Você está na página 1de 3

Activação da amidase T103I pela hidroxilamina a partir de uma estirpe recombinante de Escherichia coli.

A amidase (EC 3.5.1.4) é uma enzima indutível na estirpe selvagem de

Pseudomonas aeruginosa 8602 permitindo a esta espécie a utilização de amidas simples como fonte única de carbono e azoto. Assim, estes substratos actuam como agentes indutores da síntese desta enzima. A amidase catalisa a hidrólise de amidas alifáticas produzindo o respectivo ácido orgânico e amónia (1). A utilização de agentes mutagénicos (raios UV e N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanina, entre outros) sobre a estirpe selvagem 8602 permitiu o isolamento de vários mutantes constitutivos produtores de amidases nomeadamente L10, AI3, Ph1 e AIU (2). A estirpe mutante AI3 sintetiza uma amidase alterada (T103I) que apresenta uma alteração na sua

especificidade de substrato de enorme interesse comercial na medida em que actua quer sobre acetamida quer sobre p-nitroacetanilida e derivados. Assim, esta enzima poderá ser usada na síntese de péptidos que têm uma importante aplicação como neurotransmissores em Medicina (3).

O presente trabalho consistiu na produção da amidase T103I a partir de uma

estirpe recombinante de Escherichia coli (4,5). Inicialmente, observou-se que

a actividade específica do extracto celular da amidase T103I era

extremamente baixa (0.0016IU/mg de proteína). Contudo, a presença da

hidroxilamina na mistura reaccional de doseamento da actividade enzimática aumentou dramaticamente a actividade da amidase T103I. O efeito activador

da hidroxilamina sobre a actividade da amidase foi investigado através da

variação da sua concentração (0-100mM) na mistura reaccional. A activação

máxima da amidase foi obtida a uma concentração de hidroxilamina de 70mM. Assim, a actividade específica da amidase foi de 0.347 e 0.0016IU/mg de proteína na presença e na ausência de hidroxilamina, respectivamente. Neste trabalho, a actividade enzimática máxima foi de

97.6IU/l de caldo de fermentação. Esta é a primeira vez que o efeito activador

da hidroxilamina sobre a actividade da amidase T103I é descrito e divulgado

numa comunicação científica.

A enzima recombinante sintetizada nesta estirpe hospedeira encontra-se

predominantemente sob a forma de corpos de inclusão de acordo com a

análise de SDS-PAGE e PAGE nativa (6). Os parâmetros físico-químicos de fermentação foram alterados de forma a reduzir a formação de corpos de inclusão nomeadamente arejamento, temperatura, pH, concentração de IPTG e composição do meio de cultura (7). Por outro lado, procedeu-se à solubilização dos corpos de inclusão e à sua renaturação (8) usando os tampões tris 0.1M contendo 100mM DTT, benzamidina 1mM e ureia 6M a pH 8.0 e tris 0.5M contendo 5mM EDTA, glutatião oxidado 1mM e glutatião reduzido 5.0 mM a pH 8.5 .

Bibliografia

1. Tata, R. Marsh, P. and Brown, P.R. (1994)” Arg-188 and Trp-144 are Implicated in the Binding of Urea and Acetamide to the Active Site of Amide from P. aeruginosa” BBA, 1205-139-145.

2. Domingos, A., Karmali, A. and Brown, P.R. (1989) “One-step affinity purification of amidases from mutant strains of Pseudomonas aeruginosa” Biochimie 71, 1179-1184.

3. Serralheiro, M.L.M., Prazeres, D.M.F. and Cabral, J.M.S. (1999). “Continuous production and simultaneous precipitation of a dipeptide in a reversed micellar membrane reactor” Enzyme Microbial Technology, 24, 507-514.

4. Martins, S., Farnaud, S.,Pacheco, V., Pacheco, R., Karmali, A., Tata, R. and Brown, P.R. (2000) “Differential Behaviour of Recombinant Wild-Type and Altered Amidases on Immobilized- Ion Affinity Chromatography” International J. Biochromatography 5, 111-129.

5. Karmali, A., Pacheco, R., Tata, R. and Brown, P.R. (2001). “Substitution of Thr-103-Ile and Trp-138-Gly in Amidase from P. aeruginosa are Responsible for Altered Kinetic properties and Enzyme Stability” . Molecular Biotechnology 17, 201-212.

6. Teilum, K., Ostergaard, L. and Welinder, K. G. (1999) “ Disulphide bond formation and folding of plant peroxidases expresses as inclusion body protein in Escherichia coli thioredoxin reductase negative strains” Prot. Expr. Purif. 15, 77-82.

7. Thomas, J. G., Ayling, A. and Baneyx, F. (1997) “ Molecular chaperones, folding catalysts and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold”. Appl. Biochem. Biotechnol. 66, 197-238

8. Rudolph, R. and Lilie, H. (1996) “ In vitro folding of inclusion body proteins” FASEB J. 10, 49-56.