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UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA CURSO DE QUMICA - LICENCIATURA

RELATRIO EXPERIMENTAL:

Oxiredutases: Polifenoloxidase

Adi Eloy de Moraes Murilo Azevedo Nanci Berganton Paulo Henrique Menegati Thamiris Fernanda Bessi

Relatrio Laboratorial

de

Atividade como

realizado

requisito parcial avaliao da disciplina Bioqumica. Prof Prof. Ana Clia Ruggiero

Piracicaba 2012

Introduo A enzima polifenoloxidase pertence ao grupo das enzimas oxiredutases e contm o cobre como grupo prottico. Ela esta diretamente relacionada a oxidao de compostos fenlicos. A PFO compreende duas enzimas distintas, cuja diferena est relacionada especificidade aos substratos. A primeira, denominada lacase, no atua sobre monofenis e tm ao restrita oxidao de orto e para-difenis. Enquanto que a segunda denominada tirosinase, cresolase, catecol oxidase, fenolase ou orto-difenol oxidase destacada como a mais importante, pois ela a responsvel pelo escurecimento oxidativo dos tecidos, principalmente, de frutas e hortalias, catalisando a hidroxilao de monofenis (atividade cresolase) e a subseqente oxidao do orto-difenol resultante em orto-quinonas (atividade catecolase). A ao da PFO est relacionada formao de ligaes cruzadas entre grupos fenlicos em protenas de parede, pectinas e outros polmeros de parede; unindo-os de maneira complexa A lignina, um componente da parede celular secundria, um polmero de grupos fenilpropanides altamente ramificado, com um padro de ligaes complexo e irregular que une as subunidades aromticas de trs diferentes lcoois fenilpropanides (coniferil, cumaril e cinapil). Essas subunidades, sintetizadas a partir da fenilalanina, so secretadas para a parede celular dos vegetais onde so oxidadas no local apropriado pelas enzimas polifenoloxidase e peroxidase . Objetivos Extrair e avaliar a atividade da polifenoloxidade da banana. Procedimentos 1. EXTRAO DA POLIFENOL OXIDASE DA BANANA Pesar 20 g de banana e homogeneizar em um liquidificador juntamente com 100 mL de tampo citrato-fosfato (cido ctrico 0,1M + K2HPO4 0,1M, pH 6,0). Centrifugar a 5.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante um substrato aquoso que contm a polifenol oxidase. 2. Determinao da atividade da polifenol oxidase Preparar 2 tubos de ensaio contendo em cada um deles de pirogalol 0,1M e 3 mL do tampo citrato fosfato, pH 6,0. Um tubo ser o branco (B) e o outro tubo teste (T) TUBOS SUBSTRATO (pirogalol) Tampo c. Citrico- Fosfato pH 6 B 2,0 mL 3,0 mL H2O (mL) -

T C

2,0 mL -

3,0 mL 3,0 mL

2,0

Fazer as seguintes adies, na ordem: 1 - tubo B (branco) 0,1 mL de gua

Zerar o espectrofotmetro com o branco em 390 nm. 2 tubo C (controle ) 0,1 mL do extrato (no contm o substrato) 3 tubo T (teste) 0,1 mL do extrato.

Disparar imediatamente o cronmetro e proceder a leitura das absorbncias nos tempos indicados na tabela: Tempo (minutos) 0,5 (30 segundos) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TESTE Absorbncia (390 nm)

Terminada a leitura de todos os tempos proceder a leitura do tubo controle (C). Para cada um dos tempos fazer a seguinte subtrao: Abs = (Absorbncia do teste leitura do controle). Representar graficamente a absorbncia em funo do tempo. A atividade enzimtica (At, U/mL) calculada a partir da curva de absorbncia versus o tempo de reao usando a equao 1:

Onde V o volume da soluo resultante (enzima mais pirogalol); t a variao do tempo da reao enzimtica e ABS a variao da absorbncia da soluo da reao observada. Uma unidade de polifenoloxidade (U) definida como a quantidade de enzima que causa um aumento de 0,001 na absorbncia por minuto dentro das condies descritas. A atividade comumente expressa nos laboratrios de controle das indstrias como aumento da absorbncia/min/g de material seco. Resultados e discusses Absorbncia tubo C (controle): 0,080 Volume total dos tubos B, T e C: 5,1ml Tempo (minutos) 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.500 0.450 0.400 0.350

Teste - Absorbncia (390 nm) 0,114 0,157 0,260 0,338 0,392 0,408 0,413 0,418 0,421 0,428 0,431

(ABS teste - ABS Controle) 0,034 0,077 0,180 0,258 0,312 0,328 0,333 0,338 0,341 0,348 0,351

Absorbncia

0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0 2 4 6 8 10 12 Teste - Absorbncia (390 nm)

Tempo

1-Qual o intervalo de tempo no qual a velocidade da reao cresce linearmente A velocidade da reao cresce linearmente em te o intervalo de 5s e 8s, entretanto acreditamos que o intervalo no foi de 5s a 10s por haver algum erro de procedimento durante a realizao da pratica. 2-Qual a atividade de enzima por mL da preparao enzimtica?

3-Qual a importncia dessa reao enzimtica na indstria de frutas? As quinonas formadas pela ao da polifenoloxidase possuem ao antimicrobiana e os polmeros podem atuar como taninos, os quais inibem o ataque de alguns insetos. Ainda, podem formar complexos com protenas que atuam como uma barreira fsica para a entrada de patognicos. 4-Sugira uma forma de evitar o escurecimento enzimtico na industrializao da banana. Existem alguns mtodos para evitar ou retardar o inicio desta reao enzimtica como a embalagem a vcuo dos produtos e adio de inibidores potenciais (cido benzoico, cido ascrbico, cido ctrico) que reduzem o pH fazendo com que os valores oxidativos de escurecimento tambm diminuam.

Concluses A pratica foi satisfatria quanto ao procedimento realizado, pois nota-se no grfico o surgimento de uma hiprbole. Em relao a enzima podemos dizer que ao mesmo tempo que ela til s plantaes e indstria, pois protege o alimento de formas diferentes, ainda dizemos que ela possui um maleficio para a indstria de frutas, pois depois de colhidas elas podem escurecer e haver alterao das propriedades nutricionais dos frutos, entretanto este problema pode ser sanado por adio de aditivos.

Referencias Bibliogrficas

MENDONA, S. C. ; GUERRA, N. B. Mtodos fsicos e qumicos empregados no controle do escurecimento enzimtico de vegetais. Boletim SBCTA, Campinas, v. 37, n. 2, p. 113-116, 2003. TAIZ, L. ; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 4.ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. 848p.