UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA

ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE

DEPARTAMENTO DE PROTECCIN VEGETAL RAMA DE FITOPATOLOGA

NOTAS DEL CURSO DE:

VIRUS (VIRUS FITOPATGENOS)

PROTECCIN VEGETAL 7mo. SEMESTRE ING. MENA ADRIANO JORGE DANIEL Profesor JUAN JOS ROS, SINALOA. AGOSTO DE 2010

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA

ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE NOMBRE DE LA CARRERA Licenciatura en Ingeniera Agronmica NOMBRE DE LA ASIGNATURA : Virus (Virus Fitopatgenos) SEMESTRE: Sptimo FASE DE FORMACIN: Acentuacin LNEA CURRICULAR: Produccin Agrcola AREA: Proteccin Vegetal HORAS HORAS TERICAS: 3 PRCTICAS: 2 CRDITOS: 8

FUNDAMENTACIN CURRICULAR La asignatura de Virus se encuentra incluida en el VII semestre de la Licenciatura en Ingeniera Agronmica en el rea de Proteccin Vegetal y se encuentra vinculada de manera directa a las asignaturas de Fitopatologa General, Fitopatologa Agrcola, Hongos, Bacterias, Nematodos, Manejo de Enfermedades, Fungicidas y Enfermedades de hortalizas. Es de gran importancia ya que se considera que el 15 % de las enfermedades ocurridas en campo son causadas por estos patgenos y adems por el auge y el impacto que estas enfermedades tienen actualmente en el mbito agrcola; es por eso que un alumno egresado de esta Fase de Acentuacin necesita conocer la importancia de estos agentes como causantes de enfermedades.

PROPSITO(S) GENERAL(ES) DEL CURSO Que los alumnos conozcan las caractersticas ms importantes de estos patgenos de plantas, sus formas de ataque y el dao que causan, las formas de transmisin en campo, las tcnicas de identificacin usadas y el impacto como agentes causantes de enfermedades, para que sean capaces de manejar de manera correcta las tcnicas de diagnstico ms empleadas en su identificacin y aprenda el manejo correcto de los principios de control que se usan para estos agentes fitopatolgicos. ACTIVIDADES DE ENSEANZA 1) 2) 3) 4) 6) Exposicin oral y escrita por parte del profesor Exposicin oral y visual por parte del profesor y los alumnos Conferencias sobre enfermedades virales Seminarios sobre temas relacionados con virus de plantas Prcticas de laboratorio y campo ii

ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE 1) 2) 3) 4) 5) Lectura de textos Trabajo en equipo Consultas bibliogrficas y sitios de Internet Debate por equipos de los temas impartidos Reportes de trabajos de prcticas de campo y laboratorio

CRITERIOS DE EVALUACIN DE LOS APRENDIZAJES ESCOLARES Asistencia (80 % de asistencia obligatoria para aprobar curso y tener derecho a examen ordinarios y extraordinarios) Participacin en clases0.5 Cumplimiento de tareas escolares.0.5 Elaboracin de trabajos escritos ....0.5 Asistencia y reporte de las prcticas de laboratorio y campo1.5 Exmenes terico-prcticos sobre las diversas unidades del programa.6.0 Presentacin oral y visual sobre un tema especfico..1.0

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CONTENIDO TEMTICO
UNIDAD I. INTRODUCCIN E IMPORTANCIA EN EL ESTUDIO DE LOS VIRUS DE PLANTAS

1.1. Concepto de virus 1.2. Importancia de los virus 1.3. Sntomas causados por virus en plantas 1.3.1. Importancia de la sintomatologa causada por virus 1.3.2. Latencia, Enmascaramiento, Planta portadora, Periodo de incubacin 1.3.3. Clasificacin de sntomas por su localizacin 1.3.3.1. Sntomas externos 1.3.3.1.1. Sntomas locales 1.3.3.1.2. Sntomas sistmicos 1.3.3.2. Sntomas internos 1.3.3.2.1. Histolgicos 1.3.3.2.2. Citolgicos 1.3.4. Factores que intervienen en la variacin de sntomas 1.4. Factores causantes de sntomas semejantes a los inducidos por virus

UNIDAD II. FORMA, COMPOSICIN QUMICA Y TAXONOMA DE LOS VIRUS QUE AFECTAN PLANTAS

2.1. Principales formas de virus de plantas 2.2. Tamao de los virus 2.3. Estructura qumica de los virus de plantas 2.4. Composicin y funciones del cido nucleico viral 2.5. Composicin y funciones de la protena viral 2.6. Replicacin de virus 2.7. Translocacin de los virus de plantas 2.8. Nomenclatura iv

2.9. Posicin taxonmica de los virus que afectan plantas 2.9.1. Grupos de importancia de virus fitopatgenos

UNIDAD III. FORMAS DE TRANSMISIN E IDENTIFICACIN DE LOS VIRUS DE PLANTAS

3.1. Concepto de transmisin de virus 3.2. Tipos de transmisin de virus 3.2.1. Transmisin por propagacin vegetativa 3.2.2. Transmisin mecnica 3.2.2.1. Tcnica de Frotis 3.2.2.1.1. Factores que intervienen en una transmisin por frotis 3.2.2.2. Tcnica de injerto 3.2.2.3. Tcnica de inyeccin 3.2.3. Transmisin por semilla 3.2.3.1. Importancia de la transmisin por semilla de virus en plantas 3.2.3.2. Mecanismos de entrada de los virus en la semilla 3.2.3.3. Tcnicas de deteccin de los virus en semillas 3.2.4. Transmisin por polen 3.2.5. Transmisin de virus a travs de Biotransmisores 3.2.5.1. Transmisin por insectos 3.2.5.1.1. Clasificacin de virus de acuerdo a la transmisin por insectos 3.2.5.1.1.1. Virus no persistentes 3.2.5.1.1.2. Virus persistentes 3.2.5.1.1.2.1. Persistentes circulativos 3.2.5.1.1.2.2. Persistentes propagativos 3.2.5.1.1.2.3. Persistentes transovricos 3.2.5.2. Transmisin de virus por hongos 3.2.5.3. Transmisin de virus por nematodos 3.2.5.4. Transmisin de virus por caros 3.2.5.5. Transmisin de virus por plantas parsitas v

3.3.5.6. Transmisin de virus por vertebrados 3.3. Identificacin de virus 3.3.1. Pruebas de eliminacin de virus 3.3.2. Rango de hospedantes 3.3.3. Propiedades de infectividad de los virus 3.3.3.1. Punto de inactivacin trmica (PIT) 3.3.3.2. Punto final de dilucin (PFD) 3.3.3.4. Longevidad in Vitro 3.3.4. Tipo de partcula viral 3.3.5. Formas de transmisin 3.3.6. Pruebas serolgicas 3.3.6.1. Doble difusin en agar 3.3.6.2. Prueba de Elisa

UNIDAD

IV.

DESCRIPCIN

DE

LAS

PRINCIPALES

ENFERMEDADES

CAUSADAS POR VIRUS EN PLANTAS CULTIVADAS

4.1. Descripcin de los principales virus que afectan hortalizas 4.1.1. Virus que afectan tomate 4.1.2. Virus que afectan chile 4.1.3. Virus de cucurbitceas 4.2. Descripcin de los principales virus que afectan cultivos bsicos 4.2.1. Virus que afectan frijol 4.2.2. Virus que atacan maz y trigo 4.3. Descripcin de los virus que afectan frutales 4.3.1. Virus de ctricos 4.3.2. Virus que afectan papaya

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UNIDAD I. INTRODUCCIN E IMPORTANCIA EN EL ESTUDIO DE LOS VIRUS DE PLANTAS

1.1.

CONCEPTO DE VIRUS

La palabra "virus" fue descrita por primera vez en el diccionario Phillips en 1720 como "veneno o toxina". Durante mucho tiempo este trmino fue utilizado en el lenguaje mdico, para designar enfermedades infecciosas cuyas causas eran desconocidas. Despus de las investigaciones llevadas a cabo por Pasteur en 1864 sobre la especificidad microbiana se pens por analoga, que cada enfermedad deba de tener su agente causante ya fuera un hongo, una bacteria u otro microorganismo. Para explicar este hecho en algunas enfermedades de las plantas, producidas por agentes no visibles al microscopio comn, se cre el concepto de "ULTRAMICROBIOS", para referirse a organismos ms pequeos a los que en aquella poca se conocan y tenan la capacidad de causar infeccin.

Los virus son agentes infecciosos causantes de enfermedades de diversos organismos vivos. La palabra virus es de origen latino y significa pus o veneno. Los virus son partculas compuestas por cido nucleico (AN) y protena, de tamao submicroscpico, son parsitos obligados que solo se multiplican en el interior de las clulas del hospedante. Los virus no son clulas ni estn constituidos por ellas, pero se propagan al obligar a la clula vegetal a que los multiplique utilizando su propia energa y maquinaria biosinttica. A consecuencia de lo anterior el metabolismo de las clulas vegetales se altera a tal grado que las plantas se enferman. Los virus no matan a las plantas directamente mediante toxinas ni enzimas. En cambio desvan el metabolismo y se generan substancias extraas y se alteran diversas funciones vitales que inducen el desarrollo de sntomas, que pueden variar desde simples cambios de color hasta necrosis severa o muerte sbita de la planta. En otros el efecto es casi imperceptible como en el caso de los hospedantes asintomticos.

1.2.

IMPORTANCIA DE LOS VIRUS Los virus son importantes porque:

1. Causan enfermedades en el hombre (sida, cncer, poliomielitis, rabia, gripe y hepatitis viral, etc.), animales domsticos y silvestres.

2. Afectan a otros microorganismos (bacterifagos, micovirus) por lo que contribuyen al equilibrio microbiano de la naturaleza.

3. Causan enfermedades de plantas. Se han caracterizado ms de 1000 virus, de los cuales ms de 500 son patgenos de plantas. Al alterar el funcionamiento normal de la planta llegan a provocar prdidas hasta de 100%. Los daos no son nicamente en la cantidad sino en la calidad de la produccin; por ejemplo frutos deformes y manchados pierden valor comercial.

Prcticamente cualquier planta puede ser atacada por virus y es comn encontrar a mas de dos virus afectando al mismo tiempo a la misma planta. Algunos como el Virus del Mosaico del Tabaco tiene un rango de hospedantes muy amplio; puede atacar ms de 300 especies de plantas herbceas y leosas distribuidas en 50 gneros.

A consecuencia de las enfermedades virales (o virosis) se derivan tambin una serie de gastos adicionales para lograr el control: aplicaciones de insecticidas contra vectores, cubiertas de agribn, trampas amarillas, etc.

1.3.

SNTOMAS CAUSADOS POR VIRUS EN PLANTAS

Un amplio rango de anormalidades son causadas por virus y casi nunca las caractersticas de la planta puede ser cambiada por la infeccin del virus, ya que la mayora de los efectos notables son cambios de color o desarrollos anormales. La mayora de los virus que atacan plantas infectan a sus hospedantes sistmicamente, 2

esto es, se dispersan desde el sitio de la infeccin a otras partes de las plantas. Sin embargo, no todos los tejidos o clulas son invadidos y los tejidos meristemticos de races y retoos, por ejemplo, parecen escapar a las infecciones.

Las relaciones sobre la multiplicacin de los virus y sus consecuentes sntomas (efectos visibles del patgeno sobre su hospedante), an es poco entendido, y es conveniente sealar que depende en gran medida de algunos factores como: medio ambiente, relacin virus-hospedante, condiciones fisiolgicas de las plantas, edad de los tejidos del hospedante y el tiempo de infeccin de estos.

Los sntomas causados por virus en plantas eran de las nicas herramientas con que se contaba en aos anteriores para la identificacin de estos patgenos y actualmente juegan un papel de gran importancia debido a:

a) Con los sntomas se pueden reconocer plantas virosas en el campo y eliminarlas. b) Se puede determinar en algunos casos la naturaleza virosa de la enfermedad. c) Sirven en Virologa para expresar la nomenclatura de estos patgenos. d) Se puede valorar por medio de los sntomas el grado fitopatolgico de una enfermedad en una planta y un cultivo.

1.3.1. IMPORTANCIA DE LA SINTOMATOLOGA CAUSADA POR VIRUS Sin negar la importancia de los sntomas para identificar enfermedades virales, el diagnstico de estas en base a los sntomas, es con frecuencia de baja precisin. Los sntomas son tiles para el diagnstico preliminar y solo en el caso de enfermedades muy conocidas se puede afirmar con total certeza que el agente causal de tal o cual enfermedad es determinado virus. Lo anterior se debe a que:

Sntomas similares pueden ser producidos por diferentes virus. El mismo virus puede producir un amplio rango de sntomas, dependiendo de la variante del propio virus, del ambiente y genotipo del hospedante.

Otros patgenos o factores abiticos tambin producen sntomas similares. 3

La falta de sntomas no necesariamente significa que la planta no est infectada. Puede suceder simplemente que la infeccin est latente.

1.3.2. LATENCIA, ENMASCARAMIENTO, PLANTA PORTADORA, PERIODO DE INCUBACIN Las infecciones causadas por algunos virus en plantas no se manifiestan como sntomas por lo que a estos virus se les conoce como VIRUS LATENTES y la planta que tiene al virus se le conoce con el nombre de PORTADORA; por ejemplo, Datura stramonium (Toloache) con el Virus del Enchinamiento del Tomate. Otras plantas manifiestan los sntomas del dao por virus pero estos desaparecen temporalmente conocindose a este fenmeno como ENMASCARAMIENTO. Se define como PERODO DE INCUBACIN, al tiempo que ocurre desde la inoculacin de un virus hasta la aparicin de los primeros sntomas y este es muy variable; en frutales es largo (meses) y en herbceas las lesiones locales se presentan de 2-5 das y la infeccin sistmica de 2-3 semanas.

1.3.3. CLASIFICACIN DE SNTOMAS POR SU LOCALIZACIN Los sntomas causados por virus fitopatgenos se pueden clasificar en: EXTERNOS e INTERNOS.

1.3.3.1.

SNTOMAS EXTERNOS

Son aquellos efectos visibles del dao causado por un patgeno sobre su hospedante. Este tipo de sntomas son los ms importantes en la descripcin de los virus en plantas y se clasifican en PRIMARIOS y SECUNDARIOS (por su secuencia de infeccin) y en LOCALES y SISTEMICOS (de acuerdo al proceso infectivo).

1) Primarios.- Son las manifestaciones iniciales que presenta una planta y resultan frecuentemente mediante inoculaciones mecnicas artificiales o en infecciones naturales (transmisin de virus por medio de la semilla).

2) Secundarios.- Ocurren posteriormente, y, se presentan en partes no inoculadas de las plantas. Por ejemplo, el Virus Jaspeado del Tabaco en chile, primeramente presenta marchitez (sntoma primario), las plantas se defolian y despus al brotar las yemas, stas presentan sntomas de mosaico (sntoma secundario).

1.3.3.1.1. SNTOMAS LOCALES Llamados tambin reacciones de hipersensibilidad, son aquellos que se manifiestan en el lugar de la inoculacin. Carecen de importancia a nivel de campo (no se presentan) pero son muy importantes a nivel experimental; las plantas que se usan para obtener estos sntomas se les conoce con el nombre de PLANTAS INDICADORAS y algunos ejemplos de estas son:

Nicotiana glutinosa (Tabaco) Chenopodium amaranticolor (Chual) Gomphrena globosa (Amaranto globoso)

Virus del Mosaico del Tabaco Virus del Mosaico de la Sanda Virus Pinto del Tomate

1.3.3.1.2. SNTOMAS SISTMICOS Son aquellos que se manifiestan lejos del punto de inoculacin; es decir, por toda la planta y dentro de estos tenemos:

a) Mosaicos.- Son alternaciones de reas blancas, amarillas o verde-claro entremezcladas con el verde normal de la hoja o fruto. Ejemplo: Virus del Mosaico del Tabaco.

b) Moteados.- Son reas clorticas aisladas, muy pequeas y difusas. Ejemplo: Virus Moteado Clortico del Clavel.

c) Clorosis.- Consiste en un amarillamiento de la planta, debido al decremento o retraso de la clorofila. Puede existir en los mrgenes y se llamar clorosis marginal; en el pice y entonces ser clorosis apical o entre las nervaduras y ser clorosis

intervenal o aclareamiento de nervaduras. Ejemplo: Virus del Enanismo Amarillo de la Cebada, Virus Rayado Fino del Maz, etc.

d) Virescencia (Autolisis).- Cambios de color que ocurren en las flores las cuales adquieren una pigmentacin verde.

e) Variegacin.- Decoloracin irregularmente distribuida sobre las flores, las cuales presentan reas clorticas o blancas. Ejemplo: Virus Variegado del tulipn.

f) Necrosis.- Implica muerte de clulas y tejidos, puede ocurrir en races, tallos, hojas, flores y frutos. Ejemplo: Virus de la Marchitez Manchada del Tomate.

g) Manchas anulares.- Manchas que se presentan en forma de anillos. Ejemplo: Virus de la Mancha Anular del Tabaco.

h)

Tumores o

agallas.-

Sobrecrecimiento anormal

de tejido debido al

agrandamiento de las clulas o a la multiplicacin excesiva de estas. Ejemplo: Virus del Tumor y Heridas del Trbol.

i) Epinastia.- Prdida del ngulo normal de la hoja, en la cual el pice se dobla hacia el envs. Ejemplo: Virus del Mosaico Comn del Frijol.

j) Escoba de bruja (Blastomania).- Proliferacin excesiva de brotes o yemas que dan la apariencia de una escoba.

k) Filodia (Mal de agujetas).- Reduccin de la lmina foliar dando la apariencia de nervadura principal. Ejemplo: Virus del la Mancha Anular de la Papaya.

l) Enanismo o achaparramiento.- Desarrollo reducido de la planta; es decir, sta no alcanza la altura deseada. Ejemplo: Virus del Enanismo del Maz.

m) Enchinamiento.- Acortadura de la nervadura central, enrollndose las hojas hacia el centro. Ejemplo. Virus del Enchinamiento del Tomate.

Otros tipos de sntomas sistmicos que pueden provocar los virus en las plantas son: islas verdes (zonas abolsadas de color verde intenso), deformacin de frutos, leprosis o sarnas, brote hinchado, acortamiento de entrenudos, cambios de hbitos, gomosis, raquitismo, rama ahulada, etc.

1.3.3.2.

SNTOMAS INTERNOS

Son aquellos que se manifiestan en el interior de las plantas y pueden ser HISTOLOGICOS Y CITOLOGICOS.

1.3.3.2.1. HISTOLGICOS Este tipo de sntomas se manifiestan en los tejidos de las plantas. Ejemplo: el Virus Tristeza de los Ctricos cuando ataca ctricos existe acumulacin de almidn entre el patrn e injerto y para detectar la enfermedad se tiene que usar una solucin de lugol o Ioduro de potasio. En el Virus del Enrollamiento de la Hoja de Papa hay acumulacin de celulosa en el tejido vascular y para detectarlo se tie con resorcinol o azul de algodn en los tubrculos.

1.3.3.2.2. CITOLGICOS Son los sntomas que se manifiestan en las clulas de las plantas y se les conoce con el nombre de cuerpos X o inclusiones virales; estas inclusiones fueron descritas por Ivanowski en 1903 en clulas de plantas de tabaco infectadas con el Virus del Mosaico del Tabaco.

Estos cuerpos o cristales se forman como producto del metabolismo anormal que realizan las clulas infectadas y se forman por partculas de virus, substancias producidas por estos patgenos (protenas), por organelos celulares anormales o bien por una combinacin de todo lo anterior; su distribucin es abundante en la epidermis de las hojas, pero tambin en tallos, races, flores y frutos. En las clulas 7

se localizan en el citoplasma, ncleo y nuclolo. Aunque hasta la fecha su funcin es poco conocida se cree que forman parte de la replicacin; estas inclusiones son de gran importancia ya que nos ayudan a diagnosticar el origen de la enfermedad y en la identificacin del virus.

Las inclusiones virales las podemos clasificar en AMORFAS, CRISTALINAS Y PARACRISTALINAS. Dentro de la amorfas podemos encontrar: granulosas, fibrosas, vacuoladas, bandeadas, laminadas y densas; dentro de las cristalinas tenemos: hexagonales, cuadradas, rectangulares, piramidales y romboides.

1) Granulosas.- Son de formas redondas u ovaladas con la apariencia de pequeos grnulos y de tamao variable. Ejemplo. Virus Jaspeado del Tabaco en chile.

2) Fibrosas.- Formadas por estructuras alargadas en forma de fibra. Ejemplo: Virus del Mosaico de la Sanda.

3) Vacuoladas.- De forma redonda, con lmites bien definidos por una membrana y con reas claras por dentro. Ejemplo: Virus del Mosaico de la Calabaza.

4) Laminadas.- Inclusiones con forma de lmina.

5) Densas.- Cuerpos densos redondos, de tamao variable. Ejemplo: Virus del Mosaico del Pepino.

6) Paracristalinas.- Inclusiones cristalinas en forma de aguja. Ejemplo: Virus del Mosaico del Tabaco.

1.3.4. FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA VARIACIN DE SNTOMAS La manifestacin de los sntomas en las plantas se ve influenciada por algunos factores dentro de los que destacan:

a) Ambiente.- Dentro de las condiciones ambientales el factor ms importante es la temperatura ya que influye directamente en la variacin de la sintomatologa de los virus, por ejemplo, el Virus del Mosaico del Tabaco cuando es inoculado a plantas de Nicotina glutinosa y la temperatura es de 18-20 C da lesiones locales muy pequeas; si la temperatura alcanza los 25 C las lesiones son ms grandes y si se inocula y se somete a temperaturas de 35 C se presenta un sntoma sistmico. Otros factores ambientales que influyen son la luz (cuando el VMT se inocula y se mantiene al hospedante en obscuridad continua no manifiesta sntomas), el mismo virus cuando es inoculado a pepino y existe excesos de nitrgeno el virus se torna muy agresivo.

b) Virus.- En este caso depende del tipo de virus, la virulencia y la capacidad de dar origen a nuevas razas fisiolgicas.

c) Edad de la planta.- En forma general se puede mencionar que las plantas entre ms jvenes son mayormente susceptibles al ataque de los virus.

d) Hospedante.- Este factor est muy relacionado con la susceptibilidad y/o resistencia del hospedante al patgeno; es decir entre ms susceptible mayor grado de virulencia.

1.4.

FACTORES CAUSANTES DE SNTOMAS INDUCIDOS POR VIRUS

SEMEJANTES

A LOS

Anormalidades genticas Deficiencias nutrimentales Dao por herbicidas Dao por insectos o caros Dao por pesticidas Otros fitopatgenos

Los sntomas causados por estos ltimos agentes no son de naturaleza infecciosa; es decir, que no se transmiten mediante injerto. Adems, al paso de los das la recuperacin puede ser comn.

Agentes infecciosos tambin pueden causar sntomas similares a los ya descritos: por ejemplo el tizn tardo llega a ser confundido con el Virus de la Marchites Manchada, por productores y tcnicos inexpertos.

El uso de los sntomas para la diagnosis de campo es una gua valiosa pero imprecisa, sobre todo para los tcnicos no familiarizados con las enfermedades comunes en un cultivo en una regin determinada. An el especialista debe ser humilde antes de poder afirmar que un virus particular est involucrado en determinada enfermedad.

Lo anterior no significa que cada vez que detectemos sntomas presuntamente virales, se tendr que acudir a un experto. Dependiendo de la experiencia del investigador y de los antecedentes del problema, los diagnsticos de campo pueden ser relativamente precisos. El patrn de dispersin de la enfermedad puede dar indicios del virus o grupo de virus que se trate. Por ejemplo en el caso de Geminivirus en tomate, los sntomas ms notables son de enchinamiento y reduccin en el crecimiento; su presencia en la regin est relacionada con las poblaciones de Mosca Blanca y generalmente al inicio de las epidemias se aprecia un gradiente en dnde las plantas de las orillas son las primeras en ser infectadas, especialmente si hay maleza cercana en los drenes. En base a lo anterior en sentido estricto, solo se puede afirmar que tenemos problemas de virosis, cuyos sntomas coinciden con los descritos para Geminivirus, pero en ningn momento podemos decir con precisin de que Geminivirus se trata; tampoco podemos negar que posiblemente haya plantas infectadas por otros virus.

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El apoyo del laboratorio puede ser indispensable para determinar con certeza a los patgenos involucrados, sobre todo cuando se presentan sntomas que antes no se haban observado en el cultivo en la regin.

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UNIDAD II. FORMA, COMPOSICIN QUMICA Y TAXONOMA DE LOS VIRUS QUE AFECTAN PLANTAS

2.1. PRINCIPALES FORMAS DE VIRUS DE PLANTAS Con los descubrimientos de Takahashy y Rawlins (1932), cuando por el fenmeno de refringencia mencionaron que las partculas del Virus del Mosaico del Tabaco (VMT) medan alrededor de 10:1 (largo y ancho) y con la primera microfotografa tomada al microscopio electrnico por Kausche, Pfankuch y Ruska (1939) en donde mostraron que este virus presentaba forma de varilla rgida; se iniciaron las investigaciones para determinar la forma, tamao y composicin qumica de los virus de plantas. Actualmente se tienen determinadas varias formas de virus fitopatgenos dentro de las cuales tenemos:

a) Varillas rgidas, como el Virus del Mosaico del Tabaco y el Virus Cascabeleo (Rattle) del Tabaco.

b) Varilla (filiforme) flexible, como el Virus X de la Papa, Virus de la Tristeza de los Ctricos, Virus de la Mancha Anular de la Papaya, Virus del Mosaico de la Sanda y Virus Jaspeado del Tabaco.

c) Baciliforme, como el Virus del Mosaico de la Alfalfa.

d) Baliforme, como el Virus del Mosaico del Maz.

e) Polidricos, como el Virus del Mosaico de la Calabaza, Mosaico del Pepino, etc.

f) Gemelos (Geminivirus), como el Virus del Mosaico Dorado del Frijol, Virus del Mosaico Estriado del Maz y Virus del Chino Amarillo del Tomate. 2.2. TAMAO DE LOS VIRUS Las dimensiones de los virus que afectan plantas son muy variables y su tamao se 12

mide en nanmetros o milimicras.

+ Un nanmetro (=1 milimicra) = 0.000 000 001 m; o 0.000 001 mm; o 0.001 micras

El tamao de los virus isomtricos vara de 17-70 nanmetros (nm) de dimetro; los baciliformes alcanzan 300 nm de longitud x 95 nm de ancho; los de varilla rgida miden 114-215 nm de largos por23 nm de ancho; las dimensiones de los virus de varilla flexible alcanzan hasta 2000 nm de longitud por 10 nm de ancho.

As, por ejemplo, el grupo del Virus del Mosaico del Tabaco (varilla rgidaTobamovirus) mide 18 por 300-315 milimicras de longitud; el grupo del Virus Rattle del Tabaco (varilla rgida- Tobravirus) alcanza una longitud de 20-22 por 130-180 milimicras. El grupo del Virus X de la Papa (Potexvirus) que es una varilla flexible, mide de 13 por 480-580 nm., mientras que el Virus Tristeza de los Ctricos (FlexibleClosterovirus) alcanza hasta 2000 nm., de longitud, siendo el virus ms grande de los que atacan plantas. Los virus que poseen forma bacilar (Mosaico de la Alfalfa) y bala (Marchitez Manchada del Tomate) miden alrededor de 66-227 nm., de longitud y los polidricos miden de 18-90 nm , siendo el ms pequeo el virus satlite de la necrosis del tabaco que mide 18 nm de largo (Smith ,1977; Lozoya, 1987 y Gibs y Harrison, 1976).

2.3. ESTRUCTURA QUMICA DE LOS VIRUS DE PLANTAS Con los descubrimientos de Stanley (1935), cuando aisl las partculas del Virus del Mosaico del Tabaco y mencion que los virus estaban constituidos de protena y el de Bawden y Pirie (1936), cuando describieron la naturaleza nucleoproteica de los virus se lleg a la conclusin que los virus de plantas bsicamente estaban constituidos de cido nucleico (ARN o ADN) ms una cubierta de protena. Las partculas de los virus que atacan plantas contienen diferentes cantidades de AN, variando de 15-45 % en virus isomtricos, de 5 a 42 % en virus helicoidales (varilla, bala y baciliforme) y los virus que contienen lpidos en su constitucin su porciento vara de 1 -20 %. 13

La siguiente tabla nos muestra algunos ejemplos del contenido de AN y protena de algunos virus de plantas: VIRUS % DE AN
(Acido Nucleico)

% DE PROTENA

Virus Mosaico del Tabaco Virus X de la Papa Virus Mosaico de la Alfalfa Virus Mosaico de la Calabaza Virus Mancha Anular del Tabaco Viroides

5 6 20 35 22 100

95 94 80 65 58 0

Las partculas de la mayora de los virus que atacan plantas contienen una cadena simple (sencilla) de ARN, pero el Virus del Tumor y Heridas del Trbol y el Virus del Enanismo del Arroz contienen doble cadena de ARN; el Virus del Mosaico de la Coliflor posee doble cadena pero de ADN y el Virus del Mosaico Estriado del Maz contiene una cadena simple de ADN en su composicin.

Otros virus adems de poseer protena contienen lpidos como es el caso del Virus de la Marchitez Manchada del Tomate, Virus del Mosaico del Maz y el Virus del Enanismo Amarillo de la Papa.

2.4. COMPOSICIN Y FUNCIONES DEL CIDO NUCLEICO VIRAL El AN viral est formado por la unin de nucletidos; cada nucletido del AN viral est formado por dos purinas (adenina y guanina) y tres pirimidinas (citosina, uracilo y timina), los cuales para poder unirse requieren de un glcido (azcar) y un puente de fosfato. Cada nucletido del ARN viral est conformado por adenina, guanina, citosina y uracilo y el del ADN por adenina, guanina, citosina y timina; por lo tanto, las diferencias bsicas entre los dos cidos es que el ARN tiene la base de uracilo (ribosa) y el ADN tiene la base de timina (desoxiribosa) y el ARN tiene un oxidrilo ms que el ADN.

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Como ya se mencion, el cido nucleico es el resultado de la unin lineal de una gran cantidad de nucletidos y la secuencia de stos determina la estructura del citrn y cada citrn se le llama codons y est compuesto por tres nucletidos; de tal forma que una cadena de ARN (como el caso del VMT) posee 6500 nucletidos distribuidas de la siguiente manera: 1900 molculas de adenina, 1680 de guanina, 1180 de citosina y 1740 de uracilo para un total de 6500 nucletidos.

El AN viral tiene como funcin especfica el de dar arreglo a las subunidades de la protena del virus y la ms importante, que es causar infeccin en la planta. Los experimentos de Gierer y Schramm (1956), y de Conrad y Williams (1957) demostraron que el AN del Virus del Mosaico del Tabaco es suficiente para causar infeccin en plantas, por lo que se ha concluido que es el cido el que contiene la informacin gentica del virus. La evidencia de que el AN viral es el encargado de la infeccin en plantas se basa en las siguientes evidencias:

A) Al Hidrolizar la enzima ribonucleasa y desoxiribonucleasa se pierde la infectividad; B) El antisuero que reacciona con la protena no destruye su infectividad y C) Al inocular por separado el AN viral y la protena; solo se observaron sntomas donde se inocul el cido.

En algunos virus el AN viral est seccionado o divido en partes por lo que ha estos virus se les conoce como virus multiparticulados; por ejemplo, el Virus del Mosaico de la Alfalfa tiene divido su AN en cuatro partculas y para poder causar infeccin requiere que estn presentes las cuatro partculas; a cada una de las partculas virales que estn seccionadas se les conoce con el nombre de Virin. Otro virus que tiene seccionado su AN es el Virus del Mosaico del Chcharo de Vaca y la que codifica la infeccin es la partcula del medio; el Virus Cascabeleo del Tabaco est dividido en dos partculas y si slo se inocula una se codifica la informacin para la reproduccin de sntomas y no para la formacin de protena por lo que se deben de inocular ambas.

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2.5. COMPOSICIN Y FUNCIONES DE LA PROTENA VIRAL La estructura de los virus es la protena y es la que forma el cuerpo del virus. La protena viral est formada por subunidades de protena llamadas capsmeros, los cuales al unirse y arreglarse conforman lo que se conoce con el nombre de cpside o protena viral; tan pronto como un AN viroso se produce, induce a las clulas del husped a producir las molculas de protena que debern formar la cubierta proteica de dicho virus. La sntesis de protena en las clulas depende de la presencia de aminocidos, la cooperacin de los ribosomas y de los ARN de transferencia y los ARN mensajeros. El ARN mensajero que se produce refleja parte de la clave que determina la clase de protena que deber producirse por codificacin y la secuencia en la cual los aminocidos debern de arreglarse y la protena formada es para uso exclusivo del virus que form dicha cubierta.

La protena viral est compuesta de alrededor de 20 aminocidos diferentes, conteniendo en mayores proporciones la serina y trionina; el tipo y arreglo de estos aminocidos es regido por el AN viral. Algunos virus de plantas tienen composicin compleja, ya que adems de poseer aminocidos la protena contiene algunas substancias polippticas, por ejemplo, el Virus del Enanismo Amarillo de la Papa contiene cuatro diferentes tipos de polipptidos y los virus que contienen lpidos se les ha encontrado glucsidos. Las funciones de la protena viral son bsicamente el dar forma al virus, proteger al AN de factores externos y juega un papel muy importante en la transmisin de virus por pulgones.

2.6. REPLICACIN DE VIRUS La infeccin de una planta por un virus esta en relacin directa con la sntesis del mismo, puesto que la infeccin no ocurrir a menos de que el virus se multiplique en el tejido del husped susceptible. Los virus y viroides estn constituidos de molculas reguladoras; es decir, el cido nucleico viral ordena a la planta que realice funciones para su beneficio, y dentro de las funciones bsicas ordenadas esta la patogenicidad y la replicacin de ste.

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El proceso de replicacin de los virus es un tanto complejo pero en forma general lo podemos dividir en las siguientes etapas: a) Adsorcin y penetracin; b) Liberacin del AN; c) Replicacin del AN; d) Sntesis temprana de protena; e) Sntesis tarda de protena y f) Ensamblaje.

Las partculas virales no tienen capacidad de penetrar a las clulas autnomamente (por s solas) o por aberturas naturales como lo hacen los hongos y las bacterias. Los virus que afectan a los vegetales entran a las clulas a travs de heridas hechas mecnicamente, por vectores o por la fecundacin de un vulo por el grano del polen infectado. Una vez dentro el siguiente contacto del virus es con el citoplasma de la clula en donde existen ciertos sitios de infeccin que son saturados con partculas virales; se da una asociacin electrosttica entre el virus y el citoplasma y de esta manera queda inmerso en dicho citoplasma. Puesto que la parte activa del virus, que es el cido nucleico est cubierto de protena, deber liberarse de la vaina proteica para establecer la infeccin. La liberacin del AN tiene lugar durante las primeras horas siguientes a la inoculacin, ocurriendo los pasos siguientes en forma ordenada, y probablemente esto se concluya ms bien por la clula husped que por el virus, puesto que ningn virus de planta contiene o produce por si mismo alguna enzima. Los fragmentos de la cubierta proteica degradada permanecen en la clula y son utilizados en los procesos sintticos de la misma. Una vez que el AN se libera de la protena, este acta como ARN mensajero y se asocia con los ribosomas celulares (esta fase se conoce como fase de eclipse o polisoma) para sintetizar una protena funcional conocida con el nombre de enzima replicasa la cual tiene un peso aproximado de 130,000 a 165,000 daltons; la enzima replicasa se asocia con el virus y forman los moldes de AN los cuales son negativos debido a que sus bases de adenina, guanina, citosina y uracilo estn cambiadas y son ledas como una imagen del virus vista a un espejo, la cual a medida que se va formando, se conecta temporalmente a la cadena virosa progenitora, a los ribosomas y a la enzima replicasa para convertirse en AN positivos y por tanto infectivos. La enzima replicasa tambin tiene como funcin formar protena de encapsulamiento o protena temprana. Una vez que los ARN son infectivos pueden tomar dos caminos: a) volver 17

a entrar a los ribosomas celulares (aparentemente estos ARN son de bajo peso molecular) y formar otra vez moldes y seguir el mismo proceso anterior y formar otra vez protena (la cual se llamar sntesis tarda de protena) o b) darse el ensamblaje con la protena formada tempranamente, estos es, el ARN organiza las subunidades de protena alrededor de l y al unirse forman la partcula completa.

El los sitios de la clula en los cuales el ARN del virus y de la protena se sintetizan y los sitios en los cuales estos componentes se unen para producir los viriones todava no se ha determinado con absoluta certeza pero los estudios efectuados con el VMT sugieren que el ARN viroso, despus que est libre de su cubierta proteica se mueve a los ncleos o posiblemente a los nuclolos, en donde se duplica. El primer virin intacto aparece en las clulas de las plantas 10 horas despus de la inoculacin. Las partculas virosas pueden existir solas o en grupos formando las inclusiones virales.

2.7. TRANSLOCACIN DE LOS VIRUS DE PLANTAS Despus de la introduccin de un virus en la clula, el virus aparentemente se mueve, antes y despus de desprenderse de su cubierta proteica, hacia los sitios de sntesis y ensamblaje de sus componentes. El movimiento probablemente es pasivo y depende de la corriente protoplasmtica de la clula, pero otros mecanismos tambin pueden estar implicados.

Para que un virus realice la infeccin en una planta el virus deber moverse de una clula a otra, y multiplicarse en la mayora de ellas o al menos en las clulas en las que se mueve. Se cree que los virus en sus movimientos de clula a clula, siguen un camino a travs de las conexiones plasmodesmatales de las clulas adyacentes y se cree tambin que el retculo endoplsmico puede conectar una clula a otra. Sin embargo, es posible que los virus no se muevan a travs de la clula del parnquima a menos que los virus infecten las clulas y se multipliquen en ellas, esto ocasiona una invasin continua y directa de clula a clula.

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Se considera que el radio de dispersin de los virus de clula a clula vara de acuerdo con la clase y edad de las clulas de las plantas infectadas y es mayor en las clulas alargadas y jvenes que en las viejas y redondas. Otras formas de movimiento de los virus en plantas ocurren a travs de los tejidos vasculares (floema y xilema).

El transporte de los virus por el floema ocurre aparentemente, a travs de los tubos cribosos, pudindose mover hasta 15 cm en solo seis minutos. En forma general se puede indicar que los virus que ocasionan sntomas de lesiones locales o de hipersensibilidad su movimiento lo realizan a travs de las conexiones plasmodesmales que existen entre clula y clula y los virus que provocan sntomas sistmicos lo realizan por medio de los tejidos vasculares.

2.8. NOMENCLATURA A travs del tiempo se han seguido varios sistemas de nomenclatura de virus incluyendo el uso de sistemas binomiales, el cual se encuentra solamente en la literatura antigua. Actualmente el nombre particular de cada virus se adopta en base a los sntomas los ms caractersticos de la enfermedad (a juicio del descubridor del patgeno), en hospedante en el que se observ por vez primera al virus. As por ejemplo, el Virus Mosaico del Pepino lleva este nombre porque fue descubierto en pepino y uno de los sntomas principales es el mosaico.

En virologa es comn el uso de siglas para designar de manera abreviada a los virus, lo cual resulta prctico. As se utiliza VMP para el Virus Mosaico del Pepino, VMT para el Virus Mosaico del Tabaco o VMAT para el Virus Mancha Anular del Tabaco. Es necesario aclarar que estas abreviaturas se usan de manera uniforme por la mayora de los investigadores, con el fin de facilitar la comunicacin oral o escrita.

Es pertinente sealar que en el idioma ingls tambin se usan abreviaturas, aunque estas no sean las mismas que en espaol; en lugar del VMP se usa CMV 19

(Cucumber Mosaic Virus) y en lugar del VMT la abreviatura es TMV (Tobaco Mosaic Virus). En esta poca de globalizacin es muy comn el uso de las siglas en ingls para referirse a los virus y algunos investigadores latinos hasta se olvidaron de las siglas en espaol, para referirse a tal o cual virus; por ejemplo todo mundo habla de TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus), en lugar de VMMT para referirse al Virus de la Marchitez Manchada del Tomate. Este fenmeno no es deseable desde el punto de vista idiomtico o nacionalista, pero que a veces facilita la comunicacin.

Resulta evidente que el sistema de nomenclatura en uso resulta inapropiado, ya que los sntomas pueden variar incluso en el mismo hospedante y con el mismo virus. Los sntomas tambin pueden ser diferentes de acuerdo a la variante del virus y por el efecto del ambiente. Sin embargo el uso del sistema binomial, tan til en hongos y bacterias, no es aceptado por los virlogos, entre otras razones porque no se acepta que los virus son seres vivos, en sentido estricto.

2.9. POSICIN TAXONMICA DE LOS VIRUS QUE AFECTAN PLANTAS La mayora de los virus que afectan plantas fueron primeramente reconocidos por los daos que estos causaban en ellas, y usualmente fueron nombradas usando el nombre de la enfermedad y del hospedante que afectaban. Por ejemplo, un virus que causaba mosaico y se le encontraba afectando plantas de tabaco se le denominaba Virus Mosaico del Tabaco. En 1939 se reportaron los primeros acuerdos del Comit para la Nomenclatura de virus designado por la Sociedad Norteamericana de Fitopatologa, donde se seleccionaron cinco caractersticas importantes de los virus para su clasificacin: 1) Sntomas; 2) alteraciones citolgicas y morfolgicas; 3) transmisin por insectos; 4) relaciones serolgicas y 5) propiedades fsicas y qumicas de los virus. Considerando que se desconoca la naturaleza del agente causal, se propusieron tres alternativas de nomenclatura: a) Si el virus era un organismo se le hara un binomio, por ejemplo, el Virus Mosaico del Tabaco se llamara Paracrystalis altathermus; b) si resultaban ser compuestos qumicos se debera agregar el sufijo "vir". As nuestro ejemplo sera, P. altathermovir y c) no 20

tomar en cuenta la naturaleza del agente y en este caso se llamara al VMT Nicotiana virus altahermus. Como es costumbre, tan pronto como se public esta propuesta surgieron crticos, adeptos y modificadores.

Tambin en 1939 Holmes propone la creacin de reino Vira, con dos divisiones, Phytophagi y Zoophagi, para virus de plantas y animales respectivamente, utilizando el sistema binomial de nomenclatura. En 1940, Fawcett sugiere un sistema que combina a los anteriores, iniciando una dcada de propuestas de diversos autores que no fueron del todo aceptadas.

En 1950 se inicia una nueva era en la taxonoma de virus al crearse un subcomit ex-profeso durante el Congreso Internacional de Microbiologa. Este grupo admite que en virus no se puede usar la misma nomenclatura cientfica tradicionalmente empleada para bacterias u otros microorganismos. Recomienda basarse en aspectos morfolgicos, fsicos y qumicos de las partculas, y en composicin antignica, en vez de amplitud de hospedantes y sntomas. A partir de entonces surgen propuestas que incluyen la naturaleza del cido nucleico, la forma y tamao del nucleocpsido, nmero de capsmeros, etc., con Gibbs et al., en 1966 nace el criptograma, que tambin se ha perfeccionado con aportaciones posteriores.

La criptograma que es usada actualmente para nombrar virus y que es aceptada por el Comit Internacional de Nomenclatura de virus es la siguiente (VMT):

R/1:2/5:E/E:S/0

En el criptograma anterior el significado de cada componente es:

R/1= La R significa que el virus est compuesto por ARM; el nmero 1 indica que la cadena del ARN es de una sola banda.

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2/5= El 2 representa el peso molecular del cido nucleico, expresado en millones. El 5 representa la proporcin (%) de ARN que posee la partcula.

E/E= Se representa aqu la forma de la partcula que recubre al ARN.

E= Virus alargados con lados paralelos pero no redondeados (varilla rgida y varilla flexible). S= Virus esfricos (polidricos). U= Virus alargados con lados redondeados (baliforme y baciliforme). X= Virus de naturaleza compleja

S/O= Describe el tipo de hospedante (en este caso plantas de semilla o angiosperma). El 0 (cero) indica el tipo de vector que en este caso no existe).

S/0= Clase de hospedante / tipo de vector

1) HOSPEDANTE

A= Parsito de algas B= Parsito de bacterias F= Parsito de hongos I= Parsito de invertebrados P= Parsito de Pteridofitas S= Parsito de plantas M= Micoplasmas V= Vertebrados

2) VECTOR

Ac= caros y araas Al= Aleyrodidae (moscas blancas) 22

Ap= Aphididae (pulgones) Au= Auchenorrhyncha (chicharritas) Cc= Coccidae (escamas) Cl= Coleptera (escarabajos) Di= Dptera (moscas y mosquitos) Fu= Hongos Gy= Gymnocerata (tingidae) Ne= Nematodos Ps= Psyllidae Si= Siphonaptera Th= Trips 0= Sin vector Ve= Vector ninguno de los mencionados

2.9.1. GRUPOS DE IMPORTANCIA DE VIRUS FITOPATGENOS A continuacin se mencionan 10 de los 28 grupos de virus aceptados actualmente con algunas de sus caractersticas ms sobresalientes:

1) Tobravirus = R/1:2.3/5 + 0.6-1.3/5:E/E:S/Ne

El miembro tipo de este grupo es el Virus Rattle del Tabaco o Cascabeleo del Tabaco y los miembros se caracterizan por poseer forma de varilla rgida con una longitud de 180-210 nm y 45-115 nm de ancho, son transmitidos por nematodos de la familia Trichodoridae; su punto de inactivacin trmica (PIT) es de 70 - 80 C, su punto final de dilucin (PFD) de 10-6 y la longevidad in vitro de seis semanas. Muchas razas de este grupo de virus se transmiten muy fcilmente mecnicamente y tienen un amplio rango de hospedantes. Tiene un solo miembro que es el Virus del Obscurecimiento Temprano del Chcharo.

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2) Tobamovirus = R/1:2/5:E/E:S/O

El miembro tipo del grupo es el Virus Mosaico del Tabaco, poseen forma de varilla rgida y la partcula mide alrededor de 300 nm de longitud, se transmite muy fcil mecnicamente pero no por insectos, el PIT es de 90 C, su PFD es mayor a 10-6 y la longevidad in vitro es por varios aos. Otros virus de este grupo son: el Virus Mosaico del Tomate y Virus de la Mancha Anular del Odontoglussum.

3) Potexvirus = R/1: 3.5/5:E/E:S/Ap

Este grupo incluye al Virus X de la Papa como su miembro tipo y las caractersticas ms sobresalientes es que sus partculas son de forma de varilla flexible y miden de 480- 580 nm de longitud, se transmiten mecnicamente, normalmente no se transmiten por vectores; sin embargo, para PVX se reportan chapulines y al hongo Synchytrium endobioticum, ocasionan generalmente sntomas de mosaico y su PIT flucta entre 60-80 C, su PFD es de 10-5 a 10-6 y la longevidad in vitro es de meses. Algunos miembros de este grupo son: Virus Mosaico de la Papaya y Virus Mosaico de la Yuca.

4) Potyvirus = R/1:3.5/5:E/E:S/Ap

El nombre de este grupo se deriva de su miembro tipo, Virus Y de la Papa (PYV), el cual ataca a papa y a otras solanceas. Estos virus tienen partculas flexibles que miden entre 720-800 nm de longitud; pueden ser transmitidos experimentalmente por medio de savia (mecnica), y en el campo sus principales vectores son los fidos, los cuales lo transmiten de manera no persistente; el PIT es de 50-60 C, su PFD est entre 10-2 - 10-3 y la longevidad in vitro es de 48-72 horas. Algunos miembros de este grupo son el Virus Mosaico Comn del Frijol, Mosaico Amarillo del Frijol, Virus Mancha Anular de la Papaya, Mosaico de la Soya, Virus Mosaico de la Sanda, Mosaico de la Caa de Azcar, etc.

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5) Cucumovirus = R/1:1.3/19+1.1/19 + 0.8/19 S/S:S/Ap

El Virus Mosaico del Pepino (CMV) es el miembro tipo de este grupo; aunque los virus que pertenecen a este grupo tienen caractersticas en comn, pueden diferir con respecto a la especificidad del hospedante y a la reaccin serolgica. Estos virus poseen partculas polidricas que miden alrededor de 30 nm de longitud; el PIT es de 60-70 C, el PFD es de 10-4 y fuera del hospedante dura alrededor de 3-6 das; se transmiten muy fcilmente mecnicamente y los sntomas generalmente causan mosaicos y algunas veces necrosis. Otros virus importantes de este grupo son el Mosaico Amarillo del Pepino, Aspermy del Tomate y Virus del Enanismo del Cacahuate.

6) Nepovirus = R/1:2.4/43+1.4-2.1/30+2.8/46:S/S:S/C,Ne

En este grupo se encuentran los virus cuyos vectores son principalmente nematodos de los gneros Xiphinema y Longidorus, sus partculas son polidricas y miden 30 nm de dimetro. Son transmitidos mecnicamente, por semilla y polen, y los sntomas principales son manchas anulares, moteados y necrosis; su PIT es de 5570 C, el PFD de 10-4 y la longevidad in vitro es de una a tres semanas. El miembro tipo de este grupo es el Virus Mancha Anular del Tabaco y tambin se encuentra el Virus Mancha Anular del Tomate, el Enrollamiento de la Hoja de Papa, Hoja de Abanico de la Vid, etc.

7) Sobemovirus = R/1:1.4/21:S/S:S/Ve,Cl

El miembro tipo de este grupo es el Virus Mosaico Sureo del Frijol (SBMV) y los miembros se caracterizan por poseer forma polidrica con partculas que varan de 28-30 nm de dimetro, se transmiten por jugos de savia, semilla y en el campo generalmente son diseminados por colepteros; su PIT es de 90-95 C, su PFD es de 10-5 y fuera del hospedante dura entre 20 y 165 das; se relaciona con el Virus Estriado Temporal de la Alfalfa. 25

8) Necrovirus = R/1:1.5/19:S/S:S/Fu

El miembro tipo de este grupo es el Virus de la Necrosis del Tabaco, el cual normalmente causa necrosis en las races de sus hospedantes; las partculas son polidricas de 26 nm de dimetro, su PIT es de 65-95 C, se desconoce su punto final de dilucin y la longevidad in vitro es de ms de 30 das, en campo es diseminado por las zoosporas de Olpidium brassicae.

9) Tospovirus= R/1:7.4/2:S/S:S/Th

El nico miembro de este grupo es el Virus Marchitez Manchada del Tomate y se caracteriza porque sus partculas son isomtricas de 70-90 nm de dimetro; su PIT es de 40-46 C, su PFD es de 10-2-3 y la longevidad in vitro es muy corta (2-5 horas). Se transmite mecnicamente y por Trips y causa mosaico y necrosis en sus hospedantes atacados.

10) Grupo del Mosaico de la Alfalfa = R/1:1.1/16+0.8/16:U/U:S/Ap

El miembro nico de este grupo es el Virus Mosaico de la Alfalfa el cual posee cuatro partculas baciliformes que miden de 18-58 nm de dimetro, se transmite muy fcilmente mecnicamente, por pulgones y los sntomas que normalmente causa a sus hospedantes son mosaicos y manchas anulares. Su PIT es de 60-70 C, su PFD es de 10-5 y la longevidad in vitro es de 2-4 das; se le encuentra muy relacionado con el grupo de los CUCUMOVIRUS.

Cuadro. Algunos ejemplos de virus importantes en Mxico.

Grupo Luteovirus Nepovirus Sobemovirus Mosaico de la alfalfa Virus Enrollamiento de la Hoja de la Papa Mancha Anular del Tabaco Mosaico Sureo del Frijol Mosaico de la Alfalfa

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Cucumovirus Tobamovirus Potexvirus Potyvirus

Mosaico del Pepino Mosaico del Tabaco, Mosaico del Tomate X de la papa Y de la papa, Mosaico Comn del Frijol, Mancha Anular de la Papaya, Mosaico de la Sanda, Jaspeado del Tabaco

Closterovirus Tospovirus Geminivirus

Tristeza de los Ctricos Marchitez Manchada del Tomate Chino del Tomate, Mosaico Dorado del Frjol, Enrollamiento de la Hoja de la Calabaza.

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UNIDAD III. FORMAS DE TRANSMISIN E IDENTIFICACIN DE LOS VIRUS DE PLANTAS

3.1. CONCEPTO DE TRANSMISIN DE VIRUS La propiedad de transmitirse de una planta enferma a una sana es una caracterstica fundamental de los virus al igual que otros agentes biolgicos que causan enfermedades. Los virus a diferencia de hongos y bacterias no tienen la capacidad de diseminarse por el viento o agua porque fuera de las clulas se inactivan con rapidez, adems, no pueden penetrar a la planta por sus propios medios y requieren que se les deposite directamente dentro de una clula.

Dada su condicin como parsitos obligados los virus no se pueden desarrollar en materia orgnica muerta; requieren del albergue en tejido vivo, ya sea en estado de reposo o de multiplicacin activa. El Virus Mosaico del Tabaco (VMT) constituye una de las pocas excepciones, ya que puede sobrevivir en restos de tejidos infectados que quedan en el campo despus de la cosecha, de tal manera que estos materiales sirven como fuente de inculo primario en el siguiente ciclo. Los virus requieren pasar constantemente de un hospedante infectado a otro sano, para poder sobrevivir en cualquier regin.

Los virus no penetran a las plantas de manera directa, ni salen de estas por sus propios medios. La dispersin no es activa; es pasiva y se da mediante los

siguientes mecanismos:

3.2. TIPOS DE TRANSMISIN DE VIRUS Las formas en que los virus son transmitidos de plantas enfermas a plantas sanas son a) Propagacin vegetativa; b) mecnicamente; c) semilla; d) polen y e) biotransmisores.

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3.2.1. TRANSMISIN POR PROPAGACIN VEGETATIVA Siempre que las plantas se propaguen vegetativamente mediante injerto, esquejes, tubrculos, bulbos o rizomas, cualquier tipo de virus que se encuentre en la planta madre, a partir de la cual dichos rganos de propagacin se obtienen casi siempre sern transmitidos a la progenie. Tomando en cuenta que casi todas las frutas y la mayora de los rboles de ornato, y los cultivos como papa se propagan mediante estos medios, este tipo de transmisin adquiere importancia significativa.

3.2.2. TRANSMISIN MECNICA Todos los virus pueden ser transmitidos a algunas plantas mediante inoculacin mecnica, pero no todas pueden infectar y establecer infeccin. En teora las partculas virales pueden ser introducidas a clulas vivas por este mtodo, pero para que el virus llegue a ser funcional depende de una gran variedad de condiciones como: el grado de susceptibilidad de la clula receptora, funcionamiento del genoma viral dentro de la clula, condiciones necesarias para la maduracin del virus, factores ambientales, etc. La TRANSMISIN MECNICA es definida como el proceso por el cual las partculas de virus son manualmente introducidas a una planta por heridas mecnicas, para facilitar la iniciacin de la infeccin en clulas potencialmente infectables.

La transmisin mecnica puede ocurrir de manera natural (campo) y de forma artificial (laboratorio); en campo, dicha transmisin puede efectuarse entre plantas bastantes prximas al rosarse con el viento, cuando las plantas son daadas por el hombre en las labores de cultivo, por medio de fumadores (como el caso del VMT), etc.

La transmisin mecnica artificial es de gran importancia a nivel experimental y se puede realizar de diferentes formas: frotis; injerto e inyecciones.

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3.2.2.1. TCNICA DE FROTIS Es la tcnica ms usada artificialmente ya que presenta varias ventajas entre las que destacan de que es muy rpida y segura, facilita el estudio de los virus en ausencia de vectores, facilita el estudio de los virus "in vitro", se pueden separar virus mediante inoculaciones mecnicas por frotis y nos da pauta para realizar estudios sobre el nmero de lesiones locales que se obtienen con inoculaciones mecnicas (Holmes, 1929; demostr que el nmero de lesiones locales era proporcional a la concentracin del inculo en ciertas especies de tabaco inoculadas con VMT). La tcnica de transmisin por este medio es muy simple y la metodologa bsica es la siguiente:

a) Tomar aproximadamente dos centmetros cuadrados (preferentemente hojas), con los sntomas bien marcados. b) Macerar en un mortero el tejido de la planta enferma y agregar solucin buffer con un PH de 7.0 a 8.5. c) Adicionar carborundum de 400 o 600 mallas por pulgada cuadrada sobre las hojas que se van a inocular. d) Con un cotonete impregnado con savia infectiva se talla suavemente donde se aplic el carborundum y lavar con agua corriente para eliminar el exceso de este material. e) Colocar la planta inoculada en un lugar fresco y fuera del alcance de los insectos vectores para evitar traslape de resultados.

Otros detalles de la transmisin mecnica.

1) Preferible inocular hojas cotiledonales 2) En plantas grandes inocular las hojas medias a jvenes 3) Gramneas deben inocularse por el envs de las hojas 4) Cucurbitceas inocularse preferentemente en hojas cotiledonales. 5) Macerar e inocular preferentemente a bajas temperaturas 6) Lavar la hoja inoculada inmediatamente despus de la inoculacin. 30

7) Las lesiones locales tienen menor concentracin que la superficie verde. 8) Inocular de preferencia por la maana o por la tarde.

3.2.2.1.1. FACTORES QUE INTERVIENEN EN UNA TRANSMISIN POR FROTIS La eficiencia de la transmisin por frotis depende de varios factores como: FUENTE DE INOCULO, PREPARACIN DEL INOCULO, APLICACION DEL INOCULO, CONSTITUYENTES DEL INOCULO Y FACTORES AMBIENTALES.

FUENTE DE INCULO.- El inculo puede ser obtenido de varias partes de la planta infectada, pero si las hojas muestran sntomas se deben de probar primero, ya que los tejidos leosos usualmente son ms pobres en partculas virales que las hojas. En hojas lo ms conveniente es usar la tiernas donde los sntomas estn ms acentuados, en hojas viejas, la concentracin de virus es menor.

PREPARACIN DEL INCULO.- Los tejidos infectados pueden contener numerosas partculas de virus infecciosos, pero la infectividad depender de varias condiciones y tcnicas que pueden ser empleadas en la fase de la preparacin del inculo, que es por tanto, un factor muy importante que puede influenciar la efectividad del inculo. El inculo es preparado por extracto de virus de tejido enfermo, por unos momentos el virus est expuesto al medio ambiente el cual puede reducir su infectividad. Varias sustancias tales como metabolitos de la hospedera y escombros celulares son liberados simultneamente con el virus; algunos de estos componentes celulares producen substancias inhibitorias por lo que es necesario agregar un solvente apropiado como antiinhibidor. Generalmente, al momento de la preparacin del inculo se utiliza una solucin de fosfatos monobsicos y dibsico de potasio (solucin buffer) con PH 7.0-8.5 ya que esta solucin ayuda a mantener la configuracin del virus y aumenta la eficiencia de la infeccin ya que diluyen inhibidores.

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APLICACIN DEL INCULO.- En este caso es muy recomendable que la planta que se va a inocular sea previamente herida con abrasivos, pudindose usarse carborundum de 400 600 mallas por pulgada cuadrada, celite, arena, carbn molido, caoln, etc., es importante evitar los excesos de abrasivo ya que causan daos muy fuertes a las plantas que pudieran confundirse a los causados por virus, tambin es necesario tallar muy suavemente la parte inoculada pudindose hacer con los dedos, cotonetes (mas usado), manta de cielo, esptulas de vidrio, etc., y posteriormente lavarse con agua corriente para eliminar los excesos de abrasivo.

CONSTITUYENTES DEL INCULO.- Como se mencion anteriormente, varios componentes (INHIBIDORES) que resultan al momento de la maceracin, afectan la infectividad de los virus. Los inhibidores son de distinta naturaleza pudiendo encontrar a los taninos (los cuales actan sobre la protena y provocan precipitacin de virus) y polifenoles oxidativos (oxidasas). Para contrarrestar el efecto de estos componentes se usan los ANTIINHIBIDORES (sustancias que contrarrestan el efecto de los inhibidores), pudiendo usar nicotina y cafena (para taninos) y para los polifenoles usar cianamida, cido saliclico, hidroxilamina, cido tioglicolico y cido ascrbico.

FACTORES AMBIENTALES.- Los factores ambientales juegan un papel muy importante en la transmisin mecnica por frotis en virologa; la luz, temperatura, nutricin y humedad son los factores ms importantes:

a) Luz.- Se ha observado que cuando la planta que es inoculada se le somete a perodos de oscuridad continua, tres das antes se favorece la infeccin; tambin cuando se inocula y despus se expone a altas luminosidades se aumenta la eficiencia de la transmisin.

b) Temperatura.- Se ha determinado que cuando se inocula a altas temperaturas (>36 C), existe una marcada tendencia a no presentarse la infeccin; esto mismo

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sucede cuando las temperaturas son menores de 12 C. La ptima para inocular es de 18-25 C. c) Nutricin.- Se ha comprobado que es mejor inocular plantas con una nutricin ptima o en ocasiones con ligeros excesos de nitrgeno.

d) Humedad.- La infeccin aumenta con los excesos de agua.

3.2.2.2. TCNICA DE INJERTO Este mtodo fue usado desde el siglo XVIII para la obtencin de plantas de tulipn que producan flores variegadas. Desde el siglo XX, el injerto se convirti en una tcnica muy til para el estudio de los virus y fue la base para determinar la naturaleza infecciosa de varias enfermedades.

El injerto es muy utilizado en virus que no se transmiten mecnicamente, pero hay que tener mucho cuidado ya que por esta tcnica tambin se transmiten otros agentes fitopatgenos. El injerto se puede realizar en plantas de diferentes especies y de diferentes gneros; cuando se usa esta tcnica en plantas diferentes existe menor posibilidad de que el injerto prenda pero, en este caso, lo nico que se persigue en virus es poner en contacto los tejidos vasculares de la planta enferma con los tejidos de la planta sana.

La metodologa usada es muy sencilla, se toma una planta que se utiliza como patrn, a la cual se le hace un corte en el tallo tratando de que llegue a los tejidos vasculares, se utiliza una hoja o una pequea rama de la planta enferma y con una navaja de rasurar se le quita la epidermis con el fin de dejar los haces vasculares descubiertos, posteriormente se introduce en el cuerpo del patrn, teniendo cuidado que los haces vasculares se pongan en contacto, para la transmisin del virus, luego se sella con Parafilm o polietileno y la planta se coloca en un lugar fresco, para esperar la aparicin de sntomas.

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Las condiciones que se deben de tomar en cuenta para el xito del injerto son las siguientes:

1.- El corte debe de ser lo ms uniforme posible para que se establezca la unin entre el patrn y el injerto.

2.-Tratar de que la superficie de contacto entre patrn e injerto sea lo ms grande posible.

3.- Evitar la deshidratacin de los tejidos una vez que se haya realizado el injerto; esto se puede lograr colocando la planta en una cmara hmeda y si no se tiene, colocar una bolsa de polietileno hmeda.

3.2.2.3. TCNICA DE INYECCIN Esta tcnica fue una de las que se utilizaron por primera vez para la transmisin de virus en plantas; en la actualidad solo se utiliza para transmitir algunos virus que no se transmiten por frotis como por ejemplo, el Virus Curly Top de la Remolacha.

3.2.3. TRANSMISIN POR SEMILLA Cuando un virus infecta a una planta, invaden todos los tejidos y llegan hasta la semilla. La evidencia ms concluyente de que los virus se transmitan por medio de la semilla fue la presentada por Reddick y Stewart en 1919, cuando demostraron que las semillas de frjol infectadas con el Virus Mosaico Comn del Frjol producan plantas infectadas desde un 10-90 %. Doolittle y Gilbert (1919), tambin demostraron que el Virus Mosaico del Pepino se transmita por este medio en pepinillo. En la actualidad alrededor del 20 % de los virus de plantas conocidos se transmiten a travs de la semilla. La transmisin de virus por este medio ocurre cuando: el hospedante es infectado sistmicamente en la floracin, cuando el virus es capaz de invadir el polen y el vulo, cuando es capaz de sobrevivir en la gameta, cuando sobrevive a la deshidratacin de la semilla y al almacenamiento y cuando no es inactivado durante el desarrollo de la semilla. 34

3.2.3.1. IMPORTANCIA DE LA TRANSMISIN POR SEMILLA DE VIRUS EN PLANTAS La transmisin por semilla constituye uno de los factores ms importantes en el desarrollo epidmico de algunos virus. Las semillas infectadas dan origen a plntulas que representan una fuente de inculo inicial temprana, que adems se halla uniformemente distribuido. Las plntulas infectadas constituyen reservorios a partir de los cuales ocurre la dispersin secundaria del virus, lo cual sucede por transmisin mecnica o mediante vectores.

La gran mayora de los virus que se transmiten por semilla, persisten en el embrin; el porcentaje de transmisin depende de la raza del virus, el hospedante, las condiciones ambientales, entre otros factores, y su "longevidad" depende del hospedante, inculo, condiciones de almacenamiento y el perodo de almacenaje.

A continuacin se mencionan algunos virus de gran importancia que se transmiten por este medio, sus hospedantes y en algunos casos su perodo de viabilidad.
VIRUS Virus Mosaico Comn del Frijol Virus Mosaico de la Alfalfa Virus Mosaico Sureo del Frijol Virus Mosaico del Pepino Pepino, Crtamo, Meln, Sandia, Calabaza, Tomate Virus Mosaico del Meln Virus Mosaico de la Soya Virus Mosaico de la Meln, Calabaza, Sandia Soya Sandia 3-5 aos 2 aos 3-5 aos 0.5-2.2 aos Alfalfa, Chile Frijol, Chcharo 3 aos 6 meses CULTIVOS Chcharo VIABILIDAD 3-3.8 aos

Calabaza Virus Mosaico del Tabaco Virus Mancha Anular del Tabaco Virus Mosaico Amarillo del Chile Garbanzo, Meln, Soya, Tabaco Frijol, Haba X 3-9 aos 0.7-5.5 aos

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Frijol Virus Mosaico del Maz Virus X de la Papa Virus Y de la Papa Virus Marchitez Manchada del Tomate Virus Mosaico de la Sandia Virus Mosaico del Trigo Calabaza Trigo, Maz X X Maz Papa Papa Tomate X X X X

3.2.3.2. MECANISMOS DE ENTRADA DE LOS VIRUS EN LA SEMILLA Los virus asociados con las semillas son acarreados de dos formas: como una infeccin o como una infestacin. La infeccin implica que el virus es llevado internamente, inmerso en los tejidos de la semilla y cuando el virus es llevado pasivamente se le conoce como infestacin o contaminacin. El Virus Mosaico Comn del Frjol, Virus Mosaico de la Soya, Mancha Anular del Tabaco, etc., son ejemplo de algunos virus que van internamente; el Virus Mosaico del Tabaco en tomate y la Marchitez Manchada del Tomate se encuentran en la cubierta de la semilla.

3.2.3.3. TCNICAS DE DETECCIN DE LOS VIRUS EN SEMILLAS La deteccin de virus en semillas es ms difcil que detectar hongos, bacterias y nematodos. Los virus son parsitos obligados y por tanto requieren de pruebas especiales para su deteccin; estas varan desde una observacin visual simple, hasta pruebas muy sofisticadas como el uso de serologa y microscopa electrnica. Las pruebas ms usadas se describen a continuacin:

A) Observacin de semillas secas.

Las observaciones visuales de la semilla revelan anormalidades tales como decoloracin, arrugamientos, reduccin en tamao, manchado, necrosis, etc. por ejemplo, el Virus Mosaico de la Soya provoca un moteado en la semilla de soya, el Mosaico del Tabaco causa necrosis y deformacin en semilla de tomate el Virus 36

Mosaico de la Calabaza reduce el tamao en un alto porcentaje cuando infecta meln y calabaza.

B) Pruebas biolgicas.

Es uno de los mtodos ms usados por el agricultor ya que es econmico, fcil y muy seguro. Existen dos pruebas biolgicas:

1) Prueba de crecimiento.

La prueba de crecimiento es usada para determinar el porcentaje de transmisin por semilla. Se plantan 100 semillas en suelo, vermiculita u otro medio de crecimiento y una vez germinado son examinadas regularmente siguiendo muy de cerca los sntomas de los virus; en algunos casos como el V.M.C.F. la transmisin por semilla puede ser detectada una vez que las hojas primarias hayan aparecido. Sin embargo, los sntomas se observan ms claramente en el primero o segundo trifolio.

2) Deteccin usando plantas indicadoras.

Los virus pueden ser detectados en la semilla haciendo extracciones de diferentes partes de la semilla y posteriormente inoculando en plantas indicadoras. El Virus Mosaico Comn del Frjol es detectado al inocular la savia del embrin y cotiledones en plantas de frjol "Monroe" en donde reacciona con sntomas locales; Chenopodium amaranticolor es usado para detectar virus como por ejemplo, el Virus Mosaico del Pepino, Virus Mosaico de la Sanda, entre otros.

C) Pruebas bioqumicas.

Dentro de las pruebas bioqumicas el uso de a) Serologa, b) Tinciones de tejidos y c) Microscopio electrnico son las pruebas ms confiables para detectar virus en la semilla. 37

a) Serologa.

Los mtodos serolgicos son usados para caracterizar y determinar las relaciones entre los virus. Estas pruebas estn basadas en la relacin entre un antisuero (virus purificado) y un antgeno (virus a identificar). Dentro de las pruebas serolgicas ms usadas para la deteccin de virus en la semilla se pueden mencionar las microprecipitacin serolgica, doble difusin en agar, aglutinacin serolgica, aglutinacin de cloroplastos y E.L.I.S.A., entre otros.

b) Tcnica de tincin.

Un gran nmero de colorantes tales como la acridina, giemsa, azul de triponina, entre otros, pueden detectar infecciones virales en los tejidos de las plantas. El uso de acridina (colorante fluorescente) sirve para diagnosticar la presencia del Virus del Chcharo de Vaca en semillas de chcharo; es muy simple y consiste en poner las semillas de chcharo en agua durante dos das, agregarle el colorante y si existe la presencia del virus se observar un agregado de un color rojo fluorescente en las semillas infectadas.

c) Microscopa electrnica.

Consiste en hacer preparaciones de las posibles semillas infectadas y observarlas al microscopio electrnico.

3.2.4. TRANSMISIN POR POLEN Cuando una planta est infectada, el virus tiene la capacidad de llegar a infectar el polen y cuando este es acarreado por el viento o por insectos el virus se transmite de una planta enferma a una sana por este medio. La transmisin por medio del polen est muy relacionada con la transmisin de virus por semilla, por ejemplo, el Virus Mosaico Comn del Frijol tiene un mayor porcentaje de transmisin por semilla y por polen ya que la planta es autgama. La gran mayora de los virus que se transmiten 38

por medio de la semilla tambin se transmiten por polen, por ejemplo, Virus Mosaico Comn del Frijol, Virus Mosaico de la Calabaza, Virus Mosaico de la Lechuga, etc.

3.2.5. TRANSMISIN DE VIRUS A TRAVS DE BIOTRANSMISORES Se aplica este trmino a cualquier agente vivo (excluyendo semilla y polen) capaz de portar o transmitir un virus fitopatgeno de una planta enferma a una planta sana. En sentido estricto la palabra vector no es sinnimo de biotransmisor, aunque en el lenguaje comn se usan de manera indistinta. Siendo ms comn el primer trmino. El ser vector implica que el virus es ingerido y se halla en contacto ntimo con el transmisor. Un ejemplo til de vector es el del mosco Anopheles, que transmite al protozoario causante del paludismo; el microorganismo ingerido se multiplica y sufre transformaciones en el interior del cuerpo del insecto, antes de poder ser transmitido. En muchos casos de biotransmisores de virus, el patgeno si se multiplica en el insecto pero hay abundantes excepciones en las que no sucede as.

Este tipo de transmisin incluye a los insectos, caros, nematodos, hongos, plantas parsitas y vertebrados, y constituye la forma ms importante de diseminacin de los virus en campo.

3.2.5.1. TRANSMISIN POR INSECTOS Constituye el grupo de biotransmisores ms importante de virus. La primera evidencia que se tiene de la transmisin por este medio fue la publicada por Takata en Japn (1895) y Takami (1901), donde se menciona a las chicharritas Inzuma dorsalis y Nephotettix cinctipes asociadas con el Virus Enanismo del Arroz. Ms tarde Doolittle (1916) demostr que el pulgn Aphis gossypii transmita al Virus Mosaico del Pepino; Botjes (1920) encontr que Myzus persicae poda transmitir al Virus del Enrollamiento de la Hoja de Papa. Actualmente se reconoce que ms de 400 especies de insectos transmite virus, y de todas estas especies Myzus persicae, es el ms importante ya que transmite alrededor de 85 virus diferentes. Las especies de insectos reportadas como transmisores de virus se encuentran principalmente en 39

los rdenes Homptera (pulgones, moscas blancas, chicharritas, escamas, psilidos, etc.); Thysanptera (trips); Coleptera (escarabajos); Orthptera (chapulines); Dermptera (tijeretas); Lepidptera (palomillas y mariposas); Dptera (mosquitos) y Hemptera (tingidos).

En general, durante la transmisin por insectos se pueden distinguir tres fases:

Perodo de adquisicin. Es el tiempo mnimo que requiere el insecto para adquirir el virus.

Perodo de latencia. Tiempo transcurrido desde que el insecto adquiere el virus hasta que es capaz de transmitirlo.

Perodo de inoculacin. Tiempo mnimo requerido por el insecto para poder trasmitir el virus adquirido, una vez que empieza a alimentarse de una planta sana.

Hay otro trmino importante denominado perodo de retencin, que se refiere al tiempo durante el cual el insecto permanece infectivo.

3.2.5.1.1. CLASIFICACIN DE VIRUS DE ACUERDO A LA TRANSMISIN POR INSECTOS En base al fenmeno de transmisin de los virus por insectos estos se han clasificado en: virus no persistentes y virus persistentes.

3.2.5.1.1.1. VIRUS NO PERSISTENTES Llamados tambin virus de estilete o virus no circulativos, constituye el grupo ms grande y de mayor importancia en campo. Este grupo de virus se caracteriza por que el insecto que los transmite (generalmente pulgones), tiene un perodo de adquisicin (tiempo que tarda el insecto en adquirir a un virus) y un perodo de transmisin (tiempo que tarda el vector en transmitir a un virus) sumamente cortos (de 10-60 segundos). El insecto retiene al virus durante un perodo muy corto que puede ser de minutos u horas; esto depende del insecto ya que si este se alimenta 40

ms rpido, ms pronto se deshace de los virus. El virus no penetra al tracto digestivo del insecto por lo que al darse el proceso de muda en este se elimina al virus; si el vector es sometido a un perodo de ayuno se aumenta la eficiencia de la transmisin. La mayora de estos virus presentan las siguientes caractersticas en comn: 1) Su punto de inactivacin trmica anda entre 50-65 C. 2) Generalmente son filamentosos (varilla rgida o flexible). 3) La longevidad "in vitro" es solamente de unos cuantos das. 4) Generalmente presentan sntomas de mosaico y manchas anulares. 5) La gran mayora se transmite por pulgones 6) Se transmiten muy fcilmente mecnicamente 7) Generalmente estn confinados a las clulas epidermales

3.2.5.1.1.2. VIRUS PERSISTENTES Tambin llamados virus circulativos; y se caracterizan porque el insecto que los transmite (pulgones, mosca blanca, chicharritas, etc.) tienen perodos de adquisicin y transmisin largos (horas, das y hasta semanas) y adems poseen un perodo de incubacin (tiempo que tarda el virus en recorrer el tracto digestivo del insecto) que tambin es de horas, semanas y hasta das. En este caso el virus si penetra al tracto digestivo del insecto por lo que al darse el proceso de muda en este, no se pierde la infectividad.

Los virus persistentes presentan las siguientes caractersticas:

1) Generalmente poseen forma polidrica 2) Los sntomas ms comunes son: amarillamientos, enchinamientos,

enrrollamientos, etc. 3) Su longevidad "in vitro" en algunos casos puede durar toda la vida del insecto. 4) Al mudar el insecto no se pierde la infectividad 5) Estn confinados a los tejidos vasculares de la planta. 41

6) Generalmente no se transmiten por medios mecnicos. 7) En la naturaleza sus principales vectores son mosca blanca, chicharritas, nematodos, etc.

Los virus persistentes se pueden clasificar en: circulativos, propagativos y transovricos.

3.2.5.1.1.2.1. PERSISTENTES CIRCULATIVOS Son aquellos virus que penetran al tracto digestivo del insecto vector, pero no se multiplican de este. Este tipo de virus generalmente son transmitidos por mosca blanca.

3.2.5.1.1.2.2. PERSISTENTES PROPAGATIVOS Son aquellos virus que penetran al tracto digestivo del insecto y se multiplican de este. Este tipo de virus se multiplican en la hemolinfa, tubos de Malpighi, cerebro, etc., y generalmente son transmitidos por chicharritas.

3.2.5.1.1.2.3. PERSISTENTES TRANSOVRICOS Son aquellos virus que penetran al tracto digestivo del insecto, se multiplican de este y adems la infectividad se pasa la progenie. Estos virus solo se transmiten por chicharritas y el virus aparentemente se multiplica en los rganos reproductores de la hembra; el Virus Enanismo del Arroz es un ejemplo tpico de estos virus.

VIRUS TRANSMITIDOS POR FIDOS Los fidos, llamados comnmente pulgones, constituyen el grupo ms importante como vector de virus que transmiten alrededor del 60 % de todos los virus que se transmiten por insectos y porque adems transmiten virus principalmente del tipo no persistente pero tambin transmiten virus circulativos y propagativo. El ciclo de vida de los pulgones es muy variado y en lugares donde el invierno no es muy fro, se reproducen partenogenticamente y en las partes donde si hace fro existe reproduccin sexual, es decir, los machos fertilizan a las hembras, las cuales ponen 42

huevecillos y de esta forma invernan. Los fidos generalmente tienen un hospedante perenne que es el hospedante primario y un hospedante secundario que es una planta herbcea; las formas ms importantes como transmisores de virus son las aladas aunque las formas pteras son muy importantes en laboratorio; los pulgones empiezan el vuelo en las maanas muy temprano y dejan de volar unas cuantas horas antes de que acabe la luz, estos insectos son atrados por los colores brillantes, principalmente amarillo. Cuando un fido se coloca en una planta, primeramente realiza inserciones de su estilete de corta duracin cuya trayectoria es hacia el interior de las clulas epidrmicas: Si la planta es de su agrado, posteriormente, para alimentarse, realiza inserciones en la bsqueda de los haces vasculares a travs de los espacios intercelulares. El piquete de probado de corta duracin es el responsable de la adquisicin e inoculacin de virus no persistentes. El piquete de alimentacin se encarga de la transmisin de virus persistentes.

Los fidos transmiten virus que pueden ser transmitidos manualmente muy fcilmente y cuyos sntomas son generalmente los mosaicos, encontrndose dentro de estos a los Potyvirus, Cucumovirus, Carlavirus, Grupo del Virus Mosaico de la Alfalfa, etc., los cuales los transmite de manera no persistente y de manera persistente transmite a los de los grupo Luteovirus, Grupo del Virus Mosaico, Enanismo del Chcharo y a la familia Rhabdoviridae.

VIRUS TRANSMITIDOS POR CHICHARRITAS De los hompteros del suborden Auchenorrhincha, las chicharritas (Cicadellidae) transmiten aproximadamente 40 virus distintos y la mayora de ellos son virus persistentes circulativos propagativos por lo que su perodo de adquisicin es sumamente grande (alrededor de 24 horas), el perodo de incubacin es de una a dos semanas y el perodo de persistencia es casi toda la vida. Tambin transmiten virus transovricos y los sntomas principales son amarillamientos, enrrollamientos y enchinamientos.

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Para comprobar que el virus se multiplica dentro del insecto vector, con una microjeringa se extrajo hemolinfa de una chicharrita del genero Ogallia constricta y se inyect a otra y la infectividad se pas hasta en ocho generaciones; se comprob que el virus se multiplicaba en las clulas del epitelio, intestino, tubos de malpighi, ovarios, hemolinfa, etc. Los virus anteriormente mencionados que son transmitidos por chicharritas estn incluidos dentro de las familias Rhabdoviridae y Reoviridae, y los grupos: Geminivirus, Grupo del Virus Rayado Fino del Maz y Enanismo Clortico del Maz, principalmente.

VIRUS TRANSMITIDOS POR MOSCA BLANCA Las moscas blancas son un grupo importante en la transmisin de virus ya que se les ha encontrado transmitiendo alrededor de 10 distintos Geminivirus; por lo menos cinco virus en forma de varilla distribuidos en los grupos Closterovirus, Carlavirus y Potyvirus, y otras enfermedades de tipo viral cuya partcula no ha sido observada. En todos los casos, la forma de transmisin es persistente circulativa. Para que la mosca blanca adquiera al virus requiere de un perodo de alimentacin de cuando menos 5 minutos, el cual va a depender del virus que se trate, su concentracin en el tejido vegetal, el biotipo, etc. El perodo de alimentacin mnimo para inocularlo en una planta sana es de 5 a 60 minutos y el perodo de incubacin es de 8-12 horas. El principal vector es Bemisia tabaci y transmiten virus cuyos sntomas principales son: aclareamiento de nervaduras, amarillamientos, enchinamientos, entre otros. Algunos virus transmitidos son el Virus Mosaico Dorado del Frijol, Virus Enchinamiento del Tomate, Virus Mosaico Amarillo de Chile, etc.

VIRUS TRANSMITIDOS POR ESCAMAS Las escamas tambin tienen la capacidad de transmitir virus; aun a pesar de que carecen de movimiento, pero las hormigas las trasladan de un lado a otro. El virus ms importante transmitido por estos insectos es el Virus de la Macroyemas del Cacao; al cual no se conoce con certeza su perodo de incubacin, su perodo de transmisin es de 36 das y tiene una incubacin de alrededor de 10 das.

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VIRUS TRANSMITIDOS POR COLEPTEROS Los colepteros transmiten virus circulativos y a diferencia de los hompteros, poseen un aparato bucal del tipo masticador y en lugar de glndulas salivales poseen glndulas gnetales las cuales secretan un jugo enzimtico en el tracto digestivo. Todos los virus transmitidos por estos insectos conservan su infectividad ante la accin de estas enzimas lo que no ocurre con otros virus. El perodo de adquisicin de estos insectos es mayor de 5 minutos y el perodo de persistencia o transmisin es de das a semanas. Cualquier virus adquirido por un coleptero es detectado en el excremento, la hemolinfa y en el regurgitado que genera el insecto en su alimentacin y que se piensa es la forma de transmisin. Las partculas de los virus trasmitidos por escarabajos son de forma polidrica y miden alrededor de 30 nm de dimetro, son relativamente estables en el laboratorio y usualmente causan mosaicos y moteados. Casi todas las especies vectoras pertenecen a la familia Crysomelidae (Alticinae y Galerucinae) pero tambin la familia Coccinelidae y Curculionidae (picudos) transmiten virus; la mayora de los virus transmisibles por colepteros se encuentran en los grupos Comovirus y Tymovirus, encontrndose principalmente al Virus Mosaico de la Calabaza ( Acalymma trivittata, Diabrotica undecimpunctata y Ceratoma trifurcata), Virus Mosaico Sureo del Frijol (Ceratoma spp., Diabrotica balteata y Epilachna varivestis), Virus Mosaico del Nabo, etc.

VIRUS TRANSMITIDOS POR TRIPS Los trips presentan dos estadios larvarios pteros los cuales se alimentan de su planta hospedante. Los siguientes dos o tres estadios larvarios muestran pequeas protuberancias de alas, son inactivos y no se alimentan. El ltimo estadio preadulto es una pupa encerrada en un capullo del cual sale el adulto. El virus ms ampliamente estudiado, transmitido por estos insectos es el Marchitez Manchada del Tomate, el cual se encuentra ampliamente distribuido, tiene un amplio rango de hospedantes y es transmitido por Thrips tabaci, T. setosus, Frankiniella schultzei, Frankiniella fusca, F. occidentalis y Scritothrips dorsalis; los cuales lo adquieren en un perodo de 30 minutos, su latencia es de 5 a 12 das y su perodo de persistencia es alrededor de tres semanas. Solamente las partculas virales adquiridas por el 45

insecto durante los primeros estadios larvales atraviesan el tracto digestivo y llegan a las glndulas salivales para ser transmitidos en la etapa adulta. A pesar de que el estado adulto no es virulfero (virulento), ste puede adquirir al virus pero no logra trasmitirlo, supuestamente debido a que conforme aumenta la edad del insecto, decrece la permeabilidad del intestino. Otros virus reportados que pueden ser transmitidos por estos insectos son el Virus Mancha Anular del Tabaco y el Virus Mosaico del Chcharo.

VIRUS TRANSMITIDOS POR OTROS INSECTOS Varias especies de piojos harinosos (Homptera: Pseudococcidae), han sido reportadas como transmisores de algunas razas del Virus de la Macroyemas del Cacao, el virus puede ser adquirido en una hora e inoculado en 15 minutos y persiste por tres o cuatro das. El transmisor de este virus es Planococcoides njalensis y el virus se caracteriza por ser de forma baciliforme, se transmite muy fcilmente mecnicamente y posee un rango moderado de plantas. Dos especies de tingidos son reconocidos como transmisores de virus en remolacha, uno se encuentra reportado en Europa y otro en Norteamrica.

3.2.5.2. TRANSMISIN DE VIRUS POR HONGOS Desde hace mucho tiempo se empez a manejar la posibilidad de que los hongos transmitieran enfermedades virales, sin embargo, los trabajos se iniciaron en la dcada de los 70's y fue Olpidium brassicae, el primer hongo reportado

transmitiendo al Virus de la Necrosis del Tabaco. Existen dos grupos de hongos, ambos de la clase Phycomycetes, que se han reportado como transmisores de enfermedades virales; en los Chytridiales, Olpidium brassicae, transmite al Virus Satlite de la Necrosis del Tabaco, Virus Necrosis del Pepino, Virus

Macronervaduras de la Lechuga y Achaparramiento del Tabaco; en los Plasmodiophorales, Polymyxa graminis transmite al Virus Mosaico del Trigo, Mosaico de la Avena y Virus Mosaico Amarillo de la Cebada , y Spongospora subterranea, transmite al Virus Mop-top de la Papa. Tambin se reporta que una especie de Pythiaceae (Pythium ultimum) transmite al Virus X de la Papa. El hongo 46

adquiere al virus y lo retiene indefinidamente en el esporangio (se ha comprobado que los esporangios de reposo de Olpidium brassicae pueden sobrevivir hasta ocho aos y mantener al virus) y despus es diseminado por las zoosporas.

3.2.5.3. TRANSMISIN DE VIRUS POR NEMATODOS La transmisin de virus por nematodos fue reportada desde 1958 por Hewitt, Rashi y Gehen, demostrando que el nematodo Xiphinema index transmita al Virus de la Hoja de Abanico de la Vid. Actualmente, dos grupos de virus son transmitidos por estos habitantes del suelo; los Nepovirus, los cuales tienen partculas isomtricas que miden alrededor de 30 nm de dimetro y los Tobravirus, los cuales la gran mayora son de partculas tubulares. Los nematodos vectores de estos dos grupos de virus corresponden al orden Dorylaimida, los cuales incluyen relativamente pocas especies conocidas como parsitos de plantas y los gneros ms comunes como transmisores de virus son Xiphinema y Longidorus (para Tobravirus) y Trichodorus (para Nepovirus). Tanto los Nepovirus como los Tobravirus pueden ser adquiridos de 15 minutos a una hora y puede ser inoculados en un perodo ms o menos similar, ambos grupos son retenidos por sus vectores por semanas y son transmitidos tanto por las larvas como por los adultos, no existe evidencia de transmisin transovarial, ni de multiplicacin del virus en el vector, se transmiten muy fcilmente mecnicamente, por semilla, y los sntomas generalmente son mosaicos y manchas anulares. Algunos virus que son transmitidos por estos vectores son: Virus de la Hoja de Abanico de la Vid (Xiphinema index y X. diversidaudatum), Mancha Anular del Tabaco (X. americanus), Virus Anillo Negro del Tomate (Longidorus elongatus), Virus Cascabeleo del Tabaco (Trichodorus pachydermus) y el Virus Bronceado Temprano del Chcharo (T. teres).

3.2.5.4. TRANSMISIN DE VIRUS POR CAROS Los caros transmisores de virus se encuentran en las familias Eriophydae y Tetranychidae y se cree que transmitan virus del tipo circulativo ya que cuando estos artrpodos mudan no se pierde la infectividad. El cuerpo de los adultos (que son los transmisores de virus) es alargado y mide alrededor de 2 mm de longitud, se 47

alimentan principalmente de hojas y otras partes de las plantas y con su estilete y dos pares de apndices que tienen en el rostro succionan, la savia de las clulas de las plantas. Cuatro de los virus transmitidos por Eriophydae tienen partculas filamentosas de alrededor de 700 nm de longitud, son transmisibles por savia y los sntomas que causan son principalmente mosaicos y moteados. El caso ms conocido es Virus Mosaico del Trigo que es transmitido por Aceria tulipae; el virus puede ser adquirido en 15 minutos, persiste alrededor de 9 das y puede ser transmitido despus de 15 minutos. Los adultos no adquieren al virus pero si lo transmiten. Otros virus transmitidos por caros son el Virus Mosaico del Higo (Aceria ficus), Virus Mosaico del Durazno (Eriophyes insidiosus), el Virus Y de la Papa (Tetranychus telarius) y el Virus Mancha Anular del Tabaco (Tetranychus spp).

3.2.5.5. TRANSMISIN DE VIRUS POR PLANTAS PARSITAS En principio, la transmisin por injerto y la transmisin por plantas parsitas es de manera similar, ya que ambos mtodos se pone en contacto el sistema vascular y las clulas. La transmisin se realiza por medio de unas estructuras que poseen estas plantas llamados haustorios. Alrededor de 20 especies de Cuscuta han sido usadas para transmitir virus, sin embargo, Cuscuta campestris y Cuscuta subinclusa, son las especies ms importantes al transmitir 24 y 12 virus, respectivamente. Los virus ms importantes transmitidos por plantas parsitas son el Virus Mosaico del Pepino, Mosaico del Tabaco y Virus Mosaico del Meln.

3.2.5.6. VIRUS TRANSMITIDOS POR VERTEBRADOS Dentro de los vertebrados transmisores de virus el hombre es considerado factor de diseminacin ms importante ya que transmite virus por semilla (transporte), partes vegetativas y labores culturales. Todos los animales vertebrados que se conocen pueden transmitir virus de manera mecnica.

3.3. IDENTIFICACIN DE VIRUS La identificacin de virus es considerado como el proceso mediante el cual se diagnostica con precisin la presencia real del de los virus presentes en una planta 48

hospedante. Para diagnosticar una enfermedad, lo primero que hay que conocer es la naturaleza de la misma, ya que ser la base primaria de identificacin del patgeno causante y por tanto se implementarn las medidas de control pertinentes. Cuando se nos presenta un problema en campo, en donde se especula la presencia de patgenos; la primera muestra de que la planta est enferma ser basndose en la sintomatologa que sta manifiesta. An a pesar de que los sntomas no son un criterio bsico para determinar al agente causal de una enfermedad, si son de gran utilidad para algunos, ya que los sntomas difieren del resto de los dems.

Comprobar la naturaleza infecciosa de la enfermedad

Antes que nada debe de determinarse que la enfermedad se puede transmitir de una planta enferma a una sana, ya que solo las enfermedades de naturaleza bitica son infecciosas. Este aspecto se prueba haciendo injertos de brotes de plantas enfermas en plantas sanas cultivadas en invernadero. Es obvio que el invernadero deber estar protegido para evitar el acceso de vectores.

A continuacin se mencionan algunas caractersticas para la identificacin de los virus fitopatgenos.

3.3.1. PRUEBAS DE ELIMINACIN DE VIRUS El primer paso en la identificacin de un virus es saber si la enfermedad es causada por ste y no por otros fitopatgenos como hongos, bacterias, nematodos, micoplasmas, espiroplasmas, plantas parsitas, deficiencias de nutrientes, etc.

Para efectuar el diagnstico de enfermedades ocasionadas por plantas parsitas superiores, solo se requiere encontrarlas en crecimiento activo sobre las ramas o races de sus plantas hospederas. La presencia de nematodos fitoparsitos indica que probablemente sea esta la causa de la enfermedad; si en un rea afectada se localiza con la ayuda del microscopio biolgico se encuentra esporas de hongos y bacterias entonces se recomienda aislar para realizar las pruebas de patogenicidad 49

con los microorganismos aislados. Si los sntomas de la enfermedad se reproducen en una planta sana injertada se descarta la posibilidad de factores abiticos; si la enfermedad se logra transmitir mecnicamente la enfermedad se considera de origen viral; si no existe transmisin por savia y los sntomas se logran suprimir con la aplicacin de tetraciclinas ser un micoplasma y si se hace con penicilina ser un espiroplasma. Si los sntomas no desaparecen con la aplicacin de antibiticos entonces ser un virus o viroide.

Una vez establecido que es un virus el causante de la enfermedad, se requiere de una serie de pruebas para determinar su infectividad dentro de las cuales tenemos las siguientes:

3.3.2. RANGO DE HOSPEDANTES Desde hace mucho tiempo y hasta nuestros das los que se encargan del estudio de los virus de plantas, utilizan hospedantes alternos en la identificacin de estos patgenos, especialmente cuando estos son transmisibles por savia. Estos hospedantes alternos responden con algn tipo de sntoma especfico (es mejor cuando reaccionan con lesiones locales) al ataque de un virus y reciben el nombre de plantas indicadoras o plantas diferenciales.

El uso de plantas indicadoras es muy importante en los estudios de identificacin de virus ya que mediante estas plantas se puede confirmar la presencia de un virus en una planta cuando los sntomas sean desconocidos, son un factor de gran importancia en la identificacin de enfermedades latentes causadas por virus y nos pueden servir en la separacin de virus cuando exista un complejo viral atacando. Las plantas indicadoras ms usadas en la identificacin de los virus son las siguientes: Nicotiana glutinosa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Phaseolus vulgaris, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Physalis spp. etc., las cuales reaccionan a los diferentes virus de plantas.

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3.3.3. PROPIEDADES DE INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS Llamadas tambin propiedades fsicas de los virus y son usadas comnmente para conocer la concentracin y estabilidad de las partculas virales en la savia. Las ms importantes son el punto de inactivacin trmica (PIT), punto final de dilucin (PFD) y la longevidad "in vitro".

3.3.3.1. PUNTO DE INACTIVACIN TRMICA (PIT) Es la temperatura mxima que soporta un virus para seguir conservando su infectividad durante un perodo de exposicin de 10 minutos. La prueba es sencilla y consiste en extraer al virus de la planta hospedante y depositar 5 ml de savia para cada tratamiento. La savia se coloca en tubos de ensayo y se ajusta a distintas temperaturas con un perodo de exposicin de 10 minutos y se separa con un intervalo de 5 C; para mantener la temperatura constante se puede usar un bao mara y una vez transcurrido el tiempo de exposicin se detiene el tratamiento sumergiendo los tubos en agua helada. Posteriormente se inocula en plantas que de preferencia reacciones con lesiones locales y en caso de no existir se usa plantas que presenten sntomas sistmicos; es conveniente empezar a inocular del tratamiento con mayor temperatura con el fin de evitar contaminaciones. El punto de inactivacin trmica de de los virus tiene un rango de 45 C (como el Virus Marchitez Manchada del Tomate) hasta 95 C (algunas razas del Virus Mosaico del Tabaco), pero la gran mayora est entre 55 y 70 C ; en virus ms complejos, como los que poseen lpidos el PIT es bajo. Diferentes razas de un mismo virus pueden tener diferente PIT; por ejemplo, para la raza B del Virus de la Necrosis del Tabaco est entre 80 y 85 C, la raza A, entre 85 y 90 C y para la razas D y E, es de 90 a 95 C. 3.3.3.2. PUNTO FINAL DE DILUCIN (PFD) Es la dilucin mxima que soporta un virus para seguir conservando su infectividad. La metodologa consiste en extraer la savia de la planta enferma y se agrega un mililitro en un tubo de ensayo que contenga 9 ml de agua destilada o solucin buffer al 0.01 molar y un PH de 7.0 para tener la dilucin de 10-1; el tubo se agita hasta mezclarse bien la savia con el agua y de este se agrega a otro tubo con la misma 51

cantidad de agua para obtener la 10-2 y as sucesivamente hasta llegar a 10-8. Una vez realizadas las diluciones, inocular en plantas que reaccionen con sntomas locales iniciando con la dilucin ms alta. Esta tcnica depende de la concentracin del virus, del diluyente, las condiciones y especies de las plantas donde se tom el inculo, las plantas inoculadas y el abrasivo usado para facilitar la infeccin. El PFD de la mayora de los virus se encuentra entre 10-1 a 10-7.

3.3.3.4. LONGEVIDAD IN VITRO Es el tiempo que dura el virus fuera del tejido hospedante una vez extrada su savia y sometida a temperatura ambiental. La savia se guarda en un frasco y se va inoculando a intervalos de tiempo dependiendo del grupo de virus que crea uno que tenga hasta que se pierda la infectividad. La longevidad "in vitro" vara de una hora (Virus Mosaico de la Manzana) hasta ms de un ao (Virus Mosaico del Tabaco).

3.3.4. TIPO DE PARTCULA VIRAL Con el descubrimiento de la microscopa electrnica se logr un importante avance en la identificacin de los virus de plantas ya que basta en muchos de los casos, una observacin del tipo de partcula del virus en estudio para diagnosticar al virus que se encuentra presente

3.3.5. FORMAS DE TRANSMISIN Desde un principio debe intentarse la transmisin mecnica ya que este aspecto permite hacer diversos estudios y da una idea del posible grupo de virus al que pertenece el patgeno en estudio.

Independientemente de que se transmita o no de manera mecnica el agente infeccioso, se debe probar la transmisin por insectos y de ser necesario, la posible transmisin por hongos, nemtodos y otros agentes sospechosos de actuar como vector.

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3.3.6. PRUEBAS SEROLGICAS Todas las tcnicas anteriores forman parte del protocolo formal para identificar virus desconocidos en una regin. Sin embargo, en los diagnsticos de rutina su uso es cada da menor, ya que otras tcnicas ms rpidas y eficaces, como la serologa presentan amplias ventajas (y algunas desventajas).

Los mtodos serolgicos han sido reconocidos desde hace miles de aos en animales que mostraban inmunidad a ciertas enfermedades. La mayora de las reacciones inmunolgicas tienen un comn bsico. El agente inmunolgico, llamado tambin antgeno (en la enfermedad el patgeno), estimula al animal a la formacin de protenas llamadas anticuerpos que aparecen en el suero; estas reaccionan especficamente con el antgeno que estimul su formacin. El suero que lleva a los anticuerpos se llama antisuero, y al que no lleva se le conoce como suero normal. Si el antisuero se mezcla con el antgeno que dio origen a los anticuerpos, se presenta una reaccin homloga o positiva y cuando la mezcla no fue con los que dieron origen la reaccin es heterloga o negativa. La serologa constituye una de las herramientas ms importantes en estudios tales como:

-Diagnsticos rpidos y precisos -Estudios epidemiolgicos -Relaciones entre virus y entre sus variantes

Bases de la serologa La tcnica se fundamenta en el conocimiento que se tiene sobre la reaccin (produccin de anticuerpos) que ocurre en los animales de sangre caliente cuando son invadidos por un agente extrao (antgeno; en este caso el virus).

Los antgenos son molculas o partculas constituidas por polisacridos y/o protenas de elevado peso molecular, ajenas al animal inoculado. De hecho un proceso similar ocurre diariamente en la naturaleza cuando los animales 53

sealados se defienden del ataque de microorganismos potencialmente patgenos. En contraparte los anticuerpos son macromolculas producidas por el animal inoculado natural o artificial mente. Las reacciones antgeno anticuerpo se caracterizan por ser relativamente especficas. As un antgeno "A" dar origen a un anticuerpo "A" y un antgeno "B" inducir la sntesis de un anticuerpo "B"; pero ni "A" dar origen a "B" y viceversa; tampoco "A" ni "B" producirn anticuerpos C, D...ni N.

Los anticuerpos son protenas del tipo de las gamaglobulinas especficas. Los anticuerpos funcionan como un sistema de defensa especfica contra el antgeno que indujo su formacin. Partculas de nucleoprotenas, tales como los virus, funcionan como antgenos; en este caso, la cpside (cubierta de protena) determina el tipo de antgeno, (segn el arreglo de sus aminocidos) que ser producido.

Este fenmeno que ocurre de manera natural tambin puede ser inducido inoculando animales con virus conocidos, con el fin de aprovechar los anticuerpos producidos en estudios de identificacin y diagnstico de virus. La produccin controlada de antisueros (anticuerpos presentes en SL suero sanguneo) se lleva a cabo en algunos centros de investigacin y en los ltimos aos constituye un prspero negocio de algunos laboratorios que se encargan de producir los a nivel comercial. Ejemplos de estas compaas internacionales son Agdia y Sanofi.

Produccin de antisueros Aunque en si la produccin de antisueros no es una tarea complicada, para lograr una alta calidad si se requiere de personal altamente capacitado. En trminos generales el proceso consiste en inocular plantas susceptibles con el virus especfico. Posteriormente el tejido infectado se macera y se somete a proceso de extraccin con solventes, agentes de precipitacin y otras substancias, auxilindose tambin con el uso de centrfugas y ultracentrfugas hasta obtener al virus con la mayor pureza posible. 54

El virus purificado se inyecta mediante un programa calendarizado en algn animal de sangre caliente, tales como conejos de Nueva Zelanda, caballos, borregos u otros. El virus tiene que combinarse con substancias coadyuvantes antes de inyectarse, para que el virus sea liberado lentamente y no cause un shock en el animal.

Despus de cierto nmero de inyecciones y 5-10 das despus de la ltima, se puede hacer un sangrado previo para checar la concentracin de los anticuerpos en la sangre del animal. Una vez determinada la concentracin ptima, el animal se puede sangrar parcialmente o se sacrifica (aplicando antes un anticoagulante), tratando de obtener la mayor cantidad de sangre posible.

Se deja la sangre en reposo y una vez que esta se coagula, se separa el suero que contendr los anticuerpos (antisuero), el cual se guarda congelado (15-25 C) en pequeas ampolletas cerradas hermticamente, previa incorporacin de un microbicida. Este antisuero est listo para su uso, previa dilucin del mismo a las concentraciones adecuadas.

Reacciones serolgicas Es posible aprovechar la capacidad de los anticuerpos para reconocer y acoplarse con el antgeno especfico que indujo su formacin con fines de identificacin de virus. Es decir si tenemos una muestra de una planta infectada con un virus "X" desconocido, podemos utilizar nuestro banco de antisueros para tratar de identificar al patgeno en estudio. Si al hacer reaccionar por separado cada antisuero disponible, y entre nuestros antisueros est un antgeno "X", habr un reconocimiento y una reaccin entre antgeno "X" y los antisueros conteniendo al anticuerpo "X", pero no con los antisueros "Y", o "Z"; estos ltimos daran reaccin positiva solo en el caso de que en la muestra hubiera los antgenos (virus) especficos correspondientes.

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Existen diversidad de tcnicas disponibles, cada una con ventajas y desventajas, entre las ms usuales: Doble Difusin en Agar, Latex, Elisa, Dot Blot, etc. La tcnica ELlSA es la ms usada en la mayora de los laboratorios.

3.3.6.1. DOBLE DIFUSIN EN AGAR Para efectuar esta reaccin se emplea una caja de petri, con agar puro. Se hacen perforaciones equidistantes de un agujero central. Para evitar que el antisuero y el antgeno se difundan por el fondo del vidrio, se sellan las perforaciones con una gota de agar lquido. En la perforacin central se coloca el antisuero y en la periferia la savia del virus y se espera 24-72 horas para observar la reaccin la cual si es positiva se manifestar en forma de media luna o espuela (cuando los antgenos estn relacionados).

3.3.6.2. PRUEBA DE ELISA Las tcnicas serolgicas convencionales (aglutinacin, doble difusin en agar) tenan numerosos inconvenientes, tales como una baja sensibilidad, o el efecto de la forma la forma de la partcula, presencia de inhibidores de la reaccin presentes en la savia. Estas desventajas quedaron superadas con la tcnica ELlSA, la cual revolucion la serologa. Esta tcnica desarrollada inicialmente en patologa clnica e inmunologa, fue adaptada en 1976 para utilizarse en la deteccin de virus fitopatgenos. Desde entonces ha sido una de las tcnicas ms utilizadas, junto con las tcnicas moleculares como PCR, que fueron desarrolladas poster. El trmino ELlSA se deriva de "Enzyme-Lynked-Immuno-Sorbent-Assay" que puede traducirse como "Ensayo de inmunoabsorbencia con enzimas conjugadas".

La ELlSA es ampliamente usada en investigacin por su alta sensibilidad y especificidad, por su carcter prctico y verstil en su metodologa, lo que permite trabajar gran cantidad de muestras con pequeas cantidades de tejido vegetal. Es posible detectar virus an en plantas con sntomas muy tenues o asintomticas y permite cuantificar concentraciones del virus. Tambin permite detectar virus en

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semillas e incluso en insectos vectores. Tambin se pueden detectar hongos y bacterias con ELlSA.

El mtodo ELlSA consiste bsicamente de cuatro fases principales:

1. La adsorcin de un antisuero especfico a la pared de un pozo de plstico.

2. Se agrega un extracto de la planta infestada. Las partculas virales se adhieren a los anticuerpos portadas en el antisuero, que previamente se adhiri a las paredes del pozo.

3. De nuevo se agrega el antisuero usado inicialmente, pero conjugado previamente con una enzima (por ejemplo la fosfatasa alcalina). Este conjugado se adhiere al virus, de tal forma que este queda atrapado entre el conjugado y el anticuerpo agregado inicialmente (se forma un "sndwich" con el virus en medio).

4. Se agrega un substrato sobre la cual pueda actuar la enzima conjugada. Al combinarse la enzima con el substrato se registra un cambio de coloracin a simple vista, cuya intensidad ser proporcional a la concentracin.

Cabe sealar que entre cada paso el pozo se lava con una solucin especial que contiene detergente y se desecha el lavado, de tal manera que si la muestra de savia no tena al virus correspondiente al antisuero utilizado, en el primer lavado (despus del punto 1) los anticuerpos no atraparn ninguna partcula viral (dada su especificidad). Si esto ocurre el conjugado (enzima-anticuerpo) tampoco se pegar y ser eliminado por el segundo lavado. Despus al agregar el substrato, este no ser afectado porque la enzima ya fue eliminada. En consecuencia no habr cambio de coloracin.

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Esta tcnica descrita es la que se usa con mayor frecuencia y se conoce como "ELlSA Sndwich doble anticuerpo". Existen variantes de ELlSA, que se usan en situaciones especiales.

Es claro que la tcnica es fcil de llevar al cabo, pero para que su utilizacin sea confiable se requiere de experiencia, ya que pequeos detalles a veces son la diferencia entre un diagnstico adecuado y uno errtico. La tcnica se facilita con el uso de equipo apropiado y en algunos laboratorios bien equipados el procedimiento es semiautomtico. Las placas con los pozos se pueden "leer" en un espectrofotmetro especial, para cuantificar la concentracin del virus. Un aspecto muy importante es la cantidad de antisueros que se tengan disponibles y la calidad de los mismos. Algunas compaas como Agdia y Sanofi son proveedores de equipo, reactivos y antisueros de alta calidad.

Cabe mencionar que desde la dcada pasada inici el desarrollo de las tcnicas moleculares, las cuales hoy en da han alcanzado un alto desarrollo y su avance es vertiginoso. Tcnicas como la de Reaccin de la Polimerasa en Cadena (Polymerase Chain Reaction = PCR), tienen una sensibilidad mucho mayor que ELlSA, de tal manera que muestras registradas como sanas mediante ELlSA (porque el virus est poco concentrado) en realidad si estn infectadas. Estas nuevas tcnicas tienen una gran importancia en la deteccin de virus en frutales, semillas, etc. Su utilidad prctica es grande en diversos casos: por ejemplo en la certificacin de sanidad de semilla, material propagativo, etc.

Tcnicas moleculares En este caso se usan tcnicas ms sofisticadas, que requieren de equipo especial, que por su alto costo solo se tiene en aquellos laboratorios ms avanzados en la investigacin en virolgica. Las tcnicas moleculares incluyen diversos aspectos del anlisis bioqumico de los virus, entre ellas el anlisis del genoma vira!. Ejemplos de estas son la Reaccin de la Polimerasa en Cadena tambin llamada PCR, o la Hibridacin de cidos Nucleicos. Se caracterizan porque son muy 58

sensibles y ms precisas que otras tcnicas. Regularmente estas pruebas se ejecutan, en casos especiales de diagnstico o con fines ms especficos. Sin embargo, en la medida que los reactivos y el equipo utilizado sea ms barato y cuando exista personas ms capacitado, estas tcnicas aparentemente se volvern tan rutinarias como ELISA.

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UNIDAD

IV.

DESCRIPCIN

DE

LAS

PRINCIPALES

ENFERMEDADES

CAUSADAS POR VIRUS EN PLANTAS CULTIVADAS

4.1.

DESCRIPCIN

DE

LOS

PRINCIPALES

VIRUS

QUE

AFECTAN

HORTALIZAS

4.1.1. VIRUS QUE AFECTAN TOMATE

4.1.2. VIRUS QUE AFECTAN CHILE

4.1.3. VIRUS DE CUCURBITCEAS

4.2. DESCRIPCIN DE LOS PRINCIPALES VIRUS QUE AFECTAN CULTIVOS BSICOS

4.2.1. VIRUS QUE AFECTAN FRIJOL

4.2.2. VIRUS QUE ATACAN MAZ Y TRIGO

4.3. DESCRIPCIN DE LOS VIRUS QUE AFECTAN FRUTALES

4.3.1. VIRUS DE CTRICOS

4.3.2. VIRUS QUE AFECTAN PAPAYA

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BIBLIOGRAFA CONSULTADA

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