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UNIVESIDADE ESTADUAL DE GOIS UNU de Cincias Exatas e Tecnolgicas Curso de Qumica Industrial Modalidade Bacharelado

Imobilizao de Peroxidase de Solanum lycocarpum St. Hill. (Solanaceae) em Compsitos de Estireno-DivinilbenzenoPolianilina-Poliglutaraldeido.

Rodrigo Simes Silva

Anpolis, Junho 2008


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Rodrigo Simes Silva

Imobilizao de Peroxidase de Solanum lycocarpum St. Hill. (Solanaceae) em Compsitos de Estireno-DivinilbenzenoPolianilina-Poliglutaraldeido.

Trabalho

de

concluso

de

curso

apresentado Universidade Estadual de Gois, UnUCET de Anpolis, para obteno do grau de Qumico Industrial. Orientadora: Prof Dra. Samantha Salomo Caramori Co-Orietador: Prof MSc. Valmir Jacinto da Silva

Anpolis, Junho 2008

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...Nunca deixe que lhe digam que no vale a pena acreditar no sonho que se tem...Ou que seus planos nunca vo dar certo, ou que voce nunca vai ser algum. Tem gente que machuca os outros, tem gente que no sabe amar, mas eu sei que um dia a gente aprende. Se voc quiser algum em quem confiar, confie em si mesmo. Quem acredita sempre alcana. Renato Russo

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DEDICATRIA
Dedico esse trabalho a minha Me, que foi a principal responsvel pela minha vitria. Dedico a ela pela confiana e credibilidade confiada em mim, pelo incentivo, cooperao e apoio. A ela devo grande parte do que sou.

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AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, este que sempre esteve ao meu lado, me guiando e me ensinando a enfrentar os problemas e as alegrias com humildade e pacincia. Em segundo lugar, a minha querida me (Dona Vera), que abdicou-se de diversas coisas em seu favor, para que eu e meu irmo pudssemos chegar onde chegamos. Ao meu Pai (Joo), que apesar da distncia, nunca deixou de me incentivar e lutar para que eu conquistasse meus objetivos. Ao Armando, meu segundo Pai, a quem devo grande parte da minha educao. Ao meu irmo, que sempre me inspirou a buscar e superar desafios cada vez maiores. A minha Av (Dona Anisia), que me acolheu em sua casa, cuidando e me ajudando, todo este tempo em que eu estive na universidade. Agradeo tambm a minha orientadora Prof Dr. Samantha Salomo Caramori, que com sua sabedoria e pacincia me conduziu ao mundo da pesquisa, me proporcionando a experincia de lidar com situaes que vo desde a frustrao de um experimento mal sucedido a alegria da obteno de um resultado interessante. Ao meu co-orientador Prof MSc Valmir que despertou em mim a admirao e o apego pela Qumica logo no primeiro perodo do Curso (Disciplina: Fundamental 1). Alm de ter me mostrado que o bom qumico aquele sempre est em busca da perfeio. Agradeo tambm pelo apoio impar, dedicado a este projeto. Ao meu amigo Fredy (Negrito) que participou deste projeto de forma excepcional, contribuindo com grande incentivo e me auxiliando nas horas mais difceis. v

Aos amigos Marcelo, Pedro e Renato (Equipe Brother`s). Amigos estes, que me ensinaram muito e que jamais sero esquecidos. Parte do que sou hoje, conquistei observando vocs. A minha querida amiga Juliana, que cuja simplicidade e a dedicao voltada aos amigos sempre foram motivo de grande admirao. Obrigado pela oportunidade de te conhecer. A Dona Romilda e seu Derocidio (Pais do Marcelo), que sempre me acolheram de braos abertos em sua casa. A Dona Maria e seu Isac (Pais do Renato), que sempre se colocaram a disposio para me ajudar hora que fosse preciso. Agradeo tambm, cada conselho e cada puxo de orelha, pois todos foram bem aproveitados. A Tia Dica e Ti Nei (Tios do Renato), por terem me acolhido em sua casa para que eu pudesse fazer o meu estgio. Aos colegas que iniciaram e os que estiveram ao meu lado nessa caminhada: Adaieti Aline, Ana Carolina (Carolzinha), Ana Paula, Camila, Elisa, Elisraic, Everton, Igor, Joice, Josiane, Juliano, luciane, Maira, Marina, Marcos (Juca), Luiz, Rafael, Robson, Rogrio A., Rogrio (Salsicha), Svio, Tiago e Vinicius. Agradeo a todos os meus familiares pela compreenso, carinho e fora, a mim dedicados nessa caminhada.

A todos, o meu MUITO OBRIGADO!

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SUMRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................ix LISTA DE TABELAS.......................................................................................................x LISTA DE ABREVEATURAS.......................................................................................xi RESUMO........................................................................................................................xii 1 INTRODUO...........................................................................................................1 2 REVISO DA LITERATURA...................................................................................4 2.1 O BIOMA CERRADO.........................................................................................4 2.2 CARACTERSTICAS DA FAMLIA SOLANACEAE......................................6 2.2.1 Solanum lycocarpum.....................................................................................7 2.2.2 Anlise Qumica e Bioqumica......................................................................8 2.3 ENZIMAS ...........................................................................................................9 2.3.1 Peroxidase....................................................................................................11 2.4 IMOBILIZAO DE ENZIMAS......................................................................14 2.4.1 Escolha do Mtodo de Imobilizao...........................................................16 2.4.1.1 Suportes para imobilizao de enzimas...............................................17 2.4.1.2 O suporte ideal.....................................................................................19 2.4.2 IMOBILIZAO DAS PEROXIDASES...................................................19 2.5 OS COPOLMEROS ESTIRENO-DIVINILBENZENO..................................20 2.6 AS POLIANILINAS..........................................................................................24 2.7 OS COMPSITOS DE POLIANILINA........................................................28 2.8 APLICAES DA PEROXIDASE IMOBILIZADA.......................................29 3 METODOLOGIA......................................................................................................31 3.1 EQUIPAMENTOS.............................................................................................31 3.2 REAGENTES E SOLUES............................................................................31 3.3 SNTESE DOS COMPSITOS DE POLIANILINA/COPOLMERO ESTIRENO-DIVENILBENZENO (PANI/STY-DVB)..............................................32 3.3.1 Tratamento do Copolmero Estireno-Divenilbenzeno (Sty-DVB) com Anilina.....................................................................................................................32 3.3.2 Polimerizao In Situ da Anilina no Copolmero Sty-DVB........................33 3.3.3 Filtrao e Lavagem dos Compsitos..........................................................34 3.4 COLETA DO MATERIAL VEGETAL.............................................................34 3.5 OBTENO DO EXTRATO............................................................................35 3.6 ATIVIDADE DA PEROXIDASE LIVRE.........................................................35 3.7 PARMETROS DE ATIVIDADE....................................................................36 3.7.1 pH timo.....................................................................................................36 3.7.2 Tempo timo...............................................................................................36 3.7.3 Temperatura tima......................................................................................36 3.7.4 Termoestabilidade a 50 e 70 C...................................................................36 3.8 ATIVAO DOS COMPSITOS Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3)........................................................................................................................37 3.8.1 Espectros de Absoro na Regio do Infravermelho (FTIR) dos Compsitos Ativados...................................................................................................................37 3.9 IMOBILIZAO DA PEROXIDASE NOS COMPSITOS Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3) ATIVADOS............................................................37 3.10 ATIVIDADE DA PEROXIDASE IMOBILIZADA........................................38 3.11 PARMETROS DE IMOBILIZAO...........................................................38 3.11.1 Tempo timo de Imobilizao..................................................................38

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3.11.2 pH timo de Imobilizao .......................................................................38 3.11.3 Reutilizao da Peroxidase Imobilizada....................................................39 4 RESULTADOS E DISCUSSO...............................................................................40 4.1 SNTESE DO COMPSITO PANI/ESTIRENO-DIVINILBENZENO...........40 4.2 PARMETROS DE ATIVIDADE....................................................................44 4.2.1 pH timo ....................................................................................................44 4.2.2 Otimizao do Tempo de Atividade da Enzima Livre................................45 4.2.3 Temperatura tima......................................................................................46 4.2.4 Termoestabilidade a 50 e 70 C...................................................................47 4.3 IMOBILIZAO DA PEROXIDASE DA S. LYCOCARPUM......................49 4.3.1 Ativao dos Compsitos Pani/Sty-DVB (HCl) e Pani/Sty-DVB (HNO3) 49 4.3.2 Tempo de Imobilizao...............................................................................52 4.2.3 pH timo de Imobilizao..........................................................................53 4.2.4 Reutilizao da Peroxidase Imobilizada......................................................54 5 CONCLUSO...........................................................................................................56 PERSPECTIVAS.........................................................................................................57 6 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS......................................................................58

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa dos biomas brasileiros, com destaque para o Cerrado ao centro. (IBGE, 2007, departamento de Geografia)....................................................................................4 Figura 2 Ferriprotoporfirina IX ou Hemina (1,3,5,8-tretametil-2,4-divinilporfina-6,6cido diproprinico)........................................................................................................12 Figura 3 Fluxograma de classificao dos mtodos de imobilizao (KENNEDY & WHITE, 1985).................................................................................................................15 Figura 4 Representao esquemtica da reao de sntese do copolmero estirenodivinilbenzeno (Sty-DVB)...............................................................................................23 Figura 5 Forma bsica da polianilina ou p-poli(fenilenoaminaimina) ........................24 Figura 7: Estrutura de octmeros da polianilina: (a) Leucoesmeraldina, (b) Esmeraldina e (c) Pernigranilina..........................................................................................................25 Figura 8: Forma isolante e condutora da polianilina de acordo com o pH do meio........26 Figura 9: Estados de oxidao da Pani em funo dos equilbrios de oxidao e reduo cido-base........................................................................................................................40 Figura 10: Mecanismo de polimerizao da anilina proposta por Wei et al. (1990).......42 Figura 11: Espectros de absoro na regio do infravermelho do copolmero Sty-DVB puro e dos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3)........................43 Figura 12: Grfico da Unidade de Enzimas em relao ao pH para a casca e polpa da S. Lycocarpum. ...................................................................................................................45 Figura 13: Grfico da Unidade de Enzimas em relao ao tempo para a casca e a polpa da S. lycocarpum.............................................................................................................46 Figura 14: Atividade enzimtica de peroxidase de casca (preto) e polpa (vermelho) de S.lycocarpum em relao temperatura de ensaio..........................................................47 Figura 15: Termoestabilidade, a 50 C, da peroxidase contida em extratos da casca (preto) e da polpa (vermelho) de S. lycocarpum.............................................................48 Figura 16: Termoestabilidade a 70 C da peroxidase contida em extratos da casca e da polpa da S. lycocarpum...................................................................................................48 Figura 17: Representao do esquema de ativao da polianilina com glutaraldedo e imobilizao da peroxidase com a Pani ativada..............................................................50 Figura 18: Espectro de Absoro na Regio do Infravermelho para os compsitos Pani/Sty-DVB (HNO3) sem ativar e ativado com poliglutaraldedo em pH 6,0............51 Figura 19: Espectro de Absoro na Regio do Infravermelho para os compsitos Pani/Sty-DVB (HC) sem ativar e ativado com poliglutaraldedo em pH 6,0................51 Figura 20: Relao entre o tempo e eficincia de imobilizao da peroxidase contida no extrato da casca da S. lycocarpum nos diferentes compostos Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC,) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). ................................................................53 Figura 21: Eficincia de imobilizao da peroxidase da casca da S. lycocarpum em relao ao pH, nos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3)...........54 Figura 22: Grfico da Reutilizao dos compsitos de Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3)..............................................................................55

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Comparao entre os atributos de alguns mtodos de Imobilizao (KENNEDY & WHITE, 1986).......................................................................................17 Tabela 2 Exemplos de Suportes Insolveis Para Imobilizao de Enzimas (FERNANDES, 2000).....................................................................................................18 Tabela 3 Preos de alguns polmeros orgnicos utilizados para imobilizao de enzimas............................................................................................................................27 Tabela 4 Composio dos reagentes empregados para a preparao dos compsitos Pani/Sty-DVB com HNO3 em pH 0................................................................................33 Tabela 5 Composio dos reagentes empregados para a preparao dos compsitos Pani/Sty-DVB com HC em pH 0...................................................................................33

LISTA DE ABREVEATURAS

APS PANI PANI/Sty-DVB POD Sty-DVB

Persulfato de Amnio Polianilina Polianilina/Estireno-Divinilbenzeno Peroxidase Estireno-Divinilbenzeno

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RESUMO
A imobilizao de enzimas atravs da formao de ligaes covalentes entre um grupo ligante da enzima e o suporte insolvel apresenta-se como um dos mtodos mais empregados e investigados nos ltimos anos. Neste contexto, o presente trabalho descreve a imobilizao da enzima peroxidase em compsitos Pani/Sty-DVB quimicamente sintetizados. Foram sintetizados e caracterizados dois compsitos que diferiam entre si, quanto ao tipo de cido empregado na sntese e quanto quantidade de anilina na soluo de intumescimento. A peroxidase foi extrada da lobeira (S. lycocarpum) e imobilizada em ambos os compsitos previamente ativados com poliglutaraldedo em pH 6,0. A atividade da peroxidase livre foi determinada utilizando pirogalol e perxido de hidrognio como substratos, sendo avaliados os seguintes parmetros: temperatura, pH e tempo timos, bem como, a termoestabilidade. Para a imobilizao da peroxidase, foram feitos os testes pH e tempo timo de imobilizao e aps a imobilizao, testes de reutilizao. Tanto os compsitos puros, quanto os com a peroxidase imobilizada foram caracterizados por FTIR. Os compsitos sintetizados via polimerizao oxidativa da anilina na presena de cido clordrico e cido ntrico, apresentaram caractersticas adequadas para a imobilizao da peroxidase em sua estrutura. Entretanto, a velocidade de polimerizao da anilina mais rpida na presena de HC do que na presena de HNO3, o que leva a concluir que a velocidade de reao depende do tipo de cido utilizado para a sntese da Pani. A peroxidase, extrada da casca de S. lycocarpum apresenta uma maior atividade do que quela extrada da polpa. Por outro lado, as mesmas apresentam um padro similar de xii

decaimento da atividade, quando submetidas a aquecimento. Entretanto, possvel notar que as enzimas presentes na casca apresentam uma maior estabilidade a 50 C, enquanto que aquelas presentes na polpa, apresentam maior estabilidade trmica a 70 C. A enzima imobilizada apresentou uma atividade maior do que a enzima livre. Isto ocorre porque a enzima livre se encontra junto ao extrato, onde pode haver algumas substncias inibidoras da peroxidase, alm de outras reaes secundrias. J a peroxidase imobilizada esta livre de interferentes, sendo disponibilizada inteiramente para reao. Foi constatado que so necessrios apenas 30 minutos para que a peroxidase seja imobilizada pelos dois compsitos. Comparando-se este resultado com os citados na literatura, pode-se concluir que a peroxidase da S. lycocarpum imobilizada em Pani/Sty-DVB representa uma opo vantajosa pela expressiva economia no tempo de imobilizao. A possibilidade de reutilizao da enzima imobilizada nos compsitos por at 10 vezes, sem reduo da atividade, mostrou ser um fator econmico chave para a soluo dos problemas de alto custo inicial. Isto particularmente importante para enzimas imobilizadas, em que a reciclagem do catalisador, a manuteno da atividade por longos perodos de uso, bem como, a estabilidade da ligao suporte-enzima so essenciais para o desenvolvimento de processos economicamente viveis. Isto se acentua ainda mais, pelo fato de que os compsitos so de fcil recuperao, visto que, os mesmo podem ser separados do meio reacional por uma simples filtrao a vcuo, podendo, ser empregada no abatimento ou na oxidao de fenol e de compostos fenlicos em guas residurias, provenientes de indstrias txteis ou na adsoro de cromo (VI) de solues aquosas.

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1 INTRODUO
Por definio, as enzimas so protenas que catalisam processos qumicos em condies suaves e com elevada seletividade e estereoespecificidade. As enzimas tm a habilidade de realizar aumentos enormes nas velocidades das reaes; em muitos casos, as velocidades das reaes catalisadas por enzimas so mais rpidas do que aquelas nocatalisadas em fatores de 106-1012. Para os organismos vivos, melhoramentos nas velocidades dessa grandeza so importantes porque eles permitem que as reaes ocorram em velocidades razoveis, mesmo em condies moderadas que existem nas clulas vivas (pH aproximadamente 7 e uma temperatura aproximadamente de 35 C). As reaes catalisadas por enzimas so completamente estereoespecficas, e essa especificidade vem da maneira como as enzimas se ligam a seus substratos. Apesar de as enzimas serem absolutamente estereoespecficas, elas freqentemente variam consideravelmente no que chamado de sua especificidade geomtrica (SOLOMOS & FRYNLE 2006). Alm disso, exibem um nmero de caractersticas que as tornam muito vantajosas quando comparadas a outros agentes catalticos convencionais, visto que, possuem um alto nvel de eficincia cataltica e alto grau de especificidade. Em adio, as enzimas so facilmente biodegradveis, facilmente removidas dos rios contaminados e facilmente padronizadas em preparaes comerciais. Geralmente atuam em condies moderadas de temperatura, presso e pH. A Engenharia Enzimtica apareceu como rea de investigao durante a dcada de 60, com a imobilizao de enzimas para utilizao em processos qumicos. Desde ento, o universo de aplicaes de processos enzimticos tem conhecido um importante desenvolvimento: biossensores, terapia enzimtica, sntese qumico-enzimtica de compostos bioativos, obteno de novos biopolmeros, processos em indstrias tradicionais como os curtumes, o papel, o txtil, entre outros. Atravs da biocatlise combinatorial, possvel obter uma vasta biblioteca de compostos qumicos. Dentre as enzimas, encontram-se as peroxidases cuja histria remete aos anos de 1855, quando Schoenbein observou que extratos de cogumelos e tecidos animais desenvolviam uma cor azul na presena de soluo de guaiaca do mesmo modo que gua clorada, cido nitroso, permanganato e hipoclorito. Os extratos podiam utilizar perxidos na oxidao da tintura de guaica. Schoenbein concluiu que esses extratos eram hbeis em ativar o oxignio atmosfrico (ozonizar). Linossier, em 1898, obteve uma preparao de peroxidases livre de oxidases a partir de leuccitos e considerou-as

peroxidases como sendo uma classe separada hbil a reagir apenas com perxidos. Em 1903 Chodat e Bach propuseram que oxidases eram misturas de oxigenases capazes de ativar o oxignio a perxidos e as peroxidases eram enzimas que utilizavam os perxidos. Tais observaes resultaram na diviso dessa famlia de oxidoredutases em trs classes: protoheme peroxidases; verdoperoxidases e flavoprotenas peroxidases (PAUL, 1963). As peroxidases esto distribudas em larga escala nas plantas e inclusive na S. lycocarpum. Esto envolvidas em diversas reaes, tais como sntese de polissacardeos, oxidao de fenis, defesas de patgenos, regulao da elongao de clulas e outras (GASPAR et al., 1982; KAO, 2003). Entretanto, caractersticas como instabilidade quando removidas do seu ambiente natural e elevado custo de isolamento e purificao, apresentadas pelas enzimas e, conseqentemente pelas peroxidases, continuam a ser fatores desencorajadores para o seu uso extensivo, especialmente em reas que tm correntemente processos alternativos estabilizados. Dentre as abordagens utilizadas na Tecnologia Enzimtica na tentativa de solucionar esses problemas, a imobilizao de enzimas desponta como uma das ferramentas mais versteis (FERNANDES, 2000). Dentre os vrios mtodos de imobilizao, a imobilizao de enzimas atravs da formao de ligaes covalentes entre um grupo ligante da enzima e o suporte insolvel um dos mtodos mais largamente utilizados e investigados (KENNEDY & CABRAL, 1987; ZABORSKI, 1974). Este mtodo emprega os mais variados tipos de ligao, sendo possvel imobilizar uma enzima atravs de qualquer um de seus grupos superficiais reativos. Assim sendo, h uma gama imensa de reaes que podem ser utilizadas para imobilizao via ligao covalente (FERNANDES, 2000). As enzimas, como a peroxidase, tm sido covalentemente ligadas a uma variedade de suportes polimricos insolveis em gua. Em anos recentes, uma classe de polmeros orgnicos, denominados de polmeros condutores, tem atrado uma ateno considervel e tm sido cada vez mais empregados como suportes para imobilizao de enzimas (GERARD et al., 2002). Entre estes, a polianilina (PANI) ocupa um importante lugar por causa de suas propriedades nicas, incluindo boa estabilidade qumica em condies ambientais, facilidade de polimerizao e dopagem e baixo custo (RUOTOLO, 2003). Ao lado de todas estas interessantes propriedades, a polianilina pode comportar-se tambm como um suporte polimrico adequado para a imobilizao de enzimas. Isto pode ser atribudo s suas caractersticas qumicas, tais como facilidade 2

de preparao, elevado rendimento de sntese, elevada estabilidade em valores extremos de temperatura e pH e resistncia a ataques de microrganismos (FERNANDES et al., 2003; FERNANDES et al., 2004). Alm disso, uma das formas mais promissoras de aumentar a processabilidade da Pani consiste na preparao de compsitos que possuam caractersticas hbridas, podendo apresentar melhores propriedades mecnicas, trmicas, qumicas, eltricas, entre outras (LOBO, 2005). Dessa forma, a imobilizao de peroxidase nos compsitos de Pani/Sty-DVB, pode-se apresentar como uma importante alternativa na soluo dos problemas apresentados pelas enzimas, quando removidas do seu ambiente natural. Neste contexto, o presente trabalho tem por objetivo preparar o compsito polianilina/estireno-divinilbenzeno (Pani/Sty-DVB) em presena de cido clordrico e (HC) e cido ntrico (HNO3), por meio da polimerizao oxidativa da polianilina. Os compsitos sero empregados para imobilizar a enzima peroxidase, extrada da Lobeira (S. lycocarpum St. Hill), em presena de poliglutaraldedo e em pH 6,0.

2 REVISO DA LITERATURA
2.1 O BIOMA CERRADO

O Brasil composto por seis biomas: Cerrado, a Caatinga, o Pantanal e as Florestas Amaznica, Atlntica e Meridional, como representado na Figura 1. A vegetao de Cerrado cobre dois milhes de km2, representando 23% do territrio brasileiro. Esse o segundo maior bioma do Brasil, superado apenas pela Floresta Amaznica, com aproximadamente 3,5 milhes de km2. O Cerrado estende-se desde reas marginais da Floresta Amaznica a reas do sul de So Paulo e Paran, ocupando mais de 20 de latitude e atingindo altitudes de 1.800 m. Alm do Brasil, reas de Cerrado podem ser encontradas tambm na Bolvia, no Paraguai e na Venezuela (RATTER et al., 1997).

Figura 1 Mapa dos biomas brasileiros, com destaque para o Cerrado ao centro. (IBGE, 2007, departamento de Geografia).

As temperaturas mdias anuais no Cerrado variam de 18 a 28 C, e a precipitao pluviomtrica oscila entre 800 e 2000 mm com uma forte estao seca de variada amplitude durante o inverno (DIAS, 1996). No Brasil, o Cerrado constitudo de cinco diferentes fitofisionomias, as quais apresentam dois extremos, uma fisionomia florestal denominada cerrado, onde h predomnio da vegetao lenhosa e uma fisionomia campestre, o campo limpo, onde, alm da vegetao herbcea, se encontram tambm pequenos subarbustos. As demais fitofisionomias, cerrado sensu stricto, campo cerrado e campo sujo, so vegetaes ecotonais entre o cerrado e o campo limpo (COUTINHO, 1978). A biodiversidade total foi estimada em cerca de 160.000 espcies de plantas, animais e fungos, das quais 10.000 espcies vegetais pertencem ao grupo das angiospermas (DIAS, 1992). O solo no Cerrado na maioria das vezes possui baixa disponibilidade de nutrientes, baixo pH e alta concentrao de alumnio. Geralmente so solos profundos e bem drenados (LOPES & COX, 1977). Porm, os variados tipos de solo que ocorrem nesse bioma fazem com que, dentro de extensa rea ocupada por essa vegetao, existam regies floristicamente distintas, definidas por espcies mais bem adaptadas s condies locais (DURIGAN et al., 2003a). Muitos outros fatores so tambm responsveis pelo mosaico vegetacional no Cerrado, clima, fogo e aes antrpicas (COUTINHO, 1990; PIVELLO e COUTINHO, 1996; RATTER et al., 1997; DEZZEO et al., 2004). O bioma Cerrado compartilha espcies com a maioria dos biomas brasileiros, tais como a floresta Amaznica, a Caatinga e a Floresta Atlntica (EITEN, 1994 apud ALMEIDA, 1998). Isso o destaca como uma grande fonte de recursos, que podem ser utilizados na medicina, indstria de alimentos e farmacutica, alm da biotecnologia (RIBEIRO & WALTER, 1988 apud FREITAS & TEIXEIRA, 2004). Entretanto, cerca de 57% da vegetao original de cerrado do pas j foram completamente destrudas e a metade das reas remanescentes encontra-se bastante alterada. A taxa anual de desmatamento do bioma foi estimada em 1,5% ou trs milhes de hectares ao ano, taxa dez vezes maior que a estimada para a Floresta Atlntica (MACHADO et al., 2004). Atualmente, apenas cerca de 2% do Cerrado encontra-se protegido em Unidades de Conservao (KLINK et al., 2005). Alm disso, a distribuio das reas protegidas no homognea pelo bioma e, como conseqncia, uma parte importante da 5

diversidade no est incorporada na rede nacional de reas protegidas (SILVA & BATES, 2002). Dessa maneira, um aspecto relativo conservao do Cerrado identificar espcies cujo potencial biotecnolgico, poder contribuir para a conservao e o reflorestamento desse bioma. 2.2 CARACTERSTICAS DA FAMLIA SOLANACEAE As solanceas tm distribuio cosmopolita, com cerca de 90 gneros (MARTINS & COSTA, 1999) e mais de 3500 espcies (DARCY, 1986; DARCY, 1991). Esto amplamente distribudas nos trpicos e nas regies temperadas, com maior centro de disperso na Austrlia e na Amrica Latina. O Brasil apresenta cerca de 30% dos gneros (26) e aproximadamente 10% (362) de todas as espcies de Solanaceae do mundo (BARROSO, 1991). Na Amrica do Sul encontra-se a sua maior diversidade, assim considera-se que esta regio seja o seu provvel centro de origem (HUNZIKER, 1979). A distribuio das espcies responde aos fatores climticos e edficos e disponibilidade de recursos. As interaes biticas e os fatores histricos, como perturbao natural e humana, tambm influenciam os padres de distribuio (MOTZKIN et al., 1999). Na primeira etapa da perturbao as espcies estabelecidas tm suas populaes reduzidas e/ou segundo Laurence e Bierregard (1997) pode ocorrer extino das plantas, tanto atravs de aes diretas sobre elas quanto atravs de efeitos indiretos nos polinizadores e/ou nos dispersores de sementes. Essas interaes entre planta, polinizador e dispersor so fundamentais na estruturao de comunidades, pois podem influenciar na sua distribuio espacial, na riqueza e abundncia de espcies, na estrutura trfica e na fenodinmica (JANZEN, 1970; HEITHAUS, 1974; BAWA et al., 1985; MORELLATO, 1991). Muitas espcies de Solanaceae so conhecidas por se distriburem amplamente em reas perturbadas, sendo consideradas espcies pioneiras (BOHS, 1994; SILVA et al., 1996; NEPSTAD et al., 1998; TABARELLI et al., 1999). No entanto, ao contrrio da maioria das espcies pioneiras apresentam, predominantemente, disperso zoocrica, principalmente quiropterocrica e ornitocrica. Outras espcies apresentam restries ecolgicas como Solanum inodorum Vell (na Serra do Japi, So Paulo, Brasil) que ocorre acima de 800 m (Joo Vasconcellos-Neto, comunicao pessoal) e, no Mxico, Lycianthes monziniana, distribudo acima de 2000 m em florestas de pino-encino (NEE, 6

1986; WILLIAMS, 1993). Esse fato pode ser atribudo grande diversidade de espcies e de hbitos de vida desse grupo, apresentando desde rvores, arbustos, ervas e lianas, s vezes semiepfitas (Markea e Juanulloa), ou ervas rizomticas, quase acaules (Jaborosa), muitas vezes armadas (Acnistus, Grabowskia e Solanum) ou inermes (BARROSO, 1991). Algumas espcies de Solanaceae so de grande importncia na alimentao humana, como Lycopersicon esculetum Mill (tomate), Solanum tuberosum L. (batata) e Capsicum spp (pimenta) (GENTRY & DARCY, 1986; NEE, 1986). Sua grande variedade e quantidade de metablitos secundrios (alcalides, esterides, flavonides, terpenos, dentre outros) so de particular interesse na rea mdica, farmacolgica e toxicolgica (EVANS, 1986; RODDICK, 1986). 2.2.1 Solanum lycocarpum Entre as plantas do gnero Solanum, encontra-se a Solanum lycocarpum A. St. Hill., popularmente conhecida como lobeira ou fruta do lobo. A S. lycocarpum uma planta arbustiva nativa das regies do cerrado brasileiro (LORENZI, 1991; KISSMAN & GROTH, 1995). Seu fruto uma baga verde globosa, volumosa e carnuda, amarelada quando madura, revestida de pilosidade, pesando at 500 g (CORRA, 1984). A lobeira apresenta grande importncia ecolgica como fonte de alimento para animais silvestres (ALMEIDA et al. 1998), em especial o lobo-guar (Chrysocyon branchyurus, Canidae), considerado dispersor natural das sementes, pois consome seus frutos durante todo o ano, praticamente no danificando as sementes que consome, e as defeca em locais em que a planta ocorre freqentemente (MARTINS; MOTTA JR., 2000). A espcie Solanum lycocarpum ocorre principalmente em reas degradadas (SILVA JUNIOR, 2005). Seus frutos possuem sementes numerosas de emergncia fcil e rpida (ALMEIDA et al, 1998), apresenta crescimento rpido e resistncia seca e ocorre em solos de baixa fertilidade. Martins (2005) comenta que a espcie tambm utilizada pelo homem como ornamental e em sua dieta, para fabricao de doces, ou como medicinal, no tratamento de doenas cutneas (ALMEIDA et al., 1998). Pode tambm ser considerada como espcie indicadora da ocorrncia da interveno humana (MARTINS, 2005).

2.2.2 Anlise Qumica e Bioqumica Na fruta-de-lobo madura podem ser encontrados vrios compostos como gua, acares (sacarose, glicose e frutose), nions (C1-, H2PO41- e HPO42-), ctions (Ca2+, Mg2+ e K1+), lcoois, steres, flavonides, glicosdeos, fenis, aminocidos, vitaminas, alcalides, terpenos, lipdeos e cidos orgnicos. Durante a maturao do fruto, o amido degradado, convertendo-se em acares solveis que contribuem para o sabor adocicado dos frutos maduros (AWAD, 1993). Corra et al. (2000), estudando o amadurecimento da fruta-de-lobo, encontraram 9,98% de amido na fruta verde e 3,92% no final do amadurecimento. Alm disso, estudos feitos por Oliveira-Jnior (2002), mostraram que os teores de vitamina C, slidos solveis totais, sacarose, fsforo e ferro da fruta-de-lobo, quando comparados com a banana, abacaxi, laranja e manga, mostraram-se equivalentes ou superiores a eles, indicando que o fruto da lobeira pode ser utilizado como alimento alternativo (ROCHA, 2006). Esses trabalhos indicam que o fruto da lobeira uma grande fonte de carboidratos, protenas e minerais e esses compostos participam da composio primria e secundria dos organismos. Os minerais correspondem frao inorgnica do alimento. Os compostos inorgnicos mais encontrados no corpo humano so: o potssio, magnsio, ferro e fsforo, em sua maioria na forma de ons. Estes participam de reaes qumicas intracelulares, dos processos de contrao muscular, conduo do impulso nervoso, e ainda da composio dos ossos, o que justifica a importncia de sua ingesto (MONTGOMERY et al.,1994; RAVEN et al, 2001). Os carboidratos, conhecidos tambm como glicdios, so a principal fonte energtica dos organismos, e ainda atuam como importantes elementos estruturais nas clulas. Dentre os mais simples esto os monossacardeos, como a frutose e a glicose, dentre os mais complexos esto os polissacardeos, como o amido e glicognio. As principais fontes dos carboidratos para o consumo do ser humano esto entre as massas, frutas e tubrculos. As plantas produzem e estocam os carboidratos pela realizao da fotossntese, acumulando-os sob a forma de amido, principalmente nas razes (RAVEN et al., 2001). Os compostos denominados secundrios so protenas especficas (enzimas), os fenis e os inibidores de protenas. Estes participam da sobrevivncia da planta no 8

ecossistema (SANTOS, 2000 apud CAMARGOS, 2002) estando envolvidos na resistncia contra pragas e doenas, na atrao de agentes polinizadores e ainda na interao de microrganismos simbiticos (VERPOORTE et al., 2000 apud CAMARGOS, 2002). As protenas esto entre as mais abundantes molculas orgnicas e desempenham diversas funes nos sistemas vivos (RAVEN et al, 2001). Dentre as suas inmeras funes, podem ser destacadas a sua participao como componente do citoesqueleto, a sua atuao como catalisador de reaes qumicas celulares, alm de servirem de transportadores para as molculas insolveis. As protenas constituem-se principalmente de aminocidos (existem 20 tipos bsicos), e estes so divididos em dois grupos de importncia nutricional: os essenciais, que precisam ser ingeridos, e os naturais, que o prprio corpo humano sintetiza. A deficincia na ingesto de protenas/aminocidos pode ocasionar transtornos no transporte de gases oxignio e gs carbnico, distrbios no crescimento e retardo mental de crianas (BURTON, 1979). As enzimas, catalisadores de reaes, atuam sobre substratos especficos. As peroxidases esto distribudas em larga escala nas plantas e inclusive na S. Lycocarpum. Esto envolvidas em diversas reaes, tais como sntese de polissacardeos, oxidao de fenis, defesa de patgenos, regulao da elongao de clulas e outras (GASPAR et al., 1982; KAO, 2003). A oxidao de compostos fenlicos ocorre na presena de oxignio, em que a peroxidase os transforma em quinonas coloridas, que participam posteriormente das reaes de polimerizao, para dar origem s melonoidinas, caracterizadas pelo aparecimento da colorao marrom-escura nos frutos (LIMA et al, 2001). Alm disso, as enzimas so de grande importncia em biotecnologia, o que as faz alvos de inmeros estudos. 2.3 ENZIMAS A histria da enzimologia, a cincia que estuda enzimas, se confunde com a histria da bioqumica. Ambas tiveram seu incio no sculo XIX, com as investigaes pioneiras sobre os processos de fermentao e digesto. A primeira Teoria Geral da Catlise Qumica foi postulada pelo qumico Jacob J. Berzelius, em 1835, partindo da observao de que extratos de malte, chamados poca de diastase e que hoje sabe-se contm uma mistura de amilases, catalisava a hidrlise de amido mais eficientemente do que o cido sulfrico (VOET & VOET, 1995). 9

Quase dois sculos depois, a qumica continua a ser o sustentculo para a elucidao dos mecanismos envolvidos na catlise enzimtica. Por outro lado, a complexidade e o grande nmero de reaes ocorrendo simultaneamente nos sistemas vivos fazem da bioqumica um instrumento essencial para a compreenso das implicaes biolgicas dessas reaes. A expanso do conhecimento e aplicaes desse tipo de catlise nos dias atuais, com todas as vantagens que lhe so inerentes, tem convocado a participao cada vez mais efetiva daqueles que detm o conhecimento das cincias qumica e bioqumica, para a soluo de alguns problemas (FERNANDES, 2000). As enzimas exibem um nmero de caractersticas que as tornam muito vantajosas quando comparadas com outros agentes catalticos convencionais qumicos, pelo seu alto nvel de eficincia cataltica, e alto grau de especificidade. Em adio, as enzimas so facilmente biodegradveis, facilmente removidas dos rios contaminados e facilmente padronizadas em preparaes comerciais. Geralmente atuam em condies moderadas de temperatura, presso e pH. Estas caractersticas promovem processos de pouca energia e com custos mais reduzidos (ZILLE, 2005). Contudo, a instabilidade comum nas enzimas, quando removidas do seu ambiente natural. O seu elevado custo de isolamento e purificao continua a ser desencorajador para o seu uso extensivo, especialmente em reas que tm correntemente processos alternativos estabilizados. Para alm destas desvantagens, o estudo de aplicaes enzimticas de um interesse constante e os seus problemas tecnolgicos so usualmente dominados (CHAPLIN & BUCKE 1990). Por definio, enzimas so protenas que tm por caracterstica funcional a capacidade de catalisar reaes e se diferem em alguns aspectos dos catalisadores qumicos por possurem maior capacidade cataltica (aumentam a velocidade das reaes em 106 a 1012 vezes) por trabalharem em condies suaves, tais como temperatura inferior a 100 C e presso atmosfrica, pH prximo a neutralidade e, finalmente, por apresentarem especificidade alta por seus substratos (reagentes) e produtos (BUGG 1997; VOET & VOET, 1995). Tais aspectos logo atraram a ateno daqueles que atuam na indstria biotecnolgica, de forma que enzimas vm sendo utilizadas como catalisadores em processos industriais h mais de 50 anos, pois representam uma considervel economia de tempo, energia e investimentos em equipamentos resistentes corroso e a altas presses e temperaturas (BON, 1999; BUGG, 1997). 10

Dentre as enzimas, encontra-se a classe das peroxidases, e nesta esta contida a peroxidase, uma enzima que vem sendo bastante estudada, principalmente pela propriedade de catalisar uma larga variedade de reaes. 2.3.1 Peroxidase Em 1855, Schoenbein observou que extratos de cogumelos e tecidos animais desenvolviam uma cor azul na presena de soluo de guaiaca do mesmo modo que gua clorada, cido nitroso, permanganato e hipoclorito. Os extratos podiam utilizar perxidos na oxidao da tintura de guaica. Schoenbein concluiu que esses extratos eram hbeis em ativar o oxignio atmosfrico (ozonizar). Linossier, em 1898, obteve uma preparao de peroxidases livre de oxidases a partir de leuccitos e considerou peroxidases como sendo uma classe separada hbil a reagir apenas com perxidos. Em 1903 Chodat e Bach propuseram que oxidases eram misturas de oxigenases capazes de ativar o oxignio a perxidos, e peroxidases enzimas que utilizavam os perxidos. Tais observaes resultaram na diviso dessa famlia de oxidoredutases em trs classes: protoheme peroxidases; verdoperoxidases e flavoprotenas peroxidases (PAUL, 1963). Posteriormente, Dunford e Stillman propuseram uma classificaco das peroxidases, em funo da espcie reativa que elas utilizavam, em superxido dismutases, capazes de utilizar o nion superxido; catalases, que utilizam o on perxido com conseqente produo de gua; e peroxidases, que utilizam os perxidos para oxidao de compostos reduzidos, sendo que todas as trs classes de peroxidases tm em comum o fato de conterem ferro ou cobre e serem geralmente hemoprotenas (DUNFORD & STILLMAN, 1976). O fato de que uma das classes de peroxidases tem o nome da famlia dessas enzimas gera em algumas ocasies certa controvrsia, que se agrava pelo fato de que os membros da classe das peroxidases so ubiquamente distribudas na natureza, com uma lista extensa de fontes dessas enzimas (DUNFORD & STILLMAN, 1976; RUZGAS et al., 1995; GOODWIN et al., 1995). Segundo Jones et al. (1998), de to extensa, essa classe de enzimas tem sido grosseiramente subdividida em: Classe I enzimas intracelulares (por ex. citocromo c e ascorbato peroxidase); Classe II enzimas secretrias de origem fngica (por ex. lignina e mangans peroxidase) e;

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Classe III enzimas secretrias de plantas (por ex. peroxidase de raiz forte e de amendoim). A larga distribuio dessas enzimas sugere que elas sejam de grande importncia biolgica. Estas enzimas em plantas esto envolvidas em uma grande variedade de processos fisiolgicos, tais como a biossntese e degradao de lignina, resposta de defesa e reparo contra injria, biossntese e polimerizao de extensinas e no metabolismo de auxinas (RIQUELME & CARDEMIL, 1995). No entanto, o exato papel que elas desempenham no metabolismo no est claro, devido ao grande nmero de reaes que elas catalisam e o considervel nmero de isoenzimas existentes (PADIGLIA et al., 1995). Comum entre elas o fato de catalisarem a oxidao, pelo perxido de hidrognio ou compostos relacionados, de uma variedade de compostos orgnicos e inorgnicos, bem como possurem como grupo prosttico a Hemina ou Ferriprotoporfirina IX, como mostra a Figura 2 (DUNFORD & STILLMAN, 1976; GOODWIN et al., 1995). CH = CH2 CH3

CH3 N Fe N CH 3 N N

CH=CH 2

CH3

HOOCCH2CH2 CH2CH2COOH Figura 2 Ferriprotoporfirina IX ou Hemina (1,3,5,8-tretametil-2,4-divinilporfina-6,6cido diproprinico).

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O mecanismo das reaes catalisadas pela peroxidase tem sido largamente estudado e j est bem estabelecido, podendo ser dividido em 3 etapas, representadas pelas Equaes 1 a 3. POD + H2O2 Composto I + AH2 Composto II + AH2 Composto I + H2O Composto II + AH. POD + AH. + H2O (Eq. 1) (Eq. 2) (Eq. 3)

Na primeira etapa (Eq. 1), o grupo prosttico heme da POD enzima sofre oxidao pela H2O2 (ou perxidos orgnicos), perdendo dois eltrons, e resultando na formao de um intermedirio instvel, chamado Composto I, que consiste em um complexo ferro-oxiferril (Fe4+ = O) com um radical ction porfirina, (FERNANDES, 2000). Na segunda etapa (Eq. 2), o radical ction porfirina recebe um eltron de um substrato orgnico reduzido (AH2), produzindo um radical livre do substrato correspondente (AH ) e um intermedirio heme-oxiferril conhecido como Composto II (FERNANDES, 2000). Na ltima etapa (Eq. 3), ocorre uma subseqente reduo por um eltron do Composto II por uma segunda molcula de substrato reduzido (AH2), resultando na recuperao da enzima nativa [POD(Fe+3)] (RUZGAS et al., 1995; GOODWIN et al., 1995). H varias rotas de reaes possveis para os radicais livres formados a partir do substrato reduzido, dependendo de suas caractersticas qumicas e reatividade, representadas pelas Equaes 4 a 6 (RUZGAS et al., 1995): AH. + AH. AH. + AH. AH. + O2 HA A AH AH + AH2 + O2
_

(Eq. 4) (Eq. 5) (Eq. 6)

A peroxidase catalisa uma larga variedade de reaes orgnicas de oxidoreduo, tais como desmetilao, descarboxilao, halogenao, hidroxilao e polimerizao por condensao (CHEN & NOBE, 1993). Os principais substratos doadores de eltrons para essa enzima so da classe dos fenis e naftis (pirogalol,

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resorcinol, hidroquinona, entre outros) e aminas aromticas (anilina, benzidina, ortodianizidina, entre outros) (FERNANDES, 2000). Apesar de suas admirveis caractersticas, a ampliao do uso de enzimas tem se deparado com a barreira econmica. O custo de purificao, mesmo que parcial, ou ainda da produo desses catalisadores tem barrado seu uso disseminado e, algumas vezes, tornado seu uso proibitivo em processos industriais. Foi neste contexto que os esforos de vrias reas de pesquisa se somaram, resultando no surgimento de uma nova rea de estudo e pesquisa, a Tecnologia Enzimtica (FERNANDES, 2000). Dentre as abordagens utilizadas na Tecnologia Enzimtica na tentativa de solucionar esses problemas, a Imobilizao de Enzimas desponta como uma das ferramentas mais versteis (FERNANDES, 2000). 2.4 IMOBILIZAO DE ENZIMAS Muito antes que as tcnicas de imobilizao fossem conhecidas, catalisadores imobilizados j estavam em uso em processos em escala industrial (WINFRIED, 1988). Em 1815 foi descoberto, por meio puramente emprico, que o vinagre poderia ser eficientemente produzido pelo lcool contido em raspas de alimentos, devido s bactrias aderidas nestes pequenos pedaos de matria, constituindo um sistema de imobilizao efetiva. O desenvolvimento de um mtodo de origem puramente emprico no torna esse processo totalmente invivel em biotecnologia. De fato, muitos processos que utilizam microorganismos, assim como a produo de bebidas alcolicas, queijos e pes j eram praticados muito antes da descoberta do envolvimento destes microrganismos (WINFRIED, 1988). Em 1916 foi reportado por Nelson e Griffin que o carvo ativo conservava sua habilidade de romper a sacarose aps o contato com o fermento de invertase e lavagens subseqentes, sendo o primeiro artigo publicado a respeito de imobilizao de enzimas. Por muito tempo nenhuma ateno foi dada a este assunto, porm, aps a Segunda Guerra Mundial, novos estudos nesta rea apareceram. As publicaes ressurgiram durante os anos 50 demonstrando o desempenho de polmeros sintticos para o uso em imobilizao de protenas (WINFRIED, 1988). Devido a importncia do assunto, foi realizada a primeira Conferncia de Engenharia de Enzimas nos EUA, em 1971, com maior nfase aos temas relacionados imobilizao de enzimas. Entre outras coisas o termo enzima imobilizada foi 14

recomendado nesta primeira reunio, no sentido de normalizar a linguagem cientfica com relao aos diferentes nomes usados at quela data, tais como enzimas fixadas, insolubilizadas, ligadas a matriz, dentre outras (WINFRIED, 1988). Uma das definies mais abrangentes de enzimas imobilizadas a que considera imobilizadas enzimas que esto fisicamente confinadas, ou localizadas em uma certa regio definida do espao, com reteno de suas atividades catalticas, e que podem ser usadas repetidamente e continuamente (CHIBATA et al., 1978). H vrios meios de se classificar os mtodos atualmente utilizados para imobilizar enzimas. Kennedy & White (1986), propuseram uma classificao que combina a natureza da interao responsvel pela imobilizao com a natureza do suporte utilizado, como mostra a Figura 3.

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Figura 3 Fluxograma de classificao dos mtodos de imobilizao (KENNEDY & WHITE, 1985).

15

preciso ter em mente o sistema onde a enzima imobilizada vai ser utilizado no momento da escolha do mtodo de imobilizao, uma vez que, cada mtodo traz em si limitaes que precisam ser consideradas (FERNANDES, 2000). A imobilizao de enzimas atravs da formao de ligaes covalentes entre um grupo ligante da enzima e o suporte insolvel um dos mtodos mais largamente utilizados e investigados (KENNEDY & CABRAL, 1987; ZABORSKI, 1974). Este mtodo emprega os mais variados tipos de ligao, sendo possvel imobilizar uma enzima atravs de qualquer um de seus grupos superficiais reativos. Assim sendo, h uma gama imensa de reaes que podem ser utilizadas para imobilizao via ligao covalente (FERNANDES, 2000). Deve ser tomado um cuidado especial para que grupos importantes para o desempenho da atividade cataltica no sejam envolvidos na formao da ligao covalente entre enzima e suporte, o que teria como conseqncia uma enzima retida desprovida de atividade (FERNANDES, 2000; ALFAYA & KUBOTA, 2002). Inconvenientes desta tcnica incluem as condies mais drsticas e maior nmero de etapas de reao e, conseqentemente, mais tempo para sua realizao. No entanto, uma vez imobilizada adequadamente, essas preparaes apresentam grande estabilidade, de forma que somente alteraes muito drsticas no meio sero capazes de interferir neste tipo de ligao (KENNEDY & WHITE, 1986; ALFAYA & KUBOTA, 2002). 2.4.1 Escolha do Mtodo de Imobilizao A escolha do mtodo de imobilizao a ser utilizado passa, necessariamente, por uma anlise da aplicao a que se destina o sistema contendo a enzima imobilizada. Uma vez definida a aplicao e as condies operacionais onde a enzima dever atuar, pode-se ento avaliar, dentre as tcnicas disponveis, aquela que melhor se adequar s necessidades exigidas (FERNANDES, 2000). Outros parmetros no menos importantes so o tempo e os custos necessrios para se viabilizar o mtodo de imobilizao escolhido, uma vez que eles iro refletir no processo e, portanto, nos custos do produto final. Na Tabela 1 esto apresentados, de modo resumido e comparativo, alguns parmetros a serem observados quando da escolha do mtodo de imobilizao (KENNEDY & WHITE, 1986 APUD FERNANDES, 2000). 16

Tabela 1 Comparao entre os atributos de alguns mtodos de Imobilizao (KENNEDY & WHITE, 1986).
Caracterstica Preparao Fora da ligao Atividade Enzimtica Regenerao do suporte Custo da imobilizao Estabilidade Aplicao Generalizada Proteo contra Ataque Microbiano Ligao Cruzada
Mdia Forte Baixa Impossvel Mdio Alta No Possvel

Adsoro Ligao Fsica


Simples Fraca Mdia Possvel Baixo Baixa Sim No

Quelao com metal


Simples Mdia Alta Possvel Mdio Mdia Sim No

Ligao Covalente
Difcil Forte Alta Rara Alto Alta No No

Inica
Simples Mdia Alta Possvel Baixo Mdia Sim No

Aprisionamento
Difcil Mdia Baixa Impossvel Mdio Alta Sim Sim

2.4.1.1 Suportes para imobilizao de enzimas Muitos suportes orgnicos, sejam naturais, sejam sintticos, tm sido propostos para a imobilizao de enzimas e a predominncia do uso desses sobre os inorgnicos deve-se, principalmente, versatilidade que esses materiais tm de participarem de um grande nmero de diferentes reaes, o que favorece sua ativao. Por outro lado, sua aplicao em muitas reas limitada por sua pobre estabilidade dimensional, bem como a dificuldade de recuperao do catalisador do meio de reao por mtodos simples (KENNEDY & WHITE, 1986). Outro inconveniente associado aos suportes orgnicos, particularmente os naturais e seus derivados, a susceptibilidade ao ataque de microrganismos. Os suportes inorgnicos tm a slica e vidros de poro controlado como seus principais representantes, com um grande volume de trabalhos publicados utilizando-se esses materiais (ZABORSKI, 1974; KENNEDY & WHITE, 1986; CHEETHAN, 1986). A possibilidade de obteno de materiais com propriedades morfolgicas variadas, tais como dimetros do poro, rea superficial e forma das partculas, somada s propriedades mecnicas, particularmente, a baixa compressibilidade, tornaram tais

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suportes os elementos de escolha para montagem de reatores para aplicaes industriais (KENNEDY & WHITE, 1986; CHEETAN, 1986). A principal desvantagem do uso desse tipo de suporte, alm de um nmero limitado de reaes de ativao, principalmente a baixa estabilidade em faixas alcalinas de pH. Na Tabela 2 so apresentados alguns exemplos de suportes orgnicos e inorgnicos utilizados em processos de imobilizao (FERNANDES, 2000). A escolha do suporte to importante quanto a escolha do mtodo de imobilizao a ser utilizado em um determinado sistema (ALFAYA & KUBOTA, 2002; FERNANDES, 2000). Alguns cuidados devem ser tomados nessa escolha, uma vez que, aps a imobilizao, o suporte ser o principal constituinte do microambiente em que a enzima estar imobilizada. Neste sentido, aconselhvel que sejam avaliadas algumas caractersticas do sistema, que serviro de guia no processo de escolha do material mais adequado. Em primeiro lugar, devemos considerar novamente a aplicao e, portanto as condies em que o par suporte-enzima devero atuar. Suportes com limitaes de estabilidade em extremos de pH jamais podero ser utilizados em faixas de pH prximas quelas em que se tornam susceptveis degradao, pois comprometero o sistema. Do mesmo modo, a estabilidade trmica do material importante, quando as condies de atuao requerem altas temperaturas. Portanto, devemos em primeiro lugar analisar as caractersticas do material e sua adequabilidade s condies operacionais. Em seguida, devemos lembrar que to logo se d a imobilizao, o suporte ser o material mais prximo da enzima e, portanto, o fator mais importante na constituio do microambiente onde a catlise ocorrer. Neste sentido, importante avaliar as caractersticas fsico-qumicas desse material e sua relao com os substratos e produtos da reao, de modo a prevenir interaes indesejadas entre eles, tais como alterao no pH timo da enzima, adsoro de substrato ou produto, alterao na afinidade da enzima pelos substratos, resistncia a transferncia de massa e difuso de solutos, entre outras. Tabela 2 Exemplos de Suportes Insolveis Para Imobilizao de Enzimas (FERNANDES, 2000).

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Classificao Suportes orgnicos - naturais Agar / Agarose Carbono ativado Celulose Colgeno Dextranas Gelatinas Quitina / Quitosana Seda Suportes orgnicos - sintticos

Suporte

Copolmeros de cido acrlico / metacrlico Copolmeros de anidrido malico Poli(amida) Poli(anilina) Poli(estireno) Poli(pirrol) Poli(vinillcool) Polmeros de acrilamida

Suportes inorgnicos

Alumina Celite Hidroxiapatita xidos metlicos hidratados Slica Titnio Vidro de poro controlado Zircnio

2.4.1.2 O suporte ideal A busca pelo suporte ideal para imobilizao continua a ser um dos campos mais estudados da Tecnologia Enzimtica. Kennedy & White (1986) destacam algumas caractersticas, como favorecer a ligao do substrato, impedir o crescimento bacteriano, ser estvel nas condies de reao, ter longo perodo de vida til e alta capacidade de reteno de enzimas, importantes para se considerar um suporte ideal. 2.4.2 IMOBILIZAO DAS PEROXIDASES

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As enzimas, como a peroxidase, tm sido covalentemente ligadas a uma variedade de suportes polimricos insolveis em gua. Em anos recentes, uma classe de polmeros orgnicos, denominados de polmeros condutores, tem atrado uma ateno considervel e tm sido cada vez mais empregados como suportes para imobilizao de enzimas (GERARD et al., 2002). Entre estes, a polianilina (PANI) ocupa um importante lugar por causa de suas propriedades, incluindo boa estabilidade qumica em condies ambientais, facilidade de polimerizao e dopagem, baixo custo e suas propriedades nicas (RUOTOLO, 2003). Ao lado de todas estas interessantes propriedades, a polianilina pode comportar-se tambm como um suporte polimrico adequado para a imobilizao de enzimas. Isto pode ser atribudo s suas caractersticas qumicas, tais como facilidade de preparao, elevado rendimento de sntese, elevada estabilidade em altas temperatura e pH e resistncia a ataques de microrganismos (FERNANDES et al., 2003; FERNANDES et al., 2004). As peroxidases tm sido objeto de numerosos estudos, incluindo o desenvolvimento de biossensores (ALFAYA & KUBOTA, 2002; RAZOLA et al., 2002), diagnstico clnico (KASAI, et al., 2002), biorremediao (BUDDE et al., 2001; GONZLEZ et al., 2006) e remoo de fenol e compostos fenlicos (LAI & LIN, 2005). Muitos suportes polimricos, naturais e sintticos, tm sido empregados nestes estudos, incluindo prolas naturais de quitina e quitosana (NAKA et al., 1998), poliestireno (BRYAN et al., 2002), polianilina (PANI) (FERNANDES, 2003; SAKHAROV, 2003; FERNANDES et al., 2004), tereftalato de etileno (KILLARD et al., 1999) e compsitos (YONGCHENG et al., 1997; CARAMORI & FERNANDES, 2004). Recentemente, Lobo (2005) realizou a incorporao da polianilina em copolmeros estireno-divinilbenzeno (Sty-DVB) em presena de cido ntrico e clordrico em diferentes concentraes, obtendo resultados satisfatrios para ambos os sistemas. Desta forma, estes compsitos de polianilina suportada em copolmero estireno-divinilbenzeno (PANI/Sty-DVB) surge como uma alternativa vivel para a imobilizao da enzima peroxidase em sua superfcie porosa. 2.5 OS COPOLMEROS ESTIRENO-DIVINILBENZENO

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As resinas de troca inica (polmeros trocadores de ons), tais como o copolmero Sty-DVB, podem ser definidas como matrizes polimricas insolveis contendo grupos ionizveis fixos em sua estrutura, atravs dos quais pode ocorrer a troca inica. As cargas fixas no esqueleto polimrico podem ser positivas ou negativas, conferindo, assim, resina a capacidade de trocar nions ou ctions, respectivamente (COUTINHO, 2001). Um trocador inico pode ser genericamente, representado por R onde R X, representa a matriz fixa e X representa o on capaz de participar do processo de troca, que se d de maneira estequiomtrica com os ons de mesma carga. A quantidade desses ons define a capacidade de troca inica. As equaes mostradas abaixo exemplificam o processo de troca catinica e aninica, respectivamente. RNa 2 RNa RCl 2 RCl + + + + HCl CaCl2 NaOH (aq) (aq) (aq) RH R2Ca ROH R2SO4 + NaCl (aq) (Eq. 7) (Eq. 8) (Eq. 9) (Eq. 10)

+ 2 NaCl (aq) + NaCl (aq)

Na2SO4 (aq)

+ 2 NaCl (aq)

Embora as reaes citadas ocorram em meio aquoso (aq) com os trocadores inicos em fase slida, estes podem tambm se encontrar na forma de trocadores inicos lquidos e as reaes conduzidas em meio de outros solventes que no sejam exclusivamente gua (LUZ, 1991). As resinas de troca inica podem ser sintetizadas com uma grande variedade de grupos funcionais e com fcil controle da porosidade, da rea superficial especfica e do tamanho mdio de partculas. Os mtodos empregados na preparao desses materiais consistem da sntese da matriz polimrica insolvel, seguida da funcionalizao dessa matriz, ou seja, da introduo de grupos funcionais que sero responsveis pelo processo de troca inica. Dentre os grupos funcionais que podem ser incorporados em resinas de troca inica esto os grupos 3 , SO COO e 32 em resinas catinicas e os PO grupos 3+, =NH2+ e 3+ em resinas aninicas (SILVA, 2001). NH NR Entre as matrizes polimricas mais utilizadas, esto os copolmeros Sty-DVB. Tais copolmeros so materiais amplamente empregados em empacotamento de colunas para cromatografia de excluso por tamanho (SEC). So formados por esferas minsculas semi-rgidas obtidas por copolimerizao em suspenso do estireno (Sty)

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com divinilbenzeno (DVB), sendo compatveis com muitos solventes orgnicos e apresentam boa resistncia qumica e mecnica (OLIVEIRA et al., 2000). Os copolmeros base de estireno e divinilbenzeno economicamente disponveis so conhecidos como resinas convencionais, tipo gel ou microrreticulares. Uma resina tipo gel apresenta uma estrutura porosa definida como a distncia entre as cadeias polimricas no estado inchado. Os copolmeros macroporosos, tambm denominados macrorreticulares, apresentam uma porosidade no gel, isto , espaos vazios ao lado da porosidade gel convencional. Esses vazios formam um sistema intercomunicante de canais entre aglomerados de partculas esfricas do tipo gel, Kun e Kunin (1982). As estruturas fsicas dos copolmeros reticulados macroporos possibilitam uma eficiente capacidade no processo de separao e, portanto, so amplamente empregados como material de partida para resinas de troca inica. Por meio da copolimerizao em suspenso aquosa de estireno e divinilbenzeno Coutinho e Rabelo (1994), variaram alguns parmetros reacionais na sntese dos copolmeros para obter copolmeros com porosidades diferentes. Essas caractersticas morfolgicas so controladas variando a relao molar entre os monmeros (estireno e o divinilbenzeno), a variao das quantidades de diluentes inertes e a mudana no grau de diluio durante a polimerizao. Para que ocorra a modificao das estruturas macroporosas dos polmeros reticulados tornam-se necessrio, durante a polimerizao dos monmeros, a utilizao de compostos inertes denominados diluentes. Os fatores mais importantes que influenciam na modificao polimrica so o tipo e quantidade de diluente, bem como a quantidade de agente reticulante empregada na sntese. Tolueno e heptano so bons e maus solventes, respectivamente, para a cadeia de poliestireno. Se o sistema diluente dos monmeros um bom agente de solvatao para o polmero em formao, as cadeias polimricas ficam mais estendidas e a separao de fases, devido insolubilidade do polmero reticulado, ocorre mais tarde e poros pequenos so produzidos. Quando o diluente um mal solvente para as cadeias polimricas em crescimento, estas ficam mais retradas e a separao de fases ocorre mais cedo (em grau de converso mais baixo) e poros maiores so gerados, Coutinho e Rezende (2001). Freqentemente, utilizam-se bons solventes durante a sntese para produzir estruturas com poros pequenos enquanto que os maus solventes produzem estruturas com poros grandes.

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O estireno copolimerizado com uma pequena quantidade de DVB e uma baixa taxa de diluio de monmeros resultam em um copolmero do tipo gel, que so caracterizados pela reduzida porosidade. O tamanho do poro somente depende da proporo de DVB por causa do restrito aumento da estrutura do polmero pela ligao cruzada (SEDEREL, 1973). Portanto, as resinas do tipo gel so completamente ineficientes como permutadores de ons em meio apolar. Se a resina gel for seca, a matriz polimrica colapsa e a cadeia polimrica ser fechada pelas foras atmicas atuantes. Nesta condio, a menos que um reagente capaz de expandir a matriz seja adicionado, o colapso da prola gel no permitir que o material exiba atividade cataltica, porque somente os stios nas superfcies das prolas so acessveis aos reagentes. De modo contrrio, as resinas macroporosas, possuem uma significativa porosidade no gelatinosa, quando comparadas s resinas do tipo gel. A porosidade permanente ocasionada por canais entre aglomerados de reduzidas partculas gis esfricas (RABELO, 1994). A estrutura macroporosa formada pela reduzida razo de solventes na formulao. Entretanto as propriedades catalticas das resinas sulfnicas dependem de diferentes parmetros. As propriedades fsicas e as caractersticas morfolgicas das prolas do polmero, a distribuio dos grupos cidos sulfnicos na matriz polimrica e as caractersticas dos reagentes e produtos so importantes fatores na determinao do desempenho cataltico. A Figura 4 apresenta uma representao esquemtica da reao de sntese do copolmero Sty-DVB. Os copolmeros Sty-DVB possuem estrutura reticulada que pode ser facilmente modificada quimicamente atravs dos anis benznicos ligados s cadeias polimricas. Essas so ligaes qumicas covalentes que ocorrem entre as cadeias polimricas do copolmero.
HC CH2 + HC CH2 Divinibenzeno HC CH2 Polimerizao em suspenso aquosa CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

Estireno

Copolmero Estireno-Divinilbenzeno

Figura 4 Representao esquemtica da reao de sntese do copolmero estirenodivinilbenzeno (Sty-DVB).

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2.6 AS POLIANILINAS Em 1840, Fritzsche obteve um leo incolor a partir do ndigo, ao qual designou anilina, e ao produto de oxidao deste leo de polianilina (PANI), provavelmente o polmero orgnico sinttico mais antigo (WUDL et al., 1987). Entre 1907-1912, aps extensivas investigaes, a PANI foi descrita como um octmero que existia em quatro estados de oxidao diferentes, correspondentes a polmeros de colorao diferentes, dependendo do nmero de unidades quinonaimina presentes no esqueleto carbnico (WUDL et al., 1987; MACDIARMID & EPSTEIN, 1989). No entanto, somente na dcada de 80, com o advento das tcnicas modernas de caracterizao de materiais, que estudos fsico-qumicos tornaram possvel a completa elucidao das estruturas qumicas desses polmeros (WUDL et al., 1987; WEI & HSUED, 1989; MACDIARMID & EPSTEIN, 1989; CHIANG & MACDIARMID, 1986; RAY et al., 1989). O termo polianilina, como empregado nos dias atuais, refere-se a uma famlia ou classe de polmeros consistindo de 1000 ou mais unidades repetitivas, cuja forma bsica tem a composio generalizada mostrada na Figura 5, obtida pela polimerizao qumica ou eletroqumica da anilina (MACDIARMID & EPSTEIN, 1989; RAY et al., 1989). H N H N y Forma bsica da polianilina ou esmeraldina Figura 5 Forma bsica da polianilina ou p-poli(fenilenoaminaimina) N N
1 -y

As propriedades de polianilinas descritas por essa frmula geral podem ser variadas, na dependncia de duas variveis: o grau de oxidao e o grau de protonao do polmero em questo (RAY et al., 1989). O estado de oxidao da polianilina pode, em princpio, ser variado continuamente desde o valor de y = 1, dando origem ao polmero completamente reduzido, at o valor de y = 0, quando se obtm o polmero totalmente oxidado. Os termos leucoesmeraldina, esmeraldina e pernigranilina referemse a polmeros cujos estados de oxidao so definidos por valores de y iguais a 1; 0,5 e 0, respectivamente, conforme mostra a Figura 6.

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H N

H N

H N

H N x

Polmero completamente reduzido Leucoesmeraldina

N x

Polmero completamente oxidado Pernigranilina H N C


+. _

H N

H N C
+. _

H N x

Hidrocloreto de Esmeraldina

Figura 6 Polianilinas com variados graus de oxidao e dopagem (RAY et al., 1989). Uma outra maneira de representar os diferentes estados de oxidao da polianilina por suas estruturas de octmeros, conforme mostra a Figura 7.
H N H N H N H N

(a)
H2 N N H H N N N H H N N N H N H

(b)
H2 N N H N N H N

(c)
H2 N N N N N

Figura 7: Estrutura de octmeros da polianilina: (a) Leucoesmeraldina, (b) Esmeraldina e (c) Pernigranilina.

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O tomo de nitrognio imina de qualquer uma dessas espcies pode ser protonado, dando origem aos sais correspondentes, sendo que o grau de protonao do polmero bsico depende de seu estado de oxidao e do pH do cido empregado no processo. (MACDIARMID & EPSTEIN, 1989; CHIANG E MACDIARMID, 1986). A polianilina pode ocorrer em diferentes estados de oxidao, dos quais a forma esmeraldina, 50% oxidada, a mais estvel, a forma base esmeraldina (isolante) do polmero pode reagir com cidos (HC) resultando na forma sal esmeraldina (condutora). A reao de protonao ocorre principalmente nos nitrognios imnicos da polianilina ( N=). Este estado contm duas unidades repetitivas, a amina-fenileno e a iminaquinona, como mostra a Figura 8. Alm da elevada condutividade eltrica, que chega ordem de 102 S.cm 1, outra propriedade interessante da polianilina exibir diferentes coloraes em variadas condies de pH ou o potencial eltrico (FAEZ et al., 2000).
H N .. H N .. y DESPROTONAO _ (NH 4 OH 0,1 mol.L 1 ) H N C
+. _

N ..

N ..
1 -y

DOPAGEM POR PROTONAO _ (HC 0,1 mol.L 1 ) H C N +. _ H N ..


1 -y

H N .. y CONDUTOR (ES)

Figura 8: Forma isolante e condutora da polianilina de acordo com o pH do meio. Mtodos qumicos e eletroqumicos tm sido utilizados para a sntese de polianilinas. Na polimerizao qumica, vrios cidos protnicos, tais como cido clordrico, sulfrico, tolueno sulfnico, entre outros, tm sido usados em combinao com diversos agentes oxidantes, como o dicromato de potssio, perxido de hidrognio e persulfato de amnio (PALANIAPPAN, 1995; PRON et al., 1988; MAIA et al., 2000). A sntese eletroqumica se d pela oxidao eletroqumica da anilina em meio cido, sob a aplicao de uma certa corrente ou potencial eltrico. Polianilinas com

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substituies no anel ou no tomo de nitrognio amina podem ser facilmente sintetizadas e dopadas em uma grande variedade de nveis, com conseqente variao nas suas propriedades eltricas e fsico-qumicas (MACDIARMID & EPSTEIN, 1989). Tal versatilidade tem despertado enorme atrao na comunidade cientfica, uma vez que as polianilinas detm caractersticas nicas, como a simplicidade no processo de dopagem, sua excelente reversibilidade redox e suas propriedades pticas, eltricas e eletroqumicas. Alm disso, a alta estabilidade ambiental e facilidade na preparao candidatam fortemente as polianilinas a aplicaes na rea da engenharia bioqumica, como um suporte potencialmente atrativo para imobilizao de enzimas (LEITE et al., 1994; THANGARATHINAVELU et al., 1994; MAIA et al., 2000), visto que apresentam propriedades semelhantes quelas esperadas do suporte ideal. Some-se a tais caractersticas o fato de que as polianilinas so polmeros de sntese extremamente barata e com excepcional rendimento. Na Tabela 3 so mostrados, para efeito de comparao, os preos de alguns polmeros orgnicos naturais e sintticos largamente usados para imobilizao. Tabela 3 Preos de alguns polmeros orgnicos utilizados para imobilizao de enzimas. Polmero (100g) Sephadex Poliacrilamida Celulose Polianilina Preo (R$) 293,00 292,00 13,50 7,20

No sem razo, ento, que vimos nos ltimos anos um nmero de publicaes utilizando polianilinas para imobilizao de enzimas e construo de eletrodos enzimticos (SCOTT, 1997; PARENTE et al., 1992; LEITE et al., 1994; NADRUZ JR et al., 1996), particularmente polianilinas sintetizadas eletroquimicamente. Uma busca na base de dados do web of science (htpp://webofscience.fapesp.br), combinando as palavras-chave polianilina, imobilizao e enzimas trabalhos entre 1990-1999. No entanto, apesar das diversas publicaes, o uso de polianilinas quimicamente sintetizadas, visando explorar suas propriedades como suporte, em funo das caractersticas de estabilidade ambiental e reatividade nos processos de ativao, tem sido mais restrito, surgindo a necessidade de um estudo sistemtico sobre as resultaram em diversos

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caractersticas e propriedades das polianilinas quimicamente sintetizadas, bem como a sua aplicao como suporte para imobilizao de enzimas. 2.7 OS COMPSITOS DE POLIANILINA Uma das formas mais promissoras de aumentar a processabilidade da Pani consiste na preparao de compsitos com caractersticas hbridas, podendo apresentar melhores propriedades mecnicas, trmicas, qumicas, eltricas, entre outras. Todavia, a escolha do material empregado como matriz e o mtodo de preparao dos compsitos determinaro as caractersticas e a propriedade do produto obtido (Lobo 2005). Diferentes mtodos de sntese so usados para a preparao de compsitos de Pani, como exemplo pode-se citar: a polimerizao eletroqumica da anilina na matriz, a polimerizao qumica in situ da anilina na matriz ou em soluo com a matriz polimrica, entre outros (PUD et al., 2003). Naturalmente, cada um desses mtodos oferece vantagens e limitaes. Contudo, a presena de compsitos utilizando o mtodo de polimerizao in situ permite obter em uma nica etapa um material polimrico facilmente processvel, Leyva et al. (2002). Como relatado por Bae et al (2003) e Amaral et al (2001), a eficincia da polimerizao confere aos compsitos uma estrutura homognea. Por isso, a tcnica usada neste trabalho, emprega a polimerizao in situ da anilina em copolmero Sty-DVB. O crescente interesse, nos ltimos anos, na obteno de compsitos de Pani pode ser verificado na literatura, onde se observa um significante aumento no nmero de publicaes. A obteno desses materiais compsitos tem permitido a utilizao da Pani para aplicao em diferentes campos de atuao, como por exemplo: em dispositivos ptico-eletrnicos (RADHAKRISHNAN & KAR, 2005); em diodos orgnicos emissores de luz (YU et al, 1998), sensores qumicos (PRASAD et al. 2005); biosensores, (GERARD & MALHOTRA, 2005), absorvedores de microondas, (OLMEDO et al. 1995); clulas solares (TAN et al, 2003); inibidor de corroso (BRESLIN et al. 2005), aplicao em baterias secundria de ltio, (KITANI et al., 1999) e outros. Entretanto, apesar do grande nmero de publicaes, o uso de compsitos de Pani para a imobilizao de enzimas ainda tem sido pouco estudado. Com isso, a

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imobilizao de peroxidase em compsitos de Pani/Sty-DVB desponta como mais uma aplicabilidade desses compsitos.

2.8 APLICAES DA PEROXIDASE IMOBILIZADA A deteco sensvel e seletiva de compostos das classes dos fenis e das aminas aromticas de grande importncia ambiental, devido sua alta toxicidade, assim como pelo fato deles serem gerados em processos industriais de larga escala e descartados na forma de efluentes das indstrias de plstico, farmacutica, txtil, refinarias de leo e minerao de carvo. Tais compostos so de alta toxicidade e figuram entre os mais recalcitrantes aos tratamentos convencionais de efluentes, sendo, portanto, extremamente importante o controle de suas concentraes nos corpos aquticos (KLIBANOV et al., 1983; PANDEY & WEETALL, 1995; SAWAHATA & NEAL, 1982). No menos importante, o perxido de hidrognio utilizado em vrios campos industriais em funo de seu alto poder oxidante, particularmente nas indstrias de alimentos, txtil ou ainda na rea de tratamento de efluentes, onde atua como esterilizante, alvejante e oxidante (AIZAWA et al., 1974; COSGROVE et al., 1988). O monitoramento da concentrao desse reagente nos processos citados, que extremamente importante para o controle de qualidade e eficincia dos mtodos, feito nas indstrias geralmente por mtodos titrimtricos, espectrofotometria e de quimiluminescncia (COSGROVE et al., 1988). Recentemente, a sensibilidade da POD por esse substrato tem sido utilizada para construo de sensores eletroqumicos com alta seletividade e especificidade (AIZAWA et al., 1974; COSGROVE et al., 1988; YANG et al., 1995). Ainda devido ao fato desta enzima utilizar como substrato o perxido de hidrognio, que produto da reao de outras oxidoredutases, a peroxidase tem sido utilizada em conjunto com estas enzimas para dosagem de compostos de importncia clnica, dentre os quais podemos destacar a dosagem de glicose (PANDEY & WEETALL, 1995), colesterol (CHARPENTIER & MUR, 1995), algumas bases nitrogenadas como a guanina, hipoxantina e xantina (KITO et al., 1990), algumas aminas como histamina, putrescina e cadaverina (MALE et al., 1996), NADH (HALLIWELL & DE RICKER, 1978), rafinose, galactose e outros acares (KIBA et 29

al., 1993), cidos graxos livres (KAWASAKI et al., 1990), aminocidos como o glutamato e L-lactato (RUZGAS et al., 1995), entre outros. Outra rea em que o uso desta enzima se destaca a imunologia, onde a peroxidase a enzima ligada ao anticorpo secundrio e produz o cromforo revelador dos ensaios de ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) (NILSSON, 1989; BRYNDA et al., 1998; PAEK & SCHRAMM, 1997). Considerando tal versatilidade, fcil compreender o grande interesse e vultuoso nmero de trabalhos publicados com essa enzima. A peroxidase vem sendo imobilizada em uma grande variedade de suportes, e sua aplicao na construo de eletrodos enzimticos ganhou grande impulso nos ltimos anos. No entanto a imobilizao de peroxidase sobre compsitos de Pani/Sty-DVB, constituem uma lacuna que este trabalho pretende preencher.

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3 METODOLOGIA
3.1 EQUIPAMENTOS Alm das vidrarias comuns de laboratrio, os seguintes equipamentos foram utilizados neste trabalho: Agitador Quimis Balana Analtica modelo SA 210 Scientech. Banho Maria Modelo 100, marca FANEN Banho Maria Modelo YCM-04M GEMMY IND. CORP. Bomba a Vcuo Caixa de Isopor Cronmetro Progressivo Espectrofotmetro UV/VIS Bioespectro SP-200 Liquidificador Modelo Predileto, Marca Astro Eletro Papel Alumnio Papel de filtro Qualy 14 m. Pipeta Semi-automtica 100-1000L marca HTL Espectrmetro de Absoro na Regio do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) - Bomem Michelson MB-Series Hartmann & Braun 3.2 REAGENTES E SOLUES Os principais reagentes e solues utilizados neste trabalho esto relacionados abaixo: Acetato de Sdio cido Clordrico 1,0 mol L-1 cido ntrico 1,0 mol/L gua destilada Anilina lcool Etlico Estireno-Divinilbenzeno (Sty-DVB) Fosfato de Sdio Dibsico

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Hidrxido de Sdio 1,0 mol L-1 Material Vegetal o Lobeira (S. lycocarpum St. Hill)

Persulfato de amnio (APS) Pirogalol Poliglutaraldeido 25% Soluo de Cloreto de Sdio 0,1 mol L-1 Soluo de Perxido de Hidrognio 5 mmol.L-1 Soluo de Pirogalol 12,69 mmol.L-1 Soluo de Poliglutaraldeido 2,5% pH 6,0. Soluo Tampo Acetado de Sdio 0,05 mol L-1 Soluo Tampo Fosfato de Sdio 0,05 mol L-1

3.3 SNTESE DOS COMPSITOS DE POLIANILINA/COPOLMERO ESTIRENO-DIVENILBENZENO (PANI/STY-DVB)

O copolmero Sty-DVB empregado neste estudo foi cedido pela Universidade Federal de Gois. Os compsitos de polianilina/copolmero estireno-divenilbenzeno (Pani/Sty-DVB) empregados neste trabalho foram sintetizados conforme metodologia empregada por Lobo (2005) em sua dissertao de mestrado. Neste experimento, duas etapas foram elaboradas para a realizao da sntese dos compsitos de Pani/Sty-DVB. Inicialmente, as prolas do copolmero estireno-divinilbenzeno foram tratadas com soluo de anilina/etanol e, em seguida, a Pani foi produzida por oxidao qumica. 3.3.1 Tratamento do Copolmero Estireno-Divenilbenzeno (Sty-DVB) com Anilina Neste processo, as prolas do copolmero Sty-DVB foram intumescidas com soluo de anilina/etanol com diferentes propores, cujas porcentagens esto apresentadas nas tabelas 4 e 5, de acordo com os sistemas cidos empregados para a polimerizao.

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Tabela 4 Composio dos reagentes empregados para a preparao dos compsitos Pani/Sty-DVB com HNO3 em pH 0. Amostras Pani/Sty-DVB-80 Pani/Sty-DVB-60 Pani/Sty-DVB-40 Pani/Sty-DVB-20 Porcentagem de anilina 80%. 60%. 40% 20%. Anilina (mL) 80,0 60,0 40,0 20,0 Etanol (mL) 20,0 40,0 60,0 80,0

Tabela 5 Composio dos reagentes empregados para a preparao dos compsitos Pani/Sty-DVB com HC em pH 0. Amostra Pani/Sty-DVB-80 Pani/Sty-DVB-60 Pani/Sty-DVB-40 Pani/Sty-DVB-20 Porcentagem de anilina 80%. 60%. 40% 20%. Anilina (mL) 80,0 60,0 40,0 20,0 Etanol (mL) 20,0 40,0 60,0 80,0

Para cada grama de copolmero Sty-DVB foram adicionados 100 mL de soluo de anilina/etanol (com diferentes porcentagens). A mistura reacional foi mantida sob agitao magntica temperatura ambiente por 3 horas (tomando-se o cuidado com a velocidade de agitao para evitar que as prolas se quebrassem). Feito isso, as prolas do copolmero intumescidas com a soluo foram filtradas em funil de Bchner presso reduzida (com o objetivo de retirar o excesso de anilina) e, posteriormente, utilizadas para a preparao dos compsitos Pani/copolmero Sty-DVB. 3.3.2 Polimerizao In Situ da Anilina no Copolmero Sty-DVB Na preparao dos compsitos Pani/copolmero Sty-DVB dois tipos de cido foram utilizados no processo de sntese, o cido clordrico e o cido ntrico. Os cidos foram utilizados em pH 0. Aqui a razo molar monmero/agente oxidante foi de 1,0/1,25. A proporo de agente oxidante relativa quantidade de soluo usada para intumescer o copolmero Sty-DVB. No processo de sntese da polianilina, as prolas do copolmero, anteriormente intumescidas com anilina, foram transferidas para um bquer ao qual foi adicionado 40

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mL de soluo cida (soluo aquosa de cido ntrico ou cido clordrico pH 0). O sistema reacional foi mantido sob agitao em banho de gelo at a estabilizao da temperatura em 0 C. Separadamente, a soluo do agente oxidante foi preparada solubilizando o persulfato de amnio (APS), em 60 mL da soluo cida com o mesmo nion da soluo aquosa anterior. Em seguida, a soluo do agente oxidante foi adicionada lentamente na mistura reacional, que foi deixada sob agitao magntica temperatura constante por 3 h. 3.3.3 Filtrao e Lavagem dos Compsitos

Decorridas trs horas de reao o material obtido foi filtrado em funil de Bchner e lavado vrias vezes com gua destilada e depois com uma mistura de gua/etanol, com proporo de 1/1 (v/v), para remoo do excesso de APS e subprodutos da polimerizao (oligmeros e resduos orgnicos). Aps o processo de lavagem, o compsito e as partculas de polianilina foram transferidos para uma peneira de 125 m onde foram lavados novamente com gua destilada e etanol. Essa etapa teve como objetivo peneirar a polianilina que polimerizou fora do compsito, separando assim as prolas do compsito. As prolas do compsito Pani/copolmero Sty-DVB peneiradas foram secas em estufa a 70 C por 48 h. 3.4 COLETA DO MATERIAL VEGETAL

Foram coletadas 22 amostras de frutos de S. lycocarpum de oito plantas, localizadas no municpio de Anpolis, Gois. As coletas foram realizadas entre os meses de abril e junho do ano de 2008. Estas amostras foram levadas ao laboratrio de anlise instrumental da Universidade Estadual de Gois (Campus Dr. Henrique Santillo), onde foram armazenadas a -7 C.

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3.5 OBTENO DO EXTRATO


Para obteno do extrato bruto de frutos de S. lycocarpum, lavou-se o fruto, exaustivamente, com gua destilada. Separou-se a casca e a polpa e pesou-se o material separado na proporo de 1,0 g para 10 mL de soluo tampo de extrao. A mistura contendo a casca ou a polpa e o tampo de extrao foi triturada e agitada, utilizando um liquidificador modelo Predileto marca Astro Eletro por cerca de 3 min. Feito isso, filtrou-se a soluo utilizando papel de filtro Qualy 14 m.

3.6 ATIVIDADE DA PEROXIDASE LIVRE

A presena de atividade de peroxidase foi determinada de acordo com a metodologia de Halpin et al. (1989), utilizando pirogalol e perxido de hidrognio como substratos, com as modificaes descritas a seguir. Para a realizao dos testes, 0,1 mL do extrato recebia 1,4 mL de soluo tampo fosfato de sdio 0,05 mol.L-1 pH 7,0 e 1,0 mL de soluo de pirogalol 12,69 mmol.L -1. Iniciou-se o teste adicionando-se 0,5 mL de uma soluo de perxido de hidrognio (H2O2) com uma concentrao de 5 mmol.L-1 em um tubo de ensaio. Deixada a reao proceder por 1 minuto, transferiu-se a soluo para uma cubeta de quartzo e fez-se ento a leitura de absorbncia do produto formado. A leitura foi feita em um espectrofotmetro UV/VIS Bioespectro SP-200 a 420 nm. Para efeito de comparao da atividade de peroxidase, provas em branco foram feitas na ausncia de amostra. Os experimentos foram todos realizados em triplicata. Uma unidade de enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima capaz de produzir um aumento de 0,1 na absorbncia a 420 nm aps um minuto de ensaio (HALPIN et al., 1989).

35

3.7 PARMETROS DE ATIVIDADE


3.7.1 pH timo Na tentativa de determinar o pH timo da atividade de peroxidase, foram preparados extratos em solues tampo fosfato de sdio 0,05 mol.L-1, pH 7,0; 6,5 e 6,0; e soluo tampo acetato de sdio 0,05 mol.L-1, pH 5,5; 5,0; 4,5 e 4,0. O pH timo foi medido atravs de ensaios de atividade de peroxidase como descrito anteriormente. 3.7.2 Tempo timo Para a escolha do tempo timo de reao para a peroxidase, foram feitos testes a fim de determinar o tempo em que a sua atividade chegasse ao mximo (tempo timo). Para isso preparou-se um ensaio de atividade de peroxidase em pH timo, de modo que a reao se processasse dentro da cubeta, que foi levada ao espectrofotmetro, onde foram feitas as leituras, com intervalos de um minuto, at a marca de 30 min. 3.7.3 Temperatura tima A fim de se obter a temperatura em que a atividade de peroxidase chegasse ao mximo, foram feitos os testes de atividade em pH e tempo timo, com diferentes temperaturas (30, 35, 40, 45, 50, 55 e 60 C). Nestes ensaios a mistura reacional (contendo a amostra, tampo fosfato de sdio 0,05 mol L -1 pH 7,0; o pirogalol e o H2O2) foi colocada durante 20 min em banho-maria previamente estabilizado na temperatura desejada. Em seguida, fez-se as leituras em espectrofotmetro. 3.7.4 Termoestabilidade a 50 e 70 C Os ensaios de termoestabilidade foram feitos mantendo-se o extrato em banhomaria previamente aquecido a 50 C, por 10, 30, 60 e 90 min. Decorrido este tempo, o extrato foi retirado do aquecimento e deixado em repouso at que atingisse a temperatura ambiente, para que em seguida fosse testada quanto atividade de peroxidase, conforme descrito no item 3.6. Em seguida, repetiu-se o procedimento para a temperatura de 70 C.

36

3.8 ATIVAO DOS COMPSITOS PANI/STY-DVB (HC) E PANI/STYDVB (HNO3) A ativao dos compsitos de Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3) foi feita pela ligao de poliglutaraldedo segundo modificao da metodologia de Olsson & gren (1983). A reao se processou adicionando-se a cada um dos compsitos uma soluo 2,5% (v/v) de poliglutaraldedo preparada em tampo fosfato de sdio 0,05 mol L-1, pH 6,0 na proporo de 15 mL/0,2 g dos compsitos. A mistura foi deixada reagir por 2 h sob agitao lenta. Em seguida, fez-se a separao dos compsitos ativados da mistura reacional por meio de filtrao a vcuo, acompanhada de lavagem exaustiva do mesmo com a soluo tampo, at que todo o poliglutaraldedo no ligado fosse retirado. 3.8.1 Espectros de Absoro na Regio do Infravermelho (FTIR) dos Compsitos Ativados A caracterizao qualitativa de grupos funcionais, caractersticos do copolmero Sty-DVB, dos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3) sem ativar e ativados com poliglutaraldedo em pH 6,0, foi realizada por meio de espectrometria de absoro na regio do infravermelho. Para obteno dos espectros de infravermelho dos compsitos preparados, utilizou-se um Espectrmetro de Absoro na Regio do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) - Bomem Michelson MB-Series Hartmann & Braun com 80 scans e resoluo de 4 cm 1 na faixa de freqncias de 4000 a 400 cm 1. As amostras foram analisadas em pastilhas de KBr contendo aproximadamente 1 % m/m de amostra. 3.9 IMOBILIZAO DA PEROXIDASE NOS COMPSITOS PANI/STY-DVB (HC) E PANI/STY-DVB (HNO3) ATIVADOS A reao de imobilizao da peroxidase nos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3), foi preparada adicionando-se os compsitos ativados com poliglutaraldedo em pH 6,0, ao extrato preparado em tampo fosfato de sdio 0,05 mol L-1, pH 7,0, na proporo de 3,0 mg/mL, deixando-se a mistura reagir sob agitao

37

lenta, por 30 min, a uma temperatura de aproximadamente 4 C. Aps este intervalo de tempo, a reao foi interrompida e fez-se a separao dos compsitos da enzima no ligada ao Pani/Sty-DVB por filtrao a vcuo. Para remoo completa da peroxidase no ligada, foi feita a lavagem dos compsitos com a mesma soluo tampo, por trs vezes e, em seguida, fez-se a lavagem dos mesmos com uma soluo de NaC 1,0 mol L-1, por mais duas vezes. Os compostos obtidos nesta etapa, foram designados por Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). 3.10 ATIVIDADE DA PEROXIDASE IMOBILIZADA Os testes de atividade de peroxidase imobilizada foram feitos segundo metodologia utilizada na atividade da peroxidase livre conforme item 3.6, utilizando 30 mg de Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC) no lugar de 0,1 mL de extrato. Alm disso, neste caso, deixou-se a reao proceder pelo tempo de 20 min e efetuou-se a filtrao a vcuo em funil de placa porosa. Feito isso, fez-se a leitura em espectrofotmetro. Repetiu-se o procedimento para o composto Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). 3.11 PARMETROS DE IMOBILIZAO 3.11.1 Tempo timo de Imobilizao Foram feitos testes a fim de se determinar o tempo necessrio para que o maior nmero possvel de enzimas disponvel para imobilizao se ligasse aos compostos Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). Ensaios de atividade enzimtica foram feitos aps 10, 30, 60, 120 e 150 min de imobilizao. 3.11.2 pH timo de Imobilizao Foram feitos testes no intuito de se verificar o efeito do pH sobre os grupos ligantes tanto da enzima como dos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3). Nestes testes, preparou-se os extratos conforme item 3.5 em solues tampo fosfato de sdio 0,05 mol.L-1, pH 7,0; 6,5 e 6,0; e solues tampo acetato de sdio 0,05 mol.L-1, pH 5,5; 5,0; 4,5 e 4,0. Fez-se a imobilizao da peroxidase nos diferentes

38

valores de pH e realizou-se os ensaios de atividade da peroxidase imobilizada, conforme o item 3.10. 3.11.3 Reutilizao da Peroxidase Imobilizada Afim de se saber a quantidade de vezes que as enzimas imobilizadas nos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3) poderiam ser reutilizadas, foram feitos os teste de reutilizao dos compostos Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). Neste experimento os compostos que ficaram retidos no filtro no item 3.10, foram lavados com soluo tampo de fosfato de sdio 0,05 mol L-1, pH 7,0. Em seguida, foram realizados ensaios de atividade da peroxidase imobilizada. Este procedimento foi repetido at que no fosse mais observada atividade da enzima imobilizada. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos na medida de atividade do sistema Pani/Sty-DVB-Peroxidase logo aps o processo de imobilizao.

39

4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 SNTESE DO COMPSITO PANI/ESTIRENO-DIVINILBENZENO Todos os compsitos foram obtidos por meio da polimerizao oxidativa da anilina na presena de dois tipos de cido, o cido clordrico e o cido ntrico (ambos em pH 0), seguida, de oxidao com soluo de persulfato de amnio. As diferentes converses entre estados de oxidao da Pani, no processo de polimerizao oxidativa, pde ser observado pelas mudanas na colorao do meio reacional nos dois sistemas cidos. Segundo Heeger (2002), os estados de oxidao da Pani envolvem equilbrios de oxidao e reduo e cido-base, como pode ser observado na Figura 9.

H N

H N +.

H N

H N +.

REDUO OXIDAO

H N+ H

H N

Sal de esmeraldina (verde) _ 2 H+

Sal de leucoesmeraldina (incolor) _ 2 H+

2n

H N

H N N N

REDUO OXIDAO

H N

Base de esmeraldina (azul) _ 2 e _ ; _ 2 H+

Base de leucoesmeraldina (incolor)

2n

Base de pernigranilina (violeta)

Figura 9: Estados de oxidao da Pani em funo dos equilbrios de oxidao e reduo cido-base. Para o processo de polimerizao, empregando cido clordrico, pde-se observar que aps a adio da soluo do agente oxidante, foi possvel observar o incio da oxidao pela colorao azul caracterstica da pernigranilina protonada, que um produto intermedirio da polimerizao da anilina. Em todos os compsitos preparados, a colorao azul no demorou mais que 5 minutos para aparecer. medida que se processou a reao, a mudana da cor azul para verde escuro tornou-se visvel na 40

soluo, indicando a formao da estrutura sal de esmeraldina. Essa mudana de colorao ocorreu em um intervalo de tempo inferior a 2 minutos para todos compsitos preparados com cido clordrico. No processo de polimerizao oxidativa da anilina, utilizando o cido ntrico, o aparecimento da colorao da cor azul foi observado, somente aps a completa adio do agente oxidante, que demorou em torno de 10 minutos. Dependendo da quantidade de anilina empregada para intumescer o copolmero Sty-DVB, a formao de pernigranilina apresentou um intervalo de tempo que variou de 10 (para maior quantidade de anilina) at 30 minutos (para a menor quantidade de anilina). A mudana da cor azul para verde escuro, evidenciando a formao da estrutura sal esmeraldina, foi observada num intervalo de 5 a 10 minutos, respectivamente. Por meio desses resultados, pode-se concluir que a velocidade de polimerizao da anilina mais rpida na presena de cido clordrico do que na presena de cido ntrico, o que leva a concluir que a velocidade de reao depende do tipo de cido utilizado para a sntese da Pani. O efeito cintico pode ser explicado pelo mecanismo de polimerizao da anilina. Quando o agente oxidante introduzido no meio reacional, provoca a formao do ction radical do monmero, que a primeira etapa na polimerizao da anilina. As etapas seguintes acontecero com o acoplamento de dois ctions radicais. A reao continua com acoplamento dos ctions radicais do monmero e da cadeia polimrica que vai sendo formada. Os produtos intermedirios so muito dependentes do pH e do tipo de nion do cido usado, por isso as condies de sntese iro influenciar na obteno do polmero (WEI et al., 1990). Segundo Morales et al. (1999), a formao do par inico entre o ction radical e/ou a carga positiva da cadeia polimrica pode controlar a velocidade de polimerizao. O on cloreto um forte par inico porque faz uma blindagem da carga positiva dos ctions nas cadeias polimricas em crescimento, facilitando o seu acoplamento com outro ction-radical, o que aumenta a velocidade de polimerizao. Porm, na presena do on nitrato, que forma par inico mais fraco, o efeito de blindagem enfraquecido e, conseqentemente, as aproximaes do ctionradical cadeia em crescimento sero dificultadas. Esse efeito de blindagem responsvel pelo aumento considervel na velocidade de polimerizao da anilina. Por isso, na sntese que ocorre na presena de cido clordrico a formao das cadeias polimricas sero favorecidos pelo forte par inico com o nion cloretos enquanto que na presena de nions nitratos a velocidade reao ser lenta devido formao do fraco 41

par inico. Wei et al. (1990), propuseram um mecanismo para a polimerizao da anilina, apresentada na Figura 10.

NH3

_ H+

NH2 ..

_ e_

+.

NH2

.
b

NH2

a + b _ 2H

NH ..
_

NH2 ..
_

2e

NH

NH2 NH2 ..
+

_ H+

NH ..

NH ..

_ H+

NH ..

NH ..

NH2 ..

_ + 2e ; _ 2H

Polianilina

NH2 ..

Figura 10: Mecanismo de polimerizao da anilina proposta por Wei et al. (1990).

A Figura 11 apresenta os espectros de absoro na regio do infravermelho para o copolmero Sty-DVB puro e para os compsitos Pani/Sty-DVB obtidos a partir do intumescimento do copolmero Sty-DVB com 80% de anilina e sintetizado na presena de cido ntrico (Pani/Sty-DVB (HNO3)) e cido clordrico (Pani/Sty-DVB (HC)), ambos em pH 0. Pode se observar, em todos espectros dos compsitos, as bandas caracterstica do copolmero Sty-DVB na regio de 3013 cm 1 a 3046 cm 1 atribudas a absoro do estiramento vibracional CH aromtico, as bandas de absoro na regio de 2917 cm1 a 2887 cm1 do estiramento CH em aliftico e as bandas nas regies de 758 cm 1 e 698 cm 1 atribudas a deformao fora do plano da ligao CH do anel aromtico mono-substitudo (OKUBO et al., 2001). As bandas de absoro nas regies de 1560 cm e 1492 cm esto associados ao estiramento N= Q= N e ao estiramento NBN da 1 1

42

cadeia da Pani se sobrepem s bandas na regio de 1583 cm 1 e 1485 cm 1 caracterstico do estiramento da vibracional no plano da ligao C= C do anel benznico do copolmero. Pode-se observar em todos os espectros dos compsitos a banda relacionada ao modo vibracional do nion NO3 na regio de 1394 cm 1, a banda em 1245 cm 1 atribuda ao estiramento C .+ associado condutividade da Pani e a banda N de absoro em 1122 cm 1 atribuda deformao C no plano em aromtico. Essas H absores confirmam a presena da PANI nos compsitos. A demais bandas em 874 cm 1 atribuda a deformao angular C fora do plano no anel quinide, em 798 cm 1 H atribuda a deformao fora do plano C e C C no anel, em 499 cm-1 e 690 cm 1 H C atribudas, respectivamente, a deformao vibracional fora do plano da ligao C e no C plano da ligao C do anel benzenide se sobrepem s bandas de absoro do H copolmero nesta regio (LOBO, 2005).

C o p o lm e r o S t y - D V B

I n t e n s id a d e R e la t iv a ( u .a .)

C o m p s ito P a n i/S t y - D V B ( H C l) C o m p s ito P a n i/S t y - D V B ( H N O 3 )

4000

3500

3000

2500

2000

1500
-1

1000

500

N m er o d e O n d a (c m )

Figura 11: Espectros de absoro na regio do infravermelho do copolmero Sty-DVB puro e dos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3).

43

4.2 PARMETROS DE ATIVIDADE 4.2.1 pH timo

Por serem protenas, as enzimas tm propriedades sensveis ao pH. De fato muitas protenas s so ativas em uma faixa estreita de pH, tipicamente entre 5 e 9. Isso o resultado dos efeitos do pH sobre uma combinao de fatores, tais como a ligao do substrato enzima, a atividade cataltica da enzima, a ionizao do substrato e a variao da estrutura da protena (normalmente importante apenas em extremos de pH) (VOET & VOET). Alm disso, as enzimas tm um pH timo (ou um intervalo de pH) no qual a sua atividade mxima. Em um pH maior ou menor, a atividade diminui. Isso no surpreendente. As cadeias laterais dos aminocidos do centro ativo podem atuar como cidos e bases fracas com funes crticas que dependem da manuteno de certos estados de ionizao e, em algum lugar da protena, as cadeias laterais podem desempenhar um papel essencial nas interaes que mantm a estrutura da protena (NELSON & COX, 2002). Com base nisso, o experimento realizado mostrou a influncia que o pH exerce sobre atividade da peroxidase encontrada na casca e na polpa da S. Lycocarpum. Os resultados encontrados para a atividade da peroxidase da casca e da polpa em diferentes valores de pH esto descritos no grfico da Figura 12. Observando-se o grfico da figura 12, nota-se que medida que o pH aumenta, aumenta-se tambm a atividade enzimtica, expressa em unidades de enzima. Ainda pelo grfico, percebe-se que na faixa de pH entre 6,0 e 7,0 tem-se uma maior atividade, sendo que com pH 7,0 a enzima apresenta maior eficincia como agente catalisadora da reao. Assim sendo, determinou-se como pH 7,0 o pH timo de atuao da peroxidase da S. Lycocarpum. Ademais, possvel observar que a casca do fruto de S. lycocarpum contm atividade de peroxidase superior quela encontrada para a polpa deste fruto. Estes resultados mostraram-se condizentes com aqueles obtidos por Alvim & Clemente (1998) que relataram ter encontrado em mexerica a maior atividade da enzima na casca e com Valderrama et al. (2001), que verificaram que a maior atividade enzimtica de peroxidase est presente, tanto na casca da ma de cultivar Gala quanto na de cultivar Fuji. 44

450

U nid ad e d e E n zim a (U )

Casca

400 350 300 250 200 150 100 50 0 4,0

Polpa

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

pH

Figura 12: Grfico da Unidade de Enzimas em relao ao pH para a casca e polpa da S. Lycocarpum. 4.2.2 Otimizao do Tempo de Atividade da Enzima Livre

medida que se aumenta o tempo de contato da enzima com o substrato, observa-se um aumento na atividade enzimtica. Observando-se o grfico da Figura 13, percebe-se que o aumento da atividade em relao ao tempo descrito por uma curva hiperblica que tende assintoticamente para um limite, a que corresponde a um estado de equilbrio da reao. Esta caracterstica tpica de enzimas com cintica michaeliana, que inicialmente reagem rapidamente com o substrato at um grau de saturao, em que todas as molculas j esto com seus stios catalticos saturados. Sendo assim, pode-se perceber que de 1 a 20 min a atividade da enzima aumenta consideravelmente e entre 20 e 30 min h um decrscimo na taxa de crescimento da mesma. Portanto, pode-se adotar o tempo de 20 min como sendo o tempo em que a atividade enzimtica atingiu seu ponto mximo.

45

U n id a d e d e E n zim a (U )

700 600 500 400 300 200 100 0 0

Casca Polpa

10

15

20

25

30

Tempo (minutos)

Figura 13: Grfico da Unidade de Enzimas em relao ao tempo para a casca e a polpa da S. lycocarpum. 4.2.3 Temperatura tima

Assim como ocorre com a maioria das reaes qumicas, a atividade enzimtica favorecida pela elevao da temperatura, que aumenta a energia cintica das molculas, fazendo com que um nmero cada vez maior delas atinja o estado de transio. O gradativo aumento na atividade s se verifica enquanto a enzima conservar sua estrutura nativa. Acima de determinada temperatura observa-se uma diminuio nessa atividade. Isso deve-se ao fato de que essas enzimas comeam a ser desnaturadas (MARZZOCO & TORRES, 2007). Com base nisso, determinou-se a temperatura em que a atividade da peroxidase mxima. Observando-se o grfico da Figura 14, percebe-se que 40 C a temperatura em que a atividade enzimtica em relao temperatura mxima. Sendo assim, pode-se determinar a temperatura de 40 C, como sendo a temperatura tima de atuao da peroxidase da S lycocarpum. 46

300
C a sc a P o lp a

U n id a d e d e e n z im a ( U )

250

200

150

100

50

0 30 35 40 45
o

50

55

T e m p era tu ra (

C)

Figura 14: Atividade enzimtica de peroxidase de casca (preto) e polpa (vermelho) de S.lycocarpum em relao temperatura de ensaio. 4.2.4 Termoestabilidade a 50 e 70 C

Conforme dito anteriormente, o aumento da atividade enzimtica em relao temperatura s acontece at o momento em que determinada temperatura comea a desnaturar a enzima, com isso a enzima perde a sua estrutura nativa. A desnaturao provoca drsticas alteraes na conformao da molcula, acarretando a perda do poder de catlise (MARZZOCO & TORRES, 2007). Com base nisso, analisou-se a termoestabilidade da peroxidase presentes tanto no extrato da casca, quanto no extrato da polpa. Os resultados obtidos esto dispostos nos grficos das figuras 15 e 16.

47

400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80

C asca P o lp a

U n id a d e d e E n z i m a (U )

90

100

T e m p o (m in u t o s )

Figura 15: Termoestabilidade, a 50 C, da peroxidase contida em extratos da casca (preto) e da polpa (vermelho) de S. lycocarpum.

35

C a sc a P o lp a

A tiv id a d e r e s id u a l (U )

30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100

T e m p o (m in u to s)

Figura 16: Termoestabilidade a 70 C da peroxidase contida em extratos da casca e da polpa da S. lycocarpum.

48

Durante o tratamento trmico dos extratos enzimticos, observou-se um decrscimo quase contnuo da atividade de peroxidase nas duas temperaturas, tanto para os extratos da polpa quanto para os extratos da casca da S. lycocarpum. Embora tenha sido observado que a queda na atividade em funo do aquecimento demonstra um padro similar para as amostras de casca e polpa, possvel notar que as enzimas presentes na casca so mais termorresistentes a 50 C, enquanto que aquelas presentes na polpa apresentam maior resistncia a 70 C. 4.3 IMOBILIZAO DA PEROXIDASE DA S. LYCOCARPUM 4.3.1 Ativao dos Compsitos Pani/Sty-DVB (HCl) e Pani/Sty-DVB (HNO3)

O glutaraldedo tem sido extensamente empregado como um agente de ativao para a imobilizao de enzimas por muitos anos. Embora haja muitas discusses a respeito da natureza da reao e das estruturas responsveis por esta propriedade, comumente aceito que tais reaes ocorrem entre os grupos carbonila do glutaraldedo e os grupo amina das enzimas, por meio da formao de uma base de Schiff (MELO et al., 1999). A natureza da reao envolvida na ativao de suportes por glutaraldedo foi, inicialmente, investigada por Richard & Knowles (1968). Desde ento, vrios estudos foram realizados no sentido de desvendar as estruturas presentes neste composto. No entanto, prevalece a idia de que a ligao ao glutaraldedo se d em pH neutro ou levemente alcalino (TREVAN, 1980; ZABORSKI, 1974) e que a forma envolvida na reao seja predominantemente polimrica, ou seja, o poliglutaraldedo. No final do sculo passado, Melo et al. (1999), concluram que durante o processo de ativao do suporte, ocorre uma deposio de poliglutaraldedo na superfcie ou no interior do mesmo. Segundo Arora et al. (2007), o glutaraldedo atua como um agente formador de ligaes cruzadas, se ligando covalentemente, com uma de suas terminaes, aos grupos amina terminais da matriz de polianilina e a outra terminao, se liga aos grupos amina da enzima. A Figura 17 apresenta uma adaptao do esquema de ativao da polianilina com glutaraldedo seguido da imobilizao da peroxidase com a Pani ativada, apresentado por Arora et al. (2007) e por Andrade et al. (2008).

49

N CH HOC + HOC Glutaraldedo H N H2O H N NH2


PEROXIDASE

PEROXIDASE

COH N

CH

NH2

+ H N

H2O

H N

H N

H N

Esqueleto da Polianilina

Polianilina Ativada com Glutaraldedo

Peroxidase-PANI

Figura 17: Representao do esquema de ativao da polianilina com glutaraldedo e imobilizao da peroxidase com a Pani ativada

Os espectros de absoro na regio do infravermelho (FTIR) para os compsitos Pani/Sty-DVB ativados com poliglutaraldedo em pH 6,0; mostram o aparecimento de uma banda por volta de 1700 cm 1. Melo et al. (1999), trabalhando com a polianilina eletroquimicamente polimerizada, observaram o aparecimento de uma banda em 1700 cm 1, para os polmeros tratados com poliglutaraldedo sob refluxo em pH 8,0, qual relacionaram ao estiramento de carbonila de aldedo, indicando a presena deste composto na estrutura da polianilina. As Figuras 18 e 19 mostram os espectros de FTIR para os compsitos Pani/StyDVB (HNO3) e Pani/Sty-DVB (HC), ambos ativados com poliglutaraldedo em pH 6,0. Pode-se observar que, ambos apresentam uma banda em 1700 cm 1, indicando a presena do poligluraldedo na estrutura da polianilina, o que no ocorre com os espectros de FTIR dos compsitos sem ativar.

50

C o m p s it o P a n i /S t y - D V B ( H N O 3 )

I n t e n s id a d e R e la t iv a ( u .a .)

C o m p s it o P a n i /S t y - D V B ( H N O 3 ) a t i v a d o

4000

3500

3000

2500

2000

1500
-1

1000

500

N m ero d e O n d a (cm )

Figura 18: Espectro de Absoro na Regio do Infravermelho para os compsitos Pani/Sty-DVB (HNO3) sem ativar e ativado com poliglutaraldedo em pH 6,0.

C o m p s it o P a n i/ S t y - D V B ( H C l)

I n t e n s id a d e R e la t iv a ( u .a .)

C o m p s it o P a n i/ S t y - D V B ( H C l) a t iv a d o

4000

3500

3000

2500

2000

1500
-1

1000

500

N m e r o d e O n d a (c m )

Figura 19: Espectro de Absoro na Regio do Infravermelho para os compsitos Pani/Sty-DVB (HC) sem ativar e ativado com poliglutaraldedo em pH 6,0. 51

4.3.2 Tempo de Imobilizao

Na Figura 20, pode-se observar a influncia do tempo de contato do extrato com os compsitos de Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3) ativados, sobre a eficincia da imobilizao. medida que se aumenta o tempo de imobilizao, observase um aumento na atividade de peroxidase imobilizada, at o tempo de 30 min. Aps esse tempo, observa-se um certo declnio na atividade, que logo tende a se estabilizar. Com isto possvel afirmar que o tempo necessrio para a imobilizao da enzima contida no extrato de 30 min. Fernandes (2000), estudando o tempo de imobilizao de Horseradish peroxidase em diferentes polianilinas ativadas com poliglutaraldedo, relata a necessidade de um tempo de 60 min para a imobilizao. Os resultados obtidos aqui sugerem que 30 min so suficientes e que intervalos de tempo maiores que este podem ocasionar em uma perda de eficincia no processo. Essa reduo na atividade observada aps um aumento do tempo de imobilizao j foi relatada por Trevan (1980). Este autor explica que os grupos reativos do suporte, aps terem reagido com as molculas de enzima no processo de imobilizao, j estariam saturados. Por isto, possvel que com o passar do tempo molculas de enzima presentes na soluo poderiam reagir com aquelas j imobilizadas, formando camadas irregulares, que dificultariam o acesso do substrato at o stio cataltico, resultando numa falsa idia de reduo de atividade com o aumento do tempo de imobilizao.

52

P a n i/S ty -D V B -P e ro x id a se (H C l)

U n id a d e d e E n z im a (U )

600

P a n i/S ty -D V B -P e ro x id a se (H N O

500

400

200

100

0 0 20 40 60 80 100 120 140 160

T e m p o (m in u to s)

Figura 20: Relao entre o tempo e eficincia de imobilizao da peroxidase contida no extrato da casca da S. lycocarpum nos diferentes compostos Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC,) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). 4.2.3 pH timo de Imobilizao

Os resultados dos testes de pH timo de imobilizao mostrados na Figura 21 revelaram comportamentos bastante similares aos obtidos para a enzima da casca livre (Figura 12). Entretanto no pH 4.5. a enzima imobilizada apresenta desempenho superior ao da enzima livre. Por outro lado, no pH 5,0 a enzima imobilizada apresenta um desempenho inferior. Contudo, observando-se os dados obtidos para a enzima imobilizada, pode-se constatar que assim como para a enzima livre, o pH 7.0 apresentase como o pH timo de imobilizao, confirmando este como o pH de melhor atuao da enzima livre.

53

U n id a d e d e E n zim a (U )

600

Pani/Sty-DVB (HNO Pani/Sty-DVB (HCl)

500

400

300

200

100

0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

pH

Figura 21: Eficincia de imobilizao da peroxidase da casca da S. lycocarpum em relao ao pH, nos compsitos Pani/Sty-DVB (HC) e Pani/Sty-DVB (HNO3).

4.2.4 Reutilizao da Peroxidase Imobilizada Os resultados obtidos na reutilizao dos compostos Pani/Sty-DVB- Peroxidase (HC) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3) esto dispostos no grfico da Figura 22. Os resultados obtidos se mostraram bastante satisfatrios, pois a atividade das enzimas manteve-se basicamente constante nas primeiras 10 reutilizaes. Isso sinal de uma forte ligao enzima-suporte. Alem disso, pode-se observar que os compostos Pani/StyDVB- Peroxidase (HC) apresentam uma maior estabilidade em relao aos compostos Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3). Por outro lado, este comportamento compensado pela melhor eficincia da peroxidase imobilizada em compsitos de Pani/Sty-DVB (HNO3).

54

A tiv id a d e R e s id u a l (% )

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6
Pani/Sty-DVB (HCl) Pani/Sty-DVB (HNO
3

10

11

12

13

14

15

Nmero de utilizaes

Figura 22: Grfico da Reutilizao dos compsitos de Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HC) e Pani/Sty-DVB-Peroxidase (HNO3).

55

5 CONCLUSO
Os compsitos sintetizados via polimerizao oxidativa da anilina na presena de cido clordrico e cido ntrico, apresentaram caractersticas adequadas para a imobilizao da peroxidase em sua estrutura. Entretanto, a velocidade de polimerizao da anilina mais rpida na presena de HC do que na presena de HNO3, o que leva a concluir que a velocidade de reao depende do tipo de cido utilizado para a sntese da Pani. A peroxidase, extrada da casca de S. lycocarpum apresenta uma maior atividade do que quela extrada da polpa. Por outro lado, as mesmas apresentam um padro similar de decaimento da atividade, quando submetidas a aquecimento. Entretanto, possvel notar que as enzimas presentes na casca apresentam uma maior estabilidade a 50 C, enquanto que aquelas presentes na polpa, apresentam maior estabilidade trmica a 70 C. A enzima imobilizada apresentou uma atividade maior do que a enzima livre. Isso pode ser explicado pelo fato de que a enzima se encontra junto ao extrato, onde pode haver algumas substncias inibidoras da peroxidase, alm de outras reaes secundrias. J a peroxidase imobilizada esta livre de interferentes, sendo disponibilizada inteiramente para reao. Foi constatado que so necessrios apenas 30 min para que a peroxidase seja imobilizada pelos dois compsitos. Comparando-se este resultado com os obtidos por Makino et al. (1988), que relata a necessidade de um tempo de 4 h para que a imobilizao fosse completa e Fernandes (2000) que relata a necessidade de 60 min para que o mesmo ocorra, possvel afirmar que a peroxidase da S. lycocarpum imobilizada em Pani/Sty-DVB representa uma opo vantajosa pela expressiva economia no tempo de imobilizao. A possibilidade de reutilizao da enzima imobilizada nos compsitos mostrou ser um fator econmico chave para a soluo dos problemas de alto custo inicial. Isto particularmente importante para enzimas imobilizadas, em que a reciclagem do catalisador, a manuteno da atividade por longos perodos de uso, bem como, a estabilidade da ligao suporte-enzima so essenciais para o desenvolvimento de processos economicamente viveis. Isto se acentua ainda mais, pelo fato de que os compsitos so de fcil recuperao, visto que, os mesmo podem ser separados do meio reacional por uma simples filtrao a vcuo.

56

PERSPECTIVAS Algumas possveis aplicaes para a peroxidase imobilizada nos compsitos Pani/Sty-DVB seria seu emprego no abatimento ou na oxidao de fenol e de compostos fenlicos em guas residurias, provenientes de indstrias txteis. Uma outra possvel aplicao desse material seria o emprego dos compsitos Pani/Sty-DVB como material adsorvente de Cr (VI), uma vez que, so capazes de adsorver quantidades considerveis desse metal pesado a partir de solues aquosas.

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