Instituto de Qumica Departamento de tecnologia de processos bioqumicos Biotecnologia Experimental Bioqumica Grupo: Cathaline Santos Janote Daniela Bragana

a Nicolas Juriti Nazareth Turma 04

Prtica n 01 Espectrofotometria
I Introduo A palavra espectrofotometria designa um mtodo de anlise baseado em medidas de absoro de radiao eletromagntica pelas molculas. A chamada radiao luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiao eletromagntica, sendo a luz visvel os comprimentos de onda contidos entre 400 e 700 nm.

Fig. 1 Comprimentos de onda, explicitando o espectro de luz visvel.

Um espectrofotmetro um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo. Usando um prisma o aparelho separa a luz em

feixes com diferentes comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar atravs da amostra um feixe de luz monocromtica (de um nico comprimento de onda, ou quase).

Fig. 2 Esquema simplificado do funcionamento de um espectrofotmetro

Esse feixe de luz incidente pode sofrer reflexo, refrao, espalhamento ou ser absorvida pelo material. Disso resulta que somente uma parte da radiao incidente transmitida atravs do material. O processo de absoro ocorre ao nvel molecular. Assim, como acontece num tomo, cada molcula caracteriza-se por possuir nveis de energia moleculares quantizados, os quais podem ser ocupados pelos eltrons das molculas. Por outro lado, a radiao carrega energia, sendo que o valor dessa energia depende do comprimento de onda da radiao. A absoro da radiao se d quando a energia que ela transporta igual diferena entre dois nveis de energia da molcula; nessa situao, a energia da radiao transferida para a molcula e ocorre a chamada absoro da radiao. Cada substncia absorve a radiao de maneira peculiar, ou seja, os comprimentos de onda que uma certa substncia absorver caracterstico da sua estrutura e outras substncias absorvero outros comprimentos de onda. Se levantarmos dados referentes intensidade de luz absorvida por uma substncia, em funo dos comprimentos de onda da radiao, estaremos obtendo uma curva chamada espectro de absoro da substncia. O importante que cada substncia tem um espectro caracterstico e, desse modo, possvel identificar um material desconhecido a partir de sua curva de absoro, comparada com curvas de substncias conhecidas. A espectrofotometria nos permite, ento, identificar substncias com base no seu espectro. Permite tambm quantific-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a concentrao da substncia, segundo a lei de Lambert-Beer.

Segundo essa lei, a absoro da luz diretamente proporcional a concentrao da soluo e ao caminho tico percorrido por ela.

Fig. 3 Relao entre a concentrao da soluo e a luz absorvida. IT2 = 2 IT1

Fig. 4 Relao entre a distncia percorrida pelo feixe luminoso e a luz absorvida pela soluo. IT3 = 3 IT1

Dessa maneira, a expresso para radiao absorvida pela soluo (absorvncia) segundo a lei de Lambert-Beer definida como:
Onde c a concentrao da soluo d a distncia percorrida pelo feixe luminoso K o coeficiente de absortividade

Abs = Kcd

Abs = log I0 / I

Onde I0 a intensidade da radiao incidente I a intensidade da radiao transmitida I / I0 denominado Transmitncia (T)

II Objetivo - Treinamento na utilizao de tcnicas espectrofotomtricas; - Elaborar uma curva padro para determinao da concentrao de leveduras em uma soluo aquosa. III Material - Bales volumtricos de 50mL, 100mL, 200mL, 250mL e 500mL; - Pipeta graduada de 1mL; - Cubetas de vidro, com largura de 1cm; - Espectrofotmetro; e, - Suspenso de fermento biolgico com concentrao de 15g/100mL, preparada anteriormente. IV Procedimento - A partir de uma suspenso de fermento biolgico contendo 15g de fermento em 100mL de gua destilada, preparar diluies de 1/50, 1/100, 1/200, 1/250 e 1/500 em bales volumtricos, conforme Tabela 1; - Transferir uma alquota para as cubetas de vidro e ler as absorvncias das suspenses diludas em espectrofotmetro a um comprimento de onda de 570nm, zerando o aparelho com uma cubeta contendo gua destilada (ensaio branco).

1 2 3 4 5

Volume da suspenso (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Volume final (mL) 500,00 250,00 200,00 100,00 50,00

Concentrao (g/L) 0,3 0,6 0,75 1,5 3,0

Tabela 1 Diluies feitas a partir da suspenso de fermento 15g/100mL.

V Resultados O ensaio em branco e as solues diludas foram analisadas em um espectrofotmetro. As leituras obtidas esto apresentadas na Tabela 2. Soluo Branco 1 2 3 4 5 Amostra A Amostra B Concentrao (g/L) 0 0,3 0,6 0,75 1,5 3,0 CA CB Absorvncia 0,000 0,120 0,236 0,271 0,470 0,934 0,371 0,660

Tabela 2 Leitura das absorvncias de cada soluo.

A partir da leitura dos valores de absorvncia de cada suspenso diluda possvel construir uma curva padro, apresentada no Grfico 1.

1 0,9 0,8 Absorvncia 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

y = 0,3031x + 0,0278 2 R = 0,9966

3,5

Concentrao (g/L)

Grfico 1 Curva padro de Absorvncia a 570nm X Concentrao de leveduras (g/L).

VI - Discusso De acordo com os resultados apresentados, possvel determinar as concentraes desconhecidas das amostras A e B. Com a equao da reta encontrada na curva padro e os valores da absorvncia de cada amostra, temos: 0,371 = 0,3031 CA + 0,0278 CA = 0,371 0,0278 0,3031 CA = 1,13 g/L 0,660 = 0,3031 CB + 0,0278 CB = 0,660 0,0278 0,3031 CB = 2,08 g/L Sabendo a largura das cubetas utilizadas, concentrao e absorvncia de cada soluo calculamos, aproximadamente, o valor do coeficiente de absortividade da suspenso de leveduras analisada.

Soluo 1 2 3 4 5 Amostra A Amostra B

Concentrao (g/L) 0,3 0,6 0,75 1,5 3,0 1,13 2,08

Absorvncia 0,120 0,236 0,271 0,470 0,934 0,371 0,660 Mdia

K (L/g.cm) 0,4 0,39 0,36 0,31 0,31 0,33 0,32 0,35

Tab. 3 Valores para K, segundo Abs = Kcd e considerando d = 1cm.

Como o coeficiente de absoro depende da soluo analisada, ou seja, o material onde foi incidida a luz, era esperado que o valor de K fosse o mesmo para todas as amostras, uma vez que foi trabalhado com a mesma suspenso de leveduras, diferenciando apenas suas concentraes. Essa diferena explicada pelo somatrio de pequenos erros possivelmente cometidos durante o ensaio, como preciso no volume das diluies, a utilizao de pipeta graduada (menor preciso comparada com a volumtrica) ou cubetas engorduradas.