PRCTICA # 3 COLORACIN DE WRIGHT Y GIEMSA

A. Introduccin
Con el fin de estudiar satisfactoriamente los frotis sanguneos, es necesario colorearlos. En la mayora de los laboratorios los colorantes ms empleados para la tincin hematolgica se basan en el de Romanowsky constituido fundamentalmente con la mezcla de eosina (cido) y azul de metileno (bsico). Adems se han incorporado el empleo de derivados por oxidacin del azul de metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B, C). Son los azures los responsables de la coloracin prpura o roja de ciertas estructuras. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tienen carcter bsico fijan la eosina mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno. Esto explica que las estructuras basfilas se tian de color azul mientras que los competente acidfilas adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar a los leucocitos polimorfonucleares en 3 grupos:

Granulocitos eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de carcter bsicos que fijan los colorantes cidos y se tien de color rojo-naranja. Granulocitos basfilos , en los que la granulacin especfica posee sustancias de carcter cido que fijan los colorantes bsicos y se tien de color azul oscuro. Granulocitos neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos de carcter neutro por lo que fijan ambos colorantes simultneamente, de ah que se tien de color pardo.

Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los ms utilizados son el de Wright, Giemsa y May- Grnwald-Giemsa, entre otras.

1. Tincin de Wright Esta coloracin es conocida como policromtica debido a que produce varios colores. Es una solucin de alcohol metlico de un colorante cido (eosina) y otro bsico (azul de metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguneo al portaobjetos. El amortiguador, que consiste en una solucin tamponada, mantiene el pH del colorante y favorece la mejor absorcin por los diferentes componentes celulares.

Materiales:

Colorante de Wright: para 100 mL se requiere de colorante de Wright (0.3g), metanol (97.0 mL) y glicerol (3.0 mL). Disolver en un mortero el colorante con el glicerol. Una vez disuelto se adiciona el metanol trasvasndolo a un frasco oscuro. Agitar. Filtrar antes de usar. Solucin amortiguadora tamponada: en un litro de agua destilada se agregan 3.76 g de hidrofosfato disdico (Na2HPO4* 2H20) y 2.10g de fosfato de potasio dihidrogenado (KH2PO4). Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de vidrio en lugar fresco. Ajustar el pH a 7.2. Rejilla horizontal o soporte de tincin.

Figura 4. Tincin de Wright manual en portaobjetos y cubreobjetos.

Fuente: Rodak B. Hematologa: fundamentos y aplicaciones clnicas. 2 ed. Rondinone S, trad. Buenos Aires: Mdica Panamericana, 2004. 884p.

Tcnica:

Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tincin con la sangre hacia arriba (ver figura 4). Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Wright gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los glbulos sanguneos. El colorante deber cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deber agregarse una cantidad adicional si ste se comienza a evaporar. Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright, para evitar la coloracin dbil. Esperar la formacin de brillo metlico. Puede usarse de igual manera agua desionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos. Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensin presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.

Resultados:

Los eritrocitos se observarn de color naranja o rosado.

El citoplasma de los monocitos presentarn una tonalidad azul griscea con grnulo rojizos bastante finos y sus vacuolas caractersticas. El citoplasma de los linfocitos presentar varias tonalidades azules. Los ncleos de los linfocitos y neutrfilos aparecern de color prpura oscuro. Los ncleos de los monocitos de color prpura algo ms claros (lila). Los grnulos de los eosinfilos son de color rojo-anaranjado intenso. Los grnulos de los basfilos prpura azulado muy oscuro. Los grnulos de los neutrfilos se aprecian de color lila, bastante finos. Las plaquetas toman coloracin violeta o prpura.

Observaciones:

Los tiempos varan de acuerdo a cada lote o tiempo de maduracin del colorante. De ah que si los frotis recin teidos resultan demasiado plidos se corrige aumentando el tiempo de tincin o disminuyendo el tiempo de lavado. Si en la preparacin se observa precipitados de colorante puede ser debido a varias causas: lavado insuficiente al final del proceso, utilizacin de porta o cubreobjetos sucios, mala filtracin del colorante, mala distribucin del colorante a lo largo de la extensin por no mantenerse en posicin horizontal. Durante la tincin el tampn fosfato controla el pH del colorante. Si el colorante es demasiado cido la extensin resultar demasiado rojiza y si por el contrario es demasiado alcalina la precipitacin presentar un aspecto azulado.

2. Tincin de Giemsa Es la segunda coloracin en uso, luego de la tincin de Wright, y en importancia de las mezclas de Romanowsky. Es quizs la mejor modificacin de este tipo de coloraciones para descubrir parsitos en la sangre, como en el caso de malaria ( Plasmodium spp.) y tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de Giemsa tambin da excelentes resultados para la tincin rutinaria de frotes sanguneos. Cuando se va a teir con este colorante, debe fijarse primero la muestra con metanol absoluto por un tiempo mnimo de tres minutos (cuando la preparacin no incluye metanol). El colorante en solucin nunca se utiliza de manera directa, por lo que se debe diluir con la solucin amortiguadora en una proporcin de 1:10 1:20 y el tiempo de coloracin podr ser de 10 20 minutos, respectivamente. Material: Colorante de Giemsa (constituido por una mezcla de azul de metileno, eosina y varios azures en dilucin acuosa): 1.0g del colorante en polvo, 66mL de metanol absoluto y 66mL de glicerol. Se debe disolver el colorante con el glicerol, adicionar el metanol, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente de 7-14 das (maduracin). Filtrar antes de su empleo. Guardar en frasco color mbar. Importante: Las indicaciones de preparacin pueden variar dependiendo de la casa comercial. Tcnica:

Fijar el frotis con alcohol metlico de 3-4 minutos. En caso de que la preparacin del colorante ya posea metanol, este paso queda obviado. Sumergirlo verticalmente en una solucin de Giemsa preparada extemporalmente a partir de 1 volumen de la solucin colorante ms 9 volmenes de solucin tampn (pBs, pH 6.8) o bien en agua desionizada. Esperar durante 10-20 minutos. Lavar el frotis con abundante agua, directamente del chorro. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.

Resultados y observaciones:

Los ncleos celulares se tornan violeta intenso. Es frecuente encontrar en el mtodo de Giemsa que la granulacin eosinfila no presenta la tonalidad rojo-anaranjada caracterstica sino que presenta una tonalidad pardo rojizo. Esta dificultad puede prevenirse aadiendo una gota de fucsina fenicada por cada 10ml de alcohol metlico utilizado. Las granulaciones neutrfilas (lila) y los hemates (rojo plido) se tien mal; sin embargo, esta coloracin permite diferenciar algunas formas de metamielocitos que pueden ser confundidos con los monocitos, pues el protoplasma de los monocitos queda de color azulado y el de los metamielocitos de color rosa. El citoplasma de los linfocitos presenta una tonalidad azul definida y sus ncleos violeta de intensidad variable. Los grnulos basfilos y las plaquetas se tien de color azul, no obstante stas ltimas presentan corpsculos violeta internos.

3. Tincin de May-Grnwald o de Jenner Modificacin de la coloracin de Wright, muy inferior a sta, porque no produce efecto cromtico entre ncleos, citoplasma e inclusiones. No obstante, el eosinato de azul de metileno de Jenner disuelto en alcohol metlico, destaca bien los grnulos de leucocitos y es por tanto especialmente til en su recuento diferencial. No es til para descubrir parsitos en sangre. Materiales: Colorante May-Grnwald en polvo (disponible comercialmente) 0.3g. Alcohol metlico absoluto 100mL. Se debe calentar la mezcla a 56C hasta la disolucin completa del colorante. Dejar enfriar en nevera a 4C durante 24 horas, agitando en periodos al azar. Filtrar antes de su empleo. Tcnica:

Cubrir el frotis con el colorante, dejar actuar de 3-5 minutos. Cubrir la preparacin con igual volumen de agua destilada neutra. Mover el porta para que abarque toda la extensin. Dejar por 5-10 minutos.

Lavar con agua destilada hasta que la preparacin tome una coloracin rojo-rosado. Secar al aire en posicin vertical y observar con objetivo de inmersin.

Resultados:

Los ncleos celulares se tornan violeta azulado. Los eritrocitos se tien mal, adquiriendo coloracin rojo plido. El citoplasma de los linfocitos aparece azul mientras que el monocito azul grisceo. Los grnulos basfilos son violeta intenso, los eosinfilos rojo intenso mientras que los neutrfilos azul oscuro. Las plaquetas se tien de color azul con corpsculos violeta internos.

4.

Tincin de Pappenheim o tincin panptica de May-Grnwald-Giemsa

Es el resultado de combinar la tincin de Giemsa con la de May-Grnwald, con el fin ltimo de combinar las ventajas de dichos colorantes, de ah que, esta tincin resalta de manera especial las granulaciones leucocitarias y mejora la coloracin de los hemates. Materiales:

Frotis sanguneo seco Colorante de Giemsa (ver especificaciones en la coloracin respectiva) Colorante de May-Grnwald (ver especificaciones en la coloracin respectiva)

Tcnica:

Fijar el frotis en el porta sumergindolo en solucin metanlica de May-Grnwald durante 2 3 minutos. Transferir a una dilucin de May-Grnwald diluida en agua destilada o con PBS (1:1) preparada extemporneamente y dejar en reposo durante 2 3 minutos. Sin lavar, sumergir el frotis en la solucin de Giemsa preparada extemporneamente durante 20 minutos. Lavar el frotis con abundante agua destilada y sumergirlo en tampn PBS de pH 6.8 de unos 2-5 minutos. Secar el frotis al aire y una vez seco est listo para su observacin al microscopio.

Resultados:

ii. Esta preparacin proporciona una amplia gama de colores. Los hemates se tien de una tonalidad color rosa plido con una zona central ms clara. La policroma se advierte con una tendencia de color azulado.

iii. La cromatina nuclear se tie de rojizo a violeta oscuro dejando dibujadas las estructuras cromticas que sirven para evaluar y determinar el grado de madurez celular. iv. Los linfocitos se tien de azul claro bastante definido adems de presentar pequeos granos azurfilos de color rojo intenso. El citoplasma de los monocitos aparece de un color ligeramente azulado. v. Las granulaciones de los eosinfilos son rojo-anaranjado casi amarillentas. Las granulaciones de los basfilos son violeta oscuro a negro, mientras que los grnulos neutrfilos rojo-prpura bastante claros. vi. Las plaquetas presentan una porcin perifrica azulada y grnulos centrales rojos.

5. Causas de error en la tincin del frotis sanguneo Una extensin de sangre bien teida debe caracterizarse por una buena diferenciacin de las estructuras sub-celulares de los leucocitos, definicin completa de los hemates y de la ausencia de precipitados que den lugar a artefactos no deseados. Todos los colorantes anteriormente descritos pueden producir resultados poco satisfactorios en la coloracin del frotis, siendo algunas de las causas de estos malos resultados las siguientes: Una coloracin excesivamente azul que puede ser debida a:

Frotis excesivamente gruesos Tiempo prolongado, dando lugar a sobretincin Lavado insuficiente Empleo de solucin diluyente o el colorante demasiado alcalino.

Importante: En este caso los eritrocitos aparecen azules o verdes, la cromatina nuclear es azul oscuro o negra y los grnulos de los eosinfilos son azulados o grises. Este defecto se puede corregir coloreando por menos tiempo con el colorante y por ms tiempo con el amortiguador. Si esto no mejora el frote, debe evaluarse la calidad de los reactivos utilizados y tomar decisiones con respecto al cambio de lote. Una coloracin excesivamente rosada que puede deberse a:

Tincin insuficiente Lavado prolongado Secado inadecuado Empleo de solucin colorante o amortiguante muy cidos.

Importante: En estos frotes los eritrocitos aparecen de un color rojo brillante o anaranjados, la cromatina nuclear es rosa plida y los grnulos de los eosinfilos son rojo brillante intensos. La presencia de precipitados en el frote puede deberse a:

Lminas mal lavadas Secamiento insuficiente Accin excesiva de la solucin fijadora Lavados inadecuados al concluir la tincin Filtracin inadecuada del colorante que se est utilizando.

Otras causas de error pueden ser debidas a:

Apreciacin de artefactos morfolgicos debidos al anticoagulante empleado. Apreciacin de artefactos debido a suciedad, deterioro o a la presencia de grasa en la lmina. Hidratacin de los eritrocitos.

CUESTIONARIO 1. Indique cules son los componentes del colorante de Wright y como se prepara. Indique cules son los componentes del colorante de Wright y como se prepara. 2. Qu soluciones pueden utilizarse como amortiguador para la tincin de Wright y cul es el pH que debe tener? 3. Qu sucede cuando se evapora el colorante? 4. Describa el principio de los dispositivos de tincin automatizados, sus ventajas y desventajas. 5. En qu consiste la tincin de Wright-modificado?