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Activao da amidase T103I pela hidroxilamina a partir de uma estirpe recombinante de Escherichia coli. A amidase (EC 3.5.1.

4) uma enzima indutvel na estirpe selvagem de Pseudomonas aeruginosa 8602 permitindo a esta espcie a utilizao de amidas simples como fonte nica de carbono e azoto. Assim, estes substratos actuam como agentes indutores da sntese desta enzima. A amidase catalisa a hidrlise de amidas alifticas produzindo o respectivo cido orgnico e amnia (1). A utilizao de agentes mutagnicos (raios UV e N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanina, entre outros) sobre a estirpe selvagem 8602 permitiu o isolamento de vrios mutantes constitutivos produtores de amidases nomeadamente L10, AI3, Ph1 e AIU (2). A estirpe mutante AI3 sintetiza uma amidase alterada (T103I) que apresenta uma alterao na sua especificidade de substrato de enorme interesse comercial na medida em que actua quer sobre acetamida quer sobre p-nitroacetanilida e derivados. Assim, esta enzima poder ser usada na sntese de pptidos que tm uma importante aplicao como neurotransmissores em Medicina (3). O presente trabalho consistiu na produo da amidase T103I a partir de uma estirpe recombinante de Escherichia coli (4,5). Inicialmente, observou-se que a actividade especfica do extracto celular da amidase T103I era extremamente baixa (0.0016IU/mg de protena). Contudo, a presena da hidroxilamina na mistura reaccional de doseamento da actividade enzimtica aumentou dramaticamente a actividade da amidase T103I. O efeito activador da hidroxilamina sobre a actividade da amidase foi investigado atravs da variao da sua concentrao (0-100mM) na mistura reaccional. A activao mxima da amidase foi obtida a uma concentrao de hidroxilamina de 70mM. Assim, a actividade especfica da amidase foi de 0.347 e foi de 0.0016IU/mg de protena na presena e na ausncia de hidroxilamina, respectivamente. Neste trabalho, a actividade enzimtica mxima 97.6IU/l de caldo de fermentao. Esta a primeira vez que o efeito activador da hidroxilamina sobre a actividade da amidase T103I descrito e divulgado numa comunicao cientfica. A enzima recombinante sintetizada nesta estirpe hospedeira encontra-se predominantemente sob a forma de corpos de incluso de acordo com a

anlise de SDS-PAGE e PAGE nativa (6). Os parmetros fsico-qumicos de fermentao foram alterados de forma a reduzir a formao de corpos de incluso nomeadamente arejamento, temperatura, pH, concentrao de IPTG e composio do meio de cultura (7). Por outro lado, procedeu-se solubilizao dos corpos de incluso e sua renaturao (8) usando os tampes tris 0.1M contendo 100mM DTT, benzamidina 1mM e ureia 6M a pH 8.0 e tris 0.5M contendo 5mM EDTA, glutatio oxidado 1mM e glutatio reduzido 5.0 mM a pH 8.5 . Bibliografia 1. Tata, R. Marsh, P. and Brown, P.R. (1994) Arg-188 and Trp-144 are Implicated in the Binding of Urea and Acetamide to the Active Site of Amide from P. aeruginosa BBA, 1205-139-145. 2. Domingos, A., Karmali, A. and Brown, P.R. (1989) One-step affinity purification of amidases from mutant strains of Pseudomonas aeruginosa Biochimie 71, 1179-1184. 3. Serralheiro, M.L.M., Prazeres, D.M.F. and Cabral, J.M.S. (1999). Continuous production and simultaneous precipitation of a dipeptide in a reversed micellar membrane reactor Enzyme Microbial Technology, 24, 507-514. 4. Martins, S., Farnaud, S.,Pacheco, V., Pacheco, R., Karmali, A., Tata, R. and Brown, P.R. (2000) Differential Behaviour of Recombinant Wild-Type and Altered Amidases on ImmobilizedIon Affinity Chromatography International J. Biochromatography 5, 111-129. 5. Karmali, A., Pacheco, R., Tata, R. and Brown, P.R. (2001). Substitution of Thr-103-Ile and Trp-138-Gly in Amidase from P. aeruginosa are Responsible for Altered Kinetic properties and Enzyme Stability . Molecular Biotechnology 17, 201-212. 6. Teilum, K., Ostergaard, L. and Welinder, K. G. (1999) Disulphide bond formation and folding of plant peroxidases expresses as inclusion body protein in Escherichia coli thioredoxin reductase negative strains Prot. Expr. Purif. 15, 77-82.

7. Thomas, J. G., Ayling, A. and Baneyx, F. (1997) Molecular chaperones, folding catalysts and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol. 66, 197-238 8. Rudolph, R. and Lilie, H. (1996) In vitro folding of inclusion body proteins FASEB J. 10, 49-56.