PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS ALCOHLICAS

MARIA PAULA TORRES TORRES

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de Microbilogo Industrial

BOGOTA, D.C Julio 19 de 2007

VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS ALCOHLICAS

MARIA PAULA TORRES TORRES

APROBADO

___________________________ Olga Luca Mondragn Flrez Microbiloga DIRECTORA _____________________ Jennifer Alejo Microbiloga JURADO ______________________ Adriana Pez Microbiloga JURADO

BOGOT, D.C. Julio 19 de 2007

VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS ALCOHLICAS

MARIA PAULA TORRES TORRES

______________________________ Dra. ngela Umaa Muoz. M.Phill Decana acadmica

_________________________ Dr. Lus David Gmez. MSc. Director de carrera

BOGOT, D.C. Julio 19 de 2007

NOTA DE ADVERTENCIA

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

DEDICATORIA Este trabajo est dedicado a Dios por poner en mi camino cada etapa de mi vida en el momento y en el lugar adecuado. A mis paps Guillermo y Patricia, por haberme brindado toda su sabidura, su amor y sobre todo su apoyo incondicional en todo momento y en todas las decisiones que he tomado y por haber realizado grandes esfuerzos a lo largo de toda mi carrera para que pudiera ser una gran profesional; a mi hermana Catalina por su amor, consejos y apoyo brindado a tiempo; a mi familia en general por ser guas a lo largo de este recorrido; a Janeth Arias por su amistad y asesora para la realizacin de este trabajo; a mis amigos por la paciencia y ayuda que me dieron en todo momento; a Olga Luca por su apoyo y amistad incondicional para que terminar con xito los ltimos semestres de mi carrera y finalmente a cada una de las personas que de alguna manera llegaron a mi vida en diferentes circunstancias llenndome de alegra, amor y fortaleza para finalizar con xito esta etapa de mi vida.

TABLA DE CONTENIDO Pg. 1. Introduccin..1 2. Marco Terico..3 2.1. Levadura.3 2.1.1. Levadura cervecera..3 2.1.1.2. Morfologa (Forma) y composicin celular.3 2.1.1.3. Composicin de la clula de la levadura4 2.1.1.3.1. Protenas..5 2.1.1.3.2. cidos nucleicos..5 2.1.1.3.3. Paredes celulares...5 2.1.1.3.4. Membranas..6 2.2. Crecimiento y Multiplicacin celular...6 2.2.1. Curva de crecimiento microbiano....6 2.2.1.1. Fase de adaptacin7 2.2.1.2. Fase logartmica.8 2.2.1.3. Fase estacionaria9 2.2.1.4. Fase de muerte...9 2.3. Reproduccin de la levadura...9 2.3.1. Reproduccin Sexual (Meiosis)...9 2.3.2. Reproduccin Asexual (Mitosis)10 2.3.2.1. Divisin celular..10 2.3.2.2. Esporas vegetativas.10 2.3.2.3. Gemacin..10 2.3.2.3.1. Reproduccin por Gemacin..10 2.3.2. Factores que intervienen en la reproduccin de la levadura11 2.3.2.1. Oxgeno..11

2.3.2.2. Temperatura..11 2.3.2.3. Composicin del mosto (sustrato nutritivo)..11 2.4. Floculacin de la levadura11 2.4.1. Hidrofobosidad.12 2.4.2. Potencial Zeta..12 2.4.3. Interaccin protenas azcares..12 2.4.4. Factores que influyen en la floculacin12 2.5. Mutacin de la levadura.13 2.5.1. Mutaciones ms comunes en el proceso cervecero..13 2.5.1.1. Floculacin.13 2.5.1.2. No asimilacin de la maltotriosa....13 2.5.1.3. Precipitacin temprana13 2.5.1.4. Respiracin deficiente.13 2.6. Levaduras salvajes.14 2.7. Metabolismo de los carbohidratos14 2.7.1. Gluclisis..15 2.7.2. Ciclo de Krebs.18 2.8. Bacterias lcticas como contaminantes..20 2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo.20 2.8.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y subproductos. 2.8.2.1. Nitrgeno23 2.8.2.2. Oxgeno..23 2.8.2.3. Subproductos que pueden afectar la calidad del producto...23 2.9. Factores que afectan el rendimiento del alcohol...24 2.9.1. Cambios de pH durante la fermentacin.24 2.9.1.2. Absorcin de bases por la levadura..25 2.9.2. Produccin de cidos.25 2.9.3. Floculacin de la levadura.26 2.10. Proceso de elaboracin de la cerveza27 2.10.1. Molienda..27 2.10.2. Proceso en Pailas..28 2.10.3. Filtracin del Mosto.......28

2.10.4. Ebullicin del Mosto......29 2.10.5. Enfriamiento del Mosto.30 2.10.6. Fermentacin.31 2.10.6.1. Principales transformaciones que tiene lugar durante la fermentacin33 2.10.6.1.2. Consumo de oxgeno.33 2.10.7. Maduracin.35 2.10.7.1. Dos etapas..36 2.10.7.2. Fermentar hasta el extracto lmite...36 2.10.8. Filtracin..38 2.10.9. Envasado39 3. 4. Justificacin40 Objetivos del proyecto..41

4.1. Objetivo general..41 4.2. Objetivos especficos..41 5. Materiales y Mtodos...42 5.1. Tipo de estudio42 5.2. Anlisis Microbiolgicos44 5.3. pH, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin45 5.4. Tcnicas Empleadas..45 5.4.1. Siembra en Placa.45 5.4.2. Filtracin por membrana.46 5.4.3. Recuento en cmara de Neubauer...47 5.4.3.1. Levadura en Proceso de Fermentacin y Maduracin..47 6. 7. 8. 9. 10. 11. Resultados ........................................48 Discusin de Resultados.58 Conclusiones.......................72 Recomendaciones73 Referencias Bibliogrficas...74 Anexos78

LISTA DE TABLAS Pg. Tabla 1. Porcentaje de la Materia seca remanente.4 Tabla 2. Anlisis Microbiolgicos.44 Tabla 3. pH, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin45 Tabla 4. Agua acueducto de Cali.48 Tabla 5. Enjuagues Tanques (Fermentaciones y Maduraciones)..49 Tabla 6. Agua de Empuje y Mosto...50 Tabla 7. Propagacin de la Levadura..51 Tabla 8. Fermentaciones y Maduraciones..51 Tabla 9. % Petite Mutants (Respiracin Deficiente)..54 Tabla 10. Agua Desairada.55 Tabla 11. Tierra Diatomcea.55 Tabla 12. BBT`s..56 Tabla 13. Sifn (Cerveza sin pasterizar).56 Tabla 14. Conteo celular Fermentaciones..56 Tabla 15. Conteo celular Maduraciones.57

LISTA DE FIGURAS Pg. Figura 1. Morfologa Saccharomyces cerevisiae.3 Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin de la glucosa...16 Figura 3. Ciclo del cido tricarboxlico (Ciclo de Krebs)...19 Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas21 Figura 5. Proceso Cervecero42 Figura 6. Material para toma de muestras..43 Figura 7. Enjuague Tanque 107...49 Figura 8. Medios Utilizados en (Propagacin, Fermentacin y Maduracin)52

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RESUMEN Este trabajo se realiz con el objetivo de evaluar la calidad microbiolgica del producto en proceso en una planta productora de bebidas alcohlicas. Como primera medida se hizo una revisin del proceso tpico cervecero llevado a cabo en la planta con el fin de identificar los puntos crticos claves durante la produccin y para llevar a cabo el cumplimiento de los objetivos planteados al inicio de esta valoracin, se tomaron muestras en cada una de las etapas identificadas, donde el manejo de las muestras se realiz, utilizando material estril (botellas biolgicas) y su almacenamiento previo a la siembra se llev a cabo bajo condiciones de refrigeracin para evitar multiplicacin de microorganismos presentes en stas o proliferacin de contaminantes por mal manejo de las mismas, para garantizar la trazabilidad de este estudio, los resultados obtenidos durante todo el proceso de investigacin, fueron consignados en un formato que previamente fue establecido. Para el aislamiento e identificacin de los diferentes microorganismos se llevaron a cabo las tcnicas de siembra en superficie y profundidad, recuento en cmara de Neubauer y filtracin por membrana, utilizando medios altamente selectivos que garantizaran el xito de la siembra y a su vez se respet pH, tiempos, temperatura y mtodos de incubacin que ya haban sido estandarizados. Los resultados encontrados en la mayor parte de las etapas de produccin fueron consistentes a lo largo del estudio puesto que no se identificaron microorganismos ajenos o contaminantes del proceso cervecero, sin embargo donde se encontraron variantes de la levadura al observar los indicadores, las muestras no se salen de los parmetros establecidos para encontrar este tipo de mutacin durante el proceso fermentativo, entrando dentro de especificaciones. Finalmente, se pudo concluir que la estandarizacin que se tiene actualmente del proceso es la adecuada y con la cual se puede garantizar una ptima calidad del producto terminado.

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Palabras Claves: Valoracin de la calidad, Produccin de cerveza, Variantes de levadura

ABSTRACT Present work had an objective to evaluate microbiological quality of product in process at alcoholic beverage industry plant. First was doing a review of typical process at plant goes to identify critical points during production and objectives since that validation started. All parts of process were sampling using sterile material (sample bottles) and there were package refrigerated. Results were consigned in a previously established format to have a guaranty of tradability of present study. To the isolation of microorganisms techniques used were: counting chamber Neubauer and membrane filtration using selective mediums under standardized conditions like pH, time, temperature and incubation methods. Results showed that in all time of present study, measures were consistent because didnt find foreign microorganisms, however, where we found yeast variants, samples didnt going out of established parameters. Finally, we can conclude that standardization of process is adequate to guaranty the quality of finished product.

Keys

words:

evaluate

microbiological

quality,

beer

production,

microorganisms, yeast variants

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1. INTRODUCCIN La premisa fundamental de una empresa productora de bebidas alcohlicas es que la calidad de sus productos surge como consecuencia de hacer las cosas bien desde el comienzo, en forma ordenada y metdica, es as como en el proceso de elaboracin se ha observado que uno de los aspectos ms importantes para esta empresa consiste en garantizar una excelente calidad de su producto, por medio de un riguroso control, la utilizacin de una buena y adecuada materia prima y la realizacin de un ptimo proceso de fabricacin, logrando as el objetivo de la satisfaccin de sus clientes, tanto externos como internos, en el marco de un proceso integrador de todas las reas involucradas en el sistema de calidad. En la medida que se avanza en el proceso de elaboracin de la cerveza, se evidencia que dentro de cada una de las etapas de elaboracin existen muchos riesgos que pueden afectar el producto en proceso organolptica, fisco- qumico y microbiolgicamente y de esta manera influir en la calidad del producto terminado. En el control de la calidad se encuentran involucrados no solo el control proceso, las especificaciones y el muestreo, sino tambin los procedimientos de organizacin, documentacin y autorizacin que aseguran se lleven a cabo las pruebas pertinentes para verificar el cumplimiento de los estndares internacionales y de est manera asegurar que la calidad es satisfactoria. Es as como el objetivo de este trabajo de investigacin es valorar la calidad microbiolgica del producto en proceso empleado en cada una de las etapas de produccin de bebidas alcohlicas, con el fin de identificar los microorganismos tpicos o posibles contaminantes, que puedan

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afectar la calidad del proceso de elaboracin y de esta manera establecer por medio de los resultados obtenidos, si stos afectan la calidad del producto terminado.

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2. MARCO TEORICO 2.1. Levadura Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen principalmente por gemacin, son organismos eucariticos, es decir que tienen una membrana nuclear bien definida que envuelve el ncleo (Adams et al, 1998). Las levaduras son las causantes principales de la fermentacin de los alimentos, lo cual puede ser perjudicial (deterioro) o favorable (produccin de cervezas, vinos, pan, quesos, enzimas, etc) (Adams et al, 1998). 2.1.1. Levadura cervecera

Saccharomyces cerevisiae tiene como caracterstica que al final de la fermentacin se va al fondo del tanque, se conoce como levaduras de profundidad y su temperatura ptima de fermentacin es de 10 14 C (Aguilar, 2003).
2.1.1.2. Morfologa (Forma) y composicin celular S. cerevisiae tiene forma esfrica, elipsoide u ovoide. Su tamao vara con la edad de la clula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras. Puede vivir aislada o formando colonias (Aguilar, 2003).

Fuente: El cervecero en la prctica, 2002. Figura 1. Morfologa de Saccharomyces cerevisiae.

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La clula est constituida aproximadamente por: P-glucanos (polisacrido) Mananos (polisacrido) Protenas Lpidos (grasas) Sustancias inorgnicas Hexosamina y quitina 40% 40% 8% 7% 3% 2%

2.1.1.3. Composicin de la clula de la levadura Con el objeto de producir una nueva clula, todos los compuestos presentes en la clula se deben incrementar. La clula de levadura tiene alrededor del 75 80% de agua (Adams et al, 1998). El contenido de otros materiales es usualmente expresado como % de la materia seca remanente. % DE LA MATERIA SECA REMANENTE Minerales: 8%
( 5% P2O5 ; 3%K2O) (glucgenos, Betaglucanos, etc)

Carbohidratos: 40% Material nitrogenado: Protenas 64%, peptonas 10%, aminocidos 8%, cidos nucleicos. Lpidos: 1% - 2%

Fuente. El cervecero en la prctica, 2002 Tabla 1. Porcentaje de la Materia Seca Remanente

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2.1.1.3.1. Protenas
Alrededor del 50% del material celular (seco) puede ser material protenico. Las protenas presentes son principalmente enzimas y protenas estructurales. Las protenas se combinan con los cidos nucleicos para formar los sitios para la sntesis de nuevas protenas. Las protenas son sintetizadas en la levadura a partir de los aminocidos, la formacin de los enlaces pptidos requieren energa, la cual es portada por el ATP (Klimovitz, 2002). Algunos aminocidos de los requeridos estn presentes en el mosto y son transportados dentro de la clula y concentrados all por los aminocidos-permeasas; la eficiencia de este transporte es diferente para cada aminocido, as que los aminocidos disponibles dentro de la clula para la sntesis de protenas no estn necesariamente en la misma proporcin que en el mosto. Si un aminocido no esta disponible dentro de la clula, la levadura puede sintetizarlo por s misma (Klimovitz, 2002). 2.1.1.3.2. cidos nucleicos Constituyen alrededor del 18% del material celular nitrogenado. Dirigen la sntesis de protenas, la secuencia de las cuatro bases en el cido nucleico determina la secuencia de los aminocidos en la protena que se est sitentizando. Proporcionan la informacin gentica necesaria para sintetizar las protenas (Klimovitz, 2002). 2.1.1.3.3. Paredes celulares Compuestas principalmente de polisacridos, entre ellos la manosa y la glucosa que forma los mananos y beta glucanos. Una considerable cantidad de protenas tambin est presente con algunos componentes menores tales como fosfatos. Durante la fermentacin la composicin de la pared celular cambia (Aguilar, 2003).

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2.1.1.3.4. Membranas Las membranas rodean el citoplasma y las mitocondrias de la clula de levadura. Estn compuestas por mananos, protenas y materiales grasos, estos ltimos son principalmente esteroles y glicridos. La membrana citoplasmtica es semipermeable y regula el flujo de nutrientes hacia el interior de la clula y el de subproducto hacia el exterior (Aguilar, 2003). 2.2. Crecimiento y multiplicacin celular El crecimiento celular es el incremento ordenado de todos los constituyentes de la clula viva, es el desarrollo individual, su estudio implica conocer los modelos que explican la generacin y sntesis de macromolculas, como se sintetiza la pared celular y que enzimas participan, etc; adems de los aspectos bioqumicos interesa conocer tambin como se transportan y ensamblan las macromolculas y de donde se ensamblan (Klimovitz, 2002). La multiplicacin celular, por otra parte, se refiere al estudio del aumento del nmero de individuos en un poblacin; su estudio implica conocer la cintica de la multiplicacin, velocidad con que se sucede, relaciones que tiene con el medio ambiente, con los productos y con el consumo de sustratos, cambios fisiolgicos y morfolgicos que se suceden (Klimovitz, 2002). 2.2.1. Curva de crecimiento microbiano Cuando un microorganismo (bacteria, hongo o levadura) se le inocula en un medio de cultivo apropiado para su desarrollo y se le dan las condiciones ptimas para su crecimiento, este presenta una curva de crecimiento tpica, donde fcilmente se podra graficar en funcin del tiempo la concentracin celular (nmero de clulas por unidad de volumen

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del cultivo) o concentracin de biomasa microbiana (gramos de clulas microbianas en sustancia seca por unidad de volumen de cultivo) (Ingledew, 1996). 2.2.1.1. Fase de adaptacin Esta fase recibe diversos nombres, se consideran de adaptacin cuando la poblacin inicial se localiza en un medio ambiente que les favorece para su desarrollo; en estas condiciones los individuos necesitan adaptarse a ese medio ambiente generando abundante actividad metablica pero sin multiplicarse; se producen enzimas e incremento en los componentes estructurales especialmente los citoplasmticos, las clulas adsorben gran cantidad de agua y hacia el final de esta fase presentan un tamao mayor que el normal (se considera tamao normal el que presentan durante la fase logartmica). En esta fase hay mayor consumo de oxgeno por clula que en cualquier otra fase y se observa adems incremento en la concentracin del ARN mientras que el ADN permanece constante; el tiempo de duracin depende de las condiciones del medio ambiente: prolongado si son desfavorables, corto si son favorables e inclusive puede ser cero en el caso de que se traslade una poblacin en fase logartmica a un medio similar si la dilucin no es alta. En muchos casos la fase de adaptacin se prolonga demasiado, siendo ms correcto denominarla de latencia; en estos casos las condiciones para el desarrollo son muy desfavorables (pH, baja temperatura, falta de nutrientes, etc) y el organismo solamente esta subsistiendo (Ingledew, 1996). A la fase de adaptacin se le denomina tambin fase LAG. El cambio de la fase LAG a la fase LOG se denomina de aceleracin positiva; la reproduccin celular comienza y poco a poco se va aumentando la velocidad de crecimiento (Adams el al, 1998).

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2.2.1.2. Fase logartmica En esta fase se representa tambin cambios citomorfolgicos; la clula se vuelve fisiolgicamente joven y se encuentra en su estado ms normal; en el caso de las bacterias todas las clulas reaccionan al Gram en forma homognea y es en esta fase en donde se describe si son Gram Positivas o Gram Negativas. La clula tiene composicin normal constante, mientras que la composicin del medio vara. El metabolismo es bastante activo y dirigido esencialmente a obtener energa y construir para multiplicarse, por eso es esta fase se producen los metabolismos primarios (Ingledew, 1996). La pared celular es ms delgada que en otras fases y esto hace que la poblacin sea ms sensible a los agentes fisicoqumicos. El tiempo de duracin depende del organismo y de las condiciones del medio, si estas son favorables el tiempo ser menor, puesto que al ocurrir metabolismo se genera una mayor poblacin y el material nutriente se agotara ms rpidamente (Klis et al, 2002). A medida que se sucede el metabolismo van cambiando las condiciones del medio, por ejemplo el pH; en estas condiciones se reduce la velocidad del crecimiento, (fase de desaceleracin), esta disminucin tambin se ve afectada por el agotamiento de los nutrientes y porque el metabolismo produce sustancias txicas que se van acumulando, ejemplo, los alcoholes, aldehdos, etc; las cuales tienen efecto antimicrobiano (Ingledew, 1996). A medida que transcurre el tiempo, las condiciones se tornan ms desfavorables hasta que se llega a un estado de equilibrio en el cual se produce ligera multiplicacin pero tambin muerte; este estado se denomina fase estacionaria (Ingledew, 1996).

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2.2.1.3. Fase estacionaria La poblacin se equilibra; se presentan tambin cambios morfolgicos: decrece el tamao de la clula, aumenta el espesor de la pared celular como un mecanismo de resistencia para contrarrestar las condiciones adversas del medio ambiente; hay variacin en la actividad metablica y se sintetizan principalmente los metabolitos secundarios (Klis et al, 2002). A la cantidad de clulas que alcanzan esta fase se le denomina crecimiento total. 2.2.1.4. Fase de muerte Disminuye el nmero de clulas viables; al aumentar la mortalidad disminuye la concentracin en biomasa a la autlisis; la poblacin puede llegar a un punto tal de auto esterilizacin en el que los individuos mueren por las mismas condiciones que han generado (Klis et al, 2002). Esta fase es muy importante desde el punto de vista bioqumico ya que en ella se generan sustancias de mucho inters especialmente los antibiticos (Ingledew, 1996). 2.3. Reproduccin de la levadura La levadura se puede reproducir de dos formas diferentes: sexual y asexual. 2.3.1. Reproduccin sexual (Meiosis): En este proceso se realiza la fecundacin unindose dos clulas sexuales. Los dos ncleos de las clulas se unen formando uno, mezclndose el material gentico de los dos padres.

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De este tipo de reproduccin resultan cuatro clulas hijas, cada una con la mitad de los cromosomas iniciales (Klimovitz, 2002). 2.3.2. Reproduccin asexual (Mitosis): Se caracteriza porque sin fecundacin, un solo individuo puede producir una clula exacta (Klimovitz, 2002). Este tipo de reproduccin puede ocurrir de tres maneras: 2.3.2.1. Divisin celular: es una simple divisin de la clula formando un nuevo individuo a partir del que se esta dividiendo (bacterias y algunos tipos de levaduras) (Klimovitz, 2002). 2.3.2.2. Esporas vegetativas: la clula forma un cuerpo reproductor, que una vez afuera y en condiciones del medio adecuadas produce un nuevo organismo (bacterias y hongos) (Klimovitz, 2002). 2.3.2.3. Gemacin: es la ms importante en este caso porque es la principal forma en que se reproduce la levadura cervecera (Klimovitz, 2002). 2.3.2.3.1. Reproduccin por Gemacin La clula madre produce un pequeo brote en la pared celular, que aumenta gradualmente y se estructura poco a poco como una nueva clula de levadura (Klimovitz, 2002). Cuando la clula hija ha alcanzado el desarrollo adecuado, se separa de la clula madre por estrangulacin dejando una cicatriz en la pared celular (Klimovitz, 2002).

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Es posible llegar a tener cadenas celulares cuando una madre tiene varias formaciones de nuevas clulas al mismo tiempo y a su vez las clulas en crecimiento empiezan a ser madres de otras nuevas, sin haber terminado de separarse (Klimovitz, 2002). 2.3.2. Factores que intervienen en la reproduccin de la levadura 2.3.2.1. Oxgeno: A mayor oxigeno, entonces mayor es la velocidad de reproduccin 2.3.2.2. Temperatura: A mayor temperatura, mayor velocidad, teniendo en cuenta que la temperatura ptima de desarrollo se encuentra entre 25C y 30C 2.3.2.3. Composicin del mosto (sustrato nutritivo): debe contener los nutrientes requeridos para la formacin de la nueva clula 2.4. Floculacin de la levadura La floculacin es una propiedad fsica, donde las clulas de la levadura se adhieren unas con otras, formando grupos que rpidamente sedimentan (levaduras de fondo) o alcanzan la superficie del liquido (levaduras de superficie) (Klimovitz, 2002). Una levadura que flocule bien facilita la separacin y recoleccin de la levadura, disminuye tiempos de proceso y evita que pase excesiva cantidad de levadura a maduracin (riesgos de autolisis) (Klimovitz, 2002). Los mecanismos fsicos por medio de los cuales la levadura flocula son:

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2.4.1.

Hidrofobosidad:

la

pared

celular

presenta

caractersticas

hidrfobas (repele el agua) lo que hace que se aglomeren. Esta propiedad esta asociada a la edad de la clula (Klimovitz, 2002). 2.4.2. Potencial Zeta: Es una medida de la carga elctrica de la superficie celular. La reduccin en esta carga favorece el acercamiento celular (y por ende la floculacin). La carga superficial se afecta por el pH del medio y la presencia de sustancias buffer como los fosfatos (Klimovitz, 2002). 2.4.3. Interaccin protenas azcares: Existe una protena llamada lectina que tiene la propiedad de reconocer (atraer) sacridos como la manosa. Como la pared celular de la levadura es rica tanto en lectina como en manosa se considera factible que estos compuestos se atraigan entre si uniendo las clulas (Klimovitz, 2002). 2.4.4. Factores que influyen en la floculacin Una levadura que carezca de los factores genticos de la floculacin no podr flocular. A menor temperatura la levadura entra en un estado de latencia que activa el sistema de floculacin. A menor pH se activa la floculacin por la neutralizacin de cargas en la pared celular. Durante la fermentacin hay una cada de pH por lo que la levadura tiende a flocular al final. El calcio favorece la formacin de lectina en la pared celular y facilita la unin lectina-manosa entre las clulas de la levadura.

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La presencia de azcares (como la manosa) o de protenas tipo lectina en el mosto puede bloquear los sitios de atraccin de la pared de la clula e interrumpir la floculacin (Klimovitz, 2002). 2.5. Mutacin de la levadura Se conoce como mutacin los cambios que ocurren en la informacin gentica de la clula (DNA) inducido por factores externos y que pueden generar variaciones en el metabolismo o comportamiento celular, asociados a la fraccin de DNA alterado (Heggart, 1999). En el proceso cervecero se pueden favorecer las mutaciones por malas prcticas de manejo de la levadura cido, (condiciones externas con de almacenamiento, tratamiento contaminacin levaduras

diferentes, etc). Sin embargo nos es muy comn que se presenten mutaciones a gran escala en el proceso tpico cervecero (Heggart, 1999). 2.5.1. Mutaciones ms comunes en el proceso cervecero 2.5.1.1. Floculacin: La levadura no flocula adecuadamente (separacin difcil) 2.5.1.2. No asimilacin de la maltotriosa: genera fermentaciones frenadas 2.5.1.3. Precipitacin temprana: la levadura se precipita al fondo del tanque antes de terminar de fermentar 2.5.1.4. Respiracin deficiente: la levadura presenta deficiencias en su respiracin generando malas fermentaciones y un perfil de subproductos totalmente diferente. Se conoce como petite mutant (Klimovitz, 2002).

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2.6. Levaduras salvajes

Se considera como levadura salvaje o silvestre cualquier espcimen que no corresponda al utilizado en el proceso y que aparece como contaminante del medio o equipos de trabajo (Heggart, 1999). No todas las levaduras salvajes originan defectos en el producto, pero son indeseables ya que pueden llegar a competir con la levadura del proceso. Algunos tipos de levadura salvaje, pueden producir velos (turbidez), malos olores, sabores anormales, floculacin deficiente y fermentacin diferente. Las levaduras salvajes se pueden identificar por diferentes formas: Forma de las clulas (redondas, ovales, alargadas, etc) Tamao de la clula Forma de agrupamiento de las clulas (aisladas, cadenas, etc). Forma de reproduccin Metabolismo fermentativo.

Algunas de las levaduras salvajes ms comunes en cervecera son: Saccharomyces elipsoideus, S. turbidans, S. pastorianus, S. chevaliere. Cndida utilis, C. tropicales y C. mycodema (Heggart, 1999). 2.7. Metabolismo de los carbohidratos Las clulas de levadura necesitan una fuente de energa qumica libre para crecer, debido a que muchos de los componentes de la clula

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requieren de sta para ser sintetizados. Parte de esta energa es obtenida por el rompimiento de los azcares simples, como la glucosa, pero esto no ocurre en una forma simple y rpida; en cambio las clulas obtienen la mayora de sus requerimientos inmediatos de energa del rompimiento del ATP, en el cual los grupos fosfato pueden ser removidos por una enzima de la levadura, liberando gran cantidad de energa, sta es entonces utilizada por las enzimas para el crecimiento de la levadura. El ATP es producido en la clula de la levadura por dos mecanismos de formacin diferentes: La gluclisis y el ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs), el segundo de los cuales es mucho ms complejo y eficiente que el primero (Kandler, 1983). La gluclisis puede ser conducida aerbica y anaerbicamente; cuando es aerbica el producto final es el cido piruvco que entra al ciclo de Krebs; cuando es anaerbica el producto final es el alcohol (Kandler, 1983). 2.7.1. Gluclisis (Embden Meyerhof Parnas) La ruta glicoltica o tambin denominada Embden Meyerhof Parnas es la utilizada por Saccharomyces cerevisiae y consiste en la degradacin de los azcares presentes en un medio de cultivo para la obtencin de energa y otros intermediarios necesarios para el crecimiento de la levadura. Durante el proceso son producidos cantidades sustanciales de etanol, CO2 y calor gracias a la accin de enzimas las cuales, al interior de la clula, catalizan diversas reacciones que resultan en la produccin de dos molculas de cido pirvico, estas a su vez por la accin de la enzima piruvato descarboxilasa en condiciones anaerbicas, en dos molculas de acetaldehdo y dos de CO2 y finalmente dos molculas de etanol a partir del acetaldehdo por accin de la enzima alcohol deshidrogenasa y cuya reaccin podra resumirse as:

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Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ ------------ 2 Piruvato + 2ATP + 2NADH+ 2H++ Calor 2 piruvatos + 2NADH + 2H+ ------------------ 2 Etanol + 2CO2 + 2NAD Algo del cido pirvico producido y otros intermediarios pueden ser usados por la levadura en variedad de rutas metablicas como sustrato para la generacin de nuevas clulas, algo de glicerol es generado a partir de uno de los intermediarios de la ruta: la dihidroxiacetona, dependiendo de las condiciones, de manera que no puede desligarse el metabolismo respiratorio del fermentativo pues esta ruta metablica opera tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis generndose energa en forma de ATP y calor respectivamente. (Jacques et al, 1999).

Fuente: The alcohol textbook 3 edition page 61.

rd

Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin de la glucosa.

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Los hechos principales de la fermentacin son: 1. Activacin de la glucosa con dos molculas de ATP (reacciones 1 y 3). 2. Isomerizacin de la glucosa. 3. Rompimiento del azcar de 6 carbonos en 2 de 3 carbonos cada uno. 4. Oxidacin de los fragmentos con NAD coenzima. El NADH2 reducido es liberado dentro de la clula. La oxidacin libera ATP es entonces regenerado (etapas 6 y 9) removiendo fosfatos de los compuestos de 3 carbonos por el ADP. 5. El NADH2 reducido que se libera es oxidado, reduciendo el acetaldehdo (formado por al cido pirvico) a etanol. El NAD libre es liberado y puede ser aprovechado para la fermentacin de otro azcar. Parte del NADH2 tambin puede ser usado para formar cido lctico. El ATP producido puede ser usado como fuente de energa por la levadura. Algunos de los compuestos intermedios tambin son usados para el crecimiento de la levadura, tales como el cido pirvico pueden ser liberados de la clula de levadura a la cerveza, nuevamente el cido pirvico es un ejemplo. Cuando esto pasa, la levadura queda con un exceso de NADH2 es usado para formar glicerol a partir de la dihidroxiacetona fosfato (Harper, 2004). Despus del alcohol y CO2, el principal subproducto de la fermentacin por levadura es el glicerol. El cido pirvico durante la fermentacin es usado, en la parte, para la produccin de aminocidos y parte queda en la cerveza.

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2.7.2. Ciclo de cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs) La fermentacin va gluclisis es muy poco eficiente en la liberacin de energa y formacin de ATP, ya que alrededor del 95% de las caloras utilizables de los azcares del mosto permanece en el alcohol formado durante la fermentacin. En presencia de oxgeno, mucha ms energa aprovechable en la formacin de ATP puede ser obtenida de la glucosa (Harper, 2004). Despus de la gluclisis el cido pirvico formado pasa a travs de una serie de reacciones conocidas como el ciclo del cido ctrico. Las reacciones son mostradas en la grfica, en donde se puede observar que forman un ciclo. Al comienzo el cido oxalactico se combina con el cido actico en la forma de acetil-coenzima A. Cuando el ciclo se completa, el resultado neto es la oxidacin del cido actico a CO2 y agua; el cido oxalactico es liberado para comenzar otra vez el ciclo con otra molcula de cido actico obtenida del cido pirvico. El hidrgeno removido en las fracciones intermedias del ciclo en la forma de coenzimas reductoras puede ser oxidado en presencia de oxgeno por una serie de reacciones que generan ms ATP (Harper, 2004). Transferencia de hidrgeno o electrones del hidrgeno a travs del sistema citocromo. El resultado final es producir alrededor de 38 ATP de una molcula de glucosa. La fermentacin sin oxgeno produce slo dos ATP a partir de una molcula de glucosa.

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Fuente: Harper: Bioqumica ilustrada, 2004. Figura 3. Ciclo del cido Tricarboxlico (Krebs)

Algunos compuestos intermedios del ciclo TCA son usados por la levadura para su crecimiento. Por ejemplo, acetil-CoA y a - cetoglucano. Pequeas cantidades de algunos cidos del ciclo son liberados por la clula de la levadura y contribuyen a la acidez de la cerveza. Por ejemplo al cido succnico. Los cidos unidos a la coenzima A son muy inestables y algunas veces reaccionan para formar steres, los cuales tienen una gran influencia en el aroma de la cerveza (Harper, 2004). Las reacciones de la gluclisis ocurren dentro de la clula, en el citoplasma. Las TCA tambin ocurren dentro de ella, pero slo en una parte muy especializada en la clula, llamada mitocondria. La mitocondria puede ser formada solamente a partir de otra mitocondria algunas veces

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durante la gemacin de la levadura, una clula hija puede formarse sin mitocondrias. Cuando esto ocurre la clula hija y toda su descendencia no podrn nunca formar mitocondrias por lo tanto, crecen muy lentamente en los medios de cultivo de laboratorio, porque no pueden usar el oxigeno del aire para crecer ms eficientemente; forman slo pequeas colonias en el agar; por esta razn estas levaduras son llamadas petite verdant o respiratorias deficientes (RD). (Heggart, 1999). Las levaduras RD producen fermentaciones pobres, con poca atenuacin y tienden a liberar gran cantidad de diacetilo en la cerveza. Por esta razn las levaduras con cierto porcentaje de RD deben ser descartadas (Klimovitz, 2002). 2.8. Bacterias lcticas como contaminantes El grupo de bacterias lcticas est constituido por cocos y bacilos que comparten propiedades fisiolgicas y bioqumicas y cuyo metabolismo generador de energa es fermentativo, los sustratos fermentables son azcares que incluyen variedad de monosacridos, disacridos y polialcoholes y cuyo producto final principal es el cido lctico y en algunos casos el nico dependiendo de la ruta metablica que utilicen para convertir los carbohidratos, de ah que las bacterias lcticas pueden dividirse en dos grupos segn los productos resultantes de la fermentacin de glucosa (Jacques et al, 1999). 2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo El grupo de bacterias lcticas denominado homofermentativo produce virtualmente un nico producto de fermentacin: el cido lctico, mientras el grupo heterofermentativo produce etanol y CO2 adems de cido lctico. Dicha diferencia est determinada por la presencia o ausencia de la enzima aldolasa, una de las enzimas claves en la gliclisis; los

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heterofermentadores, carentes de aldolasa, no pueden descomponer el difosfato hexosa a fosfato triosa, en lugar de ello, oxidan la glucosa 6fosfato a 6-fosfogluconato y entonces lo decarboxilan a pentosa fosfato, la cual se transforma en triosa fosfato y acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa (Jacques et al, 1999). Esta triosa fosfato se convierte finalmente en cido lctico con la produccin neta de 1 ATP, mientras el acetilfosfato acepta electrones del NADH generado durante la produccin de pentosa fosfato y as se convierte en etanol sin produccin de ATP (Jacques et al, 1999). Debido a esto, los heterofermentadores producen slo un mol de ATP a partir de glucosa a diferencia de los homofermentadores que producen dos moles de ATP igualmente a partir de glucosa (Jacques et al, 1999).

Fuente: modify of carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria, 1983. Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas.

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Estas rutas para el metabolismo de carbohidratos llevadas a cabo por las bacterias acido lcticas pueden igualmente dividir este grupo en tres clases: homofermentativos obligados, heterfermentativos facultativos y heterofermentativos obligados, las especies de homofermentativos obligados el nico producto final a partir de hexosas es el cido lctico y la va glicoltica es la nica utilizada, las especies de este grupo producen la enzima aldolasa pero no producen la fosfocetolasa, lo cual las inhabilita para fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999). Las especies de heterofermentativos facultativos poseen las dos enzimas aldolasa y fosfocetolasa inducible, pues logran fermentar pentosas y gluconato slo bajo ciertas condiciones pues la ruta de a fosfocetolasa es inhibida en presencia de glucosa. (Jacques et al, 1999) y finalmente, las especies lcticas heterofermentativas obligadas generan una mezcla de productos finales bajo condiciones normales usando cualquiera de las vas metablicas; estos productos finales incluyen cido lctico, cido actico, etanol y CO2 as como pequeas cantidades de cidos frmico y succnico, estos organismos excepto algunas cepas especficas, pueden fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999). 2.8.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y

subproductos Las necesidades nutricionales de las bacterias lcticas son muy similares a las de las levaduras convirtindose as en sus principales antagonistas por nutrientes esenciales y factores de crecimiento que algunas veces estn presentes en cantidades limitadas en los sustratos de fermentacin, as como que son capaces de metabolizar las mismas fuentes de carbono para realizar su tipo de fermentacin (Jacques et al, 1999).

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2.8.2.1. Nitrgeno: varios aminocidos y vitaminas son necesarias para el crecimiento de cido lcticas, algunas homofermentativas y heterofermentativas poseen enzimas proteasas y pueden degradar las protenas en formas asimilables de nitrgeno, sin embargo esta caracterstica no es general y la mayora de ellas toman el nitrgeno necesario del medio de cultivo en el que se hallen, de manera que en este sentido son fuertemente competitivas frente a las levaduras en sistemas de fermentacin (Bely et al, 2003). 2.8.2.2. Oxgeno: las bacterias lcticas se han descrito como anaerobias, sin embargo se ha demostrado que prefieren ambientes microaeroflicos y pueden sobrevivir en ambientes donde el oxgeno est completamente ausente, manejando una tasa de crecimiento baja (Oliveira, 1999). Este tipo bacteriano carece de las enzimas catalasa y superoxido dismutasa, las cuales son usadas por bacterias aerbicas para convertir compuestos txicos: el perxido de hidrgeno y el superxido respectivamente, ambos formados durante sus procesos respiratorios (Jacques et al, 1999). Saccharomyces cerevisiae produce catalasa y crece adecuadamente bajo condiciones aerbicas, con el oxigeno como requerimiento principal en los primeros estados de la fermentacin por lo que se constituye en otra ventaja competitiva de las bacterias lcticas bajo condiciones anaerobias en la fermentacin de la levadura. (Jacques et al, 1999). 2.8.2.3. Subproductos que pueden afectar la calidad del producto La produccin de algunos compuestos por bacterias contaminantes contribuye a la disminucin de la calidad del producto final de la fermentacin as como el desarrollo mismo del proceso pues el microorganismo fermentador puede ver afectada su fisiologa por la

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presencia de sustancias extraas y/o en altas cantidades (Jacques et al, 1999). Los cidos lctico y actico son productos que afectan notablemente las caractersticas organolpticas del producto (etanol), pues se producen a partir de l, as como la acrolena y el diacetil, una cetona que puede producirse durante la fermentacin cuando el piruvato es convertido a cido lctico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus son los responsables de dicha produccin, no obstante, las levaduras producen diacetil durante los primeros estados de la fermentacin pero este es removido por la accin de varias enzimas y por la presencia de algunos aminocidos en el medio (Jacques et al, 1999). 2.9. Factores que afectan el rendimiento de alcohol Un gran nmero de factores pueden reducir el rendimiento de alcohol y disminuir la productividad de la planta, estos factores pueden ser reducidos o eliminados para minimizar las perdidas de sustrato y maximizar las ganancias en trminos de producto (Oliveira, 1999).

2.9.1. Cambios de pH durante la fermentacin El pH de la cerveza vara entre 3.9 4.5; en parte se debe a las diferencias en los mostos, pero tambin a las diferencias en la fermentacin. Por ejemplo, un mosto dado produce una cerveza con pH 4.4 cuando se fermenta con levadura de produccin normal y puede producir cervezas con pH 3.9 cuando se fermenta con levadura recin salida del propagador (Klimovitz, 2002). El pH cae rpidamente en las primeras etapas de la fermentacin, lo que significa que se presenta incremento en la concentracin de iones H+ o acidez.

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2.9.1.2. Absorcin de bases por la levadura La remocin de bases o lcalis del mosto puede hacer que est se vuelva ms cido. Por muchos aos, se asumi que la levadura usa los iones fosfato bsicos H2PO42 como fuente de fosfatos para el crecimiento, y que la perdida de sta base causa el descenso del pH durante la fermentacin (Klimovitz, 2002). Sin embargo se ha demostrado que la levadura usa slo el ion H2SO4- el cual es ligeramente bsico. Por lo tanto, el uso de los fosfatos produce solamente alrededor del 10% del aumento de la acidez durante la fermentacin (Klimovitz, 2002). Los aminocidos bsicos son usados por la levadura y la prdida de stos produce un 30% del cambio de acidez.

2.9.2. Produccin de cidos El CO2 producido durante la fermentacin es dbilmente cido. Esto produce un 10% del cambio de acidez. Los cidos orgnicos, especialmente el succnico, lctico, pirvico y mlico producidos por la levadura, producen otro porcentaje del cambio de acidez durante la fermentacin. La levadura puede excretar algunos iones H+ directamente a la cerveza pero esto no ha sido demostrado an (Klimovitz, 2002). Ya que la malta es la fuente de compuestos bsicos como los iones fosfato y los aminocidos, el contenido de malta tambin influye en el pH de la cerveza. A mayor cantidad de malta, mayor cantidad de compuestos

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bsicos presentes al comienzo de la fermentacin y mayor el pH de la cerveza (Klimovitz, 2002). 2.9.3. Floculacin de la levadura Al finalizar la fermentacin, las clulas de levadura forman agrupaciones probablemente hasta de 100 clulas; la levadura S. cerevisiae atrapa burbujas de CO2 y flota. El que la levadura por s misma, se remueva del mosto fermentado despus de que ha cumplido a cabalidad su funcin metablica, es una de las principales caractersticas deseables en la levadura cervecera; a esta caracterstica se le designa con el nombre de floculacin (Klimovitz, 2002). Existen muchas definiciones de floculacin de la levadura pero una de las ms aceptadas dice: Floculacin es el fenmeno por medio del cual las clulas de levadura se adhieren en grumos y sedimentan rpidamente del medio en el cual se encuentran suspendidas (Klimovitz, 2002). Las caractersticas de floculacin de un cultivo puro de levadura en particular, es una de las propiedades ms importantes que se tiene en cuenta al seleccionar una cepa de lavadura para propsitos cerveceros (Klimovitz, 2002). Los factores que influyen en la floculacin de la levadura son: 1. Caractersticas genticas de la levadura. 2. La presencia de iones Ca++ en solucin; la cantidad requerida vara de acuerdo con la cepa. Algunos investigadores han encontrado que otros iones divalentes tales como Mg y Mn pueden, aparentemente ejercer la accin del calcio. 3. La temperatura. 4. Cantidad de glucgeno almacenado en la clula.

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5. El contenido de fsforo mananos, los cuales se han encontrado en la pared exterior de la clula de levadura al final de la fermentacin, pero durante la fermentacin no. Una teora dice que existe atraccin electrosttica entre las cargas negativas del fosfato y las positivas del calcio, ocasionando la agrupacin de las clulas (Hornsey, 2003) 2.10. Proceso de elaboracin de la cerveza La cerveza, al igual que otras bebidas similares producidas con cereales, es sometida a fermentacin pero no a destilacin. Las materias primas que intervienen en el proceso son agua, lpulo y cebada, suplida a veces por el maz, el arroz o el azcar (Hough, 1990). 2.10.1. Molienda

Tanto la malta como los cereales sin maltear (trigo, avena, centeno, maz, arroz), tienen que pasar por el molino que rompe el grano, dando lugar a la harina y otras partes fijas (Hornsey, 2003).

La molienda consiste en destruir el grano, respetando la cscara o envoltura y provocando la pulverizacin de la harina. La malta es comprimida entre dos cilindros pero evitando destruir la cscara lo menos posible, pues sta servir de lecho filtrante en la operacin de filtracin del mosto; a su vez el interior del grano en una harina lo ms fina posible. Estas dos condiciones, cscara entera y harina fina no podrn respetarse si el grano no est seco (excepcin molienda hmeda) y muy bien desagregado, una tercera exigencia es un buen calibrado de la malta. La molienda debe ser tambin regulada segn el cocimiento posterior (Hornsey, 2003).

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2.10.2. Proceso en Pailas En esta parte del proceso se extraen de la malta y eventualmente de los granos crudos la mayor cantidad de extracto y de la mejor calidad posible en funcin al tipo de cerveza que se busca fabricar. La extraccin se logra principalmente por hidrlisis enzimtica, solamente un 10% de la extraccin es debida a una simple disolucin qumica. Las amilasas desdoblan el almidn en dextrinas y maltosa, principalmente las enzimas proteolticas desdoblan las protenas complejas en materias nitrogenadas solubles, la fitasa desdobla la fitina en inositol y fosfato, etc. Estas transformaciones enzimticas han sido ya empezadas durante el malteado a un ritmo menos intenso del que suceder en el cocimiento; donde debido a la accin de las diferentes temperaturas y la gran cantidad de agua las reacciones suceden muchas veces en forma explosiva (Hough, 1990). Cuantitativamente el desdoblamiento del almidn en azcares y dextrinas es el ms importante. Las principales reacciones que ocurren durante el cocimiento por accin de las amilasas son formacin de dextrinas, formacin de maltosa y en menor proporcin formacin de glucosa (Hough, 1990). 2.10.3. Filtracin del Mosto Una vez disueltas las materias solubles por el cocimiento es necesario separar el mosto de la parte insoluble llamada orujo o afrecho. La operacin se realiza en dos fases: primero el flujo del mosto y luego la operacin de lavado del extracto que contiene el afrecho (Verstrepen, 2003). El mosto y el agua de lavado deben ser claros pues si se aporta durante la operacin demasiadas sustancias mal disueltas, la clarificacin de la cerveza ser demasiado difcil. La calidad de la cerveza puede ser tambin alterada por un lavado de afrecho con agua alcalina pues los polifenoles y sustancias amargas de la cscara de la malta se disuelven

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muy fcilmente en agua alcalina an ms si se tiene en cuenta que el lavado se hace en agua a una temperatura mxima de 75 C; sta no puede exceder ese lmite, pues se corre el riesgo de disolver almidn presente an en el afrecho, lo que conllevara a problemas de turbiedad y fermentacin posteriores (Verstrepen, 2003). 2.10.4. Ebullicin del Mosto La finalidad de la ebullicin es estabilizar enzimtica y

microbiolgicamente el mosto, buscar la coagulacin de las protenas. La destruccin de las enzimas es realizada para evitar que sigan desdoblando a lo largo de la fermentacin, las amilasas podran seguir desdoblando las dextrinas y stas se transformaran enteramente en alcohol (Hornsey, 2003). La esterilizacin del mosto es obtenida por simple ebullicin, pues su reaccin es ligeramente cida. La coagulacin de las materias protenicas debe hacerse lo mejor posible, pues si subsisten en el mosto ocasionaran problemas en la fermentacin, provocando fcilmente turbiedad en la cerveza embotellada. La esterilizacin y la destruccin de las enzimas es fcil de realizar, un cuarto de hora de ebullicin es generalmente suficiente (Hornsey, 2003).

La coagulacin de protenas es mucho ms difcil, se realiza por etapas, la primera es la desnaturalizacin que consiste en la ruptura de puentes de hidrgeno en la molcula de protena, pasando del estado hidratado al deshidratado, mantenindose en suspensin nicamente por su carga elctrica; luego de la desnaturalizacin se produce la coagulacin propiamente dicha por agrupacin de micelios deshidratados; es aqu donde el pH juega un papel muy importante, pues la coagulacin ser eficiente si se realiza en el punto isoelctrico; como existen muchas protenas en el mosto se ha optado por el pH 5.3 como el ms conveniente (Hornsey, 2003). Durante la ebullicin, la coloracin tambin aumenta sobre todo por la formacin de melanoidinas, tambin

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por oxidacin de taninos, estas dos reacciones son favorecidas por el pH elevado. Por ltimo a lo largo de la ebullicin se forman productos reductores que contribuyen a la calidad y estabilidad de cerveza (Hornsey, 2003).

El lupulado del mosto se realiza tradicionalmente durante esta operacin, es decir, en la paila de ebullicin. El amargor es obtenido por isomerizacin de los cidos y del lpulo; esta isomerizacin es incompleta debido principalmente al pH del mosto, el pH ptimo de isomerizacin es de 9. Existen muchas lupulonas y humulonas en el lpulo; cada uno de estos compuestos donar su ismero respectivo; el conjunto es conocido como isohumulonas pues son esencialmente quienes donan el amargor deseado (Verstrepen, 2003). 2.10.5. Enfriamiento del Mosto El mosto obtenido por sacarificacin de la malta o de los adjuntos y por protelisis de las protenas de la malta, es llevado a ebullicin durante hora y media con el lpulo para otorgarle el amargo, a lo largo de esta ebullicin la esterilizacin completa es obtenida gracias al pH que oscila alrededor de 5.3 (Hough, 1990). Los precipitados proteicos son eliminados por sedimentacin, filtracin o centrifugacin; el mosto es enseguida enfriado a la temperatura de inoculacin de la levadura, esta temperatura depende del tipo de levadura empleada y del tipo de cerveza a fabricar entre 6 a 20C (Hough, 1990). Durante el enfriamiento un nuevo precipitado de polifenoles-protenas se forma, por un lado por enlaces de hidrgeno y tambin por la falta de solubilidad de las prolaminas. La presencia de este nuevo precipitado juega un rol esencial sobre la formacin de H2S por la levadura (Verstrepen, 2003). El mosto enfriado, en principio estril, debe ser aireado antes del inicio de la fermentacin, de no ser aireado la tasa de mortalidad de la levadura aumentara a tal punto que sta no podra ser reutilizada; la oxigenacin

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del mosto antes del inicio de la fermentacin permite a la levadura sintetizar cidos grasos insaturados (olecos, linolecos, y linolnicos), en ausencia de estos cidos grasos la pared celular esta sujeta a alteraciones lo cual lo hace ms permeable a los steres correspondientes a los alcoholes superiores que ella misma forma (Klimovitz, 2002). La composicin del mosto es muy variable en funcin al tipo de cerveza fabricada, su densidad puede variar entre 2 a 20 grados Plato (P), es decir que puede contener de 2 a 20g de soluto por 100g de lquido; a su vez puede ser rico o no en aminocidos y pptidos en funcin de la importancia de la protelisis y de la proporcin de adjuntos utilizados (Klimovitz, 2002). La relacin maltosa/dextrinas es igualmente variable de acuerdo al mtodo de cocimiento escogido. De manera general se puede decir que el mosto es un medio incompleto, normalmente carente de aminocidos y cidos grasos insaturados pues es imposible obtener un crecimiento rpido y completo de levadura; cosa que no sucede si se tratara de un medio sinttico a base de extractos de levadura (Klimovitz, 2002). 2.10.6. Fermentacin Hasta esta etapa se ha preparado un lquido complejo y se ha purificado cuidadosamente hasta el momento de agregar la levadura cervecera para producir su fermentacin (Hornsey, 2003). Inicialmente, se agrega al mosto fro, levadura en una cantidad calculada, para que quede en el mosto de 8 a 10 millones de clulas por cc. Para la fermentacin de mosto concentrado, se usa un milln de clulas por cc por cada grado plato del mosto (Hornsey, 2003). La cantidad de levadura previamente determinada se diluye en el mosto y luego se inyecta a la lnea de mosto fro durante el enfriamiento. La cantidad total de levadura

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que se inyecta se calcula teniendo el cuenta el volumen de mosto que va contener la tina de fermentacin (Hornsey, 2003). La temperatura inicial de fermentacin puede variar entre 6 a 10 C. Una vez que se inicia la fermentacin se aprecian como cambios notorios, el descenso del extracto, la produccin de gas carbnico y el desprendimiento de calor; durante la fermentacin se controla el descenso de la densidad regulando la temperatura con atemperadores (serpentines o chaquetas), por los cuales circula agua fra o salmuera o agua glicolada a temperaturas que oscilan entre 1 a 2 C para el caso del agua y de -5 a -10 C para el caso de la salmuera o el agua glicolada (Xiao, 2004). Para recolectar el gas carbnico que se desprende de la fermentacin, comnmente el tanque est conectado por la parte superior con dos tuberas; una que va a la intemperie y la otra que va a la planta de purificacin de gas carbnico. En la planta de gas carbnico, ste es purificado y licuado con el fin de inyectarlo posteriormente a la cerveza (Hornsey, 2003). Cuando se alcanza el extracto lmite o sea hasta donde se le va a dejar fermentar se abre el fro para conseguir enfriar la cerveza y para que la levadura se alimente (Xiao, 2004). Se consigue enfriar la cerveza hasta 5 C y se suspende el envi de gas carbnico a la planta, luego se bombea la cerveza a los tanques de maduracin y se recupera la levadura (Hornsey, 2003). A la cantidad de levadura obtenida en cada fermentacin se le denomina cosecha de levadura, lo normal es obtener 4 veces la cantidad de levadura agregada (Hornsey, 2003). Al final de esta cuando los azucares han sido transformados hasta alcohol y gas carbnico se tendr la cerveza. Despus de la fermentacin la

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cerveza es separada de la levadura, la cual puede ser utilizada para fermentar ms mosto, posteriormente. La fermentacin juega un rol esencial en la calidad de la cerveza, en particular gracias a los productos secundarios como los alcoholes superiores y steres; es tambin la etapa de la fabricacin ms difcil de controlar (Xiao, 2004). La levadura que es reutilizada de una fermentacin a otra no tiene un metabolismo estable; sta se va degenerando. 2.10.6.1. Principales transformaciones que tiene lugar fermentacin 2.10.6.1.2. Consumo de oxgeno Durante la fermentacin, se distinguen dos procesos muy diferentes en el metabolismo de la levadura. El primero de ellos es el proceso de crecimiento o multiplicacin celular, el cual es caracterizado por un incremento en el nmero de clulas. El segundo es el proceso del extracto, es decir, consumo del extracto y formacin de alcohol (Klimovitz, 2002). Despus de que la clula se ha adaptado a la presin osmtica del mosto y los nutrientes han permeado hacia el interior de ella, comienza el proceso de crecimiento. La multiplicacin requiere energa, est es proporcionada por los azcares que son metabolizados por una larga cadena de reacciones enzimticas. Primero que todo, la energa producida por estas reacciones es usada para el principal propsito de la vida; la multiplicacin (Klimovitz, 2002). Para obtener una buena multiplicacin celular, el mosto debe ser aireado. Es bien sabido que el oxgeno juega un papel muy importante en el crecimiento celular o mejor, en la formacin de la membrana celular. La membrana celular est compuesta fundamentalmente por protenas, carbohidratos y materiales grasos, de los cuales los ms importantes son durante la

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los esteroles y los glicridos; los glicridos son compuestos en los que el glicerol est unido a cidos grasos, algunos de ellos insaturados (Klimovitz, 2002). La sntesis de los esteroles y de los cidos grasos insaturados son dos de las pocas reacciones en el metabolismo de la levadura, que requieren oxgeno molecular (Klimovitz, 2002). La energa producida a partir de los carbohidratos es acumulada en forma de ATP; ste puede ser utilizado en la formacin de acetil-CoA (Coenzima A) la cual reacciona de muchas formas diferentes. Durante la etapa de crecimiento la clula de levadura utiliza este compuesto activo para la sntesis de esteroles y de cidos grasos insaturados, consumiendo el oxgeno; consecuentemente, la cantidad de oxgeno proporcionado al mosto con la aireacin es decisiva para la multiplicacin celular. Cuando el oxgeno ha sido consumido, cesa la sntesis de esteroles y cidos grasos y por lo tanto la acetil-CoA puede ser utilizada en otras reacciones (Klimovitz, 2002). Muchos investigadores han asociado con el metabolismo de los lpidos en la levadura, la formacin durante la fermentacin, de los steres encontrados en la cerveza, los cuales constituyen un grupo importante entre los compuestos voltiles de la cerveza debido a su fuerte y penetrante aroma a frutas (Heggart, 1999). Los steres son formados por la combinacin de un cido orgnico y un alcohol con la prdida de agua. Los steres encontrados en cerveza son normalmente steres del cido actico. La formacin de steres requiere energa, no es una reaccin espontnea. El acetato activo o acetil-CoA, que es formado en la levadura por el cido pirvico, es un compuesto de alta energa (Verstrepen, 2003).

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El cido actico unido a la coenzima es inestable y puede fcilmente separarse a cido actico libre, que en presencia del alcohol puede formar el correspondiente acetato, utilizando la energa del acetil-CoA (Harper, 2004). Otros cidos como el pirvico, que tambin son formados durante la fermentacin, no forman steres muy fcilmente debido a que no se encuentran unidos a coenzimas en enlaces de alta energa (Harper, 2004). El cido succnico se encuentra unido a la coenzima A y los cidos son elaborados por la levadura a partir de sus enlaces con la coenzima A, as que los steres de estos cidos se encuentran en la cerveza pero a muy bajas concentraciones. La mayor parte del aroma de la cerveza se debe a acetatos (Verstrepen, 2003). La acetilCoenzima A participa en una variedad de reacciones metablicas, entre las cuales se destacan su oxidacin cclica por la va del TCA y su papel en la formacin de las unidades fundamentales para la sntesis de los cidos grasos (Harper, 2004). La produccin de steres est influenciado por cualquier factor que afecte tanto la biosntesis como el consumo de acetil Coenzima A.

2.10.7. Maduracin Es la etapa siguiente a la fermentacin y comprende todo el tiempo que dure la cerveza en los tanques a baja temperatura antes de ser filtrada. Comnmente se divide en dos etapas que son reposo y acabado, entre el reposo y el acabado puede haber una prefiltracin, pre-enfriamiento y precarbonatacin (Klimovitz, 2002).

47

La maduracin se puede hacer: 2.10.7.1. Dos etapas Reposo y acabado y durante el reposo hacer una segunda fermentacin, en el paso de reposo a acabado la temperatura es de 2 a 3 C y en acabado se puede enfriar a -1 C (Klimovitz, 2002). 2.10.7.2. Fermentar hasta el extracto lmite Este sistema es americano y en el paso de fermentacin a reposo se efecta el enfriamiento y entre reposo y acabado, pre-carbonatacin, prefiltracin y pre-enfriamiento y durante la filtracin final se hace tambin enfriamiento (Klimovitz, 2002). Los objetivos de la maduracin consisten en acumular o almacenar cerveza, dejar sedimentar en forma natural la materia amorfa y la levadura que an tiene la cerveza, refinacin del sabor por eliminacin de las sustancias voltiles que causan el sabor verde, separacin por precipitacin de los compuestos que se forman al ser enfriada la cerveza, es muy importante considerar que la cerveza se enturbia al ser enfriada despus de haber sido filtrada, otro de los objetivos es completar la atenuacin lmite que no ha sido alcanzada en la fermentacin y tambin se busca carbonatar la cerveza (Klimovitz, 2002). Al recibir la cerveza en un tanque de maduracin es necesario contrapresionar para evitar la salida de gas y la formacin de espuma. Es un factor que puede contribuir a la deficiencia de espuma. Durante la maduracin la cerveza debe mantenerse bajo presin de 0.3 a 0.5 atmsferas para evitar la oxidacin y facilitar la clarificacin (la levadura con presin tiende a sedimentarse y ms con fro) y se evita el exceso de

48

purga. Al recibo la contrapresin puede ser con aire o con gas carbnico. Despus se deja bajar la presin con el objeto de efectuar purga y eliminar aire en la parte vaca del tanque. Luego se cierra y se sostiene algo de presin porque de lo contrario, se dara una eliminacin de muchas sustancias voltiles y se afecta el aroma de la cerveza. El tanque no se llena completamente (Klimovitz, 2002). Si la maduracin es muy larga o prolongada el sabor se suaviza demasiado, pierde cuerpo, pierde amargo y queda muy simple. Con respecto a la temperatura de cerveza en maduracin se especifica entre -2 y 0 C si se hace segunda maduracin se pasa a la etapa de reposo de 2 a 3C y cuando se pasa al acabado se enfra a -2C. Si es mayor de 0C puede presentarse autlisis de la levadura que pasa a maduracin afectando el sabor, se presentan coagulaciones de las sustancias que precipitan en fro (proteosas o peptonas - taninos) y por tanto se obtienen cervezas qumicamente inestables, tambin por esta temperatura alta no se obtiene una buena clarificacin y por lo tanto cervezas muy turbias al final de la maduracin que causan problemas en la filtracin. Al subir la temperatura se puede aumentar el efecto de la oxidacin (Heggart, 1999). En referencia al tiempo de la maduracin cuando se hace en una sola etapa se deja de 2 a 3 semanas. Cuando es en dos etapas el tiempo de la primera etapa dura comnmente 2 semanas y el tiempo de acabado o segunda etapa dura aproximadamente una semana. La produccin debe ser programada de tal manera que la cerveza tenga una maduracin uniforme (Klimovitz, 2002). Si el tiempo es corto menos de 15 das es posible que se obtenga un mal sabor, no precipiten las sustancias que causan estabilidad qumica deficiente, no se clarifique bien la cerveza originando problemas de filtracin (Klimovitz, 2002).

49

Al final de la maduracin como se va a llevar a cabo una filtracin y por lo tanto una eliminacin de la levadura se tendr que proteger la cerveza agregndole antioxidantes para que se combinen con el oxgeno y evitar que se combine con la cerveza pudindose emplear cido ascrbico o bisulfito de sodio o potasio y para mejorar la clarificacin de la cerveza se emplean clarificantes que pueden ser gelatina, viruta y una mezcla de bentonita con cido tnico (Heggart, 1999). La clarificacin normal de la cerveza en maduracin es afectada por maltas muy frescas sin el debido tiempo de reposo, temperaturas altas en maduracin, alto extracto fermentable residual, poco tiempo de maduracin, falta de presin positiva en los tanques de maduracin y tambin por maltas mal modificadas o con un alto contenido de beta glucanos (Heggart, 1999). 2.10.8. Filtracin Despus de la maduracin y antes del embotellamiento, la cerveza pasa de nuevo por una filtracin con tierra diatomcea que elimina los ltimos restos que puedan quedar de la fermentacin y tambin los restos de nitrgeno que durante la maduracin han formado una especie de mucosa, lo que podra provocar ms adelante que la cerveza saliera turbia (Hornsey, 2003).

2.10.9. Envasado

Antes de llevar la cerveza a la mquina de llenado se inyecta CO2 en los tanques hasta conseguir la saturacin deseada, para que la cerveza salga de su recipiente con una buena capa de espuma (Hornsey, 2003).

Para alargar el tiempo de conservacin de una cerveza, sin que cambie de aspecto, se esteriliza por medio de la pasteurizacin despus del envasado (las botellas pasan por un tnel con agua a 70C), o con una

50

pasteurizacin flash antes de envasar (durante el recorrido del tanque a la cadena de envasado la cerveza se calienta hasta 65 C) (Hornsey, 2003).

51

3. JUSTIFICACIN La calidad de la cerveza en el sentido ms amplio, es la suma de todas aquellas caractersticas que le permiten a un producto llenar los requisitos del mercado y atraer a los consumidores para quienes est dirigido; la calidad tambin es usada para denotar la ausencia de defectos y, mientras que el trmino se aplica tanto al empaque como al proceso de elaboracin del producto, slo este ltimo aspecto ser evaluado en este proyecto. Las cerveceras generan y recolectan grandes cantidades de informacin con respecto a caractersticas especficas de la produccin de la cerveza tanto en producto en proceso como en el producto terminado, la cual requiere ser analizada de una manera confiable para que se constituya en una herramienta bsica para el control de su proceso. Considerando esto, se hace importante la necesidad de conocer el comportamiento microbiolgico de la cerveza, en cada una de sus etapas de produccin, para que al obtener los datos, dicha informacin contribuya a mejorar la calidad, consistencia del producto y confiabilidad del proceso que se lleva a cabo, para establecer finalmente que los anlisis realizados son precisos y repetibles, que estn utilizando los controles proceso adecuados, para que los cerveceros puedan centrar su atencin en la administracin y mejora continua del proceso.

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4. OBJETIVOS DEL PROYECTO

4.1. Objetivo general Evaluar la calidad microbiolgica del producto en proceso en una planta productora de bebidas alcohlicas.

4.2. Objetivos especficos Determinar el nmero de clulas de levadura en los tanques de fermentacin y maduracin durante el proceso de elaboracin del producto mediante el recuento en cmara de Neubauer Determinar la presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no Saccharomyces en los procesos de fermentacin y maduracin. Evaluar la presencia de mutantes de levaduras del proceso (Respiracin Deficiente (RD) y Variants) Determinar la presencia de bacterias contaminantes del proceso: coliformes y cido lcticas.

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5. MATERIALES Y MTODOS 5.1. Tipo de estudio Esta investigacin se realiz de manera experimental y se valor la calidad microbiolgica del producto en proceso, para esto se realiz la toma de muestras en cada una de las etapas de produccin de la cerveza Figura 5. Se determin que aunque existen puntos del proceso donde se pueda presentar contaminacin por factores externos a los de la produccin propiamente dicha, estos no afectan la calidad del producto terminado.

Figura 5. Proceso Cervecero

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El manejo de las muestras se realiz, utilizando material estril (botellas biolgicas y Frascos Shoot) y su almacenamiento previo a la siembra se llev a cabo bajo condiciones de refrigeracin para evitar cualquier foco de contaminacin evaluadas. ajeno al proceso de las muestras que fueron

Figura 6. Material para toma de muestras

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Los resultados obtenidos durante todo el proceso de investigacin, fueron consignados en el formato previamente establecido por la Empresa (Anexo 1).

5.2. Anlisis Microbiolgicos del proceso

ANLISIS MICROBIOLGICOS MAC RAKA MYGP CONKEY WLN WLD RAY SDM LISINA TTC FRECUENCIA 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 1ml 0.2ml 0.2ml 1ml 1ml 100ml 100ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml v 0.2ml v 0.2ml v 20ml 20ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 250ml 250ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml X X X Diario Diario Diario Diario C/Propagac. Diario Semanal Semanal Semanal Semanal

MUESTRAS Chase Water (Agua de Empuje) Mosto Fermentaciones 24 96 H Maduraciones 4 6 das Propagacin en cada etapa BBT Sifn Agua Desairada Tanques y Torres Acueducto Tierra Diatomcea

PCA 1ml 1ml

Tabla 2. Anlisis Microbiolgicos

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5.3. pH de medios de cultivo, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin

T Incubacin 25C 25C 25C 25C 25C 30C 44C 30C 44C 25C 25C Tiempo Incubacin 5 das 5 das 7 das 7 das 7 das 4 das 48 Horas 48 Horas 48 Horas 4 das 5 das Mtodo de Incubacin Aerobio Aerobio Anaerobio Aerobio Aerobio Aerobio Aerobio Aerobio Aerobio Aerobio Aerobio

Medio WLN WLD

pH 5.5 - 5.8 5.5 - 5.8

Comentario Leer a los 3 das y si esta negativo incubar 2 das ms Leer a los 3 das y si esta negativo incubar 2 das ms -------------------Leer a los 5 das y si esta negativo incubar 2 das ms Leer a los 5 das y si esta negativo incubar 2 das ms Leer a las 48 Horas y si esta negativo incubar 2 das ms - - - - - - - - - -- - - - - - - -----------------------------------------------------------------------

Microorganismo Levaduras/hongos /bacterias Bacterias Mic.cido lcticos Lev Salvaje no Saccharomyces Levadura salvaje Bacterias Bacterias Termotolerantes Coliformes Coliformes Termotolerantes RD (petite mutans) Variants (verdants)

Raka Ray 5.4 0.2 Lisina SDM PCA PCA Agar Mac Conkey Agar Mac Conkey** MYGP WLN 7.1 0.2 5.0 - 6.0 5.5 - 5.8 7.1 0.2 4.8 0.2 * ----7.0 0.2 7.0 0.2

Tabla 3. pH, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin * pH despus de adicionar el cido lctico ** El manual de Oxoid recomienda no incubar ms de 48 Horas el agar Mac Conkey ya que puede dar resultados confusos. (Sept. 27 de 2006) 5.4. Tcnicas Empleadas 5.4.1. Siembra en Placa Para el aislamiento e identificacin de los diferentes microorganismos que pueden crecer en los medios de cultivo mencionados anteriormente, se

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utiliza la tcnica de siembra en superficie, donde se inocula 0,2 ml de la muestra a evaluar y se lleva a cabo la homogenizacin de sta utilizando la esptula de Digralski. Para llevar a cabo la siembra en el medio Plate count agar, se utiliza la siembra en profundidad, donde se inocula 1 ml de la muestra y posteriormente se adiciona el medio de cultivo lquido a una temperatura adecuada para evitar la muerte de los microorganismos o inhibicin de los microorganismos, la homogenizacin se realiza de manera manual haciendo suaves movimientos giratorios de la caja de petri. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin adecuado para cada medio de cultivo, se realiza el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC); Estos recuentos dan la pauta de la cantidad de microorganismos presentes en una muestra, como tambin el grado de contaminacin o concentracin de microorganismos, en productos industriales (Escobar, 2002). 5.4.2. Filtracin por membrana La filtracin por membrana se ha convertido en una parte importante de la tecnologa de la separacin en los ltimos decenios. Su importancia radica en el hecho de que trabaja sin la adicin de productos qumicos y conducciones de proceso fciles y bien dispuestas. La membrana funciona como una pared de separacin selectiva. Ciertas sustancias pueden atravesar la membrana, mientras que otras quedan atrapadas en ella. Es un proceso de bajo coste energtico. La mayor parte de la energa requerida es la necesaria para bombear los lquidos a travs de la membrana. Al llevar a cabo el recuento de las UFC slo deben ser contadas las colonias que se han formado en la membrana y dicho nmero se divide por el volumen filtrado.

58

5.4.3. Recuento en cmara de Neubauer 5.4.3.1. Levadura en Proceso de Fermentacin y Maduracin 1. Mezclar vigorosamente la muestra a analizar. 2. Tomar 1 ml de muestra utilizando una pipeta graduada y verter en tubo falcon de 10 ml. 3. Adicionar 9 ml de cido actico al 10% (nicamente para las muestras de fermentacin) 4. Se mezcla nuevamente la muestra utilizando el vortex. 5. Montar la muestra en la cmara y realizar el recuento en el cuadrante del centro 6. El recuento de clulas obtenidas se multiplica por los 5 cuadrantes donde se llev a cabo el conteo, por el factor de la cmara 104 y por el factor de dilucin utilizado 101.

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6. RESULTADOS

Los datos utilizados para la construccin de las tablas que aparecen en este captulo, salvo que se indique lo contrario en el texto, son los datos promedio de la totalidad de los resultados obtenidos durante el tiempo en el cual se evalu la calidad microbiolgica de cada una de las etapas de produccin.

Parmetro Acueducto (Enero) Acueducto (Febrero) Acueducto (Marzo) Acueducto (Abril) Acueducto (Mayo)

N Muestras analizadas

PCA UFC/ml

Mac Conkey UFC/100cm3

% DE

5 5 5 5 5

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

100% 100% 100% 100% 100%

Tabla 4. Agua Acueducto de Cali

Parmetro Enjuague tanque 101 Enjuague tanque 102 Enjuague tanque 103 Enjuague tanque 104 Enjuague tanque 105 Enjuague tanque 106 Enjuague tanque 107 Enjuague tanque 108 Enjuague

N Muestras analizadas

PCA UFC/ml

WLN UFC/ml

WLD % DE UFC/ml

20 20 20 (1) 20 20 (1) 20 20 20 20

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 40 0 5 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

100% 100% 80% 100% 95% 100% 100% 100% 100%

60

tanque 109 Enjuague tanque 110 Enjuague tanque 401 Enjuague tanque 402 Enjuague tanque 403 Enjuague tanque 404 Enjuague tanque 408 Enjuague tanque 409 Enjuague tanque 410 Enjuague tanque 411 Enjuague tanque 412 Enjuague tanque 1 Enjuague tanque 2 Enjuague tanque 3 Enjuague tanque 4 Enjuague tanque 5

20 (1) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

90% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Tabla 5. Enjuagues de Tanques [fermentacin (101 110), Maduracin (401 412) y Filtracin (1 - 5)]

Figura 7. Enjuague Tanque 103

61

Parmetro Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto Agua de empuje Mosto

N Cocimiento

N Muestras analizadas

PCA UFC/ml

WLN UFC/ml

WLD UFC/ml

Mac Conkey UFC/ml

% DE

1-5 3 8 - 12 9 16 - 20 19 24 - 28 25 32 - 36 34 40 44 42 48 52 50 56 60 60 64 - 68 66 72 76 73 80 - 84

5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0

0 NA 0 NA NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0 NA 0

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Tabla 6. Agua de Empuje y Mosto

62

Parmetro Propagacin A Propagacin A Propagacin B Propagacin B Propagacin C Propagacin C Propagacin D Propagacin D Propagacin E Propagacin E

Hls 80 120 80 120 80 120 80 120 80 120

Mac Conkey UFC/ml

Raka Medio Ray Lisina WLN WLD SDM UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

% DE 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Tabla 7. Propagacin de Levadura

Parmetro Fermentacin 24 Horas Fermentacin 48 Horas Fermentacin 72 Horas Fermentacin 96 Horas Maduracin 4 Das Maduracin 5 Das Maduracin 6 Das

N Muestras Analizadas

Mac Conkey UFC/ml

Raka Medio Ray Lisina WLN WLD SDM UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml

% DE 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

80 80 80 80 80 80 80

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

Tabla 8. Fermentaciones y Maduraciones

63

Figura 8. Medios de Cultivo Utilizados para el anlisis de muestras (Propagacin, Fermentaciones y Maduraciones)

64

Clase de Levadura /Generacin A A A A A A1 A1 A1 A1 A2 A2 A2 A3 A3 A3 A3 B B B B B1 B1 B1 B1 B2 B2 B2 B2 B3 B3 B3 C C C C C1 C1 C1 C1 C2 C2 C2 C2 C3

Tanque N 102 107 104 103 108 106 109 105 101 110 107 104 103 102 108 106 109 105 101 110 107 104 103 102 108 106 109 105 101 110 107 102 108 106 109 105 107 101 110 102 103 108 106 105

% Petite mutants 0% 0% 0% 0% 0,71% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,75% 0% 0% 0% 0,65% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,69% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,59% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

65

C3 C3 C4 C4 C4 D D D D D D1 D1 D1 D1 D2 D2 D2 D2 D2 D3 D3 D3 D3 D3 E E E E E E1 E1 E1 E1 E2 E2 E2 E2 E3 E3 E3 E3

103 107 101 110 102 103 104 109 106 105 107 110 101 108 102 103 104 109 106 107 105 103 101 110 102 103 104 107 102 101 103 107 108 106 101 109 102 103 104 110 106 Tabla 9. Respiracin Deficiente

0% 0% 0% 0% 0,81% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,59% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

66

Parmetro Agua desairada Tanque 1 Agua desairada Tanque 2 Agua desairada Entrada Torre Agua desairada Salida Torre Agua desireada Salida Torre

N Muestras analizadas

PCA UFC/ml

Mac Conkey UFC/100cm3 % DE

22 22 22 22 22

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

100% 100% 100% 100% 100%

Tabla 10. Agua Desairada

N Muestras analizadas WLN UFC/ml WLD % DE UFC/ml

Parmetro Tierra Diatomcea (Enero) Tierra Diatomcea (Enero) Tierra Diatomcea (Febrero) Tierra Diatomcea (Febrero) Tierra Diatomcea (Marzo) Tierra Diatomcea (Marzo) Tierra Diatomcea (Abril) Tierra Diatomcea (Abril) Tierra Diatomcea (Mayo) Tierra Diatomcea (Mayo)

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Tabla 11. Tierra Diatomcea

67

Parmetro BBT Tanque 1 BBT Tanque 2 BBT Tanque 3 BBT Tanque 4 BBT Tanque 5

N Muestras Analizadas

PCA UFC/ml

Mac Raka Conkey WLN Ray UFC/ml UFC/ml UFC/ml

% DE 100% 100% 100% 100% 100%

80 80 80 80 80

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

9.8 9.8 9.4 7 9.2

0 0 0 0 0

Tabla 12. Tanques Anlisis BBT`s

Parmetro Sifn Poker Sifn Costea

N Mac Raka Muestras Conkey WLN Ray Analizadas UFC/ml UFC/ml UFC/ml

30 30

0 0

9.8 9.4

0 0

% DE 100% 100%

Tabla 13. Sifn (Cerveza sin pasterizar)

Recuentos Celulares Fermentaciones UFC/ml

Promedio Tanque Enero Febrero Marzo Abril Mayo

101 102 103 104 105 106 107 108 109 110

1,2E+06 1,7E+06 1,4E+06 1,4E+06 1,3E+06 1,4E+06 1,9E+06 1,3E+06 1,7E+06 2,3E+06

1,3E+06 2,2E+06 1,1E+06 1,7E+06 1,6E+06 1,2E+06 1,2E+06 1,8E+06 2,0E+06 1,4E+06

2,0E+06 1,8E+06 1,3E+06 2,1E+06 1,5E+06 2,3E+06 1,6E+06 1,3E+06 1,4E+06 1,9E+06

1,8E+06 1,5E+06 2,3E+06 2,6E+06 1,8E+06 2,1E+06 1,5E+06 1,8E+06 2,1E+06 1,7E+06

1,7E+06 1,1E+06 1,2E+06 1,9E+06 2,1E+06 1,1E+06 1,8E+06 1,5E+06 2,2E+06 1,3E+06

Tabla 14. Conteos Celulares Fermentaciones

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Recuentos Celulares Maduraciones UFC/ml Promedio Tanque Enero Febrero Marzo Abril 401 1,2E+04 1,4E+04 1,3E+04 1,9E+04 402 1,7E+04 1,4E+04 1,4E+04 1,3E+04 403 2,0E+04 1,3E+04 1,5E+04 1,6E+04 404 1,8E+04 2,1E+04 2,3E+04 1,3E+04 408 1,3E+04 1,1E+04 1,6E+04 1,2E+04 409 2,2E+04 1,7E+04 1,2E+04 1,8E+04 410 1,7E+04 1,2E+04 2,1E+04 1,8E+04 411 1,1E+04 1,9E+04 1,1E+04 1,5E+04 412 1,8E+04 1,5E+04 2,3E+04 2,1E+04 Tabla 15. Conteos Celulares Maduraciones

Mayo 1,7E+04 2,3E+04 1,4E+04 1,9E+04 2,0E+04 1,4E+04 2,2E+04 1,3E+04 1,8E+04

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7. DISCUSIN DE RESULTADOS

Tradicionalmente la calidad se ha definido como el nivel de conformidad de un producto a su diseo o especificaciones. Esta calidad es la que se puede generar y controlar dentro de la fbrica, logrando de esta manera acreditar una marca cuya personalidad se caracteriza por una serie de parmetros, unos de orden legal, otros tpicos del proceso tales como controles fsico-qumicos, organolpticos y microbiolgicos y unos ms frutos del diseo de imagen del producto, por esto, para cada una de las cervezas que elabora, est establecida una norma o parmetro que define exactamente la calidad que se debe alcanzar; sin embargo, aunque pueden existir variaciones en las materias primas, mano de obra y el proceso propiamente dicho, se deben evitar al mximo diferencias entre los distintos lotes durante el proceso de fabricacin, esto con el fin de obtener un producto homogneo, lo que implica una estandarizacin del proceso de produccin; por esto se desarroll un sistema de control en cada una de las fases del proceso para limitar la presencia de contaminantes, que terminan afectando finalmente a los consumidores; para asegurar esto, se hace imprescindible impedir, entre otros, la presencia de patgenos y de contaminantes indeseables. Ambos aspectos, en especial el primero, se consiguen mediante la pasterizacin y otros sistemas de eliminacin (Garca, 2007). Pero para certificar la inocuidad de la produccin, se requieren distintos procesos de verificacin y es precisamente en este punto donde se evalu la calidad microbiolgica del producto identificando algunas de las desviaciones que se pueden presentar y de esta manera con los resultados obtenidos brindar un apoyo durante el proceso de elaboracin, para que una vez finalizada la produccin se asegure que el producto cuando sale al mercado cumple con las especificaciones establecidas. Un plan de control incluye la peridica toma de muestras a lo largo de todo el proceso para su anlisis directo al microscopio y a travs de

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medios de cultivo adecuados para obtener crecimiento de colonias y realizar una verificacin ms especializada de las mismas, caractersticas que no son posibles de identificar en una muestra en fresco (Hornsey, 2003). El control microbiolgico se ocupa del estudio y determinacin de los microorganismos diferentes a la levadura cervecera cultivada, que pueden contaminar el producto influyendo en la calidad del producto terminado (Hornsey, 2003). Para garantizar que el proceso inicia libre de microorganismos contaminantes, se evalu la calidad del agua potable suministrada por el acueducto municipal de Cali, sta se tuvo en cuenta debido a que algunas de las tuberas de la cervecera se encuentran deterioradas y podran convertirse en una fuente de contaminacin importante puesto que pueden aportar una carga microbiana que podra terminar en una alteracin de todos los procesos llevados a cabo en la cervecera; se realizaron anlisis microbiolgicos para identificacin de mesfilos y coliformes los cuales usualmente indican la presencia de otros contaminantes microbiolgicos. El lmite mximo de coliformes totales es de 0 UFC/100 cm3 y ninguna muestra debe contener E. coli o coliformes fecales en 100 cm3 de de agua (Decreto 475), durante todo el transcurso de esta evaluacin se obtuvo un recuento de cero unidades formadoras de colonias (UFC/100cm3); estos resultados garantizaban, que el agua utilizada en la cervecera en los diferentes procesos como enjuagues de tanques o como agua de dilucin, se mantenan libre de contaminacin microbiolgica. Partiendo de este hecho, se evaluaron los enjuagues realizados a los diferentes tanques que se encuentran en la planta (fermentacin, maduracin y filtracin) y que son utilizados para almacenamiento de materia prima y producto, puesto que durante el proceso de elaboracin de cerveza se producen precipitados, tanto de sales inorgnicas como de productos orgnicos y adherencias de los mismos a las superficies de los depsitos, las tuberas y otras piezas del equipo con las que entra en

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contacto el mosto y la cerveza , el no mantener una adecuada rutina de limpieza le estara agregando esta contaminacin al producto en proceso y por consiguiente contaminara tuberas, mangueras y dems (Klimovitz et al, 2002). Estos precipitados estn constituidos fundamentalmente por sales de calcio, magnesio, protena desnaturalizada y levadura que en caso de no ser eliminados durante el enjuague realizado, estaran proporcionando nutrientes y proteccin a los microorganismos contaminantes (Klimovitz et al, 2002). La rutina de limpieza, supone primero un lavado con agua, que va seguido por rociado a alta velocidad de un fluido germicida como Soda custica a concentraciones del 3%, a una temperatura de 80^85C, se realiza un segundo enjuague y se adiciona posteriormente cido ntrico a una concentracin que oscila entre 2 2.5%, despus se somete a un ltimo enjuague utilizando una presin aproximada de 80 150 con una ducha (Khatcher) de agua potable fra, finalmente se realiza un ltimo enjuague utilizando dixido de cloro, el cual supera varias de las limitaciones asociadas con residuales libres y asociados del cloro (Klimovitz et al, 2002). El dixido de cloro es un oxidante ms estable y fuerte que el cloro y ms efectivo, no slo para desinfectar ms rpidamente a niveles residuales ms bajos que el cloro, sino para oxidar muchos materiales y remover olores. No forma trihalometanos o clorofenoles, y no reacciona con amonaco. Con el dixido de cloro, dosificaciones ms bajas son requeridas para mantener un residual de desinfeccin de 0.3mg/L (Hornsey, 2003), por lo tanto ste no solo esteriliza, si no que a su vez facilita la limpieza. Es en este punto donde de una manera asptica y con la botella estril que contiene una cantidad adecuada de tiosulfato de sodio a una concentracin previamente establecida, el operario tomaba la muestra y la llevaba al laboratorio, donde era almacenada en la nevera a una temperatura promedio de 4C, posteriormente, al analizar los resultados

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obtenidos se encontr que del total de muestras analizadas 3 tuvieron crecimiento, al hacer el anlisis de causas se encontr que debido a fallas operacionales la concentracin utilizada en los sanitizantes empleados para llevar a cabo el aseo se haba realizado de manera incorrecta, causando este tipo de contaminacin, sin embargo, en las dems muestras no se evidenci crecimiento de ningn microorganismo tpico o ajeno del proceso cervecero en los diferentes medios de cultivo utilizados WLN y WLD, indicando de esta manera que el inicio de los procesos llevados a cabo en dichos tanques se podan llevar a cabo de manera adecuada y que si durante una etapa posterior del proceso se llegar a encontrar algn tipo de contaminacin, sta fuera una variable para descartar. El proceso de produccin inicia con el cocimiento del mosto, cuya composicin determina las propiedades de la cerveza como producto terminado. Antes de iniciar con el enfriamiento del mosto se pasa por el tanque agua caliente o agua de empuje, esta operacin se realiza debido a que el punto letal de algunos microorganismos vara con las especies y al hacerla pasar a una temperatura promedio de 70C se garantiza la eliminacin de la mayora de los microorganismos que no pueden sobrevivir bajo esas condiciones de calor (Hough, 1990); para esta muestra fueron evaluadas la presencia de mesfilos, bacterias termorresistentes y cido lcticas, descartando cualquier posibilidad de contaminacin y garantizando que el enfriamiento del mosto se iniciara de una manera adecuada. El mosto tiene que contener la cantidad correcta de azcares fermentables y nutrientes para la levadura y precursores de sabor, ste es microbiolgicamente inestable ya que constituye un medio ideal para la mayora de las bacterias Gram negativas y algunas Gram positivas tolerantes a los antispticos del lpulo, adems contiene carbohidratos simples, amino nitrgeno, minerales y micro nutrientes como vitaminas, por esto nunca se almacena a temperaturas por debajo de 55 0C por breve que sea el tiempo antes de aadirle el inculo de cultivo (Hough, 1992). Bacterias como Lactobacillus delbrueckii, y otras

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formadoras de endosporas, como son termfilas, pueden contaminar el mosto, multiplicarse rpidamente a temperaturas entre 50 - 650C y provocar sulfurados acidez. y Otras bacterias, que conforman la familia Enterobacteriaceae, al desarrollarse en el mosto producen derivados fenlicos que afectan el sabor final de la cerveza (Verstrepen, 2003). El mejor momento para hacer el muestreo es usualmente en el tanque de mosto caliente, puesto que es ah donde se mezcla el cocimiento completo y se determina su volumen (Klimovitz et al, 2002). El mosto terminado fue analizado para asegurarse que la cerveza tendr el extracto deseado, el color, el sabor, la espuma y la calidad microbiolgica requerida para dar inicio al proceso de fermentacin. Al mosto se le evalu la presencia de mesfilos, coliformes y bacterias cido lcticas, obteniendo 0 UFC/ml en todos los cocimientos evaluados, indicando de esta manera que la filtracin, tiempos y temperaturas que se tienen ya estandarizados, son adecuados para evitar la proliferacin de microorganismos ajenos al proceso; sin embargo si se hubiera presentado algn tipo de contaminacin microbiana, sta podra ser suprimida durante las etapas siguientes, fermentacin y maduracin (Klimovitz et al, 2002). La inoculacin de la levadura se lleva a cabo inmediatamente despus del enfriamiento del mosto, ya que ste puede contaminarse microbiolgicamente con facilidad (Hornsey, 2003). Es importante notar que para poder producir una cosecha de levadura en un estado ptimo fisiolgico para inoculacin, deben tomarse una serie de pasos incrementales (Aguilar, 2003). Estos incrementos reintroducen a las clulas en crecimiento activo a una nueva fuente de nutrientes, de manera que el cultivo nunca se detenga a consecuencia de una privacin de nutrientes (Hornsey, 2003). Igualmente, el mantener una concentracin mnima inicial de por lo menos 106 clulas/ml por P, tiende a reducir el

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riesgo de una contaminacin microbiana por varias razones; en primer lugar porque no se queda un exceso de nutrientes sin asimilar por mucho tiempo y en segundo lugar porque el metabolismo de las levaduras tiende a bajar rpidamente el pH del mosto a niveles subptimos para muchos microorganismos que daan el mosto, tales como coliformes y otras bacterias entricas mencionadas anteriormente (Hornsey, 2003). Durante los procedimientos de incremento, deben llevarse a cabo pruebas para asegurarse que la levadura que est siendo propagada este libre de contaminacin especialmente con bacterias y levaduras salvajes (Heggart et al, 1999), por esto se evalu la presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no Saccharomyces en medios de cultivo adecuados para evidenciar el crecimiento de este tipo de microorganismos como lo son el SDM y el medio lisina. La mayora de las levaduras salvajes o tipo no Saccharomyces pueden amenazar el xito de una operacin cervecera, ya que pueden competir de manera efectiva (aerbica, anaerbicamente, o ambos) por los nutrientes del mosto utilizados por las levaduras cerveceras y producir una variedad de sabores y aromas indeseables similares a los producidos por bacterias contaminantes (Verstrepen et al, 2003). Algunas levaduras salvajes excretan amilasas y/o proteasas, y como resultado pueden reducir los componentes deseados en el producto final tales como las dextrinas o protenas, dejando la cerveza opaca, caracterstica indeseada. El crecimiento de nmero significativo de clulas de levaduras silvestres tiene el potencial de alterar las caractersticas de floculacin del cultivo de produccin, lo que a su vez puede resultar en una fermentacin suspendida (Aguilar, 2005); al observar los resultados que se obtuvieron se ve claramente que este tipo de microorganismos no afect ninguna de las propagaciones que se llevaron a cabo durante este tiempo. As mismo, se evalu para las fermentaciones, la presencia de bacterias contaminantes del proceso tales como coliformes y cido lcticas,

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encontrando en todos los casos un crecimiento nulo, y para garantizar el xito de la fermentacin se analiz tambin la presencia de mutantes de levaduras del proceso; aspecto muy importante a tener en cuenta puesto que al ser definida la mutacin de la levadura como el cambio estable, heredable, en el DNA, que tpicamente resulta en la generacin de una forma nueva, alternada de gen, y un nuevo fenotipo (caracterstica observable), podra afectar de manera considerable el proceso de fermentacin (Philiph, 1985). Las mutaciones son usualmente detectadas mediante la prdida o alteracin observable de una funcin particular, tal como la asimilacin de una fuente de nitrgeno o de carbono. De las muchas mutaciones que pueden ocurrir y tienen un efecto significativo en la fermentacin, slo tres son usualmente observadas. Estas son: prdida de la habilidad de fermentar maltotriosa, prdida de floculencia y deficiencia respiratoria; las dos primeras son a menudo el resultado de un dao al DNA cromosomal encontrado en el ncleo de la clula, mientras que la tercera es a menudo el resultado de un dao gentico al DNA localizado en la mitocondria celular (Ha et al, 2002). Los cultivos que pierden la habilidad de fermentar maltriosa, atenan al mosto incompletamente, ya que la maltriosa es un carbohidrato abundante en el mosto; por otro lado los cultivos que pierden su habilidad de floculacin tienden a sobreatenuar al mosto, y, a menos de que sean removidos mediante centrifugacin, pueden resultar en sabores indeseados de autlisis (Ha et al, 2002). Mutantes cromosomales espontneos, o variantes, ocurren en promedio en aproximadamente una en un milln de clulas (Adams, 1998). Como resultado, ests clulas no producen rpidamente diferencias notables a una fermentacin. El resultado para estos anlisis fue negativo lo que indic que la propagacin comenzaba de una manera adecuada, dando paso a la fermentacin, contaminantes. la cual iniciaba su proceso sin ningn tipo de

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La fermentacin es uno de los procesos ms importantes y complejos en las operaciones de una cervecera. Frecuentemente, el maestro cervecero enfrenta los retos de cambios en el aroma y sabor a consecuencia de un inexplicable comportamiento y desempeo de la levadura durante la fermentacin (Verstrepen, 2003). Tradicionalmente la fermentacin cervecera es descrita como el proceso en donde los carbohidratos fermentables son transformados en etanol y numerosos subproductos y por medio de las interacciones con otros constituyentes del mosto, muchos de los compuestos de sabor en la cerveza se desarrollan (Oliveira, 1999). A pesar de su complejidad, la fermentacin es dependiente en gran medida de tres parmetros bsicos: la composicin del mosto (nutrientes para la levadura); la levadura; y las condiciones de proceso (como tiempo, temperatura, volumen, presin, forma y tamao del tanque, agitacin y corrientes en el mosto en fermentacin (Kelsall, 1995). Durante la fermentacin debe hacerse cumplir un estricto control de calidad para asegurar que sta procede normalmente y que la levadura est sana, libre de contaminacin y que acta como se espera tanto en suspensin como en floculacin (Kelsall, 1995). Los contaminantes tpicos en un proceso de fermentacin de este tipo crecen en los primeros estados de la fermentacin hasta que los descensos de pH y la elevacin en la concentracin de etanol le resultan adversos (Heggart at al, 1999). Pediococcos y Lactobacilos, pueden proliferar en esta etapa, ya que al ser los Lactobacilos generalmente insensibles a los amargos del lpulo, sobreviven en un 5% de etanol, y son capaces de crecer en un rango de temperatura de 5 - 50C (Funahashi, 1998). Los Lactobacilos son

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heterofermentativos, y producen cido lctico, cido actico, dixido de carbono, etanol y glicerol como productos finales (Funahashi, 1998). Algunos hasta pueden producir diacetilo; mientras que los Pediococcos son los nicos cocos que se conocen pueden crecer en cerveza; crecen bien en ambientes anaerbicos o microaeroflicos a temperaturas que van de 9 25C (Jacques et al, 1999). Al igual que los Lactobacilos, los Pediococos crecen bajo las condiciones cidas encontradas durante la fermentacin. Los Pediococos son fermentadores homolcticos, produciendo cido lctico como producto final. Tambin pueden producir suficiente diacetilo para alterar seriamente el sabor y el aroma de la cerveza (Jacques et al, 1999). Pediococos tambin pueden causar viscosidad en la cerveza a consecuencia de la produccin de cpsulas de polisacridos formados por azcares, protenas y cidos nucleicos (Jacques et al, 1999). Las muestras tomadas en los diferentes puntos crticos de control a lo largo de este proceso, se inocularon en un medio que inhibe selectivamente el crecimiento de las levaduras de cerveza, pero permiten el crecimiento de contaminantes (WLD), el cual est suplementado con el antibitico ciclohexamida, las levaduras de cerveza tradicionales son sensibles al ciclohexamida, mientras que muchos de los microorganismos de cervecera son resistentes y por ende forman colonias en un medio diferencial. Otro medio de cultivo utilizado fue Raka Ray, al cual se le aade Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno sorbitan), puesto que este compuesto es un conocido estimulante para el crecimiento de bacterias lcticas tales como Lactobacilos y Pediococos (Klimovitz et al, 2002), sin embargo y pese a que se utilizaron medios altamente selectivos, dichos microorganismos no fueron identificados en todas las muestra analizadas, garantizando una ptima calidad del proceso fermentativo que se llev a cabo.

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Las levaduras cerveceras son anaerobias facultativas, eso es, pueden cambiar de fermentacin a respiracin y viceversa. Tambin son de los pocos selectos organismos eucariticos que pueden sobrevivir (mientras haya una fuente de carbono fermentable disponible) la prdida total o grandes alteraciones del DNA mitocondrial asociado con en primer lugar componentes de transporte de electrones requeridos para la respiracin, y en segundo lugar con la sntesis de protena mitocondrial, y crecer indefinidamente como un mutante de deficiencia respiratoria (Heggart, 1999). Esto puede significar una prdida muy significativa de informacin gentica para una clula de levadura, ya que el genoma mitocondrial cuenta con aproximadamente el 15% (rango 5 25%) del DNA total de una levadura. Esta forma de mutacin es irreversible, y significa que el nmero de estos mutantes puede incrementarse rpidamente si ocurre una alta tasa de mutacin y si estos mutantes sobreviven y se reproducen (Ha et al, 2002). Combinando la naturaleza irreversible de la mutacin y el hecho que la observacin de las colonias con respiracin deficiente son menores en tamao que las colonias silvestres cuando son vistas de manera macroscpica en placas de medio slido MYGP, tales levaduras son llamadas como positivas - petit o variants, porque los mutantes estables de deficiencia respiratoria pueden ser aislados. Bajo condiciones aerbicas, los mutantes de deficiencia respiratoria crecen ms lentamente que las clulas de tipo silvestre porque no pueden respirar (Klimovitz et al, 2002). Tambin son incapaces de metabolizar fuentes de carbono no fermentables, tales como lactato, glicerol y etanol. Bajo condiciones anaerbicas, los mutantes de deficiencia respiratoria pueden crecer a la misma tasa lenta como las clulas de tipo silvestre, ya que ambas usan sendas fermentativas (Ha et al, 2002). Efectivamente, los mutantes de deficiencia respiratoria pueden demostrar tasas normales, reducidas, o aumentadas de gliclisis; estos mutantes de deficiencia respiratoria cuando son recubiertos con 1% de 2,3,5 cloruro de trifeniltetrazolium

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(TTC), pueden ser fcilmente identificadas como colonias blancas a consecuencia de su inhabilidad de reducir la sal de tetrazolium de incolora a roja, colonias con suficiencia respiratoria adquieren un color rojo mientras que las mutantes con deficiencia respiratoria permanecen blancas (Hornsey, 2003) , al evaluar este parmetro se encontr que esta caracterstica se presenta en la fermentacin puesto que de las 85 muestras analizadas, slo en 7 se evidenci respiracin deficiente, sin embargo al observar los indicadores, las muestras no se salen de los rangos establecidos los cuales permiten hasta un 5% para encontrar este tipo de mutacin durante el proceso fermentativo. Otro tipo de contaminantes que se pueden presentar corresponde al grupo de los coliformes, los cuales pueden crecer en un rango de pH de 4 a 8 (con un ptimo de 6.7), pero no pueden tolerar mucho alcohol, y por eso slo crecen en las primeras fases de una fermentacin (Heggart, 1999), por este motivo se analizaron muestras que estuvieran dentro de las 24 48 horas de fermentacin en el medio de cultivo Mac Conkey el cual arroja resultados 48 horas despus, encontrando 0 UFC/ml y asegurando que la fermentacin arrancaba sin ningn alterante microbiano de esta clase, stos a su vez pueden ser utilizados para decidir si se resiembra la levadura del fermentador, o se descarta. Se conoce tambin que en los fermentadores, los coliformes pueden producir etanol, dixido de carbono, cido actico, cido lctico, fenoles, acetaldehdo, dimetil sulfuro, y otros compuestos que llevan a sabores extraos en el producto final (Hornsey, 2003), luego el muestreo se extendi durante todo el proceso que dure la etapa de fermentacin, analizando de esta manera tambin muestras que se encontraban dentro de las 72 y 96 horas de fermentacin, antes de que iniciaran su paso a los tanques de maduracin donde se analizaron muestras que llevaran de 4 a 6 das en este proceso, encontrando finalmente en ambos casos que los resultados obtenidos correspondan a los que se esperaba inicialmente y

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que al finalizar dichos procesos se garantizar la satisfaccin de los estndares de calidad establecidos, puesto que el crecimiento de microorganismos no cerveceros puede resultar en una cerveza fuera de estndar, adems de provocar alteraciones organolpticas, dependiendo del contaminante, que pueden incluir acidificacin, produccin de diacetilo, sabores fenlicos extraos, olores estercolares, y otros off flavours (Verstrepen at al, 2003). Sin duda alguna, la contaminacin microbiana de la levadura de cultivo puede resultar en muy serias alteraciones en la calidad y caractersticas esperadas del producto final. Aunque en este trabajo solo se evalu la calidad microbiolgica, tambin se realizan pruebas fsico-qumicas que incluyen el chequeo de parmetros tales como tiempo, temperatura, pH, oxgeno, contenidos de extracto y alcohol, anlisis de sabor y la concentracin de clulas de levadura, procedimiento que si se tuvo en cuenta en este estudio debido a que los conteos celulares durante el transcurso y al final de la fermentacin deben encontrarse alrededor de 106 clulas/ml, parmetro que se cumpli en los conteos realizados, esta informacin se puede utilizar para determinar que la levadura pueda flocular correctamente y a su vez de paso a una fermentacin secundaria que se lleva a cabo en la etapa de maduracin (Hough, 1990), donde tambin se llevaron a cabo conteos, los cuales oscilaban en el rango de 104 clulas/ml por tratarse del perodo de maduracin, en este punto dichos recuentos son importantes para determinar que el nmero de clulas en suspensin presentes antes de la estabilizacin y filtracin, son los ideales y cumplen con el estndar, ayudando de esta manera a la eficiencia del proceso de filtracin. Despus de la maduracin y antes del envasado, la cerveza pasa de nuevo por una filtracin con tierra diatomcea que elimina los ltimos restos que puedan quedar de la fermentacin y tambin los restos de nitrgeno que durante la maduracin han formado una especie de

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mucosa, lo que podra provocar ms adelante que la cerveza saliera turbia (Klimovitz et a, 2002), se tomaron muestras de esta tierra encontrando 0UFC/ml en ambos medios WLN y WLD, garantizando de esta manera que esta no interfiere en la calidad de la cerveza que llega a BBT (tanques de cerveza brillante), sino que por el contrario es un excelente medio filtrante, al analizar las muestras de los BBT por medio de filtracin por membrana se obtiene crecimiento de levadura en el medio WLN donde aunque se observa crecimiento en el medio pese a que ya ha pasado por un filtro anteriormente esta muestra, sin embargo este crecimiento es permitido porque se trata de levadura cervecera y no de un contaminante microbiano, no obstante se tienen especificaciones los cuales indican que para entrar en el rango, el recuento no debe sobrepasar las 10 UFC/ml y al interpretar estos resultados se encontr que todos las muestras analizadas alcanzaban a entrar en dicha especificacin. Las pruebas para determinar la presencia de otros microorganismos fueron negativas en todos los casos.

Antes de llevar la cerveza a las envasadoras, se inyecta CO2 en los tanques hasta conseguir la saturacin deseada, para que la cerveza salga de su recipiente con una buena capa de espuma y no se oxide fcilmente (Hornsey, 2003). Para alargar el tiempo de conservacin de una cerveza, sin que cambie de aspecto, la cerveza pasa por una pasteurizacin despus del envasado (las botellas pasan por un tnel con agua a 70C), o con una pasteurizacin flash antes de envasar (Klimovitz, 2002). Una botella antes de pasar por este proceso se conoce con el nombre de sifn y en este caso tambin se analizaron muestras para descartar presencia de bacterias acido lcticas, coliformes o esporulados que hayan podido proliferar en algn momento del proceso entre la filtracin y el embotellado, pero los resultados nicamente muestran presencia de levadura en cantidades permisibles o dentro de especificacin.

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Finalmente es importante recordar que un control de calidad microbiolgico rutinario no resolver necesariamente los problemas de contaminacin. Sin embargo, ayudar a identificar el problema, cuando ste surja, para que puedan tomarse las medidas apropiadas para eliminar tal problema (Klimovitz, 2002). Un control de calidad microbiolgico tambin revelar los problemas que ocasionalmente surgen en un producto terminado que no sea resultado de una contaminacin microbiana, permitiendo que se pueda orientar un anlisis de causas.

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8. CONCLUSIONES

Se determin por medio del recuento en cmara de Neubauer que el nmero de clulas viables de levadura durante el transcurso y al final de la fermentacin son los adecuados para que la levadura pueda flocular correctamente.

. En la etapa de maduracin, se determin que el nmero de clulas en suspensin presentes antes de la estabilizacin y filtracin, son los ideales, cumplen con el estndar, ayudando de esta manera a la eficiencia del proceso de filtracin. No se evidenci presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no Saccharomyces durante las etapas de propagacin, fermentacin y maduracin, que pudieran afectar la calidad del proceso y del producto. Se evalu la presencia de mutantes de levaduras de proceso (Variants y Respiracin Deficiente (RD), este ltimo tipo de microorganismos se encontr en fermentaciones, sin embargo, los resultados de los anlisis cumplen los rangos o parmetros establecidos. Se evalu en el proceso la presencia de microorganismos mesfilos, coliformes y bacterias cido lcticas, obteniendo 0 UFC/ml en todos las fases evaluadas, indicando de esta manera que tiempos y temperaturas de los procesos de coccin, la filtracin y los controles proceso que se tienen ya estandarizados, son adecuados para evitar la proliferacin de microorganismos contaminantes.

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9. RECOMENDACIONES Durante los meses en que se valor la calidad microbiolgica del producto en proceso, los resultados encontrados fueron consistentes debido a que no se evidenci presencia de microorganismos contaminantes, sin embargo hubo presencia de mutantes de levadura (respiracin deficiente) que a pesar de estar dentro de especificaciones, es recomendable llevar a acabo un estudio de la

levadura utilizada en el proceso, realizando diferentes ensayos para verificar su variabilidad a travs del tiempo, as como su capacidad fermentativa o posible deformacin del genotipo de la cepa utilizada. Se sugiere evaluar la tcnica de filtracin por membrana realizando un estudio que incluya diferentes volmenes en el momento de filtrar con el fin de recuperar un mayor nmero de contaminantes, lo que llevara a analizar un mayor nmero de muestras, esto debido a que posiblemente la cantidad filtrada no es suficiente para identificar el crecimiento de microorganismos que podran causar un inadecuado perfil sensorial al causar off flavours. Se aconseja realizar un estudio comparativo con diferentes marcas de cervezas tanto nacionales como internacionales, para evaluar la influencia que tiene los diferentes tipos de levadura utilizada y que finalmente influyen en el perfil sensorial de cada una de las marcas.

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10. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Adams, A; Gottschling, D; Kaiser, C & Stearn, T. 1998. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. New York: The Laboratory. Chapter 1. Aguilar, B & FranYios, J. 2003. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letter in Applied microbiology, 37: 268 274 pp. Aguilar, B. Solis, J. FranYois, J. 2005. Estudio de la variacin de la composicin de los polisacridos contenidos en la pared celular de la levadura Saccharomyces cervisiae. Universidad de Guadalajara. Mxico. Revista digital cientfica y tecnolgica. www.e-gnosis.udg.mx [Consulta en lnea: Abril 20 de 2007] Bely, M; Rinaldi, A & Dubourdieu, D. 2003. Influence of assimilable Nitrogen on Voletiles Acidity production by Saccharomyces cerevisiae during high sugar fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol 96 N 6. 507-512 pp. Decreto 475. 1998. Normas tcnicas de calidad del agua potable. Ministerio de Salud Pblica. 13 - 14 pp. Escobar, M. 2002. Fundamentos de Microbiologa. Ed. Ceja. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. 268 272 pp. Funahashi, W. Suzuki, K. Ohtake, Y. & Yamashita, H. 1998. Two novel beer spoilage Lactobacillus species isolated from breweries. J Am Soc Brew Chem 56, 6469 pp.

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11. ANEXOS 11.1. Medios de cultivo 11.1.1. Wallerstein Laboratories Nutrient Mdium (WLN y WLD) WLN: Medio de cultivo utilizado para la diferenciacin de levaduras, levaduras salvajes y bacterias. WLD: Este medio es ms selectivo puesto que lleva cicloheximida para inhibir el crecimiento de levaduras
Frmula WLN Wallersteins medium (Oxiod) Cicloheximida g/L nutrient 80,0 80.0 0.133

WLD (Medio diferencial)

pH = 5,5 5,8 (Si es necesario ajustar el pH utilizando cido clorhdrico) Autoclavar a 121C por 15 minutes. Atemperar el medio a 50C antes de servirlo en las cajas de petri

11.1.1.2. Interpretacin
Saccharomyces cerevisiae puede crecer como una colonia blanca, verde plido o azul verdosas, la interpretacin se realiza de una manera sencilla, si el crecimiento de las colonias es espaciado y poco abundante. Otras especies de Saccharomyces y otros gneros de levaduras salvajes generalmente se distinguen fcilmente del tpico crecimiento que tiene la levadura en WLN, porque la morfologa de las otras colonias es notablemente diferente (arrugadas, levantadas, speras, polvorolientas), y su color generalmente difiere tambin, pasando de blanco por sombras de azul, a verde.

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11.1.1.3. Estimacin de Variants La levadura tpica crece con un aspecto cremoso, verdes con un pequeo centro amarillo o pequeas colonias verde oscuro. Las colonias son de 2 - 3 mm, levantados y las orillas son enteras. Todas las colonias que difieren de esta descripcin (por ejemplo, orillas no enteras, el tamao de la colonia ms pequeo, el color, las colonias brillantes, blancas y ms oscuras), puede ser considerada para ser variantes de la levadura tpica. Estas variaciones (mutaciones), a diferencia de la deficiencia respiratoria, son desconocidas, y por lo tanto, los efectos en la calidad de cerveza son tambin desconocidos.

Sin embargo, asumiendo que pueden ser perjudiciales en la calidad de la cerveza, una especificacin de <5% de variantes es permitida dentro del proceso. 11.1.1.4. Clculo
Contar el nmero total de colonias Contar el nmero total de colonias variantes (variants) Nmero total de colonias variantes x 100 Nmero total de colonias = % variants.

11.1.2. Raka Ray Medio selectivo para el aislamiento y de bacterias cido lcticas que pueden crecer en el proceso. Lactobacillus y Pediococous se discernirn en este medio.

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Varios de los componentes de este medio (extracto de hgado, extracto de levadura y N-acetilglucosamina) se han incluido para que se de una mejor recuperacin de bacterias cido lcticas. Sorbitan mono-oleato es incluido como un estimulante para bacterias cido lcticas en general. La fructosa presente le sirve como la fuente esencial de carbohidrato para Lactobacillus fructivorous mientras que la maltosa presente es tomada por Lactobacillus que no puede utilizar la glucosa, la cual puede ser utilizada por Pediococous La selectividad incrementada por la adicin de 3 g/L de de 2 phenylethanol para inhibir el crecimiento de microorganismos Gramnegativos y 7 mg de cycloheximide para inhibir levaduras.

Frmula Raka-Ray Agar (Oxoid code: CM 777) Suplemento por Litro Sorbitan mono-oleato Cicloheximida 2 Phenylethanol

g/L 77,1

10,0ml 0,007 g 3,0 g

pH 5,4 0,2 Autoclavar a 121C por 15 minutes. Atemperar el medio a 50-55C y aspticamente adicionar 3ml de phenylethanol por litro y posteriormente distribuir en las cajas de petri. 11.1.2.1. Incubacin Una vez realizada la siembra, incubar las cajas en jarras de anaerobiosis a 25C por 4 das, verificar la formacin de colonias, si no se observa crecimiento se dejan 3 das ms.

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11.1.2.2. Interpretacin Las bacterias cido lcticas crecen como colonias brillantes, cremosas. La confirmacin positiva de bacterias cidas lcticas se debe realizar utilizando la coloracin de Gram (positivo) y la prueba de Catalasa (negativo). 11.1.3. Agar Mac Conkey Medio para la deteccin y numeracin de Enterobacterias. Este medio es diferencial para la deteccin de coliformes Este medio contiene adems de otros componentes, lactosa, sales biliares, cristal violeta y rojo neutro como indicador. El cristal violeta presente en el medio sirve para inhibir el crecimiento de microorganismos Gram-positivos Las propiedades diferenciales del medio, se lleva a cabo por accin de los cidos producidos por la fermentacin de la lactosa, reaccin evidenciada gracias a la presencia del indicador rojo neutro y la absorcin de ste por las colonias para ocasionar las colonias color rojo ladrillo.
Frmula Mac Conkey Agar No. 3 (Oxoid) g/L 51.1

11.1.3.1. Interpretacin Los coliformes se desarrollarn en este medio con colonias que van desde rosadas oscuras a colonias rojas. Las bacterias Gram-positivos bacteria son inhibidas en este medio y por lo tanto no pueden crecer. Otras especies de Gram-negativos pueden crecer pero su color es casi translcido.

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Streptococcus faecalis crecer sobre este medio.

y algunas otras levaduras salvajes pueden

11.1.4. Plate Count Agar (PCA) Este es un medio de cultivo til para la enumeracin de una gran variedad de bacterias, ya que no es ni selectivo ni diferencial y general es utilizado para recuperar una gran gama de microorganismos que puedan estar presentes en una muestra para propsitos de enumeracin. En este medio pueden crecer un alto rango de bacterias y levaduras salvajes. Frmula
Plate Count Agar (Oxoid)

g/L
17,5

pH = 7,0

11.1.5. Malt Extract, Yeast Extract, Glucose, Peptone Broth (MYGP) Medio utilizado para el crecimiento de levaduras y levaduras salvajes y en cervecera para realizar el test de respiracin deficiente. Frmula Extracto de malta Extracto de levadura Glucosa Peptona Bacto-Agar g/L 3 3 10 5 30

Las clulas de levadura con respiracin deficiente a menudo aparecen como pequeas colonias en este medio, estas levaduras carecen ciertas enzimas respiratorias y han sido asociadas con el crecimiento pobre y la produccin desfavorable del sabor durante la etapa de fermentacin, as como viabilidades ms bajas de levadura.

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Para ser utilizado en el test de respiracin deficiente en levaduras, es necesario adicionar el medio Triphenyl Tetrazolium Cloride Agar (TTC), utilizando la tcnica doble capa de agar.

La prueba realizada en este medio depende del hecho si esas enzimas respiratorias estuvieron presentes, es decir si la levadura tuvo una respiracin adecuada, entonces al adicionar el medio TTC, la sal sin color que contiene el tetrazolium es reducida a la forma insoluble (trifenil) y forma un pigmento rojo. 11.1.6. Triphenyl Tetrazolium Cloride Agar (TTC) Frmula Triphenyl chloride Glucosa Bacto-Agar 11.1.6.1. Interpretacin Respiracin Normal o suficiente las colonias se tornan de rosado a rojo. Respiracin deficiente, las colonias (petites) permanecen blancas. 11.1.6.1.2. Clculo:
N = Nmero total de UFC (Rosadas o Rojas) Nv = Nmero total de UFC con Respiracin deficiente (Blancas) N x 100 = X N + Nv 100 X = % RD

g/L tetrazolium 0,5 5,0 15,0

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11.1.7. Schwarz Differential Medium (SDM) Medio para la diferenciacin de levaduras tpicas del proceso cervecero de levaduras salvajes. El complejo Silfito-fucsina inhibe las levaduras de cervecera si se utiliza en una concentracin de 0.3 - 0.35%. El medio es, por lo tanto, selectivo para el crecimiento de la mayora de las levaduras salvajes, y la apariencia de las colonias de levaduras salvajes puede es fcilmente detectable.
Frmula Extracto de malta Extracto de levadura Glucosa Peptona Fucsina Bsica Sulfito de sodio Dextrina Bacto-Agar g/L 3,0 3,0 10,0 5,0 0,47 2.92 0,11 20,0

No se Autoclava porque puede ser inhibida la accin del complejo sulfitofucsina, pero se debe calentar y una vez empiece a hervir se debe dejar por 15 minutos para garantizar la adecuada esterilizacin. Incubar las cajas de petri una vez servidas durante toda la noche a 30C antes de ser utilizado para realizar algn anlisis. 11.1.7.1. Interpretacin El medio cambia su color inicial durante el perodo de incubacin, tornndose rojo oscuro.

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La presencia de colonias rosadas fcilmente discernibles de cualquier descripcin (por ejemplo, suaves, mucoides, arrugadas), indica la presencia de levaduras salvajes.

11.1.8. Medio Lisina Este medio contiene lisina como la nica fuente de nitrgeno, lo cual lo hace ideal para la diferenciacin Saccharomyces sp, de levaduras tipo no Saccharomyces sp Al sembrar las muestras en este medio es importante que todo el nitrgeno que pueda venir de otra parte sea eliminado, por esto es importante realizar previamente las diluciones con solucin salina. Algunas bacterias pueden crecer sobre el medio lisina, por eso es importante confirmar la morfologa tpica de las levaduras salvajes a travs del microscopio. Frmula
Lisina medio Lactato de potasio 50% cido Lctico 10%

g/L
65 10 ml 1 ml

11.1.8.1. Interpretacin La apariencia tpica de una levadura salvaje se diferencia de otras colonias por la presencia de una especie de neblina en el fondo del medio, diferencindolas de otras levaduras que no se han desarrollado. Esto indicara la presencia de levaduras de tipo no Saccharomyces.

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11.2. Muestra de Clculo 11.2.1. Muestra de clculo para obtener resultados en el medio WLN en las muestras de BBT y Sifn. N = Nmero de UFC X = Nmero de cuadrantes en los que se dividi la caja para realizar conteo 20 = Volumen de muestra filtrado. N x (X) = UFC/ml 20 Ejemplo: Resultado Promedio Tanque 1 BBT N = 49 X= 4 20 = Volumen de muestra filtrado. 49 x 4 = 9.8 UFC/ml 20 Especificacin: b 10 UFC/ml 11.2.2. Muestra de clculo para obtener Porcentaje de Petite mutants (Respiracin Deficiente)
N = Nmero total de UFC (Rosadas o Rojas) Nv = Nmero total de UFC con Respiracin deficiente (Blancas) N x 100 = X N + Nv

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100 X = % RD

Ejemplo: Tanque 102 Generacin de Levadura C4 N = 123 Nv = 1 123 x 100 = 99.19% 123 + 1 100 99.19 = 0.81 % RD Especificacin: 5% de RD

11.2.1. Muestra de clculo para resultados siembra en superficie N = UFC/ml x 5 Multiplico por 5 debido a que el volumen sembrado corresponde a 0.2ml Ejemplo: Enjuague tanque 103 N = 4 UFC/ml x 5 UFC/ml = 20

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11.3. Formato para la recoleccin de Resultados Obtenidos

ANLISIS MICROBIOLOGICO DEL PRODUCTO EN PROCESO - CERVEZAS

CDIGO FECHA MUESTRA HORA TANQUE N COCIMIENTO EDAD VOL. DE MUESTRA PCA (UFC/ml) Mac Conkey (ufc/ml) WLN (UFC/ml) WLD (UFC/ml) Raka Ray (UFC/ml) ID SDM (UFC/ ml) Lisina (UFC/ ml) WLN Varia nts MYGP RD D.E/F.D.E. OBSERVACIONES

100

101