (%) 50.3 Sobrevivencia de los embriones enteros (%) 61.6 Sobrevivencia total de los embriones originales (%) 100.6 61.6

Mitades de embrin Embriones enteros

Fuente: LambXL.1991. Vivanco H.W.et al.1991

La transferencia de embriones es pues un mtodo efectivo y practico de reproduccin en los ovinos, su eficiencia depende de las tcnicas usadas y sobre todo de la experiencia alcanzada, su uso es justificado (a un alto nivel de eficiencia) como instrumento de mejora gentica.

3. La recoleccin de ovocitos y produccin de embriones in vitro en el ovino:

A. El estado actual de la tecnologa de recoleccin de ovocitos y produccin de embriones in vitro en el ovino. Areas que requieren solucin y mayor desarrollo tecnolgico. A pesar de que los primeros trabajos sobre recoleccin de ovocitos (OPU) y produccin de embriones in vitro (IVP) hechos por Robinson en ovinos datan del ano 1950 y son muy anteriores a los primeros trabajos hechos en el bovino por Bergulla y colaboradores

4 7

en 1974 (ver revisin de Raymond et al. 1981), esta tecnologa reproductiva ha alcanzado eficiencia comercial mucho mas rpido en el vacuno y esta ya en pleno uso industrial mientras que en el ovino aun cuando existen ciertas aplicaciones comerciales, la tecnologa esta todava en desarrollo y requiere de as trabajo para llevarla a niveles de eficiencia adecuados. Esto es simplemente reflejo de la mayor cantidad de recursos dedicados internacionalmente al desarrollo de OPU-IVP en bovinos debido a su mayor valor comercial. La tecnologa de recoleccin de ovocitos y produccin de embriones in vitro (OPUIVP), se viene desarrollando para las diversas especies domesticas no solamente como una alternativa para evitar los problemas (tales como limitado numero de embriones producidos por donante y gran variabilidad en las respuestas superovulatorias, alto costo) que se tienen en la ovulacin mltiple y produccin de embriones in vivo (MOET), sino que tiene sus virtudes especificas y permite aplicaciones imposibles de lograr con la tcnica de MOET. El hecho de poder cosechar los gametos femeninos ( ovocitos) directamente de los ovarios de los animales donantes, madurar los ovocitos fuera del animal donante en laboratorio ( in vitro), capacitar el espermatozoide en laboratorio, fertilizar los ovocitos madurados usando los espermatozoides capacitados en laboratorio y cultivar los embriones resultantes in vitro hasta el estadio de transferirlos a hembras recipientes es tal vez la revolucin tecnolgica mas importante en la industria animal desde la invencin de la inseminacin artificial. Esta tecnologa permite potencialmente obtener material gentico de hembras de diferente edad (juveniles pre o post pberes, adultos y hasta seniles) y diferentes estados fisiolgicos ( lactantes, secas, vacas, preadas, ciclando normalmente, inducidas a ciclar durante el anestro) y de animales muertos (ya sea beneficiados, muertos por accidente o sacrificados por razones humanitarias). El potencial de la tecnologa de OPU-IVP de revolucionar la industria animal es enorme ya que su aplicacin permitir incrementar aun mas las tasas de progreso gentico ( se puede reducir el intervalo generacional en forma dramtica) y la creacin de nuevos y mas eficientes sistemas de produccin (mellizaje por transferencia embrionaria, produccin de compuestos genticos o hbridos, produccin de corderos de carne en rebaos de ovejas lecheras, etc.). B. Aspectos tcnicos de la recoleccin de ovocitos y produccin de embriones in vitro en ovinos: a) La recoleccin de ovocitos: La cosecha de ovocitos de ovarios de animales beneficiados, cualquiera que sea la especie, se hace por aspiracin folicular usando ya sea simplemente jeringas hipodrmicas con agujas de 18 g de dimetro o mediante aspiradores que no son mas que agujas montadas en tubos de coleccin conectados a bombas de vaco ( Xu et al. 1992; Gordon, 1994) o por diseccin y ruptura de los folculos (Lu et al., 1987 ; 1988). En promedio se obtienen entre 3 y 4 ovocitos por ovario aspirado (6 a 8 por par de ovarios o sea equivalente a una oveja) de ovejas adultas sacrificadas sin previo tratamiento hormonal (Vivanco, datos no publicados del laboratorio de arTech).

4 8

La cosecha o recoleccin de ovocitos (Ovum Pick UP o OPU) ya sea en borregas adultas o borreguillas prepuberes vivas es uno de los procesos tecnolgicos que se tienen que simplificar. La recoleccin de ovocitos en el ovino es aun hecha por mtodos quirrgicos y bajo anestesia total, ya sea por laparotoma con la consiguiente exposicin del ovario fuera de la cavidad abdominal o por laparoscopia introduciendo la aguja de aspiracin a travs de la cnula intra abdominal (Snyder y Nellor, 1975; Tervit et al., 1993; 1995; 1996). Otro aspecto importante que requiere de mayor investigacin es determinar si es realmente necesario estimular hormonalmente las donantes vivas durante la estacin reproductiva antes de ser sometidas a recoleccin de ovocitos, cual seria el tratamiento hormonal optimo y cual la frecuencia con que se pude cosechar ovocitos del ovario ovino sin y con estimulacin hormonal. En vacunos debido a la ocurrencia de varias ondas foliculares en el ovario dentro del ciclo estral se colectan ovocitos cada 3 a 4 das obtenindose un promedio de 7 a 10 ovocitos por vaca sin necesidad de aplicar tratamientos hormonales ( Vivanco, 2000). En el ovino, ya sea por el hecho de que la recoleccin de ovocitos emplea mtodos quirrgicos de relativamente alto costo o por falta de informacin sobre ondas foliculares ( hasta muy recientemente, gracias al trabajo del grupo uruguayo liderado por Edgardo Rubianes que ha contribuido grandemente a comprender mas la dinmica de la fisiologa ovrica de la oveja), las recolecciones de ovocitos en animales vivos siempre se han hecho bajo estimulacin hormonal y no se han hecho colecciones repetidas en las mismas donantes. En promedio aun bajo estimulacin hormonal el numero de ovocitos colectados por oveja adulta ha sido relativamente bajo logrndose entre 12 a 14 ovocitos por oveja tratada (Tervit, 1996; Baldasarre et al., 1996; Ptak et al., 1998). La reciente aplicacin de ultrasonografia transrectal para el estudio de los eventos reproductivos en las ovejas demuestra que los folculos desarrollan en ondas o pequeos ciclos que se repiten a lo largo del ciclo estral, en ovinos estas ondas foliculares y los factores que las influencian han sido descritas por Ginther et al. (1995), Leyva et al. (1998), Bartlewski et al. (1999), Evans et al. ( 2000), Rubianes et al. (1996), Violes et al. (2000), Rubianes (2001). Para la mayora de las razas y condiciones fisiolgicas se observa la ocurrencia de 3 ondas dentro de un ciclo estral pero es solo durante el pro-estro y el estro en que el o los folculos destinados a ovular escaparan de volverse atrticos (tal como ocurre en las ondas foliculares durante el diestro en que todos los folculos terminan en atresia) y continuaran su desarrollo y maduracin alcanzando el estado pre ovulatorio (Guilbault, 1998). La ocurrencia de ondas foliculares en el ovino adulto en estacin reproductiva ofrece la posibilidad de recolecciones de ovocitos repetidas y a intervalos de 3 a 4 das tal como se efecta en el bovino, materia que es necesario investigar. La recoleccin de ovocitos de corderos pre pberes ( tan jvenes como 6 a 7 semanas de edad) esta siendo usada ya comercialmente

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en Australia a pesar que las eficiencias son relativamente bajas (especialmente en la tasa de sobrevivencia de los embriones transferidos), debido a su gran impacto en la reduccin del intervalo generacional y su consecuente efecto en la ganancia gentica anual. Estos programas estn siendo usados mayormente en la mejora del ganado Merino Super Fino. Los corderos son estimulados hormonalmente antes de la recoleccin de ovocitos la cual se efecta ya sea post mortem (beneficiando los corderos despus del tratamiento) o por laparotoma ventral (Earl, C.R. et al., 1994; Kelly, J.M. et al. 2001), El cuadro 33 muestra la produccin promedio de ovocitos maduros e inmaduros recolectados de corderos de 6 semanas de edad tratados hormonalmente, los resultados varan grandemente de acuerdo a la efectividad de los tratamientos hormonales y entre autores. Cuadro 33. Numero promedio de ovocitos recolectados por aspiracin folicular va laparotoma ventral en ovinos pre-pberes de 6 7 semanas de edad. Fuente Numer o de corder os donan tes Earl,C.R et 6 al. (1994). Kelly, J.M. 3 et al (2001) Numero SD de folculos por cordero 14.8 16.6 68.3 14.8 Numero Tasa de % de SD de recoleccin ovocitos ovocitos (%) maduros por codero 11.2 11.5 51.3 13.3 88.8 75.1 83.2 s/i

Como resultado de la estimulacin hormonal para la recoleccin de ovocitos tanto en adultos como pre-pberes una relativamente grande proporcin de los ovocitos estn ya maduros o en estado avanzado de maduracin al momento de la recoleccin, esto debe ser tomado en cuenta para reducir el numero de horas en maduracin in vitro para los ovocitos de acuerdo a su grado de maduracin, sin embargo esto se hace muy raramente en la mayora de los laboratorios emplendose mas bien tiempos fijos de maduracin in vitro diseados para ovocitos inmaduros , afectando la viabilidad de los ovocitos de maduracin ms avanzada al momento de coleccin. La recoleccin de ovocitos de ovejas fuera de estacin reproductiva requiere de tratamiento hormonal de las donantes antes de la recoleccin (Cheng, 1985; Pugh et al., 1991; Ptak, citado por Loi P. et al., 1998).

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En general los tratamientos hormonales previa recoleccin de ovocitos, tanto para ovejas pre-pberes como adultas dentro y fuera de la estacin reproductiva estn basados en administracin de dosis bajas de FSH por 2 o 3 das cada 12 horas en animales en fase progestacional inducida por tratamiento exgeno de prosgesterona o progestagenos, suspendindose el tratamiento progestacional y gonadotropico 12 horas antes del beneficio o de la recoleccin in vivo (Eral, C.R. et al., 1994;Tervit, 1996; Baldasarre et al., 1996; Ptak et al., 1998; Kelly, J.M. et al. 2001). b) Produccin de embriones in vitro (IVP): Los ovocitos recolectados son sometidos a maduracin y fertilizacin en laboratorio y los embriones resultantes son ya sea cultivados tambin en laboratorio hasta el momento de transferirlos a recipientes definitivas o pueden ser cultivados en oviductos de recipientes temporales para ser luego lavados y transferidos a recipientes definitivas. Los laboratorios difieren en los sistemas usados para IVP desde los sistemas de maduracin hasta los sistemas de cultivo de embriones. b.1. Maduracin de ovocitos in vitro: Los ovocitos luego de aspirados de los folculos son evaluados y seleccionados en base a sus caractersticas microscpicas. Los ovocitos no atreticos y rodeados de clulas del cmulo ooforo (ovocitos con mas capas y de capas ms compactas de clulas del cmulo se consideran de mayor calidad o mayor habilidad de producir embriones in vitro), son colocados en medios de maduracin y en incubacin por alrededor de 24 horas a 39C. La maduracin meiotica del ovocito sin embargo ocurre de todas maneras (as no se cultive el ovocito) en forma espontnea tan luego como el ovocito es removido del foliculo ( Edwards, 1965). La adiccin de gonadotropinas en los medios de maduracin in vitro aumenta la proporcin de ovocitos que maduran ( que alcanzan el estadio de Metafase II), pero no aumenta su potencial de desarrollo, es decir se lograra el mismo numero de embriones de un determinado numero de ovocitos as estos hayan sido madurados con o sin gonadotropinas ( Galli y Moor, 1991). El medio universal utilizado para maduracin de ovocitos en prcticamente todas las especies es el medio TCM-199 (Tissue Culture Media-199) el cual es suplementazo ya sea con gonadotropinas y con clulas de granulosa ovrica de ovejas previamente tratadas con gonadotropinas (Tervit et al.,1993) o con factores de desarrollo celular tales como EGF (Epidermal Growth

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Factor), IGF-I (Insulin-like Growth Factor-I), TGF- (Transforming Growth Factor - ) que estimulan la maduracin del ovocito sin necesidad de gonadotropinas (Harper y Brakett, 1993; Kobayashi et al., 1994); Gandolfi et al., 1996). Un aditivo comn al medio de maduracin es el suero fetal de bovino (FCS Fetal Calf Serum) tal como fue usado en los trabajos pioneros de Cheng. (1985), Cheng et al (1986) en Cambridge, UK. En bovinos, Lu et al.(1987) uso suero de vaca en celo reemplazando la necesidad de ambos FCS y suplemento hormonal, la misma estrategia no ha sido informada para el caso del ovino. Uno de las contribuciones ms significativas al desarrollo de medios de maduracin fue hecha por el grupo Argentino de la Fundacin Prez Companc que encontr una evidente relacin entre la concentracin de glutationa en el ovocito y la capacidad de los ovocitos para la fertilizacin y subsecuente desarrollo embrionario (De Matos et al., 1995) . Hoy en da en nuestros laboratorios en Nueva Zelanda usamos la estrategia de suplementar los medios de maduracin de ovocitos ovinos con cisteamina la cual determina el incremento de la concentracin de glutationa en los ovocitos (Wells et al., 1996), la misma estrategia ha sido informada para ovocitos de corderos por el grupo de Sardinia ( Ptak et al., 1997). La maduracin de los ovocitos es una de las etapas mas criticas de la produccin de embriones in vitro ya que no solo afecta las subsiguientes fases del proceso de produccin de embriones sino tambin la sobrevivencia del embrin transferido y hasta el nacimiento tal como lo demuestra en su revisin Hasler (1994). b.2. La fertilizacin in vitro: Para asegurar que ocurra una fertilizacin normal es necesario que los ovocitos estn en el estadio de maduracin adecuado y que la concentracin adecuada de espermatozoides recin capacitados se encuentre disponible para fertilizar los ovocitos dentro del micro ambiente adecuado para la fertilizacin. La vida de los gametos es relativamente corta una vez que han alcanzado su maduracin o capacitacin. El envejecimiento de los gametos es una de las causas principales de anormalidades del embrin y de la mortalidad embrionaria temprana (ver Bearden y Fuquay, 1980). Por lo depuesto el proceso de maduracin de ovocitos y capacitacin espermtica in vitro deben ser planificados para que la fertilizacin in vitro ocurra con gametos en estado optimo para la fertilizacin. Hay diversos mtodos empleados para la capacitacin espermtica in vitro. Los espermatozoides deben ser preparados antes de ser

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sometidos al proceso de capacitacin. Primeramente deben ser separados del plasma seminal y/o del dilutor lo que se logra ya sea por centrifugacin de la dosis de semen o por nadado hacia arriba o swim up en medios de diferente densidad o por filtrado a travs de gradientes de concentracin ( Percoll, Pharmacia Inc.) o por separacin con filtros de lana de vidrio. Una vez separado el espermatozoide es lavado en buffer adecuados y es sometido a la accin de los factores de capacitacin. En el caso de semen fresco el semen es mantenido por 6 horas despus de colectado a temperatura de 20C antes de proceder a la separacin espermtica, esto determina el inicio del proceso de capacitacin por stress celular (Tervit et al., 1993). En el caso de semen congelado, este ya ha sufrido tambin procesos iniciales de capacitacin debido al efecto stress del congelamiento (Guillan y Maxwell , 1998). El proceso de capacitacin espermtica es un proceso complejo que resulta en la maduracin final del espermatozoide y la secrecin de enzimas que son necesarias para la penetracin de la zona pellucida ( Bedford, J.N., 1970). El medio mas usado hasta hoy para la capacitacin espermtica del ovino esta basado en el suero de oveja en meta estro en una solucin de Hepes buffer (Cheng, 1985;Crozet et al., 1987; Tervit et al.,1993 ). La capacitacin espermtica ovina ha sido optimizada con la adicin de lactato de calcio (Pugh et al., 1991). Los espermatozoides son expuestos al medio de capacitacin por lo menos 30 minutos antes de la inseminacin de los ovocitos. Los ovocitos luego del proceso de maduracin son preparados para la fertilizacin mediante la parcial remocin de las clulas del cmulo ooforo ya sea en forma mecnica o con auxilio de incubacin con hialuronidasa. La fertilizacin in vitro es un proceso crticamente dependiente en el apropiado micro ambiente, este al igual que para la maduracin in vitro se logra manteniendo los gametos a una temperatura de 39C en incubadores con una concentracin de 5% de CO2 en aire a la mxima humedad (ver Gordon, 1990). La concentracin espermtica es otro factor critico, la mayora de autores recomienda usar 1 milln de espermatozoides por mililitro, sin embargo hay una gran variacin entre carneros y razas los cuales difieren en la optima concentracin por lo que es necesario estudiar cada caso individual. Los cuadros 34 y 35 muestran la variacin obtenida en nuestro laboratorio en Nueva Zelanda en la eficiencia de la fertilizacin y produccin de embriones in vitro de acuerdo a la raza o especie del carnero. Normalmente los gametos (espermatozoides y ovocitos) son mantenidos en incubacin en el medio de fertilizacin por hasta 24 horas transcurridas las cuales los ovocitos fertilizados (embriones) pasan a los medios y sistemas de

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cultivo donde permanecen hasta su transferencia a recipientes o congelacin para conservacin.

Cuadro 34. Eficiencia de produccin de embriones in vitro. Mtodo SOFaaBSA. ArTech, AgResearch NZ usando semen de diversas razas de carneros. Variable Texel Ronmey Poll Suffolk Coopwort Dorset h
Numero de ovocitos inseminad os Numero de ovocitos fertilizados Porcentaje de fertilidad Numero de embriones (blstulas) producidos a los 7 das post fertilizaci n Porcentaje de

75

66

66

57

51

59 78.0

50 75.0

32 48.0

53 92.0

42 82.0

22

35

22

28

13

29.0

53.0

33.0

49.0

25.0

5 4

blstulas producidas

Cuadro 35. Fertilizacin de ovocitos de ovejas Romney Marsh con semen de carneros Romney Marsh y con semen de un hbrido ovino x caprino (Geep) y subsecuente cultivo de los embriones en SOFaaBSA. arTech , AgResearch, NZ. Variable Nmero de ovocitos inseminados Numero de ovocitos fertilizados % de fertilizacin Numero de embriones logrados (blstulas de 7 das) Porcentaje de embriones producidos sobre ovocitos inseminados Semen hbrido 70 39 55.0 17 24.28 Semen Romney 60 53 88.0 31 51.0

b.3. El cultivo de los embriones: Hay prcticamente 3 mtodos para cultivar embriones desde 24 horas despus de haber sido puestos en contacto con los espermatozoides capacitados. Dos de estos mtodos son mtodos in vitro, el tercero es simplemente utilizar receptoras intermedias cultivndose los embriones en sus oviductos ligados (para evitar que los embriones lleguen al tero), estas receptoras temporales pueden ser ovejas (Galli y Lazzari, 1996) o conejas (Fukui y Ono, 1988), cultivndose los embriones hasta el estadio mximo de blstula expandida cuando son recuperados de los oviductos de las recipientes temporales y ya sea transferidos a recipientes definitivas o congelados para su conservacin. Uno de los mtodos in vitro es el mtodo denominado de CoCultivo , llamado as porque los embriones se cultivan en el medio de cultivo (el medio de cultivo mas usado en co-cultura es el TCM-199 suplementado con 10% de FCS) en el cual se ha establecido previamente una colonia de clulas somticas que crecen adheridas a la base del plato de cultivo formando una sola capa y cubriendo aproximadamente el 80% del rea de la base (80% de confluencia), estas clulas son por lo general clulas de la granulosa ovrica o del epitelio del oviducto obtenidas de las mismas ovejas donadoras de los

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ovocitos u otras clulas disponibles comercialmente tales como las clulas de hgado de rata bfalo BRL (Bfalo Rat Liver Cells) ( ver Gordon, 1990). Las clulas somticas producen factores de promocin del desarrollo celular (factores de desarrollo ppticos y/o citoquinas) que soportan el desarrollo de los embriones. Las condiciones de incubacin para co-cultura requieren 39C, 5% CO2 en aire a mxima humedad. (Rexroad y Powell, 1986; Gandolfi y Moor, 1987; Gandolfi, 1994). El otro sistema de cultivo in vitro es el Sistema Definido, llamado as debido a que la concentracin de cada componente del medio es conocida, definida, son ingredientes que se aaden y mezclan, no hay productos producidos por clulas o aportados por el suero ( como en el caso de co-cultivo). El sistema definido de mayor uso es el llamado SOF (Synthetic Oviduct Fluid), que fue diseado originalmente por Robin Tervit de nuestro instituto en Nueva Zelanda ( Tervit, et al., 1972) y luego modificado por aadido de amino cidos y albmina de suero bovino obtenindose el llamado SOFaaBSA (Gardner et al., 1974) que es el de mayor uso en ovinos en la actualidad. Las condiciones de incubacin para el sistema definido SOF requieren 39C, 5%CO2 , 7% O2 y 88% N2. c. Eficiencia en la produccin de corderos con embriones in vitro: Loi P. et al. (1998) comenta acertadamente que el cultivo de embriones in vitro a pesar de la relativa buena eficiencia de produccin de embriones transferibles aun enfrenta problemas por ejemplo las divisiones celulares en los primeros 4 ciclos de divisin celular son mas retardadas en el cultivo in vitro que in vivo, esta etapa esta grandemente asociada con la activacin de los genes del embrin, lo que puede estar asociado a la menor fortaleza y sobrevivencia embrionaria de los embriones in vitro en comparacin a los embriones in vivo, sin embargo el trabajo comparativo de Walmslet S.E. et al (2000) no muestra ninguna diferencia entre la supervivencia embrionaria de embriones producidos por fertilizacin in vitro y transferidos a recipientes inmediatamente despus de fertilizados (da 2) y por lo tanto desarrollados in vivo versus embriones que continuaron in vitro hasta ser transferidos el da 6 (despus del proceso de activacin de genes) .Los datos del estudio se muestran en el cuadro 36. Cuadro 36. Tasas de preez obtenidas con embriones cultivados in vivo luego de fertilizacin in vitro (transferidos el da 2) versus embriones cultivados in vitro hasta el estadio de morula compacta o blstula (transferidos el da 6).

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Da de No total de transferenci embriones a transferidos embrionaria Da post fertilizacin 113 Da 6 post fertilizacin 64 Fuente: Walmsley S.E. et al.

No total de recipientes

Promedio de embriones por recipiente 3.2 3.0

Numero (%) de recipientes preadas 18 (51.0%) 21 (57.0%)

35 21 (2000)

La habilidad de los ovocitos de corderos pre pberes de ser fertilizados y desarrollar in vitro hasta el estadio de embriones transferibles, as como de sobrevivir luego de la transferencia hasta el nacimiento del cordero es menor que la de los ovocitos de animales adultos. Aun cuando la maduracin del ncleo del ovocito ocurre a una tasa comparable a la de los ovinos adultos, la fertilizacin y subsiguiente desarrollo embrionario es menos eficiente, esto es atribuido grandemente a la ocurrencia de maduracin citoplasmtica anormal (Ledda et al., 1997; OBrien et al., 1997; 1997a) . OBrien et at.(1996) tambin encontraron que los ovocitos de corderos pre pberes ya sea que se maduren in vitro o in vivo muestran un mas bajo metabolismo de la glutamina y una mayor incidencia de fertilizacin poliespermica. Sin embargo, a pesar de estas diferencias, algunos autores han informado similares tasas de produccin de embriones (al estadio de blstula) a partir de ovocitos de ovejas adultas y pre-pberes, esto tal vez al efecto de especficos protocolos de estimulacin hormonal ( Armstrong et al., 1994; 1997; Earl et al., 1995). Los cuadros 37 y 38 ofrecen la eficiencia de produccin de embriones y de corderos a partir de ovocitos de donantes pre-pberes (corderos de 6 a 7 semanas de dad).

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Cuadro 37. Produccin embrionaria in vitro y tasa de supervivencia embrionaria temprana de embriones producidos de ovocitos de corderos donantes de 6 a7 semanas de edad de acuerdo al estadio de maduracin de los ovocitos al momento de la recoleccin. Tipo de ovocitos al moment o de la recolecci n Numero de ovocitos insemina dos Numero de ovocitos fertilizado s (% sobre inseminad os) Numero de embriones transferid os (% sobre inseminad os) 18 (60.0) Numero de fetos a los 48 das de gestacin (% sobre ovocitos inseminad os) 8 (27.0) % de superviven cia embrionari a sobre numero de embriones transferido s 44.44

Maduros (madura 30 21 (70.0) dos in vivo) Inmadur os 16 9 (56.0) (madura dos in vitro) Fuente: Earl, C.R. et al. (1994)

5 (31.0)

0 (0.0)

0.00

Cuadro 38. Produccin de corderos por varias generaciones consecutivas usando como donantes de ovocitos corderos de 6 a 7 semanas de edad. Donantes Numero Numer Numero Numero Numer Numero de o de de de o de de donante ovocit ovocitos embriones recipie corderos s os fertilizado transferid ntes nacidos insemi s (% sobre os (% sobre nados inseminad (porcentaj embrione os) e sobre s ovocitos transferi inseminad dos) os)
Corderos de segunda generaci n (hijas de corderos)

154

90 (58.0)

75 (48.7)

25

10 (13.3)

5 8

Corderos de Tercera generaci n (hijas y nietas de corderos)

278

248 (89.0)

181 (65.1)

50

41 (22.6)

Fuente: Kelly J.M. et al.(2001) Los resultados del cuadro 37 son muy promisorios para el caso de ovocitos madurados in vivo. Los resultados del cuadro 38 parecen haber sido afectados por el alto numero de embriones transferidos por recipiente. Produccin de corderos a partir de embriones in vitro ( Brown B.W y Radziewic T. 1996) es ms eficiente cuando se usan donantes adultas que donantes pre puberes. El cuadro 39 muestra la eficiencia total obtenida usando el sistema SOFaaBSA , logrndose en promedio 33.7% de embriones transferibles sobre ovocitos inseminados y 43.5 % de sobrevivencia embrionaria hasta el nacimiento. Cuadro 39. Eficiencia en la produccin de embriones in vitro y subsiguiente supervivencia embrionaria hasta la paricion Exper iment o Numer Numero Numero(%) o de (%) de de ovocito ovocitos embriones s fertilizados transferidos insemin ados No 1 84 76 (90.0) 29 (38.2) No2 143 129 (90.0) 40 (31.0) Total 227 205 (90.0) 69 (33.7) Fuente: Brown B.W y Radziewic T. 1996 Numero de Numero Numero de recipientes (%) de corderos implantadas recipientes nacidos (% que parieron sobre embriones transferidos) 29 12 (41.0) 12 (41.0) 20 12 (60.0) 18 (45.0) 49 24 (49.0) 30 (43.5%)

Hay todava gran debate en cuanto al hecho de que corderos nacidos de embriones producidos in vitro son ms grandes al nacimiento que corderos nacidos de reproduccin natural o de inseminacin artificial, algunos autores creen que esto es debido a efectos del suero usado en los medios de cultivo, esto no pudo ser demostrado por Thompson et al. (1995) cuando trato de probar esta hiptesis produciendo corderos con embriones cultivados en SOFaaBSA donde no hubo diferencia en el tamao al nacimiento entre corderos producidos con o sin suero en el medio de cultivo. Sin embargo, es un hecho que corderos nacidos de embriones in vitro son mas grandes que corderos nacidos por reproduccin natural tal como se muestra en el cuadro 40.

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Cuadro 40. Tamao al nacimiento y ritmo de crecimiento de corderos nacidos por reproduccin natural y corderos nacidos de transferencia de embriones in vitro Corderos nacidos de reproduccin Corderos nacidos de transferencia de natural (16 corderos) embriones in vitro (12 corderos) nacimiento 1 mes 2 mes 3 mes nacimiento 1 mes 2 mes 3 mes Peso vivo Kg 4.0 11.0 18.7 Ritmo de crecimiento 232 215 gr/dia Peso testicular gr Fuente: Brown B.W y Radziewic T. 24.1 193 27 1996 5.7 16.9 330 23.7 273 28.0 231 45.7

Todas variables comparadas en el cuadro 40 fueron significativamente superiores (P, <0.02) para los corderos nacidos de embriones in vitro, lo que sugiere la posibilidad de que existan factores en el proceso de produccin de embriones in vitro que tendran un efecto mitogenico que resulta en una mayor ritmo de crecimiento sobre todo en ciertos de ciertos tejidos tal como el tejido testicular. Esto desde el punto de vista productivo puede ser ventajoso siempre y cuando el peso y tamao al nacer no sea excesivamente levado que ponga en riesgo a la madre y/o al cordero. La tecnologa de produccin de embriones in vitro tiene pues un gran potencial y conjuntamente con las tecnologas de inseminacin artificial y transferencia embrionaria constituyen un paquete tecnolgico eficaz para lograr el mejoramiento sostenido de la productividad animal.

Referencias:

6 0

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