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5. TEXTOS GERAIS
5.1. Textos gerais sobre esterilidade .............................. 5.2. Textos gerais sobre vacinas...................................... 5.3. Anlise estatstica de resultados de ensaios e testes biolgicos ................................................................ 5.4. Solventes residuais .................................................. 5.5. Tabelas alcoomtricas .............................................. 5.6. Aferio dos interferes .......................................... 515 523 541 577 589 599 5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa ...................... 5.8. Harmonizao das Farmacopeias............................ 5.9. Polimorfismo .......................................................... 5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico ............................................................ 5.11. Caractersticas nas monografias ............................ 607 615 619 623 629

5. Textos gerais

5.1. TEXTOS GERAIS SOBRE ESTERILIDADE


5.1. Textos gerais sobre esterilidade ................................ 5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis .... 5.1.2. Indicadores biolgicos de esterilizao .......... 5.1.3. Eficcia dos conservantes antimicrobianos ...... 515 515 517 518 5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas ........................................................ 519 5.1.5. Aplicao do conceito FO esterilizao pelo vapor das preparaes aquosas .............................. 520

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

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5. Textos gerais

5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis

5.1. TEXTOS GERAIS SOBRE ESTERILIDADE


5.1.1. MTODOS DE PREPARAO DE PRODUTOS ESTREIS
Esterilidade a ausncia de microrganismos vivos. A realizao de ensaios no suficiente para garantir a esterilidade de um produto e a garantia da esterilidade passa igualmente pela aplicao de processos de produo convenientemente validados. essencial estudar o efeito do mtodo de esterilizao escolhido sobre o produto (incluindo o recipiente ou a embalagem final) do ponto de vista da eficcia e da manuteno da sua integridade e validar esse mtodo antes de o pr em prtica. Recomenda-se a escolha de um recipiente que seja compatvel com o mtodo de esterilizao aconselhado. A utilizao escrupulosa de um processo validado condio a respeitar, sob pena de obter um produto no estril ou deteriorado. De cada vez que se fazem mudanas de vulto no processo de esterilizao faz-se nova validao incluindo no que diz respeito a inquinao microbiana (carga). bvio que as normas de boa prtica de fabrico (descritas, por exemplo, no guia CEE relativo s boas prticas de fabrico) tero que ser observadas, nomeadamente no que diz respeito a: emprego de pessoal qualificado e convenientemente treinado, utilizao de locais adequados, utilizao de equipamento de produo adequado, concebido para poder ser facilmente limpo e esterilizado, respeito pelas precaues necessrias para reduzir o risco de inquinao microbiana (biocarga) antes da esterilizao, utilizao de mtodos validados em todas as etapas crticas da produo, vigilncia do ambiente e controlos durante a produo. As precaues a tomar para limitar a carga microbiana antes da esterilizao incluem a utilizao de compostos que apresentem um nvel suficientemente baixo de contaminao microbiana. Pode ser desejvel executar controlo microbiolgico e estabelecer limites apropriados para compostos cuja origem, natureza ou modo de preparao comportem riscos de contaminao. Os mtodos descritos neste texto aplicam-se principalmente inactivao ou eliminao de bactrias, leveduras e fungos. Entretanto, para os produtos biolgicos de origem animal ou humana, ou quando material de origem animal ou humana utilizado na produo, necessrio demonstrar, aquando da validao, que o processo utilizado permite eliminar ou inactivar os contaminantes vricos potenciais. Indicaes a este respeito so fornecidas, por exemplo, nas Notas Explicativas CEE. Sempre que possvel, conveniente escolher um processo que permita a esterilizao do produto na embalagem definitiva (esterilizao final). Quando se utiliza um processo final (pelo vapor, pelo calor seco ou por radiaes) totalmente validado, pode admitir-se, sob reserva de aprovao pela Autoridade Nacional, que se recorra libertao paramtrica, isto , fundamentar a libertao de um lote de unidades esterilizadas mais nos dados de produo do que nos resultados de um ensaio de esterilidade efectuado sobre uma amostra desse lote. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Se a esterilizao final no for possvel, convm recorrer filtrao usando um filtro que retenha bactrias, ou tcnica assptica; sempre que possvel, aplica-se um tratamento complementar apropriado (por exemplo, aquecimento) ao produto no seu recipiente definitivo. Em todos os casos, o recipiente e o sistema de fecho mantm a esterilidade do produto durante todo o tempo de validade. Nvel de segurana de esterilidade (NSE) Nos casos apropriados, nos mtodos descritos mais adiante faz-se referncia ao conceito de nvel de segurana de esterilidade ou NSE. Com efeito, no pode garantir-se nem verificar em absoluto a esterilidade de todas as unidades contidas numa populao que tenha sido objecto de esterilizao. A inactivao de microrganismos por processos fsicos ou qumicos um fenmeno que se rege por uma lei exponencial e, por consequncia, existe sempre uma certa probabilidade estatstica de um microrganismo sobreviver esterilizao. Para um determinado processo, esta probabilidade de sobrevivncia funo do nmero, do tipo e da resistncia dos microrganismos presentes, bem como do ambiente em que se desenrola a operao. O nvel de segurana de esterilidade (NSE) de um processo de esterilizao indica o grau de segurana com o qual um conjunto de unidades tornado estril pelo processo utilizado. O NSE para determinada tcnica expresso como a probabilidade da existncia de uma unidade no estril nessa populao. Um NSE de 106, por exemplo, corresponde a uma probabilidade de existir, no mximo, 1 microrganismo vivel em 106 unidades esterilizadas do produto final. O NSE associado a um processo, para um determinado produto, estabelecido com base em estudos de validao apropriados. MTODOS E CONDIES DE ESTERILIZAO A esterilizao pode ser efectuada por um dos mtodos descritos a seguir. possvel utilizar variantes ou combinaes destes mtodos, desde que o processo escolhido seja validado quer no aspecto de eficcia, quer na manuteno da integridade do produto, incluindo o recipiente ou a embalagem. Qualquer que seja o mtodo de esterilizao utilizado, os parmetros crticos so objecto de controlo para confirmar que o conjunto do lote sujeito, durante todo o processo de tratamento, s condies de esterilizao previamente definidas. Esta exigncia vlida em todos os casos, mesmo quando so utilizadas condies padro. Esterilizao final Para a esterilizao final, essencial ter em conta a no uniformidade das condies fsicas ou qumicas durante o ciclo de esterilizao. O local menos acessvel ao agente de esterilizao determinado para cada processo de carga e para cada tipo e forma de recipiente ou de embalagem (por exemplo, o ponto mais frio de uma autoclave). Convm igualmente determinar a dose mnima letal resultante do ciclo de esterilizao e a reprodutibilidade deste, para assegurar que todas as cargas submetidas esterilizao recebem o tratamento recomendado. Depois de se estabelecer um processo de esterilizao final, avalia-se a sua eficcia na rotina, sempre que possvel, por verificao e registo apropriados das condies fsicas ou qumicas atingidas pela carga, durante toda a durao do ciclo de esterilizao. Esterilizao pelo vapor (em autoclave). Quando aplicvel, a esterilizao pelo vapor saturado sob presso o mtodo 515

5. Textos gerais

5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis

recomendado, nomeadamente para as solues aquosas. Para este mtodo de esterilizao final, as condies padro aplicveis s preparaes aquosas so de 121C, durante, pelo menos, 15 min. Podem utilizar-se outras combinaes de temperatura e tempo desde que se demonstre que o processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106. As informaes relativas validao por meio do conceito F0 so dadas mais adiante (5.1.5). Os parmetros fsicos (temperatura e presso) existentes dentro da autoclave durante o processo de esterilizao so conhecidos. A temperatura geralmente determinada por meio de sondas instaladas no interior de vrios recipientes representativos bem como em pontos da autoclave previamente identificados como os mais frios do conjunto da carga. Os parmetros fsicos so registados durante todo o decorrer do ciclo, por exemplo na forma de diagrama temperatura/tempo ou qualquer outra apropriada. Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao, conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2). Esterilizao pelo calor seco. Para este mtodo de esterilizao final as condies padro so de 160C durante, pelo menos, 2 h. Podem utilizar-se outras combinaes de temperatura e tempo desde que se demonstre que o processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106. A esterilizao pelo calor seco realiza-se em estufas de ventilao forada ou noutros dispositivos especialmente preparados para o efeito. A carga cotocada de tal modo que a temperatura seja uniforme em todo o conjunto. Obtm-se dados relativos temperatura no interior do esterilizador durante o processo de esterilizao, recorrendo geralmente a sondas instaladas no interior de vrios recipientes representativos bem como em pontos do esterilizador previamente identificados como os mais frios do conjunto da carga. A temperatura registada durante todo o decorrer do ciclo, de forma apropriada. Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao, conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2). O calor seco a mais de 220C frequentemente utilizado para esterilizar e despirogenar material de vidro. Neste caso, em lugar de utilizar indicadores biolgicos de esterilizao (5.1.2), possvel demonstrar a existncia de uma reduo de 3 log das endotoxinas resistentes ao calor. Esterilizao por radiaes ionizantes. Este mtodo de esterilizao efectua-se por exposio do produto a uma radiao ionizante que pode ser uma radiao gama proveniente de um radioistopo apropriado (cobalto 60, por exemplo) ou um feixe de electres acelerados por meio de um acelerador apropriado. Em certos pases existem regulamentaes especiais para a utilizao das radiaes ionizantes para fins de esterilizao (ver, por exemplo, as Notas Explicativas CEE). Para este mtodo de esterilizao final, a dose padro (dose absorvida) de 25 kGy. Podem utilizar-se outros valores desde que se demonstre que a dose escolhida assegura uma taxa de letalidade adequada e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106. 516

Durante o processo de esterilizao, a radiao absorvida pelo produto objecto de verificaes regulares, efectuadas por processos dosimtricos que so independentes da taxa de radiao. Os aparelhos so calibrados em relao a uma fonte padro numa instalao de referncia quando da recepo e depois com intervalos de tempo apropriados que no ultrapassam 1 ano. Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao, conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2). Esterilizao por gases. Este mtodo s utilizado quando no possvel aplicar qualquer um dos outros processos. essencial assegurar a penetrao do gs e da humidade no produto a esterilizar e utilizar depois um processo de eliminao do gs em condies que se verificou previamente permitirem que no produto esterilizado os resduos ou produtos de transformao do gs se reduzem a uma concentrao inferior que pode provocar efeitos txicos quando da utilizao. A este respeito, as notas explicativas da CEE fornecem indicaes quanto ao emprego do xido de etileno. Convm, sempre que possvel, determinar e registar a concentrao do gs, a humidade relativa, a temperatura e o tempo de esterilizao. As determinaes so efectuadas nos locais mais desfavorveis do ponto de vista da realizao das condies de esterilizao, locais estes que foram determinados quando da validao. A eficcia do processo verificada, para cada carga esterilizada, com indicadores biolgicos apropriados (5.1.2). Um amostra apropriada de cada lote submetida a um ensaio de esterilidade (2.6.1) antes da sua libertao. Filtrao Certas substncias activas ou produtos no susceptveis de serem submetidos a uma esterilizao final podem ser esterilizados por filtrao usando um tipo de filtro que satisfaa a uma prova microbiana realizada com um microrganismo de ensaio apropriado. Pode servir uma suspenso de Pseudomonas diminuta (ATCC 19146 NCIMB 11091 ou CIP 103020). Recomenda-se aplicar uma carga de prova de, pelo menos, 107 ufc por cm2 de rea activa de filtrao e preparar a suspenso num meio de cultura de triptano-soja que, aps passagem atravs do filtro, recolhido em condies asspticas e incubado em aerobiose a 32C. Estes produtos necessitam de precaues especiais. O processo e o ambiente de produo so escolhidos de modo a limitar os riscos de contaminao microbiana e so objecto de verificao regular por mtodos apropriados. O equipamento, os recipientes e fechos e, se possvel, os componentes do produto so submetidos a um processo de esterilizao conveniente. Efectua-se a filtrao esterilizante to prximo quanto possvel do ponto de enchimento. As operaes que se seguem filtrao so realizadas em condies asspticas. As solues so filtradas por uma membrana antibacteriana de porosidade nominal inferior ou igual a 0,22 m ou por outro tipo de filtro que possua propriedades equivalentes de reteno de bactrias. So tomadas precaues para evitar as perdas de soluto por adsoro no filtro e a libertao de contaminantes pelo filtro. Tem-se em conta a contaminao microbiana antes da filtrao, a capacidade do filtro, o tamanho dos lotes e o tempo de filtrao. Um mesmo filtro no utilizado durante um espao de tempo superior quele que foi definido como adequado quando da validao do conjunto filtro-produto. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

5.1.2. Indicadores biolgicos de esterilizao

A integridade dos filtros esterilizantes verificada antes e depois do seu uso por meio de ensaios adaptados ao tipo de filtro e etapa em que efectuada a verificao (por exemplo, ponto de bolha, resistncia presso ou taxa de difuso). Dados os riscos suplementares que comporta a filtrao, em relao aos outros mtodos de esterilizao, pode ser desejvel proceder a uma pr-filtrao com um filtro antibacteriano quando impossvel limitar a contaminao microbiana por outros meios. Preparao assptica O objectivo da preparao assptica manter a esterilidade de um produto obtido a partir de componentes previamente esterilizados por um dos mtodos antes descritos. O processo de atingir este objectivo operar em condies e em instalaes concebidas para impedir a contaminao microbiana. A preparao assptica pode compreender o enchimento e o fecho assptico dos recipientes, a mistura assptica dos componentes da frmula seguida do enchimento e do acondicionamento asspticos. Para manter a esterilidade dos componentes e do produto durante a preparao conveniente dispensar ateno especial aos seguintes aspectos: meio ambiente, pessoal laborante, reas crticas, esterilizao dos recipientes/fechos e operaes de transferncia de produtos, durao mxima da armazenagem antes da embalagem final. A validao do processo de preparao compreende verificaes adequadas sobre o conjunto dos parmetros referidos e o prprio processo objecto de verificaes regulares por simulao com meios de crescimento microbiano que so postos a incubar e examinados com vista deteco de uma eventual contaminao microbiana. Alm disso, dos produtos esterilizados por filtrao ou preparados em condies asspticas submetida ao ensaio de esterilidade (2.6.1) uma amostra apropriada antes da libertao do lote.

inibidor para os esporos utilizados, em particular quanto sua germinao. Os indicadores biolgicos so caracterizados pelo nome da espcie bacteriana do microrganismo indicador, nmero da estirpe na coleco de origem, nmero de esporos viveis por suporte e pelo valor D. O valor D o valor de um parmetro de esterilizao (durao ou dose absorvida) necessrio para reduzir em 10 por cento do valor inicial, o nmero de microrganismos viveis. S tem significado em condies experimentais bem definidas. Esto presentes apenas os microrganismos indicados. Podem ser utilizados como indicadores biolgicos suportes com mais do que uma espcie bacteriana. So fornecidas informaes sobre o meio de cultura e condies de incubao. Recomenda-se que os indicadores biolgicos sejam colocados em locais considerados menos acessveis ao agente esterilizante, ou identificados como tais por prvias determinaes fsicas. Aps exposio ao agente esterilizante, utiliza-se uma tcnica assptica para transferir o suporte carregado de esporos para o meio de cultura, afim de evitar qualquer risco de contaminao na altura do exame. Podem ser utilizados indicadores biolgicos que incluam uma ampola com meio de cultura directamente colocada na embalagem de proteco do suporte semeado. A escolha dos microrganismos indicadores efectuada com base nos seguintes critrios: a) a resistncia da estirpe indicadora ao mtodo de esterilizao considerado , quando comparada, superior de todos os microrganismos patognicos e dos microrganismos potencialmente presentes no produto, b) a estirpe indicadora no patognica, c) a estirpe indicadora desenvolve-se facilmente, O desenvolvimento aps incubao dos microrganismos indicadores submetidos ao processo de esterilizao demonstra que o processo foi insuficiente. 1. Esterilizao pelo vapor. Recomenda-se a utilizao de indicadores biolgicos na esterilizao pelo vapor para a validao dos ciclos de esterilizao. Recomenda-se a utilizao de esporos de Bacillus stearothermophilus (por exemplo ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157 ou CIP 52.81). O nmero de esporos viveis por suporte superior a 5 105 e o valor D a 121C superior a 1,5 min. Verifica-se se a exposio dos indicadores biolgicos ao vapor durante 6 min a 121 1C mantm os esporos revivificveis, e que no h desenvolvimento dos microrganismos indicadores aps exposio ao vapor durante 15 min a 121 1C. 2. Esterilizao pelo calor seco. Recomenda-se a utilizao de Bacillus subtilis (por exemplo a var. niger ATCC 9372, NCIMB 8058 ou CIP 77.18) na preparao de indicadores biolgicos. O nmero de esporos viveis por suporte superior a 1 105 e o valor D a 160C da ordem de 1 a 3 min. O calor seco a temperaturas superiores a 220C utilizado frequentemente na esterilizao e eliminao de pirognios no material de vidro. Neste caso, a demonstrao da existncia de uma reduo de 3 log de endotoxinas bacterianas resistentes ao calor substitui a utilizao de indicadores biolgicos. 3. Esterilizao por radiaes. Podem ser utilizados indicadores biolgicos para monitorizar as operaes de rotina, como meio suplementar para avaliar a eficcia da dose de radiao escolhida, especialmente no caso de esterilizao com electres acelerados. Recomenda-se a 517

5.1.2. INDICADORES BIOLGICOS DE ESTERILIZAO


Os indicadores biolgicos so preparaes aferidas de microrganismos seleccionados, utilizados para avaliar a eficcia de um procedimento de esterilizao. So geralmente constitudos por uma populao de esporos bacterianos depositados num suporte inerte, por exemplo uma tira de papel de filtro, uma lmina de vidro ou um tubo de material plstico. O suporte semeado embalado de modo a que o conjunto fique protegido de qualquer alterao ou contaminao, permitindo no entanto que o agente esterilizante entre em contacto com os microrganismos. As suspenses bacterianas podem apresentar-se em ampolas seladas. Os indicadores biolgicos so preparados de modo a poderem ser conservados em condies definidas. Determina-se um prazo de validade. Microrganismos da mesma espcie bacteriana que as bactrias utilizadas para fabricar os indicadores biolgicos podem ser inoculados directamente num produto lquido a esterilizar, ou num produto lquido similar ao produto a esterilizar. Neste caso, demonstra-se que o lquido utilizado no tem efeito FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

5.1.3. Eficcia dos conservantes antimicrobianos

utilizao de esporos de Bacilius pumilus (por exemplo, ATCC 27.142, NCTC 10327, NCIMB 10692 ou CIP 77.25). O nmero de esporos viveis por suporte superior a 1 107. O valor D superior a 1,9 kGy. Verifica-se que no existe desenvolvimento de microrganismos indicadores aps exposio a 25 kGy (dose mnima absorvida) 4. Esterilizao por gases. A utilizao de indicadores biolgicos necessria para todos os procedimentos de esterilizao por gases, tanto na validao dos ciclos como nas operaes de rotina. A esterilizao por gases correctamente utilizada para os dispositivos mdicos, os isoladores, os locais, etc. A utilizao dos gases neste contexto no faz parte das actividades da Farmacopeia. A utilizao de esporos de Bacillus subtilis (por exemplo a variedade niger ATCC 9372, NCIMB 8058 ou CIP 77.18) recomendado para o xido de etileno. O nmero de esporos viveis por suporte superior a 5 105. Os parmetros de resistncia so conhecidos para o procedimento utilizado: por exemplo, para o xido de etileno, o valor D superior a 2,5 min para um ciclo de ensaio envolvendo 600 mg/l de xido de etileno a 54C com 60 por cento de humidade relativa. Verifica-se a ausncia de desenvolvimento dos microrganismos indicadores aps exposio durante 60 min no ciclo do ensaio atrs descrito, e que a sua exposio durante 15 min num ciclo com temperatura reduzida (600 mg/l, 30C e 60 por cento de humidade relativa) deixa os esporos revivificveis. A exposio dos indicadores a 600 mg/l de xido de etileno, durante 60 min, a 54C e sem humidificao deve deixar esporos revivificveis para assegurar que o indicador biolgico capaz de revelar a existncia de uma humidificao insuficiente.

A eficcia da actividade antimicrobiana demonstra-se atravs do ensaio abaixo descrito, que no se destina ao controlo de rotina. ENSAIO DE EFICCIA DOS CONSERVANTES ANTIMICROBIANOS O ensaio consiste na contaminao artificial da preparao, se possvel no recipiente definitivo, atravs da inoculao de microrganismos apropriados, conservando a preparao semeada a uma temperatura adequada, colhendo amostras do recipiente em determinados intervalos de tempo e efectuando nelas uma contagem dos microrganismos. Consideram-se adequadas as propriedades conservantes da preparao quando, nas condies do ensaio e aps intervalos de tempo e temperaturas prescritos, se produzir, conforme os casos, uma diminuio importante ou uma ausncia de aumento do nmero de microrganismos na preparao inoculada. Os critrios de aceitao, em termos de diminuio do nmero de microrganismos em funo do tempo, variam para as diversas categorias de preparaes de acordo com o grau de proteco pretendido (ver quadros)
Microrganismos de ensaio Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Candida albicans Aspergillus niger ATCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82.118. ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518; CIP 4.83. ATCC 10231; NCPF 3 179; IP 48.72. ATCC 16404; IMI 149007; IP 1431.83.

5. Textos gerais

5.1.3. EFICCIA DOS CONSERVANTES ANTIMICROBIANOS


Quando as preparaes farmacuticas no possuam elas prprias propriedades conservantes adequadas, podem adicionar-se-lhes agentes de conservao antimicrobianos, particularmente em preparaes aquosas, com o fim de evitar ou limitar a proliferao microbiana que pode ocorrer nas condies normais de conservao e de emprego e assim apresentar um risco de infeco para o doente e deteriorao da preparao, nomeadamente nos recipientes multidose. Os agentes de conservao antimicrobianos no so utilizados para substituir o cumprimento das boas prticas de fabrico. A eficcia de um agente de conservao antimicrobiano pode ser aumentada ou diminuda pelo composto activo da preparao, pela composio da preparao na qual incorporado ou pelo recipiente e modo de fecho adoptado. A actividade antimicrobiana da preparao no recipiente definitivo avaliada para o seu perodo de validade com o objectivo de assegurar que aquela actividade no sofre alterao durante o perodo de conservao. Estes exames so efectuados em amostras colhidas do recipiente definitivo imediatamente antes do ensaio. Durante a fase de desenvolvimento de uma preparao farmacutica, verifica-se a actividade antimicrobiana prpria da preparao ou, se necessrio, demonstra-se que, quando adicionada de 1 ou mais conservantes apropriados, assegura uma proteco adequada contra os efeitos nocivos que podem resultar da contaminao ou da proliferao microbiana durante o perodo de conservao e emprego da preparao. 518

Os ensaios efectuam-se com 1 estirpe de cada vez. Complementam-se os microrganismos especificados com estirpes ou espcies que constituem contaminantes potenciais da preparao. Por exemplo, a Escherichia coli (ATCC 8739; NCIMB 8545; CIP 53.126) utiliza-se em todas as preparaes orais e a Zygosaccharomyces rouxii (NCY 381; IP 2021.92) nas preparaes orais com elevada concentrao de acar. Preparao do inculo Antes do ensaio, semeie superfcie de um meio gelosado B (2.6.12) para bactrias ou um meio gelosado C sem antibiticos (2.6.12) para fungos uma cultura-me recente obtida de cada um dos microrganismos especificados. Incube as culturas bacterianas a uma temperatura entre 30-35C, durante 18-24 h, a cultura de C. albicans entre 20-25C, durante 48 h, e a cultura de A. niger entre 20-25C, durante 1 semana ou at obteno de uma esporulao satisfatria. Podem ser necessrias subculturas depois de revitalizao dos microrganismos, at que estes atinjam um desenvolvimento ptimo, sendo recomendvel que se mantenha um nmero mnimo de repicagens. Para a colheita das culturas bacterianas e de C. albicans utilize um lquido de suspenso estril contendo 9 g/l de cloreto de sdio R. Disperse e transfira a cultura desenvolvida em superfcie para um recipiente apropriado. Junte uma quantidade adequada de lquido de suspenso para reduzir o nmero de microrganismos para cerca de 108 por mililitro. Para recolher a cultura de A. niger utilize um lquido de suspenso estril contendo 9 g/l de cloreto de sdio R e 0,5 g/l de polissorbato 80 R e ajuste o nmero de esporos para cerca de 108 por mililitro com a mesma soluo. Colha imediatamente uma amostra apropriada de cada suspenso e determine o nmero de unidades formadoras de colnias por mililitro em cada suspenso, atravs da sementeira em placas ou filtrao por membrana (2.6.12). Este valor serve para

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5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas

determinar o inculo e a linha de base a ser utilizada no ensaio. As suspenses so usadas imediatamente. MTODO Para se efectuar a contagem de microrganismos viveis nas preparaes inoculadas, use o mesmo meio gelosado que foi empregue na cultura inicial do microrganismo correspondente. Semeie vrios recipientes da amostra com uma suspenso de um dos microrganismos de ensaio de modo a que se obtenha um inculo com 105 a 106 microrganismos por mililitro ou por grama da preparao. O volume da suspenso do inculo no ultrapassa 1 por cento do volume do produto. Misture cuidadosamente para assegurar uma distribuio homognea. Mantenha o produto semeado a uma temperatura entre 20C e 25C, ao abrigo da luz. Colha amostras apropriadas de cada recipiente, por exemplo 1 ml ou 1 g, no tempo 0 e nos intervalos de tempo apropriados, consoante o tipo de preparao, e calcule o nmero de microrganismos viveis atravs da sementeira em placas ou filtrao por membrana (2.6.12), assegurando que toda a actividade antimicrobiana residual da preparao tenha sido eliminada pela diluio, por filtrao ou atravs da utilizao de um desactivador especfico. No caso de se utilizar o mtodo das diluies, leva-se em linha de conta a reduo da sensibilidade na deteco de pequeno nmero de microrganismos viveis. No caso de se utilizar um desactivador especfico, confirma-se, atravs de controlos apropriados, a capacidade do sistema de permitir o crescimento dos microrganismos de ensaio. O mtodo validado com o objectivo de se verificar a capacidade para pr em evidncia a reduo na contagem do nmero de microrganismos viveis. CRITRIOS DE ACEITAO Os critrios para avaliao da actividade antimicrobiana apresentam-se na tabela em termos de reduo logartmica do nmero de microrganismos viveis relativamente ao valor obtido no inculo.
Preparaes parentricas e oftlmicas Reduo logartmica 6h Bactrias A B Fungos A B SA: sem aumento NE: no encontrado 2 24 h 3 1 7 dias 3 2 14 dias 1 28 dias NE SA SA SA

Os critrios A representam a eficcia que se recomenda seja atingida. Quando justificados, se os critrios A no puderem ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem reaces indesejveis, aplicam-se os critrios B.
Preparaes orais Reduo logartmica 14 dias Bactrias Fungos 3 1 28 dias SA SA

Estes critrios representam a eficcia que se recomenda seja atingida.

O presente captulo publicado a ttulo de informao. O fabrico, o acondicionamento, a conservao e a distribuio das preparaes farmacuticas so conduzidas de modo a assegurar uma qualidade microbiolgica satisfatria. As preparaes farmacuticas satisfazem s seguintes exigncias: Categoria 1 Preparaes obrigatoriamente estreis de acordo com a monografia da forma farmacutica correspondente e outras preparaes rotuladas de estreis. Ensaio de esterilidade (2.6.1) Categoria 2 Preparaes para aplicao local ou para administrao nas vias respiratrias, com excepo das preparaes obrigatoriamente estreis, e dispositivos transdrmicos. Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). No mximo, 102 bactrias, fungos e leveduras por grama, por mililitro ou por dispositivo transdrmico (compreendendo a pelcula protectora e a camada de suporte). Enterobactrias e outras bactrias Gram-negativas (2.6.13). Dispositivos transdrmicos: ausncia de bactrias, verificada em 1 dispositivo (comprendendo a pelcula protectora e a camada de suporte). Outras preparaes: no mximo, 10 bactrias por grama ou por mililitro. Ausncia de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1,0 g, 1 ml ou 1 dispositivo (comprendendo a pelcula protectora e a camada de suporte) (2.6.13). Ausncia de Staphylococcus aureus verificada em 1,0 g, 1 ml ou 1 dispositivo (comprendendo a pelcula protectora e a camada de suporte) (2.6.13). Categoria 3

Os critrios A representam a eficcia que se recomenda seja atingida. Quando justificados, se os critrios A no puderem ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem reaces indesejveis, aplicam-se os critrios B.
Preparaes tpicas e locais Reduo logartmica 2 dias Bactrias A B Fungos A B 2 7 dias 3 14 dias 3 2 1 28 dias SA SA SA SA

A. Preparaes para administrao por via oral ou rectal Contagem de germes aerbios viveis totais (2.6.12). No mximo, 103 bactrias e 102 leveduras por grama ou por mililitro. Ausncia de Escherichia coli (1,0 g ou 1,0 ml). 519

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5. Textos gerais

5.1.4. QUALIDADE MICROBIOLGICA DAS PREPARAES FARMACUTICAS

5.1.5. Aplicao do conceito F0 esterilizao pelo vapor das preparaes aquosas


B. Preparaes para administrao por via oral contendo matrias primas de origem natural (animal, vegetal ou mineral), quando impossvel um pr-tratamento antimicrobiano e autorizada para as matrias primas uma contaminao microbiana superior a 103 microrganismos por grama ou por mililitro. Excluem-se os medicamentos com base em plantas descritos na categoria 4. Contagem de germes aerbios viveis totais (2.6.12). No mximo, 104 bactrias e 102 fungos e leveduras por grama ou mililitro. Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas. No mximo, 102 bactrias por grama ou por mililitro (2.6.13). Ausncia de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13). Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
5. Textos gerais

5.1.5. APLICAO DO CONCEITO F0 ESTERILIZAO PELO VAPOR DAS PREPARAES AQUOSAS


Esta seco publicada a ttulo de inforrnao. O valor F0 associado a um processo de esterilizao pelo vapor saturado exprime a sua letalidade, em termos de tempo (em minutos) de exposio temperatura de 121C que seria necessrio para obter o mesmo resultado que com o processo utilizado, aplicado ao produto na sua embalagem final, em relao aos microrganismos que possuem um valor de Z de 10. O vator F0 total de um processo tem em conta as fases de aquecimento e de arrefecimento do ciclo e pode ser calculado por integrao relativamente aos tempos das taxas de letalidade associados a intervalos de temperatura pouco pronunciados. Quando um ciclo de esterilizao pelo vapor escolhido na base do conceito F0, confirmado que ele permite obter, de modo constante, uma adequada segurana de esterilidade. Para validar o processo, pode igualmente ser necessrio efectuar um acompanhamento microbiolgico contnuo e rigoroso durante a produo de rotina para demonstrar que os parmetros microbiolgicos se mantm compreendidos dentro das tolerncias estabelecidas para obter um NSE de, pelo menos, 106. Na esterilizao pelo vapor, Z caracteriza a resistncia de um microrganismo s variaes de temperatura. Define-se como a variao de temperatura necessria para modificar o valor D de um factor de 10. D o valor de um parmetro de esterilizao (durao ou dose absorvida) necessrio para reduzir at 10 por cento do valor inicial o nmero de micorganismos viveis. D s tem significado em condies experimentais bem definidas. Entre estes diferentes parmetros existem as seguintes relaes matemticas:
F0 = D121 (log N0 log N) = D121 log IF D121 N0 N IF = = = = valor de D dos esporos de referncia (5.1.2) a 121C, nmero inicial de microrganismos viveis, nmero final de microrganismos viveis, factor de inactivao. Z= D1 D2 T2 T1 log D1 log D2

Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml) (2.6.13). Categoria 4 Medicamentos com base em plantas, exclusivamente compostos por uma ou vrias drogas vegetais (inteiras, em fragmentos ou em p). A. Medicamentos com base em plantas que necessitam do uso de gua fervente. Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). No mximo, 107 bactrias e 105 fungos e leveduras por grama ou por mililitro. No mximo, Escherichia coli por grama ou por mililitro (2.6.13), utilizando diluies apropriadas. B. Outros medicamentos com base em plantas em que no intervem a gua fervente. Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). No mximo, 105 bactrias e 104 fungos e leveduras por grama ou por mililitro. Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas. No mximo. 103 bactrias por grama ou por mililitro (2.6.13). Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13). Ausncia de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13). 102

= valor de D do microrganismo temperatura T1, = valor de D do microrganismo temperatura T2. IF = N0 N = 10t/D

t D

= tempo de exposio, = valor de D do microrganismo nas condies de exposio.

520

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.2. TEXTOS GERAIS SOBRE VACINAS


5.2. Textos gerais sobre vacinas ...................................... 5.2.1. Terminologia utilizada nas monografias das vacinas .................................................... 5.2.2. Bandos de frangos isentos de microrganismos patognicos especficos para a produo e o controlo da qualidade das vacinas .................................................... 5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano ........................ 5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio .................... 523 523 5.2.5. Substncias de origem animal utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio .......... 5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas para uso veterinrio .................................................................. 5.2.7. Avaliao da eficcia das vacinas para uso veterinrio .............................................................. 5.2.8. Minimizao do risco da transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinrio .............................................. 5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio .................................. 531 532 534

523 525 529

534 538

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

521

5. Textos gerais

5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

5.2. TEXTOS GERAIS SOBRE VACINAS


5.2.1. TERMINOLOGIA UTILIZADA NAS MONOGRAFIAS DAS VACINAS
Sistema de lote semente. Sistema em que lotes sucessivos de um produto derivam do mesmo lote semente primrio. Para a produo de rotina, um lote semente de trabalho preparado a partir do lote semente primrio. A origem e a histria das passagens do lote semente primrio e do lote semente de trabalho so registadas. Lote semente primrio. Cultura de um microrganismo distribuda, a partir de um nico granel, em recipientes processados em conjunto numa nica operao de forma a assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir a contaminao. Um lote semente primrio na forma liquida normalmente conservado a uma temperatura igual ou inferior a -70C. Um lote semente primrio liofilizado conservado a uma temperatura que reconhecidamente assegure a sua estabilidade. Lote semente de trabalho. Cultura de microrganismo a partir do lote semente primrio e que se destina a ser utilizado na produo. Os lotes semente de trabalho so distribudos em recipientes e conservados como descrito anteriormente para o lote semente primrio. Sistema de banco de clulas. Sistema em que lotes sucessivos de um produto so fabricados a partir de culturas de clulas que derivam do mesmo banco de clulas primrio. Utiliza-se um certo nmero de recipientes do banco de clulas primrio para preparar o banco de clulas de trabalho. O sistema de banco de clulas validado no nvel mximo de passagens que se atinge na produo de rotina. Banco de clulas primrio. Uma cultura de clulas distribuda em recipientes numa nica operao, processados em conjunto e conservados de forma a assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir a contaminao. Um banco de clulas primrio normalmente conservado a uma temperatura igual ou inferior a -70C. Banco de clulas de trabalho. Cultura de clulas derivada do banco de clulas primrio e destinada a ser utilizada na preparao de culturas de clulas de produo O banco de clulas de trabalho distribudo em recipientes e processado e conservado como descrito para o banco de clulas primrio. Cultura de clulas primrias. Cultura de clulas obtida por tripsinizao de um rgo ou tecido apropriado. As clulas so essencialmente idnticas s do tecido animal de origem e no tm mais do que 5 passagens in vitro aps a preparao inicial obtida a partir do tecido animal. Linhas celulares. Cultura de clulas com elevada capacidade de multiplicao in vitro. Nas linhas celulares diplides, as clulas tm essencialmente as mesmas caractersticas que as do tecido animal de origem. Nas linhas celulares contnuas, as clulas so capazes de se multiplicarem indefinidamente em cultura e podem ser obtidas de tecidos sos ou tumorais. Algumas linhas celulares contnuas podem, em certas condies, ter actividade oncognica. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Cultura de clulas de produo. Cultura de clulas derivada de um ou de vrios recipientes do banco de clulas de trabalho ou cultura de clulas primrias destinadas a ser utilizadas na produo. Clulas testemunha. Quantidade de clulas reservadas, no momento da inoculao do vrus, a servirem de clulas testemunha no inoculadas. As culturas so incubadas em condies similares s culturas celulares utilizadas na produo. Colheita nica. Material colhido por uma ou vrias vezes de uma nica cultura celular de produo inoculada com o mesmo lote semente de trabalho ou com uma suspenso proveniente do lote semente de trabalho, incubado e colhido num nico ciclo de produo. Mistura monovalente de colheitas. Mistura de colheitas contendo a mesma estirpe ou tipo de microrganismo ou antignio e derivadas de ovos, de recipientes de culturas celulares etc. e processadas ao mesmo tempo. Granel final. Produto submetido a todas as fases de fabrico com excluso do acondicionamento final. constitudo por uma ou vrias misturas de colheitas monovalentes, provenientes de culturas de uma ou mais espcies ou tipos de microrganismos, aps eventual clarificao, diluio ou adio de adjuvante ou outra substncia auxiliar. tratado de forma a assegurar a sua homogeneidade e utilizado para enchimento dos recipientes pertencentes a um ou a vrios lotes finais. Lote final. Um conjunto de recipientes definitivos, fechados, ou de outras unidades de dosagem, que se espera seja homogneo nomeadamente no que respeita ao risco de contaminao durante o enchimento ou preparao do produto final. As unidades de dosagem so cheias ou preparadas de forma diferente, a partir do mesmo granel final, liofilizadas em conjunto, se for o caso, e fechadas numa nica sesso contnua de trabalho. Levam um nmero ou um cdigo de identificao que identifica o lote final. Quando o granel final cheio e/ou liofilizado em vrias sesses de trabalho diferentes, resultam vrios lotes finais aparentados (tambm chamados sublotes ou lotes de repartio) que normalmente so identificados com uma parte comum no nmero ou cdigo de identificao. Vacinas combinadas. Preparao com vrios componentes, formulada de tal forma que os vrios antignios so administrados simultaneamente. Os diferentes componentes antignicos destinam-se a proteger contra diferentes tipos ou estirpes do mesmo microrganismo e/ou contra diferentes espcies de microrganismos. Uma vacina mista pode ser apresentada pelo fabricante, quer sob a forma de uma preparao lquida nica ou liofilizada, quer sob a forma de vrios constituintes acompanhados das indicaes necessrias para a mistura antes da utilizao.

5.2.2. BANDOS DE FRANGOS ISENTOS DE MICRORGANISMOS PATOGNICOS ESPECFICOS PARA A PRODUO E O CONTROLO DA QUALIDADE DAS VACINAS
INTRODUO Quando uma monografia o especifica, os frangos, ovos embrionados e culturas celulares utilizados para a produo e 523

5. Textos gerais

5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

controlo de qualidade das vacinas so obtidos a partir de ovos produzidos por um bando de frangos isentos de microrganismos patognicos especficos (SPF). A qualidade de um bando SPF assegurada por meio do sistema descrito a seguir. A lista de microrganismos estabelecida baseada nos conhecimentos actuais e ser actualizada sempre que for necessrio. PRINCPIOS GERAIS E MTODOS Um bando definido como um grupo de aves pertencentes a um meio ambiente comum e cujo criador no teve nenhum contacto com bandos no SPF. Uma vez o bando definido, no se junta qualquer ave no SPF. Nos bandos SPF estabelecidos numa base de rotao, os nascimentos e a criao do bando de substituio sempre efectuada em pavilhes com ambiente controlado. Com acordo das Autoridades Nacionais, pode ser admitida a introduo de ovos embrionados SPF provenientes de um bando SPF controlado, de outro pavilho do mesmo local. A partir das 8 semanas de idade, estas aves de substituio so consideradas como um bando e controladas mensalmente de acordo com o descrito em Ensaios posteriores. No momento da postura, todas as aves de substituio so controladas de acordo com o indicado em Ensaio inicial. O bando colocado em condies que reduzam ao mnimo o risco de contaminao. isolado de qualquer bando no SPF, instalado num isolador ou sobre uma rede, num pavilho com ar filtrado sob presso positiva. So tomadas medidas apropriadas a fim de impedir o acesso de roedores, aves selvagens, insectos e de pessoas no autorizadas. O pessoal autorizado a penetrar nas instalaes no teve contacto com nenhuma ave ou agente susceptvel de infectar o bando. Aconselha-se ao pessoal a tomar duche e a mudar de roupa ou usar vesturio protector para entrar no pavilho. Os produtos introduzidos no pavilho so esterilizados. Os alimentos so submetidos a tratamento apropriado de modo a evitar a introduo de microrganismos indesejveis e a gua provm de um reservatrio clorado. Nenhum medicamento que possa interferir com a deteco de doenas no grupo pode ser administrado. Mantm-se um registo permanente da sade geral do bando e qualquer anomalia tomada em considerao. Os factores a controlar compreendem a morbilidade, a mortalidade, a condio fsica geral, o consumo de alimentos, a postura diria e a qualidade dos ovos, a fertilidade e taxa de nascimentos. Os ovos sujos so eliminados; a superfcie dos ovos limpos ainda quentes pode ser desinfectada. O bando provm de frangos isentos de agentes patognicos transmitidos por via vertical. Em particular, cada frango que d origem ao bando objecto de controlo repetido para assegurar que est isento do vrus da leucose e dos seus anticorpos. A fim de estabelecer o estatuto SPF de um bando, este mantido nas condies SPF durante um perodo de ensaio de, pelo menos, 4 meses. Demonstra-se, aps 6 semanas e no fim do perodo do ensaio, que todos os animais do bando esto isentos de qualquer manifestao de infeco provocada pelos agentes que figuram na lista da rubrica Ensaio inicial. Para cada nova gerao de um determinado bando, a totalidade do bando controlada o mais tardar at idade de 20 semanas, utilizando os ensaios prescritos em Ensaio inicial. Aps o ensaio inicial, efectuam-se mensalmente os 524

ensaios prescritos em Ensaios posteriores numa amostra representativa de 5 por cento (10 aves, no mnimo, e 200, no mximo) com um ensaio final de 4 semanas aps a ltima colheita de ovos. No momento escolhido, colhem-se amostras de sangue, de um nmero apropriado de aves, para todos os ensaios. As amostras de soro obtidas so analisadas para pesquisa de anticorpos contra os agentes correspondentes. Os ensaios de seroneutralizao so efectuados em misturas de 5 soros, no mximo. Todos os outros ensaios so efectuados individualmente em cada soro. Utilizam-se controlos positivos e negativos em todos os ensaios. Os reagentes utilizados nos ensaios so aferidos em relao aos reagentes padro internacionais ou europeus, caso estes estejam disponveis. No caso do vrus da leucose aviria, alm da pesquisa de anticorpos efectuada nas amostras do soro, so colhidas amostras apropriadas para pesquisa do vrus. Alm dos ensaios serolgicos, efectua-se um exame clnico uma vez por semana, pelo menos, a fim de verificar se as aves esto isentas do vrus da varola aviria e de sinais de outras infeces. Em caso de mortalidade, efectuam-se exames necrpsicos e, quando necessrio para confirmao do diagnstico, exames histopatolgicos para verificar se as aves mortas esto ou no isentas de qualquer sinal de infeco. Verifica-se a ausncia de Salmonella spp, pelo exame de culturas de amostras de fezes, pelo menos uma vez em cada 4 semanas; pode utilizar-se para os ensaios uma mistura de 10 amostras, no mximo. Se se obtiver um resultado positivo num ensaio efectuado para definir o estatuto SPF de um bando, este no pode ser qualificado SPF. Se se obtiver um resultado positivo num ensaio efectuado num bando definido como SPF, o bando perde o estatuto SPF. Como se descreve a seguir, aplicam-se disposies especiais para o agente da anemia dos pintos (AAP). Nenhum frango, embrio ou cultura celular, recolhido aps o ltimo ensaio negativo utilizado e todos os produtos obtidos a partir destas colheitas so destrudos e os ensaios de controlo de qualidade efectuados com estes produtos no so vlidos, devendo ser repetidos. Para voltar a ter o estatuto SPF, o bando mantido nas condies SPF e os ensaios de rotina mensais continuam a ser efectuados em 5 por cento do bando, excepto para a deteco do agente causal de infeco que originou o resultado positivo, em que o ensaio efectuado mensalmente em todas as aves do bando. As aves infectadas e a sua descendncia so retiradas do bando. O bando volta a ter o estatuto SPF aps 2 ensaios consecutivos totalmente negativos. Um resultado positivo no ensaio de pesquisa do AAP no exclui necessariamente a utilizao dos produtos do bando. No entanto, as vacinas vivas preparadas com substratos provenientes dos bandos SPF e destinadas a aves com menos de 7 dias de idade, so preparadas com substratos isentos do AAP. As vacinas inactivadas administradas a aves com menos de 7 dias podem ser produzidas a partir de material proveniente de bandos sem prova de estarem isentos do AAP, com a condio de se demonstrar que o mtodo de inactivao utilizado eficaz para o AAP. Mantm-se durante, pelo menos, cinco anos, um registo permanente da mortalidade e dos resultados dos controlos efectuados no bando. Qualquer constatao da diminuio da postura ou da taxa de nascimentos, excepto os casos acidentais identificados como sendo de origem no infecciosa e a obteno de resultados indicando a existncia de infeco por um agente especfico so imediatamente comunicados ao utilizador dos ovos. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

ENSAIO INICIAL Sob reserva de autorizao das Autoridades Nacionais, podem ser utilizados outros tipos de ensaios desde que possuam uma sensibilidade pelo menos igual do tipo de ensaio indicado e uma especificidade apropriada.
Microrganismo Adenovirus avirios Adenovrus hemoaglutinante avirio (Vrus da doena dos ovos moles; vrus do sndrome da queda da postura 76 EDS 76 Agente da anemia dos pintos Reovrus avirios Vrus da encefalomielite aviria Vrus da bronquite infecciosa aviria Vrus da bursite aviria Tipo de ensaio Imunoadsoro com enzima conjugada Inibio de hemoaglutinao

Microrganismo Reovrus avirios Vrus da encefalomielite aviria Vrus da bronquite infecciosa aviria Vrus da bursite aviria

Tipo de ensaio Imunoadsoro com enzima conjugada Imunoadsoro com enzima conjugada Imunoadsoro com enzima conjugada Imunodifuso contra cada serotipo presente no pas de origem Imunoadsoro com enzima conjugada Seroneutralizao Imunoadsoro com enzima conjugada para os anticorpos
5. Textos gerais

Vrus da gripe tipo A Vrus da laringotraquete infecciosa aviria

Anticorpos fluorescentes Imunoadsoro com enzima conjugada Imunoadsoro com enzima conjugada Imunoadsoro com enzima conjugada Seroneutralizao contra cada serotipo presente no pas de origem Imunoadsoro com enzima conjugada Seroneutralizao Imunoadsoro com enzima conjugada para o vrus e seroneutralizao para os anticorpos Imunoadsoro com enzima conjugada Inibio de hemoaglutinao Anticorpos fluorescentes Anticorpos fluorescentes lmunoadsoro com enzima conjugada Aglutinao e, para confirmar um ensaio positivo, inibio de hemoaglutinao Aglutinao e, para confirmar um ensaio positivo, inibio de hemoaglutinao Aglutinao

Vrus da leucose aviria Vrus da doena de Marek Vrus da doena de Newcastle Vrus da nefrite aviria Vrus via reticuloendoteliose aviria Vrus da rinotraquete do per Mycoplasma gallisepticum

Imunoadsoro com enzima conjugada Inibio de hemaglutinao Anticorpos fluorescentes Anticorpos fluorescentes lmunoadsoro com enzima conjugada Aglutinao e, para confirmar um ensaio positivo, inibio de hemoaglutinao Aglutinao e, para confirmar um ensaio positivo, inibio de hemoaglutinao Aglutinao

Vrus da gripe tipo A Vrus da laringotraquete infecciosa aviria Vrus da leucose aviria

Mycoplasma synovise

Sallmonella pulloram

Vrus da doena de Marek Vrus da doena de Newcastle Vrus da nefrite aviria Vrus via reticuloendoteliose aviria Vrus da rinotraquete do per Mycoplasma gallisepticum

5.2.3. SUBSTRATOS CELULARES UTILIZADOS NA PREPARAO DE VACINAS PARA USO HUMANO


O presente captulo geral trata das linhas celulares diplides e das linhas celulares continuas utilizadas na preparao de vacinas para uso humano; os aspectos especficos das vacinas preparadas com a tecnologia do ADN recombinante so tratados na monografia Produtos obtidos pela tecnologia do ADN recombinante. O quadro fornece uma lista de ensaios a efectuar nas diferentes etapas (clulas semente, banco de clulas primrio, banco de clulas de trabalho, clulas pertencentes ao nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado na produo). Descrevem-se a seguir as disposies gerais respeitantes utilizao das linhas celulares e aplicao dos mtodos de ensaio. Quando uma vacina produzida com clulas primrias, ou clulas que foram submetidas apenas a uma pequeno nmero de passagens, sem constituio de um banco de clulas, as exigncias aplicveis vacina constam da monografia especfica. Linhas celulares diplides. A linha celular diplide possui uma capacidade elevada mas definida de multiplicao in vitro. Linhas celulares contnuas. Uma linha celular contnua possui uma capacidade ilimitada de multiplicao in vitro; muitas vezes as clulas apresentam diferenas de cariotipo com as clulas de origem; podem ser obtidas a partir de um tecido saudvel ou de um tecido tumoral. 525

Mycoplasma synovise

Sallmonella pulloram

ENSAIOS POSTERIORES Sob reserva de autorizao das Autoridades Nacionais, podem ser utilizados outros tipos de ensaios desde que possuam uma sensibilidade pelo menos igual do tipo de ensaio indicado e uma especificidade apropriada.
Microrganismo Adenovrus avirios Adenovrus hemaglutinante avirio Agente da anemia dos pintos Tipo de ensaio Imunoadsoro com enzima conjugada Inibio de hemaglutinao Anticorpos fluorescentes

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

QUADRO 1 Ensaios efectuados nas linhas celulares

Ensaio

Clulas semente

Banco de clulas primrio (BCP)

Banco de clulas de trabalho (BCT)

Clulas do nvel de duplicao de populao pelo menos igual ao nvel mximo que ir ser utilizado na produo

1. IDENTIDADE E PUREZA Morfologia Seleco apropriada entre os seguintes ensaios (por ex. isoenzimas), imunolgicos (por ex. histocompatibilidade), marcadores citogenticos, impresso genmica Cariotipo (linhas celulares diplides)
5. Textos gerais
(1) (1)

Longevidade das clulas (linhas celulares diplides) 2. AGENTES ESTRANHOS Contaminao bacteriana e fngica Micoplasmas Ensaio em culturas celulares Co-cultura Ensaios em animais e em ovos Pesquisa especfica de potenciais contaminantes de acordo com a origem das clulas (ver a seguir em Agentes contaminantes infecciosos) Retrovrus
(3) (2) (2) (2) (2) (2) (2)

(3)

3. PODER TUMORGENO Poder tumorgeno


(4)

(1) A caracterstica diplide demonstra-se para cada banco de clulas de trabalho utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado para a produo. (2) Ensaio efectuado em cada banco de clulas de trabalho utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado para a produo. (3) Ensaio efectuado em cada banco de clulas primrias utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado para a produo. (4) As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como no possuindo poder tumorgeno e no necessitam do ensaio de poder tumorgeno. Os ensaios de poder tumorgeno j no so realizados em linhas celulares com poder tumorgeno conhecido ou previsto.

No caso de vacinas injectveis preparadas com uma linha celular contnua, o procedimento de purificao validado para se demonstrar a reduo da concentrao de ADN das clulas do substrato at um nvel equivalente, no mximo, a 10 ng por dose humana unitria, salvo indicao em contrrio. Sistema de banco de clulas. A produo de vacinas em linhas celulares contnuas ou em linhas celulares diplides baseia-se num sistema de banco de clulas. A idade in vitro das clulas contada a partir do lote semente primrio. Cada banco de clulas de trabalho preparado a partir de 1 ou vrios recipientes do banco de clulas primrio. A utilizao, a identidade e o inventrio dos recipientes so minuciosamente registados. 526

Meios e substncias de origem humana ou animal. A composio dos meios utilizados para o isolamento e para o conjunto das culturas posteriores minuciosamente registado; se so utilizadas substncias de origem humana ou animal, elas esto isentas de agentes estranhos. Se for utilizada albumina humana, ela est em conformidade com a monografia Soluo de albumina humana. Atravs de ensaios apropriados, demonstra-se que os soros de origem bovina utilizados para a preparao e manuteno das culturas celulares so estreis e isentos de vrus bovinos, nomeadamente do vrus da diarreia bovina assim como de micoplasmas. Efectuam-se ensaios apropriados na tripsina utilizada para a preparao das culturas celulares para demonstrar a FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

esterilidade e a ausncia de micoplasmas e de vrus, nomeadamente de pestivrus e parvovrus. Clulas semente. Os dados na base dos quais avaliada a aceitabilidade das clulas semente compreendem, sempre que possvel, a origem, a histria e a caracterizao. Origem das clulas semente. Para as linhas celulares humanas, o dossier contem as seguintes informaes do dador: origem tnica e geogrfica, idade, sexo, estado fisiolgico geral, tecido ou rgo utilizado, resultados da eventual pesquisa de agentes patognicos. Para as linhas celulares animais, o dossier contm as seguintes informaes da origem das clulas: espcie, linhagem, condies de explorao, origem geogrfica, idade, sexo, estado fisiolgico geral, tecido ou rgo utilizado, resultados da eventual pesquisa de agentes patognicos. As clulas de origem neural (por exemplos os neuroblastomas e as clulas P12) podem conter substncias que concentrem os agentes das encefalopatias espongiformes; estas clulas no so utilizadas na produo de vacinas. Histria das clulas semente. O dossier contem as seguintes informaes: mtodo utilizado para isolar as clulas semente, os mtodos de cultura e qualquer outro procedimento utilizado para estabelecer o banco de clulas primrio, nomeadamente aqueles susceptveis de provocar uma exposio das clulas a agentes estranhos. As informaes disponveis sobre os ingredientes dos meios de cultura das clulas, por exemplo a provenincia das substncias de origem animal, so muitas vezes incompletas; em casos justificados e autorizados, os bancos de clulas j estabelecidos com esses meios podem ser utilizados para a produo de vacinas. Caracterizao das clulas semente. A caracterizao das clulas semente assenta nos seguintes aspectos: (1) identidade (por exemplo isoenzimas, serologia, impresso genmica), (2) caractersticas de crescimento e propriedades morfolgicas (microscopia ptica e electrnica), (3) cariotipo das linhas celulares diplides, (4) longevidade in vitro das linhas celulares diplides, em termos do nvel de duplicao da populao Estabilidade dos substratos celulares. Demonstra-se que a linha celular tem uma viabilidade apropriada nas condies previstas para a sua conservao. Para cada produto preparado com a linha celular, necessrio demonstrar que pode ser obtida uma produo reprodutvel com as clulas pertencentes aos nveis de passagens situadas entre o incio e o fim da durao prevista de utilizao. Agentes contaminantes infecciosos. As linhas celulares utilizadas para a produo de vacinas esto isentas de agentes infecciosos. As pesquisas de agentes contaminantes efectuam-se como indicado no quadro. Consoante a origem e a histria da linha celular, pode ser necessria a pesquisa de alguns potenciais contaminantes especficos, nomeadamente aqueles que reconhecidamente constituem agentes infecciosos latentes da espcie de origem (por exemplo o vrus smio 40 para o macaco rhesus). No caso de linhas celulares provenientes de roedores, so efectuados ensaios para a produo de anticorpos no murganho, no rato e no hamster para detectar eventuais vrus especficos da espcie. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Pesquisam-se retrovrus nas linhas celulares como se descreve adiante. Se for detectada a presena de retrovrus capazes de se replicarem, a linha celular no aceitvel para a produo de vacinas. Poder tumorgeno. Para a preparao de vacinas vivas, a linha celular no possui poder tumorgeno ao nvel de duplicao da populao utilizada na produo. Se a linha celular com poder tumorgeno for utilizada na preparao de outras vacinas, valida-se o sistema de purificao a fim de demonstrar que a concentrao de ADN proveniente das clulas equivalente, no mximo, a 10 ng por dose humana unitria, salvo indicao em contrrio e que a concentrao em protenas provenientes das clulas do substrato reduzida at um limite aceitvel. Se a linha celular possuir um reconhecido poder tumorgeno, no necessrio proceder a ensaios de poder tumorgeno. Se o potencial poder tumorgeno de uma linha celular for desconhecido, a linha celular considerada como tumorgena, ou submetida a um ensaio de poder tumorgeno in vitro como adiante se descreve; se os resultados do ensaio in vitro forem negativos ou se no forem claramente positivos, a linha celular ser objecto de um ensaio in vivo como adiante se descreve. Os ensaios so efectuados em clulas pertencentes ao nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado na produo. As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como no possuindo poder tumorigeno e no necessitam do ensaio de poder tumorgeno. Caracterizao genmica. Demonstra-se a diploidia das linhas celulares diplides; se no estiver validada a eliminao de clulas intactas durante o tratamento aps a colheita, necessrio efectuar uma caracterizao mais aprofundada pela anlise do cariotipo. So examinadas amostras provenientes de 4 nveis de passagens regularmente distribudas pelo perodo de vida da linha celular. Cada exame incide em, pelo menos, 200 clulas em metafase, para se verificar o nmero exacto de cromossomas e avaliar a frequncia de hiperploidia, de hipoploidia, de poliploidia, de fracturas e de anomalias estruturais. As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como sendo diplides e bem caracterizadas; desde que no tenham sido geneticamente modificadas, no necessrio efectuar uma caracterizao mais aprofundada. MTODOS DE ENSAIO APLICVEIS S CULTURAS CELULARES Identificao. A identidade das clulas estabelece-se com base na impresso genmica e numa escolha apropriada dos seguintes aspectos: (1) caractersticas bioqumicas (anlise dos isoenzimas), (2) caractersticas imunolgicas (antignios de histocompatibilidade), (3) marcadores citogenticos. Clulas contaminantes. As impresses genmicas efectuadas com finalidade de identificao servem igualmente para demonstrar a ausncia de clulas contaminantes. Contaminao bacteriana e fngica. O banco de clulas primrio e o banco de clulas de trabalho satisfazem ao ensaio de esterilidade (2.6.1), efectuado para cada meio em 10 ml do sobrenadante das culturas celulares e em 1 por cento dos recipientes, com o mnimo de 2 recipientes. 527

5. Textos gerais

5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

Micoplasmas (2.6.7). O banco de clulas primrio e o banco de clulas de trabalho satisfazem ao ensaio dos micoplasmas, efectuado em 1 ou vrios recipientes pelo mtodo cultural e pelo mtodo de epifluorescncia em culturas celulares. Pesquisa de agentes estranhos em culturas celulares. As clulas satisfazem ao ensaio dos vrus hemadsorventes e aos ensaios de pesquisa dos agentes estranhos em culturas celulares que esto descritos no capitulo 2.6.16 em Culturas celulares de produo: clulas testemunhas. Se as clulas so de smio, so tambm inoculadas em culturas de clulas renais de coelho para pesquisa do herpesvrus B (herpesvrus 1 de cercopiteco). Co-cultura. Co-cultive separadamente clulas intactas e clulas lisadas com outros sistemas celulares compreendendo clulas humanas e clulas de smio. Pesquise a apario de eventuais alteraes morfolgicas. Efectue a pesquisa de agentes hemaglutinantes nos lquidos de cultura. As clulas satisfazem ao ensaio se no houver qualquer indicao da presena de agente estranho. Retrovrus. Pesquise a eventual presena de retrovrus: (1) atravs de ensaio de infectividade, (2) por microscopia electrnica de transmisso, (3) se os ensaios (1) e (2) derem resultados negativos, pela pesquisa da transcriptase inversa (em presena do magnsio e do mangansio) realizada nos depsitos obtidos por centrifugao a alta velocidade. Ensaio em animais. A cada grupo dos seguintes animais, injecte por via intramuscular (ou no caso de murganhos recm-nascidos, por via subcutnea) 107 clulas viveis igualmente repartidas entre os animais do grupo: (1) 2 ninhadas com, pelo menos, 10 murganhos recm-nascidos com menos de 24 horas de idade, (2) 10 murganhos adultos. Injecte por via intracerebral em cada um dos 10 murganhos adultos 106 clulas viveis para deteco da eventual presena do vrus da coriomeningite linfocitria. Mantenha os animais em observao durante, pelo menos, 4 semanas. Examine os animais que apresentam sintomas de doena ou anomalia para determinar a sua causa. As clulas satisfazem ao ensaio se no se observarem sinais de presena de agentes estranhos. O ensaio s vlido se, pelo menos, 80 por cento dos animais de cada grupo permanecem de boa sade e sobrevivem at ao final do perodo de observao. No caso de clulas de roedores (por exemplo clulas ovricas de hamster chins ou clulas renais de hamster recmnascido), efectue, nos animais aos quais as clulas foram injectadas, uma pesquisa de anticorpos contra potencias contaminantes vricos para a espcie. Ensaios em ovos. Injecte, pelo menos, 106 clulas viveis na cavidade alantide de cada um de 10 ovos de galinha SPF (5.2.2) com 9 a 11 dias idade, e no saco vitelino de 10 ovos de galinha SPF (5.2.2) com 5 a 6 dias idade. Incube-os durante, pelo menos, 5 dias. Proceda pesquisa de hemaglutininas nos lquidos alantides, com eritrcitos mamferos e avirios; efectue o ensaio a temperaturas de 5 3C e 20-25C e proceda leitura dos resultados decorridos 30 a 60 min. As clulas satisfazem ao ensaio se no se observar qualquer sinal da presena de agentes estranhos. O ensaio s vlido se, pelo menos, 80 por cento dos embries permanecem sos e sobrevivem at ao final do perodo de observao. 528

Ensaio de poder tumorgeno in vitro. Podem ser utilizados os seguintes ensaios: (1) formao de colnias em gelose mole, (2) produo de crescimento celular invasivo aps inoculao em culturas de rgos, (3) estudo da actividade de transformao atravs, por exemplo, do sistema de prova 3T3 que pe em evidncia a presena de oncogenes activos. Ensaio de poder tumorgeno in vivo. O ensaio consiste em estabelecer uma comparao entre a linha celular continua e uma testemunha positiva apropriada (por exemplo clulas HeLa ou Hep2). So apropriados os seguintes sistemas animais: (1) murganhos atmicos (genotipo Nu/Nu), (2) murganhos, ratos ou hamsters recm-nascidos tratados com soro ou com globulina antitimocitria, (3) murganhos timectomizados e irradiados que foram reconstitudos CF-, B+) com medula ssea de murganhos sos. Qualquer que seja o sistema animal escolhido, a linha celular e as clulas de referncia so injectadas em grupos distintos de 10 animais cada um. Em ambos os casos, o inculo por animal de 107 clulas em suspenso num volume de 0,2 ml e a injeco pode ser por via intramuscular ou subcutnea. Se se utiliza animais recm-nascidos, estes so tratados com 0,1 ml de soro ou globulina antitimocitria nos dias 0, 2, 7 e 14 aps o nascimento. So considerados soros ou as globulinas activos aqueles que suprimem os mecanismos imunitrios dos animais em crescimento ao ponto de a inoculao das 107 clulas de referncia positivas produzirem regularmente de tumores e metstases. Se os animais forem severamente afectados e apresentarem sem ambiguidades tumores de crescimento progressivo, sacrifique-os antes do final do ensaio para evitar sofrimento intil. No final do perodo de observao, sacrifique e examine todos os animais, incluindo os grupos testemunhas; pesquise, no local de injeco e noutros rgos por exemplo, os gnglios linfticos, os pulmes, os rins e o fgado), sinais macroscpicos e microscpicos de proliferao das clulas inoculadas. Em todos os casos, examine os animais em intervalos regulares procedendo palpao para detectar a formao eventual de ndulos nos locais de injeco. Mea os ndulos em 2 direces perpendiculares e registe regularmente os resultados das medies para determinar se so de crescimento progressivo. Se alguns animais apresentarem, durante a observao, ndulos com sinais de regresso, sacrifique-os antes que os ndulos no sejam detectveis palpao e proceda a um examine histolgico. Observe os animais que apresentam ndulos em crescimento progressivo durante 1-2 semanas. Nos animais que no apresentam formao de ndulos, metade so observados durante 3 semanas e a outra metade durante 12 semanas, antes de serem sacrificados para se proceder observao histolgica. Efectue uma necrpsia em cada animal, para pesquisa no local de injeco e em outros rgos (por exemplo: gnglios linfticos, pulmes, crebro, bao, rins, fgado), nomeadamente sinais macroscpicos de formao tumoral. Proceda ao exame histolgico de todas as leses com aparncia tumoral e do local de injeco. Alm disso, dado que algumas linhas celulares podem dar metstases sem manifestao de crescimento tumoral local, proceda FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio

sistematicamente em todos os animais, ao exame histolgico dos gnglios linfticos regionais detectveis e dos pulmes. O ensaio s vlido se, pelo menos, 9 dos 10 animais inoculados com clulas de referncia positivas apresentarem tumores de crescimento progressivo.

QUADRO 2 Fases das culturas celulares em que os ensaios so efectuados Banco de clulas primrio Banco de Clulas do banco clulas de clulas de de trabalho trabalho com o nmero mximo de passagens + + + + + + +

5.2.4. CULTURAS CELULARES UTILIZADAS NA PREPARAO DE VACINAS PARA USO VETERINRIO


As culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio satisfazem s exigncias descritas nesta seco. Pode tambm ser necessrio que as culturas celulares utilizadas no controlo das vacinas satisfaam todas ou algumas destas exigncias. Para a maioria dos vrus dos mamferos possvel a sua multiplicao em clulas de linha celulares, no sendo por isso aceite a utilizao de clulas primrias. As clulas cronicamenie infectadas utilizadas na preparao de vacinas veterinrias satisfazem s exigncias que lhes so aplicveis descritas a seguir. Demonstra-se que as clulas se encontram infectadas apenas com o agente indicado. LINHAS CELULARES As linhas celulares utilizadas na produo so normalmente obtidas atravs de um sistema de banco de clulas. Cada banco de clulas primrio identificado com um cdigo especfico. O banco de clulas primrio conservado em alquotas a uma temperatura igual ou inferior a -70C. No so utilizadas na produo de vacinas clulas que tenham sido submetidas a um nmero de passagens superior a 20 a partir do banco de clulas primrio. Quando se utilizam culturas de clulas em suspenso, um aumento do nmero de clulas correspondente a trs duplicaes da populao equivale aproximadamente a uma passagem. Se as clulas utilizadas na produo tiverem sido submetidas a um nmero de passagens superior a 20, demonstra-se, por validao ou atravs de novos ensaios, que as clulas de produo so sensivelmente idnticas s clulas do banco de clulas primrio no que diz respeito s caractersticas biolgicas e pureza, e que a sua utilizao no tem efeitos prejudiciais na produo da vacina. conhecida com detalhe e registada por escrito a histria da linha celular (por exemplo, origem, nmero de passagens e o meio utilizado na multiplicao, condies de conservao). Fica registada uma descrio dos mtodos de conservao e de utilizao das clulas, incluindo pormenores que permitam assegurar que durante a produo o nmero de passagens permitidas no ultrapassado. Conservam-se, para fins analticos, quantidades suficientes do banco de clulas primrio e de cada banco de clulas de trabalho. Os ensaios descritos a seguir so efectuados em culturas do banco de clulas primrio e do banco de clulas de trabalho ou em clulas do banco de clulas de trabalho com o nmero mximo de passagens admitido para a produo e provenientes de uma amostra homognea e representativa. Demonstra-se a representatividade da amostra. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Microscopia geral Bactrias e fungos Micoplasmas Vrus Identificao da espcie Anlise cariotpica Poder tumorgeno

+ + + + + + +

Anlise cariotpica. Efectua-se um exame cromossmico em pelo menos 50 clulas em mitose do banco de clulas primrio e da passagem mxima admitida para a produo. Qualquer marcador cariotpico presente nas clulas do banco de clulas primrio encontrado nas clulas com o nmero mximo de passagens. O nmero de cromossomas (valor modal) nas clulas da passagem mxima no superior a 15 por cento do valor obtido no banco de clulas primrio. Os cariotipos so idnticos. Se o nmero de cromossomas for superior ao valor declarado, se alguns marcadores cariotpicos no forem encontrados nas clulas do banco de clulas de trabalho com o nmero mximo de passagens utilizado na produo, ou se os cariotipos forem diferentes, a linha celular no utilizada no fabrico de vacinas. Identificao da espcie. Demonstra-se, por um mtodo validado, que as clulas do banco de clulas primrio e do banco de clulas de trabalho com o nmero mximo de passagens utilizado na produo pertencem espcie indicada pelo fabricante. Quando se efectua um ensaio de imunofluorescncia com o soro especfico da espcie de origem das clulas e se verifica que todas as clulas apresentam fluorescncia, no necessrio realizar outros ensaios com reagentes capazes de detectar contaminao com clulas de outras espcies. Contaminao bacteriana e fngica. As clulas satisfazem ao ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de clulas contm, pelo menos, o nmero de clulas de um tapete celular com uma rea de 70 cm2 e para clulas em suspenso aproximadamente o mesmo nmero de clulas. Antes de se realizar e ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante, pelo menos, 15 dias, sem antibiticos. Micoplasmas (2.6.7). As clulas satisfazem ao ensaio dos micoplasmas. Antes de se realizar a ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante. pelo menos, 15 dias, sem antibiticos. Ausncia de vrus contaminantes. Por tcnicas apropriadas, e pelos ensaios descritos a seguir, verifica-se a ausncia de qualquer contaminao par vrus. Os tapetes celulares examinados tm uma rea de, pelo menos, 70 cm2, so preparados e mantidos em cultura no 529

5. Textos gerais

Caractersticas das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete celular antes e depois da colorao histolgica. Regista-se, se possvel sob a forma numrica, a informao relativa especialmente velocidade e taxa de crescimento. igualmente indicada a presena ou ausncia de inibio por contacto, de clulas plurinucleadas ou de qualquer outra anomalia celular.

5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio

mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condies que as clulas utilizadas na preparao da vacina. Os tapetes celulares so mantidos em cultura, pelo menos durante 28 dias no total. As subculturas realizam-se com intervalos de 7 dias, a no ser que seja impossvel manter as clulas com vida durante tanto tempo. Neste caso, convm realizar as subculturas com intervalos inferiores, mas to longos quanto possvel. O nmero de clulas que se obtm na ltima subcultura, em recipientes apropriados, suficiente para se efectuarem os ensaios descritos a seguir. Os tapetes celulares so examinados regularmente durante o perodo de incubao para se detectar eventuais efeitos citopatognicos e, no final do perodo de observao, so submetidos aos ensaios para pesquisa de vrus citopatognicos, vrus hemadsorventes e vrus especficos, estes ltimos efectuados por imunofluorescncia ou por qualquer outro mtodo apropriado a seguir indicado.
5. Textos gerais

verificao da ausncia de microrganismos citopatognicos ou hemadsorventes pelos mtodos anteriormente indicados, verificao da ausncia de pestivrus ou outros contaminantes especficos por imunofluorescncia ou outros mtodos validados (Deteco de vrus especficos). Poder tumorgeno. Se necessrio, efectuam-se ensaios para avaliar o risco potencial da linha celular para as espcies alvo. CLULAS PRIMRIAS A utilizao de clulas primrias como substrato de fabrico de vacinas destinadas aos mamferos no na maior parte dos casos aceite, uma vez que se podem utilizar linhas celulares. Na entanto, se no houver alternativa utilizao de clulas primrias, estas provm de exploraes ou de bandos isentos de microrganismos patognicos especficos, completamente protegidos contra a introduo de doenas (barreiras sanitrias. filtros nas entradas de ar, sistema apropriado de quarentena antes da introduo de animais). No caso de se tratar de bandos de frangos, estes satisfazem as exigncias prescritas em Bandos de Frangos isentos de Microrganismos Patognicos Especficos para a Produo e o Controlo da Qualidade de Vacinas (5.2.2). No caso de se tratar de outros animais, demonstra-se que a explorao se encontra isenta de microrganismos patognicos especficos. Tambm os reprodutores da explorao de onde se obtm as clulas primrias destinadas ao fabrico de vacinas so submetidos a controlos que incluiem, pelo menos, 2 exames serolgicos de rotina por ano e, entre estes, 2 exames serolgicos suplementares em 15 por cento dos reprodutores. Particularmente no caso de clulas de mamferos, conveniente utilizar, sempre que possvel, um sistema de lote semente que compreenda, por exemplo, um banco de clulas primrio submetido a menos de 5 passagens e um banco de clulas de trabalho que no tenha sido submetido a mais da que 5 passagens a partir da suspenso celular inicial obtida dos tecidos animais. O banco de clulas primrio, banco de clulas de trabalho e as clulas com o nmero mximo de passagens utilizado na produo so submetidos aos ensaios indicados no quadro 3 de acordo com os mtodos descritos a seguir. A amostra cobre todo o tipo de clulas utilizadas no fabrico da lote. Nenhum lote de vacina produzida com estas clulas pode ser libertado se algum dos ensaios no der resultados satisfatrios.
QUADRO 3 Fases das culturas de clulas primrias em que os ensaios so efectuados Banco de clulas primrio Microscopia geral Bactrias e fungos Micoplasmas Vrus Identificao da espcie + + + + + Banco de clulas de trabalho + + + + Nvel mximo de passagens +

Deteco de vrus citopatognicos. Efectue, com um corante apropriado, a colorao citolgica a 2 tapetes celulares com, pelo menos, 6 cm2 cada um. Examine toda a superfcie dos tapetes celulares corados e verifique a presena eventual de corpos de incluso, de clulas gigantes em nmero anormalmente elevado ou de qualquer outra leso indicativa de anomalias celulares que possam ser atribudas a um agente contaminante. Deteco de vrus hemadsorventes. Lave vrias vezes, com uma soluo tampo apropriada, tapetes celulares com uma rea total de 70 cm2. Adicione uma suspenso apropriada de hemcias em volume suficiente para cobrir uniformemente a superfcie dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos de incubao, verifique a presena de hemadsoro. Deteco de vrus especficos. Verifique atravs de ensaios apropriados a ausncia de contaminantes especficos da espcie de origem da linha celular e das espcies s quais o produto se destina. Para poder efectuar os ensaios de deteco de vrus especficos prepare, em suportes adequados, um nmero suficiente de clulas. includo em cada ensaio um nmero apropriado de controlos positivos. Os ensaios realizam-se, por exemplo, com anticorpos conjugados com fluorescena ou reagentes similares. Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha de tapetes celulares com uma superfcie total de, pelo menos, 140 cm2. Congele e descongele as clulas pelo menos 3 vezes e a seguir elimine por centrifugao os fragmentos celulares. Inocule partes alquotas do lquido obtido, em clulas com uma confluncia inferior ou igual a 70 por cento, dos seguintes tipos: clulas primrias da espcie de origem, clulas sensveis aos vrus patognicos para as espcies alvo da vacina, clulas sensveis aos pestivrus. Mantenha as clulas inoculadas em cultura durante, pela menos, 7 dias, prepare os extractos congelao-descongelao como se descreveu anteriormente e inocule em culturas frescas de clulas do mesmo tipo numa quantidade suficiente que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube as clulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas so examinadas regularmente para se detectar a presena de qualquer efeito citapatognico devido a microrganismos vivos. Ao fim do perodo de 14 dias, as clulas inoculadas so submetidas ao seguinte controlo: 530

Caractersticas das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete celular antes e depois da colorao histolgica. Registam-se, se possvel sob a forma numrica, informaes relativas especialmente velocidade e taxa de crescimento. Indica-se igualmente a presena ou ausncia de inibio por contacto, de clulas plurinucleadas ou de qualquer outra anomalia celular. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.2.5. Substncias de origem animal utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio

Identificao da espcie. Demonstra-se, por um mtodo validado, que as clulas do banco de clulas primrio pertencem espcie indicada. Quando se efectua um ensaio de imunofluorescncia com o soro especfico da espcie de origem das clulas e se verifica que todas as clulas examinadas apresentam fluorescncia, no necessrio realizar outros ensaios com reagentes capazes de detectar contaminao com clulas de outras espcies. Esterilidade bacteriana e fngica. As clulas satisfazem ao ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de clulas contm, pelo menos, o nmero de clulas de um tapete celular com uma rea de 70 cm2 ou, para as clulas em suspenso, aproximadamente o mesmo nmero de clulas. Antes de se realizar o ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante, pelo menos, 15 dias, sem antibiticos. Micoplasmas (2.6.7). As clulas satisfazem ao ensaio dos micoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante, pelo menos, 15 dias, sem antibiticos. Ausncia de vrus contaminantes. Pelos ensaios descritos a seguir, verifica-se a ausncia de qualquer contaminao por vrus. Os tapetes celulares examinados tm uma rea de, pelo menos, 70 cm2 e so preparados e mantidos em cultura no mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condies que as clulas utilizadas na preparao da vacina. Os tapetes celulares so mantidos em cultura, pelo menos, durante 28 dias no total ou durante o perodo mais longo possvel, se 28 dias for impossvel. As subculturas realizam-se com intervalos de 7 dias, a no ser que seja impossvel manter as clulas com vida durante tanto tempo. Neste caso, convm realizar as subculturas com intervalos inferiores, mas to longos quanto possvel. O nmero de clulas que se obtm na ltima subcultura, em recipientes apropriados, suficiente para se efectuarem os ensaios descritos a seguir. Os tapetes celulares so examinados regularmente durante o perodo de incubao para se detectar eventuais efeitos citopatognicos e, no final do perodo de observao, so submetidos aos ensaio para pesquisa de vrus citopatognicos, vrus hemadsorventes e vrus especficos, estes ltimos efectuados por imunofluorescncia ou por qualquer outro mtodo apropriado como se indica a seguir. Deteco de vrus citopatognicos. Efectue, com um corante apropriado, a colorao citolgica de 2 tapetes celulares com, pelo menos, 6 cm2 cada um. Examine toda a superfcie dos tapetes celulares corados e verifique a presena eventual de corpos de incluso, de clulas gigantes em nmero anormalmente elevado ou de qualquer outra leso indicativa de anomalias celulares que possam ser imputadas a um agente contaminante. Deteco de vrus hemadsorventes. Lave vrias vezes, com uma soluo tampo apropriada, tapetes celulares com uma rea total de 70 cm2. Adicione uma suspenso apropriada de hemcias em volume suficiente para cobrir uniformemente a superfcie dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos de incubao, verifique a presena de hemadsoro. Deteco de vrus especficos. Verifique atravs de ensaios apropriados a ausncia de contaminantes especficos da FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

espcie de origem da linha celular e das espcies alvo do produto. Para poder efectuar os ensaios de deteco de vrus especficos, prepare, em suportes adequados. um nmero suficiente de clulas includo em cada ensaio um nmero apropriado de controlos positivos. Os ensaios realizam-se, por exemplo, com anticorpos conjugados com fluorescena ou reagentes similares. Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha tapetes celulares com uma superfcie total de, pelo menos, 140 cm2. Congele e descongele as clulas pelo menos 3 vezes e a seguir elimine por centrifugao os fragmentos celulares Inocule partes alquotas do lquido obtido, em clulas com uma confluncia inferior ou igual a 70 por cento, dos seguintes tipos: clulas primrias da espcie de origem, clulas sensveis aos vrus patognicos para as espcies alvo da vacina, clulas sensveis aos pestivrus. Mantenha as clulas inoculadas em cultura durante, pelo menos, 7 dias, prepare os extractos congelao-descongelao como se descreveu anteriormente, e inocule em culturas frescas de clulas do mesmo tipo numa quantidade suficiente que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube as clulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas so examinadas regularmente para se detectar a presena de qualquer efeito citopatognico devido a microrganismos vivos. Ao fim do perodo de 14 dias, as clulas inoculadas so submetidas ao seguinte controlo: verificao da ausncia de microrganismos citopatognicos ou hemadsorventes pelos mtodos anteriormente indicados, verificao da ausncia de pestivrus ou de outros contaminantes especficos, por imunofluorescncia ou outros mtodos validados (ver Deteco de vrus especficos).
5. Textos gerais

5.2.5. SUBSTNCIAS DE ORIGEM ANIMAL UTILIZADAS NA PREPARAO DE VACINAS PARA USO VETERINRIO
No fabrico de medicamentos veterinrios imunolgicos podem ser utilizadas substncias de origem animal (por exemplo, soro, tripsina e albumina srica), como ingredientes dos meios de cultura ou como constituintes das vacinas ou dos diluentes. Recomenda-se que a sua utilizao seja tanto quanto possvel reduzida. Colocam-se algumas restries utilizao de substncias de origem animal com o objectivo de minimizar o risco associado eventual presena de agentes patognicos nessas substncias. A utilizao de substncias de origem animal como constituintes das vacinas ou diluentes no em geral aceite, a no ser que sejam esterilizados por um mtodo validado apropriado. Quando a sua utilizao se revelar indispensvel e a esterilizao seja impossvel, so aplicados os critrios indicados em Exigncias. As substncias de origem animal utilizadas durante o fabrico so esterilizadas ou inactivadas por um mtodo 531

5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas para uso veterinrio

validado apropriado ou submetidas a um ensaio para deteco de agentes estranhos como se descreve em Exigncias. No caso de vacinas inactivadas, o mtodo utilizado para a inactivao da estirpe da vacina igualmente validado para a inactivao de eventuais contaminantes das substncias de origem animal. Alm das restries descritas a seguir, os fabricantes aplicam restries relativas manipulao de substncias de origem animal nas instalaes de fabrico de vacinas. Pode tornar-se necessrio adaptar as restries impostas nesta seco em funo da evoluo da situao zoo-sanitria no pas de origem e na Europa. EXIGNCIAS As substncias de origem animal satisfazem s exigncias da Farmacopeia no caso de existir a correspondente monografia.
5. Textos gerais

submetida a um ensaio para pesquisa de contaminantes por mtodos suficientemente sensveis. Os mtodos utilizados compreendem ensaios em culturas de clulas suficientemente sensveis e incluem clulas primrias provenientes da mesma espcie da amostra. Uma parte das clulas submetida a, pelo menos, duas passagens. As clulas so regularmente observadas durante 21 dias para deteco de eventuais efeitos citopatognicos. Durante este perodo de observao, todos os 7 dias, uma parte das clulas da espcie de origem examinada para deteco de efeitos citopatognicos aps fixao e colorao, uma outra parte submetida a um ensaio para deteco de agentes hemoadsorventes e uma outra pesquisa de agentes especficos por mtodos apropriados de serodiagnstico. Contaminao bacteriana e fngica. Antes da sua utilizao, as substncias so submetidas ao ensaio de esterilidade (2.6.1) e ao ensaio dos micoplasmas (2.6.7), ou a um processo de esterilizao que assegure a inactivao de qualquer contaminante bacteriano, fngico ou micoplsmico.

Origem. Convm avaliar cuidadosamente as riscos associados evoluo da situao zoo-sanitria no pas de origem da substncia e s doenas infecciosas potencialmente presentes na espcie animal de origem, tendo em conta as espcies alvo propostas. Os critrios de seleco so os mais exigentes, em particular para as substncias utilizadas nos produtos que se destinam mesma espcie e para as substncias de origem bovina, caprina, ovina e porcina. Preparao. As substncias de origem animal so preparadas a partir de um granel homogneo identificado por um nmero de lote. O lote pode conter substncias provenientes de um sem nmero de animais. No entanto, uma vez definido e identificado por um nmero, o lote no de qualquer forma sujeito a adies ou a contaminaes. Demonstra-se que todos os lotes da substncia se encontram isentos de contaminaes como se descreve a seguir, e/ou foram sujeitos a um processo de inactivao validado. Inactivao. O processo de inactivao escolhido capaz de reduzir o ttulo de pelo menos 106 de certos potenciais contaminantes na substncia considerada. Se no se puder demonstrar experimentalmente esta reduo de ttulo, so feitos estudos de cintica no processo de inactivao, que do resultados satisfatrios tendo em conta o nvel mais provvel de contaminao. A lista dos contaminantes potenciais para os quais se torna necessrio demonstrar a eficcia do mtodo de inactivao estabelecida em funo da espcie animal de origem da substncia. A demonstrao da eficcia do mtodo, que tem em linha de conta cada situao particular, pode ter a forma de referncias a literatura publicada ou de resultados experimentais produzidos pelo fabricante. Ensaio. Quando a amostra se apresenta na forma slida, convm, para verificar a ausncia de contaminantes, dissolv-la ou suspend-la num lquido apropriado de maneira a obter uma soluo ou uma suspenso com uma concentrao pelo menos igual a 300 g/l. Se a amostra for insolvel, ou tiver uma aco citotxica, utilizada uma concentrao mais baixa. Qualquer lote em que se revele a existncia de microrganismos vivos de qualquer espcie no satisfaz, sendo rejeitado ou novamente processado e demonstrado satisfatrio. Ausncia de contaminao vrica. A soluo (suspenso) da substncia slida ou da substncia lquida no diluda 532

5.2.6. AVALIAO DA INOCUIDADE DAS VACINAS PARA USO VETERINRIO


Durante o desenvolvimento de uma vacina so efectuados ensaios de inocuidade nas espcies alvo com a finalidade de pr em evidncia os riscos potencialmente associados com a utilizao da vacina. As vacinas vivas apenas so preparadas com estirpes cuja inocuidade tenha sido demonstrada. Nos ensaios, dose significa a quantidade de produto recomendada para utilizao e contm o ttulo ou a actividade mximos susceptveis de serem obtidos nos lotes de fabrico. No caso das vacinas vivas, necessrio efectuar os ensaios com um ou vrios lotes da vacina preparada a partir da passagem menos atenuada utilizada na produo. No caso de vacinas combinadas, demonstra-se a inocuidade de cada um dos componentes e da vacina combinada. Nas vacinas inactivadas, os ensaios de inocuidade efectuados com a vacina combinada podem ser considerados suficientes para demonstrar a inocuidade dos componentes individuais. Os ensaios descritos a seguir, com as modificaes ou os ensaios suplementares indicados na seco Produo de uma monografia especfica, podem ser efectuados no quadro dos ensaios de desenvolvimento necessrios para demonstrar a inocuidade da vacina. A. ENSAIOS LABORATORIAIS Inocuidade da administrao de uma dose nica. Administre, a um grupo de animais receptivos de cada uma das espcies e categorias s quais a vacina se destina, 1 dose de vacina por cada uma das vias de administrao recomendadas. Consoante o caso, este grupo inclui animais com a idade mnima para vacinao e fmeas gestantes. Os animais so observados e examinados regularmente para pesquisa de reaces gerais ou locais. Quando apropriado, os estudos compreendem um detalhado exame necrpsico, macroscpico e microscpico do local da injeco; estes exames no so normalmente necessrios no caso de animais que no se destinam ao consumo. So igualmente registados outros critrios objectivos, por exemplo a temperatura rectal dos mamferos e o rendimento zootcnico. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas para uso veterinrio

A temperatura rectal registada pelo menos no dia anterior ao da vacinao, no momento da vacinao, 4 h mais tarde e nos 4 dias seguintes. Os animais so mantidos em observao e examinados durante um perodo de tempo em que se espera no haver reaces mas, em todos os casos, durante, pelo menos, 14 dias aps a administrao da vacina. Os estudos de inocuidade podem igualmente incluir o exame da funo reprodutora quando os dados sugerem que a origem da matria-prima do produto constitui um factor de risco. Se estiver prescrito na monografia, efectua-se o estudo das funes reprodutoras dos machos e das fmeas gestantes e no gestantes, incluindo a pesquisa de efeitos indesejveis na descendncia, por exemplo de natureza teratognica e abortiva. Inocuidade da administrao de uma sobredose. administrada uma sobredose por cada uma das vias de administrao recomendadas, aos animais das categorias mais sensveis das espcies alvo, incluindo, se for o caso, animais com a idade mnima para vacinao e fmeas gestantes. A sobredosagem consiste normalmente em 10 doses de vacina viva ou 2 doses de vacina inactivada. Os animais so observados e examinados regularmente para pesquisa de reaces gerais ou locais. So igualmente registados outros critrios objectivos, por exemplo a temperatura rectal dos mamferos e o rendimento zootcnico. Os animais so mantidos em observao e examinados durante, pelo menos, 14 dias aps a administrao da vacina. Inocuidade da administrao repetida de uma dose nica. A administrao repetida de uma dose nica pode ser necessria para revelar quaisquer efeitos indesejveis induzidos pela referida administrao. Estes ensaios efectuam-se nas categorias mais sensveis das espcies alvo, pela via de administrao recomendada. Os animais so observados e examinados, no mnimo, durante 14 dias aps a ltima administrao para pesquisa de reaces gerais ou locais. So igualmente registados outros critrios objectivos, por exemplo a temperatura rectal dos mamferos e o rendimento zootcnico. Resduos. Normalmente no necessrio efectuar um estudo de resduos. Todavia, caso o fabrico de vacinas veterinrias envolva a utilizao de adjuvantes e/ou conservantes, atende-se possvel persistncia de resduos nos produtos alimentares. Se necessrio investigam-se os efeitos dos referidos resduos. Alm disso no caso de vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas pode ser necessrio efectuar a pesquisa do microrganismo vacinal residual no local de injeco, para alm dos estudos de disseminao que se descrevem a seguir. Efeitos indesejveis nas funes imunolgicas. Caso a vacina possa afectar negativamente a resposta imunitria do animal vacinado ou da sua descendncia, so efectuados ensaios adequados das funes imunolgicas. Exigncias especiais aplicveis s vacinas vivas. Efectuam-se os seguintes ensaios nas vacinas vivas: (a) Disseminao da estirpe da vacina. Utilizando a via de administrao recomendada mais favorvel para a disseminao, investiga-se a possibilidade de transmisso da estirpe da vacina de animais vacinados a animais no vacinados da espcie alvo. Pode tambm ser necessrio investigar os riscos de transmisso a espcies no alvo potencialmente muito sensveis estirpe da vacina viva. Convm igualmente avaliar o nmero possvel de transmisses de animal para animal em circunstncias normais, assim como as suas previsveis consequncias. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

(b) Disseminao no animal vacinado. Verifica-se a presena do microrganismo nas fezes, urina, leite, ovos e secrees orais, nasais ou outras. Alm disso, pode ser necessrio estudar a disseminao da estirpe da vacina no corpo do animal, com especial destaque para os seus locais de replicao preferenciais. Este estudo obrigatrio para vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas dos animais destinados ao consumo. (c) Reverso virulncia ou aumento da virulncia. Para o caso de vacinas atenuadas utilize a estirpe ao nvel da passagem menos atenuada para a espcie alvo entre o lote semente primrio e o produto acabado. No caso de outras vacinas vivas, utilize o material proveniente da passagem que se espera ser a mais virulenta para as espcies alvo. A primeira vacinao efectuada pela via de administrao recomendada mais favorvel reverso virulncia. Efectuam-se, pelo menos, cinco passagens em srie em animais das espcies alvo. Caso tal no seja tecnicamente possvel, em virtude do microrganismo no se replicar de modo adequado, efectuam-se nas espcies alvo tantas passagens quantas possvel. Se necessrio, pode proceder-se propagao do microrganismo in vitro entre duas passagens in vivo. As passagens efectuam-se pela via de administrao que mais provavelmente conduz reverso virulncia. Utilizam-se, pelo menos, duas espcies receptivas em cada passagem. Comprova-se a presena de microrganismos vivos provenientes da vacina no substrato de cada passagem. A inocuidade da estirpe do nvel mais elevado de passagens comparada com a da estirpe de origem. No caso de vrus particulares, a monografia pode exigir um maior nmero de passagens, e para cada passagem, um nmero de animais mais elevado se se dispuser de qualquer indicao que revele o seu interesse. A ltima passagem efectuada em animais da categoria mais apropriada para avaliar o risco potencial. (d) Propriedades biolgicas da estirpe da vacina. Podem ser necessrios mais ensaios por forma a determinar, to exactamente quanto possvel, as propriedades biolgicas intrnsecas da estirpe utilizada na vacina (por exemplo, neurotropismo). No caso de vacinas que utilizam vectores, necessrio fazer uma avaliao do risco de uma modificao do tropismo ou da virulncia da estirpe e, se necessrio, efectuar ensaios especficos. Estes ensaios so sistematicamente efectuados quando se incorpora um gene estranho na estirpe como protena estrutural. (e) Recombinao ou rearranjo genmico da estirpe. analisada a probabilidade de recombinao ou rearranjo genmico com a estirpe de campo ou outras. B. ENSAIOS DE CAMPO Os resultados dos ensaios laboratoriais so normalmente complementados e confirmados com dados comprovativos provenientes dos ensaios de campo. Nos mamferos destinados ao consumo, os ensaios incluem a medio da temperatura rectal antes e aps a vacinao num nmero suficientemente elevado de animais; noutros mamferos, essas medies efectuam-se quando os ensaios laboratoriais indiciem qualquer problema. Registam-se o tamanho e a persistncia de qualquer reaco local e a proporo de animais que apresentam reaces locais ou gerais. Se necessrio, convm igualmente medir o rendimento zootcnico. 533

5. Textos gerais

5.2.7. Avaliao da eficcia das vacinas para uso veterinrio

C. ECOTOXICIDADE Durante o desenvolvimento da vacina avaliam-se os efeitos nocivos da vacina para o ambiente e identificam-se as medidas preventivas necessrias para diminuir os referidos riscos. O grau de exposio do ambiente vacina avaliado levando em ateno a espcie alvo e modo de administrao, de excreo da vacina e o modo de eliminao do produto no utilizado. Se estes factores indicarem que haver um risco significativo de exposio do ambiente ao produto, a ecotoxicidade potencial avaliada levando em linha de conta as propriedades da vacina determinadas, por exemplo, nos ensaios descritos nesta seco.

recomendadas. A prova virulenta efectuada utilizando uma estirpe diferente daquela que foi utilizada na produo da vacina, Na medida do possvel, as condies em que se efectua a prova virulenta reproduzem as condies naturais de infeco, por exemplo no que diz respeito ao nmero de microrganismos e via de administrao utilizados. Se possvel, convm determinar qual o tipo de mecanismo imunitrio (celular/humoral, local/geral, classe de imunoglobulina) que resulta da administrao do produto s espcies alvo. ENSAIOS DE CAMPO De uma forma geral, os resultados dos ensaios laboratoriais so completados por dados obtidos nos ensaios de campo, efectuados com animais testemunhas no tratados. Quando os ensaios laboratoriais no permitam demonstrar a eficcia, aceita-se que sejam apenas efectuados ensaios de campo.

5.2.7. AVALIAO DA EFICCIA DAS VACINAS PARA USO VETERINRIO


Durante o desenvolvimento da vacina, a sua eficcia demonstrada atravs de ensaios efectuados em cada uma das espcies e categorias s quais a vacina se destina, utilizando cada uma das vias de administrao recomendadas e o esquema vacinal proposto. A natureza dos ensaios a efectuar varia consideravelmente consoante o tipo de vacina considerado. Os ensaios indicados na seco Produo numa monografia especifica podem ser efectuados no quadro dos ensaios de desenvolvimento necessrios para demonstrar a eficcia da vacina. Convm ter em conta as seguintes consideraes. A dose a utilizar nos ensaios ser a quantidade de produto recomendada para utilizao, contendo o ttulo ou a actividade mnima admitidos no fim do prazo de validade. No caso de vacinas vivas, necessrio efectuar os ensaios com a vacina preparada a partir da passagem mais atenuada utilizada na produo. Os ensaios de eficcia confirmam todas as indicaes reclamadas para a vacina. Se, por exemplo, se indica que o produto confere proteco contra doenas respiratrias, pelo menos demonstra-se que protege contra os sinais clnicos da doena respiratria. Quando se reclama uma proteco anti-infecciosa, este facto demonstrado por tcnicas de reisolamento. Se tem vrias indicaes, a sua eficcia demonstrada para cada uma delas. A influncia na eficcia da vacina da presena de anticorpos adquiridos passivamente ou transmitidos pela me adequadamente avaliada. Qualquer declarao ou indicao respeitante ao incio e durao da proteco corroborada com os resultados obtidos nos ensaios. A eficcia de cada um dos componentes das vacinas combinadas demonstrada utilizando a vacina combinada. Realizam-se ensaios de compatibilidade imunolgica quando se recomenda a administrao simultnea de vrias vacinas ou quando essa compatibilidade faz parte do esquema habitual de vacinao. Sempre que um produto seja recomendado como parte do esquema de vacinao, demonstra-se o seu papel na primo-vacinao e no rappel ou a sua contribuio na eficcia do esquema vacinal. ENSAIOS LABORATORIAIS Em princpio, a eficcia demonstrada atravs de ensaios, na espcie alvo, com prova virulenta aps administrao do produto de acordo com as condies de utilizao 534

5. Textos gerais

5.2.8. MINIMIZAO DO RISCO DA TRANSMISSO DE AGENTES DE ENCEFALOPATIAS ESPONGIFORMES ANIMAIS POR PRODUTOS MEDICAMENTOSOS PARA USO HUMANO E PARA USO VETERINRIO
1. OBSERVAES GERAIS 2. OBJECTIVO DO CAPITULO GERAL 3. MANUFACTURA (INCLUINDO A RECOLHA DE MATRIAS-PRIMAS) 3.1. Animais utilizados como fonte de matrias-primas 3.2. Partes de animais, lquidos corporais e secrees utilizadas como matrias-primas 3.3. Validao do procedimento 3.4. Idade dos animais 3.5. Produtos especficos 4. CONCLUSES

1. OBSERVAES GERAIS As encefalopatias espongiformes transmissveis (EET) incluem o scrapie(1) em ovinos e caprinos, a encefalopatia espongiforme dos cervdeos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB), e tambm, no homem, o Kuru e a doena de Creutzfeldt-Jacob (DCJ). Os agentes transmissveis responsveis por estas doenas replicam-se nos indivduos infectados, geralmente sem sinais de infeco detectvel pelos mtodos actuais de diagnstico in vivo. Depois de perodos de incubao que podem atingir vrios anos, os agentes desenvolvem a doena que conduz morte do indivduo. No conhecida nenhuma soluo teraputica. O diagnstico baseado nos sintomas clnicos e a confirmao post mortem pelas leses cerebrais caractersticas, por histopatologia ou por deteco das
(1) A designao oficial portuguesa, conforme a denominao referida na Portaria 713/96 de 9 de Dezembro. Tremor epizotico dos ovinos e caprinos. No entanto, a designao scrapie aquela que est consagrada.

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5.2.8. Minimizao do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinrio

Existe pouca informao sobre as caractersticas dos seus agentes infecciosos. So extremamente resistentes maioria dos tratamentos qumicos ou fsicos capazes de inactivar os vrus convencionais. No induzem respostas imunitrias detectveis. Existem barreiras naturais que limitam a proliferao da infeco entre as espcies, mas elas podem ser ultrapassadas em circunstncias apropriadas que dependem geralmente da estirpe, da dose, da via de exposio e da importncia da barreira inter-espcies. Estudos em animais de laboratrio demonstraram que a inoculao intracerebral a via mais eficaz. O homem tem estado naturalmente exposto ao agente infeccioso do scrapie nos ltimos 200 anos, mas apesar dos extensos estudos epidemiolgicos realizados nenhum sinal de transmisso entre ovinos e homem foi detectado. A EEB foi, pela primeira vez, notificada no Reino Unido em 1986. Um grande nmero de bovinos e de herdades foram afectadas. claro que a EEB uma infeco transmitida pela alimentao. Casos de EEB apareceram noutros pases, quer em animais importados do Reino Unido, quer em animais autctones. Na medida em que as propriedades biolgicas do agente causal da EEB diferente das do agente do scrapie, concebvel que as barreiras inter-espcies o seja tambm. Existem indcios convincentes de que a nova variante da DCJ seja devida ao agente responsvel da EEB em bovinos. A apario de uma nova variante da DCJ no homem reforou as inquietaes relativas possvel transmisso do agente infeccioso da EEB ao homem. Assim, a devida prudncia continua a aconselhar o mximo rigor nos casos em que os produtos biolgicos provenientes de espcies afectadas por estas doenas para alm da experimentao, especialmente na espcie bovina, sejam utilizadas para o fabrico de produtos medicinais. As recomendaes seguintes so, assim, seguidas para reduzir ao mnimo o risco de contaminao. Apesar deste captulo geral, sublinhado que o potencial risco associado a um produto medicinal considerado individualmente luz das circunstncias especficas e do conhecimento actual. 2. OBJECTIVO DO CAPTULO GERAL Este captulo considera as implicaes da EET nos produtos medicinais e as medidas a tomar para reduzir ao mnimo o risco de transmisso pela sua utilizao. Este capitulo aplica-se, assim, aos produtos de origem animal, particularmente aos produtos obtidas a partir de ruminantes, utilizados na preparao de: FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Este captulo geral lido em conjunto com as diferentes decises da Comisso das Comunidades Europeias progressivamente implementadas desde 1991. 3. MANUFACTURA E RECOLHA DE MATRIAS-PRIMAS Quando os fabricantes tiverem a opo entre a utilizao de produtos de origem ruminante ou no, a utilizao de produtos oriundos de animais no ruminantes preferencial. A substituio dos produtos base de ruminante por produtos oriundos de uma outra espcie em que seja estabelecido que sofra de EET, ou que possa ser infectada experimentalmente por via oral, no normalmente aceitvel. No pedido de autorizao de introduo no mercado o requerente fornece os detalhes da origem dos produtos (incluindo a origem geogrfica do animal) e sobre as medidas tomadas para reduzir ao mnimo o risco de transmisso dos agentes da EET. O fabricante farmacutico audita o fornecedor destes produtos a fim de garantir uma origem e uma manipulao conformes ao presente captulo geral e aos sistemas apropriados de controlo de qualidade. O risco de transmisso de agentes infecciosos pode ser reduzido de modo significativo atravs do controlo de um certo nmero de parmetros, entre os quais: a origem dos animais, a natureza do tecido animal utilizado no fabrico, o(s) processo(s) de produo. Nenhuma destas medidas pode necessariamente estabelecer, por si s, a inocuidade de um produto, podendo ser necessrio recorrer s trs medidas complementares mencionadas acima para reduzir ao mnimo o risco de contaminao. 3.1. Animais utilizados como fontes de matrias-primas Uma seleco minuciosa dos produtos base constitui o critrio mais importante para a inocuidade dos produtos medicinais. 3.1.1. As matrias-primas de melhor qualidade provem de pases em que nenhum caso de EEB tenha sido reportado e nos quais: a notificao obrigatria, e a verificao clnica e biolgica dos casos suspeitos obrigatria. 535

5. Textos gerais

protenas fibrilares especficas das encefalopatias espongiformes. A demonstrao da infecciosidade por inoculao do tecido suspeito a espcies alvo ou a animais de laboratrio pode igualmente ser utilizada para confirmao, mas o perodo de incubao varia de vrios meses a vrios anos. Foram assinalados casos de transmisso iatrognica de encefalopatias espongiformes. Nos ovinos, o scrapie foi transmitido acidentalmente aps utilizao de uma vacina contra o vrus Louping III preparada a partir de uma mistura de crebro e bao de ovino tratados com formol, na qual foram incorporados inadvertidamente tecidos provenientes de um ovino infectado. No homem. foram reportados casos de transmisso da DCJ. Nestes ltimos. foi atribuda administrao parenteral repetida de hormona do crescimento e gonadotropina obtidas de hipfises de cadveres humanos. Casos de DCJ foram igualmente atribudos utilizao de instrumentos contaminados em cirurgia cerebral e ao transplante de meninges e crneas humanas.

substncias activas, excipientes, produtos base, matrias-primas e reagentes utilizados na produo (por exemplo; albumina srica bovina, enzimas, meios de cultura incluindo aqueles que servem de preparao a bancos de clulas de trabalho ou novos bancos de clulas-me). Este captulo geral tambm se aplica aos produtos que entrem em contacto directo com os equipamentos utilizados na produo (e que deste modo so potenciais contaminantes), por exemplo, os meios de ensaio utilizados na validao fabril e de equipamentos. Este captulo geral est relacionado com os produtos obtidos de todos os ruminantes. As medidas propostas so sobretudo aplicveis aos produtos oriundos de bovinos, e pode ser necessrio adapt-las aos produtos de origem ovina, caprina e de outras espcies em que a susceptibilidade s EET, para alm da experimentao, seja estabelecida.

3. Textos gerais

5.2.8. Minimizao do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinrio

Uma certificao oficial est disponvel. Para alm disso, necessrio assegurar a ausncia de risco de infeco por EEB pelos seguintes factores: importao de bovinos oriundos de pases apresentando uma incidncia elevada de EEB, importao de bovinos nascidos de fmeas afectadas, utilizao de alimentos base de carne e ossos para alimento de ruminantes, e contendo protenas de ruminantes tendo como origem pases apresentando uma baixa ou alta incidncia de EEB ou em que a situao seja desconhecida. 3.1.2. As matrias-primas podem igualmente provir de pases em que a incidncia de casos autctones de EEB seja baixa, se, e para alm dos factores descritos no pargrafo 3.1.1.: as carcaas de todos os animais infectados so destrudas,
5. Textos gerais

nomeadamente do contacto entre os produtos de um grupo de risco reduzido com os pertencentes a um grupo de risco elevado. Assim, a contaminao cruzada entre certos tecidos corre o risco de ser acrescida se os animais infectados forem abatidos por trepanao ou se o crebro e/ou a medula espinal forem serrados. O risco de contaminao cruzada reduzido se os lquidos corporais forem recolhidos com um mnimo de leses tissulares, se os elementos celulares forem retirados e se o sangue fetal for recolhido evitando qualquer contaminao pelos tecidos maternos ou fetais como a placenta ou os lquidos amnitico e alantoideu, o risco devido contaminao cruzada depende de diversos factores complementares, tais como: as precaues tomadas para evitar qualquer contaminao durante a recolha dos tecidos (ver acima), o nvel de contaminao (quantidade de tecido contaminante), a quantidade de matria-prima a utilizar, o tratamento a que ser submetida a matria-prima durante o processo de fabrico. Os fabricantes apresentam uma estimativa do risco.
TABELA 1 Ttulos infecciosos relativos scrapie nos tecidos e lquidos corporais de ovinos e caprinos naturalmente infectados e apresentando scrapie clnica (2) CATEGORIA I infecciosidade elevada CATEGORIA II infecciosidade mdia cerebral, CATEGORIA III infecciosidade reduzida CATEGORIA IV infecciosidade indetectvel (3) Crebro, medula espinal, (olho). leo, gnglios linfticos, clon proximal, bao, amgdalas, (duramter, epfise, placenta), lquido cfalo-raquidiano, hipfise, glndulas supra-renais. Clon distal, mucosa nasal, nervos perifricos, medula ssea, fgado, pulmes, pncreas, timo. Cogulo sanguneo, fezes, corao, rins, glndulas mamrias, leite, ovrios, saliva, glndulas salivares, vesculas seminais, soro, msculos esquelticos, testculos, tiride, tero, tecido fetal, (blis, ossos(4), tecido cartilagneo, tecido conjuntivo, plos, pele, urina).

a prognie (descendncia) das fmeas afectadas no utilizada, as protenas de origem mamfera so interditas na alimentao de ruminantes. Os animais so nascidos depois da entrada em vigor desta interdio. Se a data de nascimento dos animais for desconhecida, a data de aplicao desta interdio e o perodo de incubao da EEB so tomadas em considerao para avaliar a inocuidade da fonte de aprovisionamento. Os rebanhos no seio dos quais tenham sido declarados casos de EEB no podem ser utilizados para aprovisionamento. 3.1.3. As matrias-primas provenientes de pases com alta incidncia de EEB no podem ser utilizados. Paralelamente a estas medidas, os pedidos de autorizao de introduo no mercado justificam as suas estratgias de aprovisionamento relativamente s categorias de produtos, a quantidade de produtos base e a utilizao prevista do produto medicinal acabado no homem. possvel beneficiar de uma margem de segurana suplementar fornecendo-se junto de pases nos quais os produtos base sejam oriundos de rebanhos bem controlados. 3.2. Partes animais, lquidos corporais e secrees utilizadas como matrias-primas Num animal infectado por uma EET, os nveis de infecciosidade variam segundo os rgos ou as secrees. Com base nos dados relativos scrapie natural, os rgos, tecidos e secrees foram classificados em quatro grupos principais apresentando diferentes nveis de risco potencial, conforme apresentado na tabela 1. Apesar de ser bem conhecido que a repartio da infecciosidade nos bovinos com EEB seja mais restrita, a classificao dos tecidos e lquidos corporais na tabela sempre utilizada para a seleco dos produtos base. As categorias contidas na tabela apenas tm um carcter indicativo e importante ter em ateno os seguintes pontos: a classificao dos tecidos apresentada na tabela l baseada na titulao da infecciosidade no murganho por via intracerebral. Nos modelos experimentais utilizando as estirpes adaptadas aos animais de laboratrio, podem observar-se ttulos mais elevados e uma classificao de tecidos ligeiramente diferente, em algumas situaes, pode produzir-se uma contaminao cruzada entre tecidos pertencentes a categorias de infecciosidade diferentes. O risco potencial depender das circunstncias nas quais os tecidos foram retirados, 536

3.3. Validao do procedimento O controlo do aprovisionamento o critrio mais importante para atingir uma inocuidade aceitvel do produto. devido resistncia estabelecida documentalmente dos agentes da EET maior parte dos processos de inactivao. Os estudos de validao dos processos de eliminao/inactivao so de difcil interpretao pois necessrio ter em considerao a natureza do produto contaminado intencionalmente e a sua relevncia face situao natural, a concepo do estudo
(2) Os estados de referncia no dosearam os tecidos entre parntesis, mas a infecciosidade relativa indicada por outros dados sobre encefalopatias espongiformes. As matrias-primas no mencionadas podem ser classificadas por analogia com aquelas que o so, baseando-se na sua composio. (3) Nenhuma infecciosidade foi transmitida em roedores aps inoculao intracerebral (at 5 mg). (4) Para o crnio e vrtebras, ver tambm o ponto 3.2. relativamente contaminao cruzada.

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5.2.8. Minimizao do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinrio

(compreendendo a reduo de escala do processo) e o mtodo de deteco do agente (doseamento in vitro ou in vivo), aps contaminao intencional e aps tratamento. So necessrias pesquisas suplementares para se poder atingir um acordo relativamente metodologia mais apropriada para os estudos de validao. Actualmente, os estudos de validao no so, assim, geralmente exigidos. No entanto, se a concepo dos procedimentos que permitam eliminar ou inactivar os agentes das EET for reivindicada, esta ser justificada pelos estudos de validao apropriados. Os estudos de validao so especficos do processo. Para alm das restries particulares que se aplicam aos estudos de validao sobre as EET e sua interpretao. O obstculo principal a identificao das etapas que iro eliminar ou inactivar eficazmente os agentes das EET durante o fabrico dos produtos medicinais de origem biolgica. Os fabricantes so incitados a prosseguir as suas investigaes sobre os mtodos de eliminao ou de inactivao a fim de identificar as etapas/procedimentos que iro favorecer a eliminao ou inactivao dos agentes infecciosos das EET. Em todos os casos, um procedimento de produo elaborado, se possvel, tendo em conta as informaes disponveis sobre os mtodos presumivelmente eficazes para a eliminao ou inactivao dos agentes das EET. Alguns procedimentos de produo podem contribuir consideravelmente para a reduo do risco de contaminao pela EET, por exemplo, os procedimentos utilizados no fabrico do sebo e seus derivados (ver adiante). 3.4. Idade dos animais Estando assumido que a infecciosidade das EET se acumula durante um perodo de incubao de vrios anos, pode ser prudente utilizar como fonte de aprovisionamento animais jovens. 3.5. Produtos especficos pouco provvel que o leite e seus derivados possam apresentar um risco de contaminao. pouco provvel que algumas matrias-primas e seus derivados, tais como os plos e a l utilizados no fabrico de lcoois de l e de lanolina, apresentem um risco de contaminao. se as garantias de recolha e de tratamentos forem fornecidas. O sebo utilizado como matria-prima no fabrico de derivados do sebo produzido segundo um mtodo, pelo menos to robusto e rigoroso como os mencionados nos regulamentos internacionais. Os derivados do sebo, como o glicerol e os cidos gordos que so fabricados a partir do sebo atravs de procedimentos rigorosos foram objecto de consideraes especficas e pouco provvel que sejam infecciosos. Exemplos de procedimentos rigorosos so: a transesterificao ou hidrlise sob presso, a uma temperatura de, pelo menos, 200C e durante 20 min, no mnimo (para a produo de glicerol, cidos gordos e steres de cidos gordos). a saponificao pelo NaOH 12 M (para a produo de glicerol e sabo): produo por lotes: a uma temperatura de pelo menos 95C e durante 3 h no mnimo, produo em continuo: a uma temperatura de, pelo menos, 140C, a uma presso de 2 bares (2000 hPa) durante 8 min, no mnimo, ou equivalente. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Gelatina: Para a gelatina produzida a partir de ossos de bovinos(5), o conjunto dos seguintes parmetros contribui para a inocuidade deste produto: a origem geogrfica dos animais, os crnios e medulas espinais presentes na matria-prima(6) so eliminados, geralmente recomendada a excluso das vrtebras, em funo da origem geogrfica dos animais, o mtodo de fabrico actualmente preferido a hidrlise alcalina, os sistemas tais como a certificao ISO 9000 e HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point) so implementados para a vigilncia do processo de produo e a produo por lotes (definio do lote, separao dos lotes, limpeza entre lotes, etc.), os procedimentos so implementadas para assegurar a traabilidade e auditar os fornecedores de matrias-primas. Para a gelatina produzida a partir da pele de bovinos: toda a contaminao cruzada com as substncias potencialmente infecciosas evitada. Os fabricantes apresentam uma estimativa do risco. 4. CONCLUSES A estimativa do risco associado EET necessita que todos os parmetros citados sejam minuciosamente tomados em considerao, e a opo prioritria consiste em evitar a utilizao das matrias-primas derivadas de animais em que a susceptibilidade s EET esteja estabelecida (de outro modo que no a prova experimental) nos produtos fabricados pela indstria farmacutica. A aceitabilidade de um produto medicinal, em particular, contendo tais matrias-primas ou podendo, em resultado do fabrico, cont-las, depende de um certo nmero de factores, entre os quais: os documentos e os registos atestando a origem dos animais, a natureza do tecido animal utilizado durante o fabrico, o(s) procedimento(s) de fabrico, a via de administrao, a quantidade de tecido utilizado nos produtos medicinais, a posologia teraputica mxima (dose diria e durao do tratamento), a utilizao prevista do produto.

(5) So aqui considerados como produto base, os ossos antes do desengorduramento (6) A futura distribuio geogrfica das EEB/EET no pode ser prevista. Qualquer modificao da distribuio geogrfica das EEB/EET pode conduzir na pior das situaes, a retirada de produtos medicinais contendo gelatina. Devido ao elevado nmero de produtos medicinais que contm gelatina como excipiente e o prazo de validade elevado da gelatina a partir da sua produo at data limite de conservao de produtos farmacuticos, qualquer retirada ter consequncias dramticas em termos de aprovisionamento de produtos medicinais essenciais. O crnio e a medula espinal so, por isso, retirados dos produtos-base da gelatina derivada de ossos de bovino qualquer que seja a origem geogrfica dos animais utilizados.

537

5. Textos gerais

5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio

Os fabricantes farmacuticos e os produtores de produtos medicinais de origem animal so responsveis pela seleco e justificao das medidas adequadas. O estado da cincia e das tecnologias so tomados em considerao. Apesar deste captulo geral, de sublinhar que o risco potencial associado a um produto medicinal especfico considerado individualmente luz das circunstncias especficas e dos conhecimentos do momento. Estas indicaes so igualmente utilizadas na avaliao da relao risco-benefcio de cada produto.

Nmero de animais. Nas monografias indicam-se o numero de animais a utilizar. Regra geral, de 2 para os mamferos e de 10 para as aves e os peixes. Identificao dos animais. Salvo excepo justificada, todos os animais so objecto de uma marcao que permita o registo individual dos dados respeitantes ao perodo total de observao. Perodo de observao. Quando se registam critrios objectivos como se descreve a seguir, tal como a temperatura corporal, os animais so examinados e observados durante, pelo menos, 3 dias antes da administrao do produto. Aps administrao do produto, os animais So mantidos em observao e examinados, pelo menos, 1 vez por dia, durante, no mnimo, 14 dias, para se detectar reaces locais e gerais. No dia da administrao do produto, necessrio efectuar, pelo menos, 1 inspeco suplementar aps 4 h, ou nos intervalos de tempo especificados nas monografias. Nos casos de 2 administrao do produto, o perodo de observao termina 14 dias aps a administrao. Reaces locais e gerais. Os animais que apresentam reaces locais ou gerais anormais graves so abatidos. Em todos os animais mortos efectua-se um exame necrpsico macroscpico. Podem ser indicados exames microscpicos e microbiolgicos complementares. Os animais mantidos em observao so examinados com vista a serem detectadas reaces locais ou gerais. Quando constituam indicadores de utilidade reconhecida, so tambm registados outros critrios, por exemplo a temperatura corporal, a massa corporal, outros ndices de rendimento e consumo de alimentos. Reaces locais. Na medida em que for apropriado e possvel, registam-se o tamanho e a persistncia de qualquer reaco local (incluindo a aparecimento de reaces dolorosas) e tambm o numero de animais que manifestam as reaces locais. Reaces gerais. A temperatura, e se apropriado, a massa corporal so anotados como indicadores gerais dos efeitos sistmicos da administrao do produto. Todos os sinais clnicos so igualmente registados. Temperatura corporal. Nos mamferos, os estudos incluem a medio da temperatura corporal durante o perodo de observao. A temperatura corporal registada, pelo menos, 3 dias antes da administrao do produto, na altura da administrao e depois, decorridas 4 h e em intervalos regulares. A temperatura corporal antes da administrao do produto encontra-se entre os valores fisiolgicos. Pelo menos nos produtos em que previsvel um aumento significativo da temperatura (por exemplo nos produtos que contm endotoxinas e vrias vacinas vricas vivas) ou nos quais a monografia correspondente especifica um aumento da temperatura (por exemplo, no mximo, 2C nas vacinas contra a actinobacilose do porco), recomenda-se a utilizao da temperatura mdia dos dias anteriores administrao do produto (por exemplo, -3 dias ao dia 0) como linha base de temperatura, para se dispor de um critrio claro para a avaliao do ensaio. Massa corporal e consumo de alimento. Quando constitui um indicador de inocuidade com uma fiabilidade e uma utilidade reconhecidas, por exemplo nos animais jovens em fase de crescimento ou nos peixes, a massa corporal medida e documentada pouco tempo antes da administrao do produto e durante o perodo de observao. Controla-se o FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.2.9. AVALIAO DA INOCUIDADE DE CADA LOTE DE VACINAS E SOROS PARA USO VETERINRIO
5. Textos gerais

O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a uma vacina como a um soro. Definio das reaces anormais. Durante os estudos de desenvolvimento, o tipo e o tamanho das reaces esperadas aps administrao do produto, so definidas luz dos estudos de inocuidade. No quadro dos ensaios de inocuidade efectuados em cada lote, esta definio das reaces locais e gerais normais ou anormais depois utilizada para se avaliar as reaces aceitveis e no aceitveis. Quantidade administrada durante o ensaio. Para um produto apresentando o ttulo ou a actividade pretendidos dentro dos limites especificados para os lotes de produo, o termo dose nos ensaios, designa a dose recomendada. A quantidade a ser administrada no ensaio geralmente definida em nmero de doses. No caso de vacinas vivas liofilizadas, as 10 doses so reconstitudas num volume apropriado de solvente para o ensaio. No caso de produtos que se apresentam na forma de 2 recipientes contendo respectivamente 1 ou vrios componentes vivos liofilizados e um ou vrios componentes inactivados a utilizar como diluente, pode ser necessrio utilizar lquido suplementar para reconstituir o(s) componente(s) liofilizado(s). Quando necessrio e justificado convm injectar num local o contedo de 2 recipientes do componente inactivado misturado no contedo de um nmero mximo de recipientes do componente vivo liofilizado e os restantes componentes vivos liofilizados reconstitudos num solvente apropriado, podem ser inoculados num local separado. No caso de vacinas combinadas, os ensaios efectuados na vacina combinada consideram-se como suficientes para estabelecer a inocuidade dos componentes individuais. Via de administrao. O produto administra-se por uma das vias recomendadas. Em princpio, convm preferencialmente utilizar a via de administrao mais favorvel em permitir a deteco de reaces. Quando se sabe que existe um risco particular, por exemplo na sequncia dos estudos de desenvolvimento, efectua-se uma 2 administrao com a dose apropriada aps um intervalo apropriado como se determinou durante a fase de desenvolvimento. Espcies animais e categorias alvo. Salvo excepo justificada e autorizada, convm utilizar animais com idade mnima recomendada e da espcie mais sensvel para a vacinao ou administrao do produto. 538

5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio

consumo de alimentos e documenta-se como indicador do efeito da administrao do produto. Na maior parte dos casos, suficiente registar a rao diria consumida ou a que parcial ou totalmente rejeitada, mas, em alguns casos, pode ser necessrio registar o peso efectivo da alimentao consumida, quando se trata de um indicador apropriado da inocuidade do produto. Sinais clnicos. Anotam-se todos os sinais clnicos de natureza geral, esperados ou no, nomeadamente as modificaes do estado de sade e as alteraes de comportamento. Fichas de avaliao. Em funo dos sinais esperados, preparam-se as fichas de avaliao para cada produto. Todos os parmetros e todos os dados so registados nestas fichas. As

fichas incluem parmetros gerais mas tambm so adaptadas a cada tipo de produto e incluem a lista de sinais clnicos que podem ser mais marcantes para um dado produto. Critrios para a repetio do ensaio. Se surge um sinal anormal, com base se necessrio de um exame necrpsico, o veterinrio responsvel determina se esse sinal devido ao produto. Se a causa do sinal clnico no for claro ou quando um animal retirado do ensaio por motivos independentes do produto, o ensaio pode ser repetido. Se, no 2 ensaio, reaparece o mesmo sinal anormal, o produto no satisfaz ao ensaio. Regista-se qualquer tratamento administrado aos animais durante o perodo de observao. Se o tratamento puder interferir com o ensaio, o ensaio no vlido.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

539

5. Textos gerais

5.3. ANLISE ESTATSTICA DE RESULTADOS DE ENSAIOS E TESTES BIOLGICOS


543 544 553 555
5. Textos gerais

1. Introduo ...................................................................... 2. Aleatoriedade e independncia de tratamentos individuais ...................................................................... 3. Ensaios dependentes de respostas quantitativas .......... 4. Ensaios dependentes de respostas qualitativas ............ 5. Exemplos ........................................................................

543

6. 7. 8. 9. 10.

Combinao de resultados de ensaios.......................... Para alm desta monografia ........................................ Tabelas e mtodos de clculo........................................ Glossrio de smbolos e termos.................................... Bibliografia recomendada ............................................

567 569 570 573 575

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

541

5.3. Anlises estatsticas

A segunda verso desta monografia aparece agora restruturada, mantendo-se os conceitos definidos na introduo feita na traduo portuguesa para a Farmacopeia Portuguesa VI. Aconselhamos a consulta daquela monografia, pois alguns conceitos no esto aqui contemplados; por outro lado, e mantendo o princpio j consignado, apresenta-se em suplemento um glossrio de termos estatsticos nas verses portuguesa e inglesa, uma vez que a terminologia estatstica est muito ligada lngua inglesa.

Os limites de confiana para uma determinada actividade do uma indicao da preciso com a qual a actividade foi calculada no ensaio. So calculados tendo em ateno o desenho experimental e o tamanho da amostra. O limite de confiana para 95 por cento habitualmente escolhido para os ensaios biolgicos. Os mtodos matemticos so utilizados para calcular aqueles limites e para garantir que existe a probabilidade de 95 por cento de que estes limites incluam a actividade real. A aceitao desta preciso pela Farmacopeia depende dos requisitos estipulados na monografia da preparao em causa. Os termos mdia e desvio padro so usados aqui tal como definidos nos manuais de bioestatstica mais divulgados. Os termos actividade declarada ou actividade rotulada, actividade atribuda, actividade assumida, relao de actividade e actividade estimada so usados neste captulo para os conceitos seguintes: actividade declarada ou actividade rotulada: no caso de um produto preparado, um valor nominal atribudo a partir do conhecimento existente da actividade da matria prima; no caso da matria prima, consiste na actividade prevista pelo fabricante, actividade atribuda: a actividade da substncia padro, actividade assumida: actividade provisria de uma amostra que forma a base de clculo da dose que ir ter uma actividade equivalente dose da preparao com o padro a utilizar, relao de actividade de uma amostra: relao entre as doses da preparao padro e da amostra com uma actividade equivalente nas condies do ensaio, actividade estimada: actividade calculada a partir dos dados do ensaio. A seco 9 (Glossrio de smbolos e termos) contm uma tabela com os smbolos mais usados neste anexo. Quando o texto se referir a um smbolo inexistente naquela seco ou usar um smbolo para um conceito diferente, ele ser definido na respectiva parte do texto.
5. Textos gerais

1. INTRODUO
Este captulo contm indicaes relativas concepo de ensaios biolgicos prescritos na Farmacopeia e anlise dos seus resultados. Foi redigido para uso dos utilizadores de que nem a formao nem as funes principais sejam de estatstica, mas que, pelas suas funes devem analisar ou interpretar os resultados daqueles ensaios, muitas vezes sem o auxlio ou orientao de um especialista. Os mtodos de clculo descritos aqui no tm um carcter obrigatrio para interpretao dos doseamentos que constituem parte integrante da Farmacopeia. Podem ser utilizados mtodos alternativos, sob a condio de serem to fiveis como os aqui descritos. H uma grande escolha de programas de clculo disposio do analista, e podem ser mais ou menos teis de acordo com as facilidades disponveis e as competncias do analista. H situaes onde a orientao de um especialista necessria: tratamento global da organizao e anlise de ensaios no mbito da investigao ou do desenvolvimento de novos produtos; as restries impostas ao desenho do ensaio neste captulo no sejam satisfeitas, por exemplo restries laboratoriais especficas podem requerer desenhos de ensaios particulares, ou quando o uso de doses em nmero igual e equidistantes no apropriado; anlise de curvas dose-resposta no lineares de grande extenso, como por exemplo nos ensaios imunolgicos. Um esboo pormenorizado de anlises de curva dose-resposta para um conjunto alargado de modelos includo na seco 3.4 e um exemplo simples dado na seco 5.4. 1.1. DESENHO GERAL E PRECISO A Farmacopeia descreve mtodos biolgicos destinados ao doseamento de substncias e preparaes em que a actividade no pode ser correctamente determinada por mtodos qumicos ou fsicos. Na medida do possvel, o princpio aplicado nos doseamentos a comparao com a preparao padro de modo a determinar a quantidade da amostra que produz o mesmo efeito biolgico que uma quantidade determinada da substncia padro, a Unidade. Uma das condies essenciais aplicao destes mtodos de titulao que os ensaios so efectuados simultaneamente com as preparaes padro e as amostras, e em condies idnticas. Para certos ensaios (por exemplo, determinao de ttulos de vrus), a actividade da amostra no expressa em termos relativos em relao ao padro. A seco 4.5 refere-se a este tipo de ensaio. Qualquer avaliao da actividade derivada do ensaio biolgico sujeita a erro aleatrio devido variabilidade inerente das respostas biolgicas e devem ser feitos os clculos dos erros, se possvel, a partir dos resultados dos ensaios, mesmo quando so utilizados os mtodos oficiais. Os mtodos para o desenho dos ensaios e clculos dos respectivos erros so, assim, descritos a seguir. Em cada caso, antes da adopo de um mtodo estatstico, devem ser realizados ensaios preliminares em nmero apropriado de modo a certificar a aplicabilidade do mtodo. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

2. ALEATORIEDADE E INDEPENDNCIA DE TRATAMENTOS INDIVIDUAIS


A distribuio de diferentes tratamentos a diferentes unidades experimentais (animais, tubos, etc.) deve ser realizada estritamente por processos aleatrios. Qualquer outra escolha de condies experimentais, que no sejam contempladas no desenho experimental, deve igualmente ser aleatria. Exemplos disso so a escolha da posio das jaulas num laboratrio e a ordem de administrao dos tratamentos. Em particular, um grupo de animais que receba a mesma dose de qualquer preparao no deve ser tratado em conjunto (ao mesmo tempo ou na mesma posio), a no ser que exista uma forte evidncia que a fonte de variao relevante (por exemplo, entre tempos ou entre posies) seja negligencivel. A distribuio aleatria pode ser obtida a partir de computadores usando a funo aleatria pr-definida. O experimentador deve verificar que so produzidas sries de nmeros diferentes cada vez que a funo activada. As preparaes atribudas a cada unidade experimental devem ser to independentes quanto possvel. Dentro de cada grupo experimental, as diluies atribudas a cada tratamento no 543

5.3. Anlises estatsticas

devem ser apenas divises da mesma dose, mas preparadas individualmente. Sem esta precauo indispensvel, a variabilidade inerente preparao no estar completamente representada na varincia do erro experimental. O resultado ser uma subestimao do erro residual conduzindo a: 1) um aumento injustificado do rigor dos testes da anlise de varincia (ver seces 3.2.3 e 3.2.4), 2) uma subestimativa dos verdadeiros limites de confiana para o teste, que so calculados a partir da estimativa de s2 (mdia quadrtica do erro residual), tal como mostrado na seco 3.2.5.

dvida, pode ser feito um teste para desvio normalidade (p. ex. o teste de Shapiro-Wilk(1)), a condio 3 pode ser verificada com um teste de homogeneidade de varincias (p. ex. o teste de Bartlett(2) ou o teste de Cochran(3)). A inspeco das representaes grficas dos dados pode igualmente ser elucidativa deste objectivo (ver exemplos na seco 5). Quando as condies 2 e/ou 3 no forem satisfeitas, a transformao das respostas podem originar um melhor preenchimento daquelas condies. Exemplos so ln y, y ou y2: a transformao logartmica das respostas y em ln y pode ser til quando a homogeneidade das varincias no satisfatria. Pode igualmente melhorar a normalidade da distribuio quando ela est desvia para a direita, a transformao de y em y til quando as observaes seguem a distribuio de Poisson, isto , quando so obtidas por contagem, a transformao quadrtica de y em y2 til quando, por exemplo, mais provvel que a dose seja proporcional rea de uma zona de inibio do que medida do dimetro da zona. Para alguns ensaios dependentes de respostas quantitativas, tal como os imunoensaios ou ensaios in vitro em clulas, deve ser usado um grande nmero de doses. Estas doses do respostas que abarcam toda a latitude de respostas e produzem uma curva no linear prolongada da dose-resposta. Tais curvas so tpicas de todos os bioensaios, mas para muitos ensaios o uso de um largo nmero de doses no tico (por exemplo, ensaios in vivo) ou prtico, e os objectivos do ensaio podem ser atingidos com um nmero limitado de doses. , deste modo, habitual restringir as doses parte linear da curva dose-resposta obtida por uma transformao apropriada, de modo a que os mtodos descritos nas seces 3.2 ou 3.3 sejam aplicveis. Contudo, em alguns casos a anlise de toda a curva dose-resposta desejvel. Um esboo de um modelo aplicvel para tais anlises dado na seco 3.4 e um exemplo simplificado apresentado na seco 5.4. Uma categoria separada constituda pelos ensaios em que a resposta no pode ser mensurada em cada unidade experimental, mas em que apenas a fraco das unidades respondendo a cada tratamento podem ser contadas. Esta categoria abordada na seco 4. 3.1.2. ENSAIOS DE ROTINA Quando um ensaio de utilizao em rotina, normalmente possvel verificar sistematicamente o cumprimento das condies 1 a 3, porque o nmero limitado de observaes por ensaio pode influenciar a sensibilidade dos testes estatsticos. Felizmente, foi demonstrado que, em ensaios balanceados simetricamente, pequenos desvios homogeneidade da varincia e da normalidade no afectam seriamente os resultados do ensaio. A aplicabilidade do modelo estatstico deve ser questionada apenas quando uma srie de ensaios demonstrar uma validao duvidosa. Pode ento ser necessrio desenvolver uma srie de investigaes preliminares como discutido na seco 3.1.1.

3. ENSAIOS DEPENDENTES DE RESPOSTAS QUANTITATIVAS


5. Textos gerais

3.1. MODELOS ESTATSTICOS 3.1.1. PRINCPIOS GERAIS Os ensaios biolgicos includos na Farmacopeia foram concebidos como ensaios de diluio, o que significa que suposto que as amostras a serem ensaiadas tenham a mesma substncia activa que as preparaes padro, mas em propores diferentes de substncia activa e substncias inertes. Em tal caso, as amostras podem, em teoria, ser derivadas das preparaes padro por diluio com substncias inertes. Para verificar se um ensaio em especial pode ser considerado um ensaio de diluio, necessrio observar os efeitos da diluio dos padres na relao dose-resposta da substncia activa. Quando a diferena entre a relao dose-resposta das preparaes padro e da amostra num ensaio se desvia marcadamente do efeito da diluio da substncia activa na diluio terica do ensaio, este modelo no validado para este ensaio especfico. Diferenas significativas nas relaes dose-resposta do padro e da amostra podem sugerir que uma das preparaes contm, para alm da substncia activa, outras componentes que no so inertes mas que podem influenciar as respostas medidas. Para realizar o efeito da diluio no modelo terico aparente, til transformar a relao dose-resposta numa funo linear na maior latitude possvel de doses. Dois modelos estatsticos so de interesse para os ensaios biolgicos prescritos: o modelo de linhas paralelas e o modelo de relao de declives. A aplicao de qualquer um deles dependente do preenchimento das seguintes condies: 1) os diferentes tratamentos foram atribudos aleatoriamente s unidades experimentais, 2) as respostas de cada tratamento esto normalmente distribudas, 3) os desvios padres da resposta dentro de cada grupo tratado do padro e da amostra no diferem significativamente uns dos outros. Quando um ensaio desenvolvido, o analista deve determinar que os dados recolhidos em mltiplos ensaios obedecem s seguintes condies tericas: a condio 1 pode ser preenchida atravs de um uso eficiente da seco 2, a condio 2 um requisito que na prtica sempre cumprido. Desvios menores deste requisito geralmente no introduzem defeitos nas anlises, desde que as diferentes rplicas por tratamento sejam includas. Em caso de 544

(1) Wilk, M. B. e Shapiro, S. S. (1968). The joint assessment of normality of several independent samples, Technometrics, 10: 825-839. (2) Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests, Proc. Roy. Soc. London, Series A, 160: 280-282. (3) Cochran, W. G. (1951). Testing a linear regression amoung variances, Biometrics 7, 17-32.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

Duas outras condies necessrias condicionam do modelo estatstico a ser usado: para o modelo de linhas paralelas 4A. A relao entre o logaritmo da dose e a resposta pode ser representada por uma linha recta no intervalo das doses usadas, 5A. Para qualquer amostra no ensaio, a linha recta paralela obtida com o padro. para o modelo de relao de declives 4B. A relao entre a dose e a resposta pode ser representada por uma linha recta para cada preparao no ensaio acima do intervalo de doses utilizadas, 5B. Para cada amostra no ensaio, a linha recta intersecta o eixo y (na dose zero) no mesmo ponto que a linha recta da preparao padro (isto , as funes de resposta de todas as preparaes do ensaio devem ter o mesmo ponto de intercepo da resposta da funo padro). As condies 4A e 4B apenas podem ser verificadas em ensaios em que, pelo menos, 3 diluies de cada preparao foram testadas. O uso de um ensaio com apenas 1 ou 2 diluies pode ser justificado quando a experincia demonstrou que a linearidade e o paralelismo ou igual intercepo so regularmente realizadas. Depois de recolher os resultados de um ensaio, e antes de calcular a sua actividade relativa de cada amostra, deve ser feita uma anlise de varincia de modo a verificar se as condies 4A e 5A (ou 4B e 5B) so cumpridas. Para tal, o total da soma dos quadrados subdividido num certo nmero de somas de quadrados correspondentes a cada condio que foi realizada. O restante da soma dos quadrados representa o erro experimental residual para a qual a ausncia ou presena de causas relevantes de variao pode ser comparada pelas sries de rcios-F. Quando a validao est estabelecida, a actividade de cada amostra relativamente ao padro pode ser calculada e expressa como uma relao de actividade ou convertida numa qualquer unidade relevante para a amostra em teste, por exemplo em Unidades Internacionais. Os limites de confiana podem ser calculados para cada conjunto de dados do ensaio. Se alguma das cinco condies (1, 2, 3, 4A e 5A ou 1, 2, 3, 4B e 5B) no for preenchida, os mtodos de calculo aqui descritos no so vlidos e deve ser realizado um estudo especial do ensaio tcnico. O analista no deve usar mais nenhuma transformao a no ser que seja demonstrado que o incumprimento dos requisitos no acidental mas devido a uma modificao sistemtica das condies experimentais. Neste caso, os ensaios, tal como descrito na seco 3.1.1., devem ser repetidos antes de adoptar uma nova transformao nos ensaios de rotina. Um nmero excessivo de ensaios invlidos devido ausncia de paralelismo ou de linearidade, num ensaio de rotina realizado para comparar materiais similares, indica desenhos experimentais com replicao inadequada. Esta inadequao resulta normalmente do reconhecimento incompleto de todas as causas de variao que podem afectar o ensaio, o que pode originar na subavaliao do erro residual conducente a grandes rcios-F. Nem sempre possvel ter em ateno todas as causas possveis de variao num nico ensaio (por exemplo, variao diria). Nestes casos, os limites de confiana de ensaios repetidos da mesma amostra podem no se sobrepor FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

satisfatoriamente, e deve ter-se cuidado na interpretao dos limites de confiana individuais.. De modo a obter uma avaliao mais correcta do limite de confiana pode ser necessrio realizar vrios ensaios independentes e combin-los numa nica actividade estimada e num nico intervalo de confiana (ver seco 6). Com o objectivo fazer o controlo de qualidade de ensaios de rotina recomendado manter o registo das previses do declive da regresso e da previso do erro residual nos mapas de controlo. Um erro residual excepcionalmente elevado pode indicar um problema tcnico. Este facto deve ser investigado e, se for demonstrado que algo correu mal durante o processo, o ensaio deve ser repetido. Um erro residual invulgarmente elevado pode igualmente indicar a presena de uma resposta fora de contexto (outlying) ou de uma observao aberrante. Uma resposta questionvel devido falha de cumprimento do procedimento durante um ensaio rejeitada. Se for descoberto um valor aberrante aps o registo das respostas, mas puder ser relacionado com irregularidades do ensaio, pode ser justificada a sua omisso. A rejeio ou reteno arbitrria de uma resposta aparentemente aberrante pode ser uma forte causa de interferncia. Em geral, desencoraja-se a rejeio de observaes apenas devido significncia de um teste de contexto. Um erro residual excepcionalmente baixo pode verificar-se esporadicamente e d origem a rcios-F que excedem os valores crticos. Em tal caso, pode justificar-se a substituio do erro residual estimado a partir do ensaio individual pelo erro residual mdio baseado nos dados histricos registados nos mapas de controlo. 3.1.3. CLCULOS E RESTRIES De acordo com os princpios gerais de um bom desenho experimental as seguintes 3 restries so normalmente impostas no desenho dos ensaios. Elas tm vantagens quer na facilidade de clculo quer na preciso. a) Cada preparao no ensaio deve ser testada com o mesmo nmero de diluies. b) No modelo de linhas paralelas, o rcio de doses adjacentes deve ser constante para todos os tratamentos do ensaio; no modelo de relao de declives, o intervalo entre doses adjacentes deve ser constante para todos os tratamentos do ensaio. c) Deve existir um nmero igual de unidades experimentais em cada tratamento. Se for usado um desenho experimental que satisfaa estas condies os clculos so simples. As frmulas so apresentadas nas seces 3.2 e 3.3. recomendado o uso de programas informticos (software) que tenha sido desenvolvido expressamente para este objectivo. Existem vrios programas que podem facilmente ser utilizados para todos os desenhos experimentais descritos nas monografias. Nem todos os programas usam as mesmas frmulas e algoritmos, mas todos eles devem chegar aos mesmos resultados. Desenhos experimentais que no cumpram as restries acima mencionadas podem ser realizveis e correctos, mas as frmulas necessrias so demasiado complicadas para serem descritas neste texto. Uma breve descrio dos mtodos de clculo apresentada na seco 7.1. Estes mtodos podem igualmente ser usados em desenhos restringidos, mas nesse caso eles so equivalentes com as frmulas simples. As frmulas para os desenhos restringidos apresentadas neste 545

5. Textos gerais

5.3. Anlises estatsticas

texto podem ser usadas, por exemplo, para criar programas especficos numa folha de clculo. Os exemplos na seco 5 podem ser usados para clarificar o especialista e para verificar se um dado programa fornece os resultados correctos. 3.2. MODELO DE LINHAS PARALELAS 3.2.1. INTRODUO O modelo de linhas paralelas ilustrado na figura 3.2.1.-I. O logaritmo das doses est representado no eixo horizontal com a menor concentrao esquerda a com a maior direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As respostas individuais de cada tratamento esto indicadas com pontos negros. As 2 linhas representam as relaes ln(dose)-resposta do padro e da amostra.
5. Textos gerais

sobrestimada, e os clculos indicam uma actividade estimada menor do que a actividade assumida. Igualmente, se a linha da amostra est situada esquerda da do padro, a actividade assumida foi subestimada, e os clculos indicam uma actividade estimada superior actividade assumida. 3.2.2. DESENHO EXPERIMENTAL As seguintes condies so teis na optimizao da preciso do desenho experimental: 1) o rcio entre o declive e o erro residual deve ser o maior possvel, 2) a amplitude das doses deve ser a maior possvel, 3) as linhas devem estar to prximas quanto possvel, isto , a actividade assumida deve ser um bom clculo da verdadeira actividade. A alocao de unidades experimentais (animais, tubos, etc.) a diferentes tratamentos pode ser feita de vrias maneiras.

Padro Amostra Resposta (V)

3.2.2.1. Desenho completamente aleatrio Se a totalidade das unidades experimentais parecer ser razoavelmente homognea sem indicao de que a variabilidade da resposta menor dentro de certos subgrupos reconhecidos, a distribuio das unidades a diferentes tratamentos deve ser efectuada aleatoriamente. Se unidades dentro de subgrupos, tais como posies fsicas ou dias de experimentao, tiverem tendncias a serem mais homogneos do que a totalidade das unidades, a preciso do ensaio pode ser aumentada atravs da introduo de uma ou mais restries no desenho. Uma escolha cuidadosa do balano sobre estas restries permite a eliminao de fontes de variao irrelevantes. 3.2.2.2. Desenho de bloco aleatrio

In dose (x)
FIGURA 3.2.1.-I Modelo de linhas paralelas para um ensaio 3 + 3.

Nota: o logaritmo natural (ln ou loge) usado extensivamente neste texto. O termo antilogaritmo usado para designar ex. No entanto, igualmente possvel utilizar os logaritmos decimais ou de Briggs (log ou log10); neste caso, o antilogaritmo correspondente 10x. Para a existncia de um ensaio satisfatrio a actividade assumida das amostras do teste deve ser prxima da actividade real. Com base nesta actividade assumida e na actividade atribuda do padro, so preparadas diluies equivalentes (se possvel), isto , doses correspondentes do padro e da amostra devem dar a mesma resposta. Se no existir informao sobre a actividade assumida, devem ser realizados ensaios preliminares num grande amplitude de doses para determinar a amplitude onde a curva linear. Quanto mais prximo da actividade assumida correcta da amostra, mais prximas estaro as 2 linhas, uma vez que devem existir respostas iguais para doses iguais. A distncia horizontal entre as linhas representa a verdadeira actividade da amostra, relativamente sua actividade assumida. Quanto maior a distncia entre as 2 linhas, pior a actividade assumida da amostra. Se a linha da amostra est situada direita da do padro, a actividade assumida foi 546

Neste desenho possvel segregar uma fonte de variao identificvel, tal como a variao sensvel entre ninhadas de animais de experimentao ou a variao entre caixas de Petri nos ensaios de difuso microbiolgica. O desenho requer que cada tratamento seja aplicado em igual nmero de vezes em cada bloco (ninhada ou caixa de Petri) e s adequado quando o bloco for suficientemente grande para acomodar todos os tratamentos. Isto est ilustrado na seco 5.1.3. igualmente possvel usar um desenho aleatrio com replicao. Os tratamentos devem atribudos aleatoriamente a cada bloco. Na seco 8.5 apresentado um algoritmo para obter permutaes aleatrias. 3.2.2.3. Desenho do quadrado latino Este desenho apropriado quando a resposta pode ser afectada por duas fontes de variao diferentes, cada uma das quais assume k diferentes nveis ou posies. Por exemplo, num ensaio de um antibitico em placa os tratamentos podem ser arranjados numa ordenao de k k numa placa grande, cada tratamento ocorrendo uma vez em cada linha de cada coluna. O desenho apropriado quando o nmero de linhas, o nmero de colunas e o nmero de tratamentos for igual. As respostas so registadas num quadrado de formato conhecido por quadrado latino. As variaes devidas s diferenas nas respostas entre as k linhas e entre as k colunas podem ser segregadas, deste modo reduzindo o erro. Na seco 5.1.2 apresenta-se um exemplo de desenho de quadrado latino, e na seco 8.6 fornecido um algoritmo para obter quadrados latinos. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

3.2.2.4. Desenho de permutao Este desenho til quando a experincia pode ser subdividida em blocos mas possvel aplicar apenas dois tratamentos a cada bloco, por exemplo um bloco pode ser uma unidade singular que pode ser testada em duas ocasies. O desenho pretende incrementar a preciso eliminando os efeitos das diferenas entre unidades ao mesmo tempo que balana o efeito de qualquer diferena entre nveis gerais de resposta nas duas etapas do teste. Se forem testadas duas doses de um padro e de uma amostra designado como um teste de permutao duplo. A experincia dividida em duas partes separadas por um intervalo de tempo apropriado. As unidades so divididas em quatro grupos e cada grupo recebe um dos quatro tratamentos na primeira parte do teste. As unidades que receberam uma preparao na primeira parte do teste recebem a outra preparao na segunda parte, e unidades recebendo pequenas doses numa parte do teste recebem as grandes doses na outra. O arranjo das doses mostrado na tabela 3.2.2.-I. Na seco 5.1.5 pode ser encontrado um exemplo.
TABELA 3.2.2.-I Ordenao das doses num ensaio cruzado Grupo de unidades 1 2 3 4 Tempo I S1 S2 T1 T2 Tempo II T2 T1 S2 S1

Para alm de alguns ajustamentos ao termo de erro, a anlise bsica dos dados resultantes de um ensaio a mesma para os desenhos completamente aleatrio, de bloco aleatrio e de quadrado latino. As frmulas de testes de bloco aleatrio no se adaptam completamente a este esquema, pelo que so incorporadas no Exemplo 5.5.5. Tendo considerado os pontos discutidos na seco 3.1. e transformado as respostas, se necessrio, devem ser calculadas as mdias dos valores em cada tratamento e em cada preparao, como mostrado nas tabelas 3.2.3.-I. Os contrastes lineares, que relacionam os declives das rectas de ln(dose)-resposta, devem igualmente ser formados. Na tabela 3.2.3.-II so apresentadas 3 frmulas adicionais, necessrias para a construo da anlise de varincia. A variao total na resposta causada por diferentes tratamentos agora dividida, como mostrado na tabela 3.2.3.-III., sendo as somas dos quadrados derivadas dos valores obtidos nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II. A soma dos quadrados devidos ausncia de linearidade apenas pode ser calculada se pelo menos 3 doses por preparao forem includas no ensaio. O erro residual do ensaio obtm-se pela subtraco das variaes permitidas no desenho variao total da resposta (tabela 3.2.3.-IV). Nesta tabela representa a mdia de todas as respostas registadas no ensaio. Deve ter-se em ateno que para um quadrado latino, o nmero de respostas replicadas (n) igual ao nmero de linhas, colunas ou tratamentos (dh). A anlise de varincia agora completada do seguinte modo. Cada soma de quadrados dividida pelo nmero de graus de liberdade correspondentes para dar origem s mdias quadrticas. A mdia quadrtica para cada varivel em teste expressa como o rcio do erro residual (s2) e a significncia destes valores (conhecidos como rcios-F) so verificadas pelo uso da tabela 8.1 ou uma subrotina apropriada de um programa informtico. 3.2.4. TESTES DE VALIDAO Os resultados dos ensaios so considerados estatisticamente vlidos se o resultado desses testes for o seguinte. 1) O termo da regresso linear significativo, isto , a probabilidade calculada inferior a 0,05. Se este critrio

3.2.3. ANLISE DE VARINCIA Esta seco fornece as frmulas requeridas para desenvolver a anlise de varincia e ser mais facilmente percebida referenciando com os exemplos prticos da seco 5.1. Igualmente deve ser consultado o glossrio de smbolos (seco 9). As frmulas so indicadas para ensaios simtricos onde uma ou mais amostras (T, U, etc.) so comparadas com o padro (P). Deve ser realado que as frmulas apenas podem ser usadas se as doses forem igualmente espaadas, se forem aplicados nmeros iguais de tratamentos por amostra e a cada tratamento aplicado um nmero igual de vezes. No se devem usar estas frmulas em quaisquer outras circunstncias.

TABELA 3.2.3.-I Frmulas para os ensaios de linhas paralelas com d doses de cada preparao
Padro (S) Resposta mdia dose mais baixa Resposta mdia 2 dose ... Resposta mdia dose mais elevada Total da amostra Contraste linear PS LS dSd S1 1S1 S1 S2 ... Sd S2 ... Sd PT LT dTd T1 1T1 1 amostra (T) T1 T2 ... Td T2 ... Td PU LU 2 amostra (U, etc.) U1 U2 ... Ud ... etc. ... etc.

2S2 ... 1 (d 1)PS 2

2T2 ... 1 (d 1)PT 2

TABELA 3.2.3.-II Frmulas complementares para a construo da anlise de varincia


HP n d HL 12n d3 d K n(PS PT hd ...)2

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

547

5. Textos gerais

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 3.2.3.-III Frmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade
Origem da variao Amostras Regresso linear No paralelismo Nolinearidade (*) Tratamentos
(*)

Graus de liberdade (f) h 1 h h (d hd 1 2) 1 1 SSprep SSreg SSpar SSlin SStreat

Soma dos quadrados


2 2 HP (P S P T

...) LT ...)

K ...)2 SSreg SSreg


2 T1

1 H (L h L S
HL (L SStreat
2 n(S 1

SSprep ...
2 Sd

SSpar ...
2 Td

...)

No calculado para as titulaes de 2 doses.

TABELA 3.2.3.-IV Clculo do erro residual


Origem da variao blocos (linhas) (*) colunas (**) Graus de liberdade n n 1 1 1) 1) 1) SSblock SScol SSres SSres SSres SStot Soma dos quadrados
2 hd (R 1 2 hd (C 1

5. Textos gerais

... ...

2 Rn ) 2 Cn )

K K

erro residual (***)

total aleatrio blocos completos quadrado latino

hd (n (hd (hd 1) (n 2) (n nhd

SStot SStot SStot (y

SStreat SStreat SStreat y )2 SSblock SSblock SScol

total
(*) (*) (**) (***)

No calculado para os ensaios totalmente aleatrios. S calculado para os quadrados latinos. Depende do tipo de ensaio utilizado.

no for satisfeito, no possvel calcular os limites de confiana para 95 por cento, 2) o termo de no-paralelismo no significativo, isto , a probabilidade calculada no inferior a 0,05. Isto indica que a condio 5A, da seco 3.1 satisfeita, 3) o termo de no-linearidade no significativo, isto , a probabilidade calculada no inferior a 0,05. Isto indica que a condio 4A, da seco 3.1 satisfeita. Um desvio significativo ao paralelismo num ensaio mltiplo pode ser devido incluso no ensaio de uma amostra que d uma recta ln(dose)-resposta com um declive diferente do das outras preparaes. Em vez de declarar a invalidao do ensaio, pode ser decidido eliminar todos os dados relacionados com aquela preparao e recomear a anlise do princpio. Quando a validao estatstica estabelecida, podem ser calculadas as actividades e os limites de confiana pelos mtodos descritos na seco seguinte. 3.2.5. CLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE CONFIANA Sendo I o ln do rcio entre doses adjacentes de uma preparao, o declive comum (b) de ensaios com d doses de cada preparao obtm-se a partir de:
b HL (LS LT Inh ...) (3.2.5.-1) onde C

M T

PT db

PS

(3.2.5.-2)

A actividade calculada uma estimativa da verdadeira actividade de cada desconhecido. Os limites de confiana podem ser calculados como os antilogaritmos de:
CM T (C 1) (CM 2 T 2V) SSreg b2dn (3.2.5.-3)

SSreg eV SSreg s2t2

O valor de t pode ser obtido na tabela 8.2 para p = 0,05 e com os graus de liberdade iguais ao nmero de graus de liberdade do erro residual. A actividade estimada (RT) e os limites de confiana associados obtm-se multiplicando os valores obtidos por AT depois da obteno dos antilogaritmos. Se as solues de armazenamento no so exactamente equivalentes, com base nas actividades atribudas e assumidas, necessrio introduzir um factor de correco (ver Exemplos 5.1.2 e 5.1.3). 3.2.6. VALORES EM FALTA Num ensaio balanceado, um acidente totalmente desligado dos tratamentos aplicados pode conduzir perda de uma ou mais respostas, por exemplo devido morte de um animal. Se se considerar que o acidente no est ligado composio da preparao administrada, os clculos exactos podem ser realizados mas as frmulas so mais complicadas e podem apenas ser dadas dentro do contexto dos modelos FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

e o logaritmo da relao de actividade de uma amostra, por exemplo T, : 548

5.3. Anlises estatsticas

lineares gerais (ver seco 7.1). Contudo, existe um mtodo aproximado que mantm a simplicidade do desenho balanceado substituindo a resposta em falta por um valor calculado. A perda de informao tomada em considerao diminuindo os graus de liberdade do total da soma dos quadrados e para o erro residual pelo nmero de valores em falta e usando uma das frmulas a seguir fornecidas para o valor em falta. Deve ter-se em ateno que este mtodo apenas aproximativo, e que o uso de um mtodo exacto preferencial. Se mais do que uma observao estiver em falta pode usar-se a mesma frmula. O procedimento consiste em fazer uma estimativa aproximada de todos os valores em falta, excepto de um, e usar a frmula apropriada para esse valor e usar todos os restantes valores incluindo os estimados por aproximao. Preencha o valor calculado. Continue de modo semelhante calculando o valor da primeira estimativa grosseira. Depois de calcular todos os valores em falta deste modo, todo o ciclo deve ser repetido desde o princpio, e em cada clculo utilize o valor mais recente, calculado ou estimado, para cada resposta qual a frmula tenha sido aplicada. Este procedimento deve ser repetido at que 2 ciclos consecutivos dem os mesmos valores; a convergncia normalmente rpida. Considerando que o nmero de valores substitudos pequeno relativamente ao nmero total de observaes na experincia completa (digamos, inferior a 5 por cento), a aproximao implcita nesta substituio e reduo dos graus de liberdade pelo nmero de valores em falta substitudos deste modo normalmente satisfatria. Contudo, a anlise deve ser interpretada com grande cuidado, especialmente se existir uma preponderncia de valores em falta num tratamento ou bloco; se forem encontrados aspectos invulgares deve consultar-se um especialista. A substituio de valores em falta num teste sem rplicas uma operao particularmente delicada. Desenho completamente aleatrio Num ensaio completamente aleatrio o valor em falta pode ser substitudo pela mdia aritmtica das outras respostas do mesmo tratamento. Desenho de bloco aleatrio O valor em falta obtm-se aplicando a equao:
y nB kT (n 1) (k G 1) (3.2.6.-1)

3.3. MODELO DE RELAO DE DECLIVES 3.3.1. INTRODUO Este modelo adequado, por exemplo, para alguns ensaios microbiolgicos quando a varivel independente a concentrao de um factor de crescimento essencial inferior concentrao ptima do meio. O modelo de relao de declives ilustrado na figura 3.3.1.-I.

Padro

Resposta (V)

dose (x)
FIGURA 3.3.1.-I Modelo de relao de declives para um ensaio 2 3 1

As doses esto representadas no eixo horizontal com a concentrao zero esquerda e a maior concentrao direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As respostas individuais de cada tratamento esto indicadas com pontos negros. As 2 linhas so as relaes dose-resposta calculadas para o padro e para a amostra, na condio que se interceptam na dose zero. Ao contrrio do modelo de linhas paralelas, as doses no so transformadas logaritmicamente. Tal como no caso de um ensaio baseado no modelo de linhas paralelas, importante que a actividade assumida esteja prxima da actividade real, e preparar diluies equivalentes das amostras e do padro (se possvel). Quanto mais correcta for a actividade assumida mais juntas estaro as 2 linhas. O rcio dos declives representa a verdadeira actividade da amostra relativamente actividade assumida. Se o declive da amostra for mais ngreme que o do padro, a actividade foi subestimada e os clculos indicam uma actividade estimada maior que a actividade assumida. De igual modo, se o declive da amostra for menos ngreme que o do padro, a actividade foi sobrestimada e os clculos indicam uma actividade estimada inferior actividade assumida. Na preparao de uma experincia, todas as respostas devem ser examinadas quanto ao cumprimento das condies 1, 2 e 3 da seco 3.1. A anlise de varincia a realizar em ensaios de rotina descrita na seco 3.3.3 de modo a que o cumprimento das condies 4B e 5B da seco 3.1 possa ser examinado. 3.3.2. DESENHO DO ENSAIO A utilizao da anlise estatstica apresentada a seguir impe as seguintes restries ao ensaio: 549

em que B a soma das respostas do bloco contendo o valor em falta, T o total do tratamento correspondente e G a soma de todas as respostas registadas no ensaio. Desenho do quadrado latino O valor em falta obtm-se de:
y k(B C T) 2G (k 1) (k 2) (3.2.6.-2)

onde B e C so as somas das respostas na linha e coluna contendo o valor em falta. Neste caso k = n. Desenho de permutao Se ocorrer um acidente conduzindo perda de valores num desenho de permutao, deve ser consultado um livro de estatstica (por exemplo, D. J. Finney, ver seco 10), pois a aplicao das frmulas apropriadas depende das combinaes de tratamentos efectuados. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

Amostra

5.3. Anlises estatsticas

a) o padro e as amostras devem ser testadas com o mesmo nmero de diluies igualmente espaadas, b) um grupo extra de unidades experimentais que no esteja sujeito ao tratamento deve ser testado (os brancos), c) deve existir um nmero igual de unidades experimentais em cada tratamento. Tal como j foi referido na seco 3.1.3, os desenhos experimentais que no cumpram estas restries podem ser possveis e correctos, mas as anlises estatsticas simples aqui apresentadas no so aplicveis e deve ser obtido aconselhamento especializado ou ser utilizada programao apropriada. O desenho com 2 doses por preparao e 1 branco, o desenho (2h+1) com zero comum prefervel, uma vez que permite a maior preciso combinada com a possibilidade de verificar a validao dentro das restries atrs mencionadas. No entanto, nem sempre pode ser assumida como vlida uma relao linear abaixo da dose zero. Com uma ligeira perda de preciso um desenho sem brancos pode ser usado. Neste caso, 3 doses por preparao, o desenho (3h) com zero comum, prefervel a 2 doses por preparao. As doses devem ser como se segue: 1) o padro dado numa dose alta, perto mas no excedendo a mais alta dose com uma resposta mdia na parte rectilnea da curva dose-resposta, 2) as outras doses devem estar uniformemente distribudas entre a dose mais alta e a dose zero, 3) as amostras devem ser dadas em doses correspondentes baseadas na actividade assumida do material. Um desenho completamente aleatrio, de blocos aleatrios ou de quadrado latino pode ser usado, tal como descrito na seco 3.2.2. O uso de qualquer um dos desenhos necessita de ajustamentos ao erro da soma dos quadrados tal como descrito para os ensaios baseados no modelo de linhas
5. Textos gerais

paralelas. A anlise de um ensaio de uma ou mais amostras contra um padro descrita a seguir. 3.3.3. ANLISE DE VARINCIA 3.3.3.1. O desenho (hd 1)

As respostas so verificadas tal como descrito na seco 3.1 e, se necessrio, transformadas. ento calculada a mdia das respostas para cada tratamento e cada preparao como mostrado na tabela 3.3.3.1.-I. Adicionalmente calcula-se a resposta mdia dos brancos (B). A soma dos quadrados nas anlises de varincia so calculadas como se mostra nas tabelas 3.3.3.1.-I at 3.3.3.1.-III. A soma dos quadrados devidos no linearidade pode apenas ser calculada se, pelo menos 3 doses de cada preparao tiverem sido includas no ensaio. O erro residual obtido subtraindo as variaes permitidas no desenho variao total da resposta (tabela 3.3.3.1.-IV). A anlise de varincia completada como se segue. Cada soma de quadrados divido pelo correspondente nmero de graus de liberdade para obter mdias quadrticas. A mdia quadrtica de cada varivel a ser testada expressa como o rcio do erro residual (s2) e a significncia destes valores (rcios-F) avaliada atravs da tabela 8.1 ou de uma subrotina adequada de um programa informtico. 3.3.3.2. O desenho (hd) As frmulas so basicamente as mesmas do desenho (hd + 1), mas existem algumas pequenas diferenas. B retirado de todas as frmulas. k n(PS PT hd ...)2

SSblank removido da anlise de varincia.

TABELA 3.3.3.1.-I Frmulas para os ensaios de relao de declive com d doses de cada preparao e 1 branco
Padro (S) Resposta mdia menor dose Resposta mdia 2 dose ... Resposta mdia maior dose Total da amostra Produto linear Ordenada na origem Declive Tratamentos No linearidade (*) JS PS LS aS bS GS GS S1 1S1 (4d 2LS
2 S1 2 PS

1 amostra a analisar (T) T1 T2 ... Td

2 amostra a analisar (U, etc.) U1 U2 ... Ud

S1 S2 ... Sd S2 2S2 2)PS (d ... ... ... Sd dSd 6LS 1)PS


2 Sd 2 3b S 3 dS d

PT LT aT bT GT JR

T1 1T1 (4d 2LT T2 1

T2 2T2

... ...

Td dTd 6LT

Pu Lu au bu Gu Ju

... ... ... ... ... ...

2) PT (d ...

1) PT T2 d
3 3dT 3 d d

GT

2 PT

(*)

No calculado para as titulaes de 2 doses.

550

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 3.3.3.1.-II Frmulas complementares para a construo da anlise de varincia


nhd2 hd nhd 4d n 2d2 a 2d aS aT ... h(d2 d) n(B PS hd PT 1 ...)2

HB

hd2

HI

4d3

TABELA 3.3.3.1-III Frmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade
Origem da variao Regresso Brancos interseco ausncia de linearidade Tratamentos
(*)

Graus de liberdade (f) n n h


(*)

Soma dos quadrados SSreg SSblanck SSint SSlin SStreat SStreat HB (B


2 HI ((aS

1 1 1 2)

SSblanck a)2
2 aT

SSint

SSlin

...)

h (d2

d)2 a2

h (d hd

(JS

JT

...) GS GT ...) K 5. Textos gerais K K SScol

n(B2

No calculado para as titulaes de 2 doses.

TABELA 3.3.3.1.-IV Clculo do erro residual


Origem da variao blocos (linhas) (*) colunas (**) Graus de liberdade n n 1 1 1) 1) 1) 1 SSblock SScol SSres SSres SSres SStot Soma dos quadrados
2 hd (R 1 2 hd (C 1

... ...

2 Rn ) 2 Cn )

erro residual (***)

total aleatrio blocos completos quadrado latino

(hd

1) (n

SStot SStot SStot (y

SStreat SStreat SStreat y )2 SSblock SSblock

hd (n (hd nhd 1) (n n

total
(*) (*) (**)

No calculado para os ensaios totalmente aleatrios. S calculado para os quadrados latinos. (***) Depende do tipo de ensaio utilizado.

O nmero de graus de liberdade para os tratamentos torna-se hd 1. O nmero de graus de liberdade do erro residual e da varincia total calculado como descrito para o modelo de linhas paralelas (ver tabela 3.2.3.-IV). As validaes do ensaio, da actividade e dos intervalos de confiana so descritas nas seces 3.3.4. e 3.3.5. 3.3.4. TESTES DE VALIDAO Os resultados dos ensaios so considerados estatisticamente vlidos se o resultado das anlises de varincia forem os seguintes: 1) a variao devida aos brancos nos desenhos (hd+1) no significativa, isto , a probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto indica que as respostas dos brancos no diferem significativamente da intercepo comum e a relao linear vlida abaixo da dose zero, 2) a variao devida intercepo no significativa, isto , a probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto indica que a condio 5B, seco 3.1 satisfeita,

3) em ensaios incluindo pelo menos 3 doses por preparao, a variao devida no-linearidade no significativa, isto , a probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto indica que a condio 4B, seco 3.1 satisfeita. A variao significativa devida aos brancos indica que a hiptese da linearidade no vlida perto da dose zero. Se isto for sistemtico e no acidental para o tipo de ensaio, o desenho hd mais apropriado. Qualquer resposta dos brancos deve ser rejeitada. Quando estes testes indicam que o ensaio vlido, a actividade calculada com os seus limites de confiana tal como descrito na seco 3.3.5. 3.3.5. CLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE CONFIANA 3.3.5.1. O desenho (hd+1) A intercepo comum a das preparaes pode ser calculada a partir de:
a (2d 1) B (2d 3)ha h(2d 3) 2d 1 (3.3.5.1.-1)

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

551

5.3. Anlises estatsticas

O declive do padro, e de modo idntico para cada uma das preparaes, calculado a partir de:
b S 6LS 3d(d 1)a 2d3 3d2 d (3.3.5.1.-2)

A relao de actividade de cada amostra pode agora ser calculada a partir de:
R T bT bS (3.3.5.1.-3)

que deve multiplicado por AT, a actividade assumida da amostra, de modo a determinar a actividade estimada RT. Se o intervalo entre doses adjacentes no for idntico para o padro e amostra, a actividade deve ser multiplicada por IS /IT. Note que, ao contrrio da anlise de linhas paralelas, no so calculados os antilogaritmos.
5. Textos gerais

Resposta (V)

Padro

Amostra

O intervalo de confiana para RT calculado a partir de:


CR T K (C
2 1) (CRT

1)

K (K

2CRT)

(3.3.5.1.-4)

In dose (x)
FIGURA 3.4.-I Modelo de curva logstica de 4 parmetros

onde C =

2 bS

2 bS e K s2t2V1

(C

1)V2

V1 e V2 esto relacionados com a varincia e covarincia do numerador e denominador de RT . Eles podem ser calculados a partir de:
V1 6 1 n(2d 1) d(d 1) 3 2(2d 1) hd (d 1) (3.3.5.1.-5)

A forma geral das curvas pode usualmente ser descrita pela funo logstica, mas outras formas so igualmente possveis. Cada curva pode ser caracterizada por 4 parmetros: a assmptota superior (), a assmptota inferior (), o factor de declive () e a locao horizontal (). Este modelo assim habitualmente referido como o modelo dos 4 parmetros. A representao matemtica da curva ln(dose)-resposta :
u 1 e
(x )

V2

(3d

3d(d 1) 1) (d 2) hd(d

1)

(3.3.5.1.-6)

Os limites de confiana so multiplicados por AT, e se necessrio por IS/IT. 3.3.5.2. O desenho (hd) As formulas so as mesmas do que no desenho (hd+1), com as seguintes modificaes:
a V1 6 nd(2d 1 1) d 3(d 1) 1 1) h(d h(d a 3 1) (3.3.5.2.-1) (3.3.5.2.-2)

Para um ensaio vlido necessrio que as curvas do padro e das amostras tenham o mesmo factor de declive, e o mesmo nvel de respostas mximas e mnimas nos extremos. Apenas a locao horizontal () das curvas pode ser diferente. A distncia horizontal entre as curvas est relacionada com a actividade verdadeira da amostra. Se o ensaio usado em rotina, pode ser suficiente testar as condies de igualdade de resposta dos nveis superior e inferior quando o ensaio desenvolvido e ento voltar a testar esta condio directamente apenas em intervalos apropriados ou quando existirem alteraes dos materiais ou das condies de ensaio. Os clculos de semelhanas mximas dos parmetros e dos seus intervalos de confiana podem ser obtidos atravs de programas informticos apropriados. Estes programas informticos podem incluir alguns testes de validao. Por exemplo, se os clculos de semelhanas mximas mostrarem desvios significativos aos modelos ajustados nas condies assumidas de igualdade superior e inferir das assmptotas e declives, ento uma ou todas as condies podem no estar satisfeitas. O modelo logstico levanta um nmero de problemas estatsticos que podem requerer solues diferentes para diferentes tipos de ensaios, e no possvel fazer um resumo simples. Uma grande variedade de aproximaes descrita na literatura relevante. Para este tipo de anlises recomendado aconselhamento profissional. De qualquer maneira, includo um exemplo simples na seco 5.4 de modo a ilustrar uma via possvel para analisar os dados apresentados. Na seco 7.5 apresentada uma pequena FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

V2

3(d

1)

(3.3.5.2.-3)

3.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS Este modelo aconselhado, por exemplo, para alguns imunoensaios quando a anlise requerida para curvas dose-resposta sigmoides prolongadas. Este modelo ilustrado na figura 3.4.-I. Os logaritmos das doses esto representados no eixo horizontal com a menor concentrao esquerda e a maior direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As respostas individuais de cada tratamento esto indicadas com pontos negros. As 2 curvas so as relaes ln(dose)-resposta calculadas para o padro e amostras. 552

5.3. Anlises estatsticas

discusso de mtodos alternativos juntamente com outras consideraes estatsticas. Se no for possvel nem o aconselhamento profissional nem o recurso a programas apropriados, possvel o uso de mtodos alternativos: 1) se existirem estimativas razoveis dos limites superior () e inferior (), seleccionar para todas as amostras as doses com mdias de respostas (u) compreendidas entre 20 por cento e 80 por cento dos limites, transforme as respostas das doses seleccionadas para e use o modelo de linhas paralelas (seco 3.2) para a anlise; 2) seleccione a amplitude de doses para as quais as respostas (u) ou as respostas apropriadamente transformadas, por exemplo ln(u), sejam aproximadamente lineares quando graficadas contra o ln(dose); o modelo de linhas paralelas (seco 3.2) podem ento ser usado para a anlise.

1) a relao entre o logaritmo da dose e a resposta pode ser representada pela curva da distribuio normal cumulativa, 2) as curvas do padro e da amostra so paralelas, isto , tm forma idntica e apenas podem diferir pela sua localizao horizontal, 3) em teoria, no existe uma resposta natural a doses extremamente baixas nem uma ausncia de resposta a doses extremamente altas. 4.2. MTODO DA PROBABILIDADE ITERATIVA (4) A curva sigmoide pode ser linearizada substituindo cada resposta, isto , a fraco de resposta positiva do grupo, pelo valor correspondente da distribuio normal padronizada cumulativa. Este valor, muitas vezes referido como normit, distribui-se teoricamente entre e . No passado, foi proposto acrescentar 5 a cada normit para obter o probit. Este facto facilita os clculos manuais porque os valores negativos so evitados. Com a chegada dos computadores, a necessidade de adicionar 5 aos normits desapareceu. O termo mtodo normit mais adequado para o mtodo descrito a seguir. No entanto, e uma vez que a designao anlise probit est to divulgada, neste texto ir-se- manter aquela designao. Uma vez linearizadas as respostas possvel aplicar a anlise de linhas paralelas, como descrito na seco 3.2. Infelizmente, a condio de validao da homogeneidade da varincia para cada dose no cumprida. A varincia mnima para o normit = 0 e aumenta para valores positivos e negativos do normit. , por isso, necessrio dar maior peso resposta na parte mdia da curva, e menor peso nas zonas extremas da curva. Este mtodo, a anlise de varincia, e a estimativa da actividade e dos intervalos de confiana descrito a seguir. 4.2.1. TABULAO DE RESULTADOS A tabela 4.2.1.-I utilizada para introduzir os dados nas colunas indicadas por nmeros: (1) a dose do padro ou da amostra, (2) o nmero de n unidades submetidas a tratamento, (3) o nmero de unidades r com resposta positiva ao tratamento, (4) o logaritmo x da dose, (5) a fraco p = r/n das respostas positivas do grupo. O primeiro ciclo comea aqui. (6) a coluna Y preenchida com zeros na primeira iteraco, (7) o valor = (Y) da funo da distribuio normal padronizada cumulativa (ver igualmente a tabela 8.4). As colunas (8) a (10) so calculadas usando as seguintes equaes: (8) (9)
Z e
y2/2

4.1. INTRODUO Em certos ensaios impossvel, ou excessivamente trabalhoso, medir o efeito de cada unidade experimental numa escala quantitativa. Em alternativa, um efeito tal como a morte ou sintomas de hipoglicmia podem ser observados quer ocorrendo ou no em cada unidade, e o resultado depende do nmero de unidades em que ocorreu. Tais ensaios so designados qualitativos ou tudo-ou-nada. A situao muito semelhante descrita para os ensaios quantitativos na seco 3.1, mas em vez de n repostas separadas para cada tratamento um nico valor registado, isto , a percentagem de unidades em cada grupo de tratamento mostrando um efeito positivo. Quando estas percentagens so graficadas em funo do logaritmo das doses a curva resultante tende a ser sigmoide (forma de S) em vez de ser linear. O clculo da curva dose-resposta feito atravs de uma funo matemtica que representa esta curvatura sigmoide. A funo mais utilizada a funo da distribuio normal cumulativa. Esta funo tem algum mrito terico, e talvez a melhor escolha quando a resposta um reflexo da tolerncia das unidades. Se a resposta mais provavelmente depende de um processo de crescimento, o modelo de distribuio logstica prefervel, embora o resultado da diferena entre os 2 modelos seja muito pequeno. As estimativas das semelhanas mximas do declive e localizao das curvas apenas podem ser encontradas aplicando um procedimento iterativo. H muitos procedimentos que conduzem aos mesmos resultados, mas eles diferem em eficcia devido velocidade de convergncia. Um dos mtodos mais rpidos consiste na optimizao directa da funo das semelhanas mximas (ver seco 7.1), que pode ser facilmente realizado com programas informticos que tenham uma subrotina interna para este objectivo. Infelizmente, a maior parte destes procedimentos no fazem a estimativa dos limites de confiana, e a tcnica para os obter demasiado complica para ser aqui descrita. A tcnica a seguir descrita no a mais rpida, mas foi escolhida devido sua simplicidade comparativamente com outras tcnicas alternativas. Pode ser usada para ensaios em que uma ou mais amostras so comparadas com um padro. Para alm disso, devem estar preenchidas as seguintes condies: FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

2 Y P Z

(4.2.1.-1)

(4.2.1.-2)

(4) Embora na maioria dos textos de estatstica publicados em portugus se mantenha o termo probit, entendeu-se traduzir pelo seu real significado probabilidade iterativa.

553

5. Textos gerais

4. ENSAIOS DEPENDENTES DE RESPOSTAS QUALITATIVAS

5.3. Anlises estatsticas

(10)

nZ 2 2

(4.2.1.-3)

As colunas (11) a (15) podem ser facilmente calculadas a partir das colunas (9) e (10) como wx, wx2 e wxy, respectivamente, e o somatrio () de cada uma das colunas (10) a (15) calculada separadamente para cada uma das preparaes. Os somatrios calculados na tabela 4.2.1.-I so transferidos para as colunas (1) a (6) da tabela 4.2.1.-II e as 6 colunas adicionais (7) a (12) so calculadas como se segue: (7)
Sxx wy2 wx w
2

A coluna (6) da primeira tabela de trabalho pode agora ser substituda por Y = a + bx e o ciclo repete-se at que a diferena entre 2 ciclos seja pequena (por exemplo, a mxima diferena de Y entre dois ciclos consecutivos menor que 10-8). 4.2.2. TESTES DE VALIDAO A validade dos ensaios deve ser avaliada antes de calcular a actividade e os intervalos de confiana. Os desvios linearidade podem ser medidos como se segue, se pelos menos 3 doses de cada preparao forem includas: adicione uma 13 coluna tabela 4.2.1.-II e preencha-a com:
Syy S2xy Sxx (4.2.2.-1)

(4.2.1.-4)

(8)
5. Textos gerais

Sxy

wxy

wx w

wy

(4.2.1.-5)

(9)

Syy

wy2

wy w wx w

(4.2.1.-6)

(10)

(4.2.1.-7)

O somatrio da coluna a medida dos desvios linearidade e segue aproximadamente uma distribuio 2 com N-2h graus de liberdade. A significncia deste valor pode ser avaliada com a ajuda da tabela 8.3 ou com uma subrotina apropriada de um programa informtico. Se o valor for significativo para o nvel de probabilidade 0,05, o ensaio deve provavelmente ser rejeitado (ver seco 4.2.4). Quando o teste acima no der uma indicao de desvios significativos regresso linear, os desvios ao paralelismo so testados para o nvel de significncia 0,05 com:
2

(11)

wy w

(4.2.1.-8)

S2xy Sxx

Sxy Sxx

(4.2.2.-2)

com h-1 graus de liberdade. O declive comum b pode agora ser obtido
b Sxy Sxx (4.2.1.-9)

4.2.3. CLCULO DA ACTIVIDADE E SEUS LIMITES DE CONFIANA Quando no existirem indicaes de um desvio significativo do paralelismo e linearidade o ln(relao de actividade) MT calculado com: M T aT b as
(4.2.3.-1)

e a intercepo a do padro, e igualmente para as amostras, obtm-se (12)


a y bx (4.2.1.-10)

TABELA 4.2.1.-I. Primeira tabela de trabalho


(1) dose S (2) n (3) r (4) x (5) p (6) Y (7) (8) Z (9) y (10) w (11) wx (12) wy (13) wx2 (14) wy2 (15) wxy

. . . . . .

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etc.

TABELA 4.2.1.-II. Segunda tabela de trabalho


(1) w S T etc. (2) wx (3) wy (4) wx2 (5) wy2 (6) wxy (7) Sxx (8) Sxy (9) Syy (10) x (11) y (12) a

. . .

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. . .

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. .

. .

554

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

e o antilogaritmo retido. Faa t = 1,96 e s = 1. Os limites de confiana so calculados como os antilogaritmos de:
CM T (C 1) (xS xT) (C 1) V Sxx C(MT xS xT)2

(4.2.3.-2) onde C b2 b2 Sxx Sxx s2t2 e V


S

1 w
T

1 w

A tabulao das respostas das amostras, e opcionalmente do padro, realizada de acordo com o descrito na seco 4.2.1. O teste para a linearidade realizado tal como descrito na seco 4.2.2. Para este tipo de ensaio no h necessidade de fazer o teste de paralelismo. A ED50 da amostra T, e de igual modo para as outras amostras, obtido tal como descrito na seco 4.2.3, com as seguintes modificaes nas frmulas 4.2.3.-1 e 4.2.3.-2).
M T aT b 1) V Sxx C (MT xT)2 (5.5.-1)

4.2.4. RESULTADOS INVLIDOS Se o teste de desvio linearidade descrito na seco 4.2.2 for significativo, o ensaio deve normalmente ser rejeitado. Se existirem razes para conservar o ensaio, as frmulas so ligeiramente modificadas. t transforma-se no valor-t (p = 0,05) com o mesmo nmero de graus de liberdade usado para verificar a linearidade e s2 transforma-se no valor de 2 dividido pelo mesmo nmero de graus de liberdade (e assim tipicamente maior que 1). O teste para paralelismo tambm ligeiramente modificado. O valor de 2 para no-paralelismo dividido pelo seu nmero de graus de liberdade. O valor obtido dividido pelo valor de s2 anteriormente calculado de modo a obter o rcio-F com h-1 e N-2h graus de liberdade, que avaliado do modo habitual para o nvel de significncia 0,05. 4.3. O MTODO LOGIT Tal como indicado na seco 4.1 o mtodo logit pode, por vezes, ser o mais apropriado. O nome do mtodo derivado da funo logit que o inverso da distribuio logstica. O procedimento idntico ao descrito para o mtodo probit com as seguintes modificaes nas frmulas e Z.
1 e (1 1 e
Y Y

e
CM T (C 1) xT (C 1 Onde V
T

e C no muda

(4.5.-2)

Esta seco composta por exemplos trabalhados para ilustrar a aplicao das frmulas. Os exemplos foram seleccionados com o objectivo principal de ilustrar os mtodos estatsticos de clculo. No tm por objectivo reflectir o mtodo mais adequado para o ensaio, caso as monografias individuais permitam a possibilidade de usar alternativas. Para aumentar o seu valor para a validao de programas, so apresentados mais nmeros decimais do que o necessrio. Deve igualmente ser notado que existem outros mtodos de clculo equivalentes. Esses mtodos devem conduzir exactamente aos mesmos resultados do que os apresentados nos exemplos. 5.1. MODELO DE LINHAS PARALELAS 5.1.1. ENSAIO MLTIPLO DE DUAS DOSES COM DESENHO COMPLETAMENTE ALEATRIO Ensaio de corticotrofina por injeco subcutnea em rato O padro administrado nas doses de 0,25 e 1,0 unidade por 100 g de peso corporal. Assumiu-se que as 2 amostras tm uma actividade de 1 unidade por miligrama e so administradas nas mesmas quantidades que o padro. As respostas individuais e as mdias de cada grupo tratado so apresentadas na tabela 5.1.1.-I. A representao grfica no sugere qualquer dvida quanto homogeneidade da varincia e normalidade dos dados, mas sugere problemas quanto ao paralelismo da preparao U.
TABELA 5.1.1.-I Resposta instrumental y massa de cido ascrbico (mg) por 100 g de glndula supra-renal
Padro S Amostra T S2 289 221 267 236 250 231 229 269 233 259 248,4 T1 310 290 360 341 321 370 303 334 295 315 323,9 T2 230 210 280 261 241 290 223 254 216 235 244,0 Amostra U U1 250 268 273 240 307 270 317 312 320 265 282,2 U2 236 213 283 269 251 294 223 250 216 265 250,0

(4.3.-1)

Y)

(4.3.-2)

4.4. OUTRAS FORMAS DA CURVA Os mtodos probit e logit so quase sempre adequados para as anlises de respostas qualitativas exigidas na Farmacopeia. No entanto, deve ser referido que a curva ln(dose)-resposta tem outras formas para alm das 2 curvas descritas, podendo ser adoptada uma outra curva . Por exemplo, se for demonstrado que a curva no simtrica, pode ser apropriado aplicar a distribuio de Gompertz (mY Y todo gompit) sendo nesse caso e 1 e e e Z eY e . 4.5. A DOSE EFECTIVA MEDIANA Em alguns tipos de ensaios desejvel determinar a dose efectiva mediana que a dose que produz uma resposta em 50 por cento das unidades. O mtodo probit pode ser usado para determinar a dose efectiva mediana (ED50), mas uma vez que no h necessidade de exprimir esta dose relativamente a um padro, as frmulas so ligeiramente diferentes. Nota: pode opcionalmente ser includo um padro de modo a validar um ensaio. Habitualmente o ensaio considerado vlido se o valor calculado de ED50 para o padro for suficientemente prximo da ED50 assumida. O significado de suficientemente prximo neste contexto depende dos requisitos especificados na monografia. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

S1 300 310 330 290 364 328 390 360 342 306 mdia 332,0

555

5. Textos gerais

5. EXEMPLOS

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.1.1.-III Anlise de varincia sem a amostra U


Origem da variao Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados

Probabilidade

Resposta instrumental y

Amostras Regresso No lineariadade Tratamentos Erro residual Total

1 1 1 3 36 39

390,6 66830,6 34,2 67255,5 26587,3 93842,8

390,6 66830,6 90,5 34,2 0,05 0,000 0,831

738,54

A anlise sem a amostra U conclui que os resultados esto de acordo com os requisitos quanto regresso e ao paralelismo, e em consequncia a actividade pode ser calculada. As frmulas na seco 3.2.5 do:
FIGURA 5.1.1.-I.

5. Textos gerais

para o declive comum:


b 20( 41,8 39,95) ln 4 10 2 58,970

As frmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos resultados:


PS PT PU HP 580,4 567,9 532,2 10/2 5 LS LT LU HL 41,8 39,95

o ln(actividade) :
M T 567,9 580,4 2 ( 58,970) 66830,6 738,64 0,1060

C 16,1 120 6 20 V

66830,6

2,0282

1,0476

66830,6 ( 58,970)2 2

10

0,9609

A anlise de varincia pode agora ser completada com as frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.1.-II apresenta os resultados.

e ln(limites de confiana) so:


1,0476 0,1060 0,0476 (1,0476 0,10602 0,1110 0,3034 2 0,9609)

TABELA 5.1.1.-II Anlise de varincia


Origem da variao Amostas Regresso No paralelismo Tratamentos Erro residual Total Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados 2 1 2 5 54 59 6256,6 63830,8 8218,2 78305,7 41340,9 119646,6 765,57 3128,3 63830,8 83,38 4109,1 5,37 0,000 0,007

Tomando os antilogaritmos encontramos a relao de actividade de 1,11 com os limites de confiana para 95 por cento entre 0,82 e 1,51.
Probabilidade

Multiplicando pela actividade assumida da amostra T conduz a uma actividade de 1,11 unidades/mg com os limites de confiana para 95 por cento entre 0,82 e ,.51 unidades/mg. 5.1.2. DESENHO DE QUADRADO LATINO COM 3 DOSES Ensaio de difuso de um antibitico usando um tabuleiro rectangular O padro tem uma actividade atribuda de 4855 UI/mg. A amostra tem uma actividade assumida de 5600 UI/mg. Para as solues de armazenamento dissolva 25,2 mg de padro em 24,5 ml de solvente, e 21,4 mg de amostra em 23,95 ml de solvente. As solues finais so preparadas diluindo inicialmente as solues de armazenamento a 1/20 e de seguida usando uma razo de diluio de 1,5. O quadrado latino gerado com o mtodo descrito na seco 8.6 (ver tabela 5.1.2.-I). As respostas deste ensaio de rotina so mostradas na tabela 5.1.2.-II (halos de inibio em mm 10). Os valores mdios dos tratamentos so mostrados na tabela 5.1.2.-III. A representao grfica dos dados (ver figura 5.1.2.-I) no coloca dvidas quanto normalidade e homogeneidade da varincia dos dados. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

A anlise confirma a existncia de uma regresso linear altamente significativa. O desvio ao paralelismo, no entanto, tambm significativo (p = 0,0075) o que era esperado da observao do grfico onde a amostra U no paralela ao padro. Esta amostra por isso rejeitada e a anlise repetida usando apenas a amostra T e o padro.

556

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.1.2.-I Distribuio dos tratamentos na placa


1 1 2 3 4 5 6 S1 T1 T2 S3 S2 T3 2 T1 T3 S3 S2 T2 S1 3 T2 S1 S2 T3 S3 T1 4 S3 S2 S1 T1 T3 T2 5 S2 T2 T3 S1 T1 S3 6 T3 S3 T1 T2 S1 S2

As frmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos resultados:


PS PT HP 529,667 526,333 6/3 2 LS LT HL 35,833 39,333 72 24 3

A anlise de varincia pode agora ser completada com as frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.2.-IV apresenta os resultados

TABELA 5.1.2.-IV Anlise de varincia TABELA 5.1.2.-II Medidas das zonas de inibio (mm
1 1 2 3 4 5 6 161 151 162 194 176 193 2 160 192 195 184 181 166 3 178 150 174 199 201 161 4 187 172 161 160 202 186 178,0 C4 5 171 170 193 163 154 198 6 194 192 151 171 151 182

10)

175,2 171,2 172,7 178,5 177,5 181,0

R1 R2 R3 R4 R5 R6

Amostas Regresso No paralelismo No lineariadade Tratamentos Blocos Colunas

1 1 1 2 5 5 5 20 35

11,1111

11,1111 0,000 0,358 0,877

8475,0417 8475,0417 408,1 18,3750 5,4722 8510 412 218,6667 415,3333 9556 82,40 43,73 20,7667 3,968 2,106 18,3750 0,885 2,7361 0,132

0,012 0,107

mdia de 172,8 coluna C1

179,7 177,2 C2 C3

174,8 173,5 Erro residual C5 C6 Total

TABELA 5.1.2.-III Mdia dos tratamentos


Padro S S1 mdia 158,67 S2 176,50 S3 194,50 T1 156,17 Amostra T T2 174,67 T3 195,50

A anlise mostra diferenas significativas entre as linhas. Isto indica o aumento de preciso adquirido pela utilizao desenho do quadrado latino em vez de um desenho completamente aleatrio. Uma regresso altamente significativa e uma origem sem significncia das linhas individuais da regresso para o paralelismo e linearidade confirmam que o ensaio satisfaz as actividades calculadas. As frmulas na seco 3.2.5 do: para o declive comum:
b 39,333 3 (35,833 ln 1,5 6 2 46,346

o ln(actividade) :
Zona de inibio (nm x 10)
M T 526,333 529,667 3 (46,346) 8475,0417 20,7667 0,02397

8475,0417 V

2,0862 0,2192

1,0108

8475,0417 46,3462 3 6

e ln(limites de confiana) so:


1,0108 0,0108 (1,0108 ( 0,0240) ( 0,0240)2 2 0,2192)

0,02423

0,06878

FIGURA 5.1.2.-I.

A relao de actividade encontrada tomando os antilogaritmos, resultando em 0,9763 com os limites de confiana para 95 por cento de 0,9112 a 1,0456. 557

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

mdia de linha

Origem da variao

Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados

Probabilidade

5.3. Anlises estatsticas

necessrio aplicar o factor de correco de


4855 25,2/24,5 5600 21,4 / 23,93 0,00700 porque as solues no

5.1.3. DESENHO DE UM BLOCO ALEATRIO DE 4 DOSES Titulao de um antibitico por turbidimetria O objectivo desta titulao a atribuio de uma actividade em unidades internacionais por ampola. A actividade atribuda do padro de 670 UI/ml, a actividade assumida da amostra de 20 000 UI/ampola. Com base nestes dados, so preparadas as solues-me como se segue: dissolver 16,7 mg do padro em 25 ml de solvente, e o contedo de uma ampola da amostra em 40 ml de solvente. As solues finais so obtidas atravs de uma primeira diluio a 1/40 das 2 solues-me, seguidas de uma srie de diluies na razo de 1,5. Os tubos so colocados em banho de gua segundo uma repartio em blocos completos (ver seco 8.5). As respostas obtidas so registadas na tabela 5.1.3.-I. A anlise da figura 5.1.3.-I no pe em dvida a validao das hipteses da normalidade dos dados e da homogeneidade da varincia. O desvio padro de S3 um pouco elevado mas sem apresente razes para preocupao. A aplicao das frmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduz aos seguintes resultados:
PS PT HP 719,4 687,6 5/4 1,25 LS LT HL 229,1 222 60 60 1

Absorvncia

exactamente equivalentes com base na sua actividade assumida. Multiplicando por este factor a potncia assumida de 5 600 UI/mg obtm-se a potncia de 5 456 UI/mg com limites de confiana para 95 por cento entre 5 092 e 5 843 UI/mg.

5. Textos gerais

FIGURA 5.1.3.-I.

TABELA 5.1.3.-II Anlise de varincia


Origem da variao Amostas Regresso No paralelismo No lineariadade Tratamentos Linhas Erro residual Total Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados 1 1 1 4 7 4 28 39 632,025 101745,6 25,205 259,14 102662 876,75 1509,65 105048,4 219,188 4,065 53,916 0,010 632,025 101745,6 1887,1 25,205 64,785 0,467 1,202 0,000 0,500 0,332

Probabilidade

A anlise de varincia efectuada com a ajuda das frmulas apresentadas nas tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.1.3.-II.
TABELA 5.1.3.-I Absorvncia das suspenses (
Padro S Bloco 1 2 3 4 5 S1 252 249 247 250 235 S2 207 201 193 207 207 S3 168 187 162 155 140 S4 113 107 111 108 98 T1 242 236 246 231 232 Amostra T T2 206 197 197 191 186 T3 146 153 148 159 146 T4 115 102 104 106 95 Mdia 181,1 179,0 176,0 175,9 167,4

1000)

Existe uma diferena significativa entre os blocos, o que demonstra que um ensaio de blocos completos permite obter uma fidelidade superior. O carcter altamente significativo da regresso e a ausncia de desvios de paralelismo e de linearidade significativos confirmam que a titulao permite calcular as actividades. As frmulas da seco 3.2.5 do: para o declive comum
b 1 ( 229,1 222) ln (1,5) 5 2 111,255

mdia 246,6 203,0 162,4 107,4 237,4 195,4 150,4 104,4

para ln(relao de actividade):


M T C 687,6 719,4 4 ( 111,255) 101745,6 53,916 0,071457 1,00223 0,4110

101745,6 V

2,0482 5

101745,6 ( 111,255)2 4

e para o ln(limites de confiana):


1,00223 0,00223 1,00223 0,07162 0,0715 0,07152 0,04293 2 0,4110)

558

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos uma relao de actividade de 1,0741 com um intervalo de confiana para 95 por cento de 1,0291 a 1,1214. A aplicao de um factor de correco de
670 6,7 / 25 20000 1 / 40 0,89512

5.1.4. ENSAIO MLTIPLO DE 5 DOSES COMPLETAMENTE ALEATRIAS Titulao in vitro de 3 vacinas da hepatite B por comparao com um padro
5. Textos gerais

Trs sries independentes de 5 diluies a 0,5 so preparadas a partir de cada vacina. Aps alguns passos adicionais inerentes ao ensaio, a absorvncia foi medida. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.1.4.-I.
TABELA 5.1.4.-I Absorvncia
Diluio 1:16000 1:8000 1:4000 1:2000 1:1000 Diluio 1:16000 1:8000 1:4000 1:2000 1:1000 0,086 0,127 0,277 0,586 0,957 0,043 0,093 0,159 0,283 0,514 Padro S 0,045 0,099 0,154 0,295 0,531 Padro U 0,071 0,146 0,268 0,489 0,866 0,073 0,133 0,269 0,546 1,045 0,082 0,145 0,318 0,552 1,037 0,051 0,082 0,166 0,362 0,545 0,097 0,167 0,327 0,501 1,140 Amostra T 0,097 0,157 0,355 0,665 1,386 Amostra V 0,082 0,144 0,306 0,551 1,039 0,086 0,173 0,316 0,624 1,068 0,094 0,178 0,345 0,576 1,051

In Absorvncia

necessria porque, tendo em conta a actividade prevista da amostra, as doses utilizadas no so exactamente equivalentes. Multiplicando a relao de actividade por este factor de correco e pela actividade assumida de 20 000 UI/ampola, obtemos uma actividade estimada de 19 228 UI/ampola, com um intervalo de confiana para 95 por cento de 18 423 a 20 075 UI/ampola.

FIGURA 5.1.4.-I.

A aplicao das frmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduz aos seguintes resultados:
PS PT PU PV HP 9,108 5,586 6,544 6,027 3 5 0,6 LS LT LU LV HL 6,109 6,264 6,431 6,384 36 120 0,3

A anlise de varincia completada com as frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.1.4.-III.

Os logaritmos da densidade ptica tm uma relao linear com os logaritmos das doses. As mdias das transformadas logartmicas dos valores da densidade ptica so apresentadas na tabela 5.1.4.-II. A representao grfica dos dados no demonstra nenhuma anomalia.

TABELA 5.1.4.-III Anlise de varincia


Origem da variao Amostas Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados 3 1 3 12 19 40 59 4,475 47,58 0,0187 0,0742 52,152 0,267 52,42 0,0067 1,492 47,58 0,006 0,006 7126 0,933 0,926 0,000 0,434 0,531

Probabilidade

TABELA 5.1.4.-II Mdia das transformadas logartmicas de absorvncia


S1 S2 S3 S4 S5 3,075 2,396 1,835 1,166 0,635 T1 T2 T3 T4 T5 2,344 1,789 1,073 0,550 0,169 U1 U2 U3 U4 U5 2,572 2,002 1,305 0,618 0,048 V1 V2 V3 V4 V5 2,485 1,874 1,161 0,554 0,047

Regresso No paralelismo No lineariadade Tratamentos Erro residual Total

Uma regresso altamente significativa e a ausncia de desvios do paralelismo e de linearidade confirmam que a actividade pode ser calculada com segurana. As frmulas da seco 3.2.5 do: para o declive comum
b 1 0,3 (6,109 6,264 6,431 ln 2 3 4 6,384) 0,90848

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

559

5.3. Anlises estatsticas

para ln(relao de actividade) da amostra T:


M T 5,586 ( 9,108) 5 0,90848 47,68 0,0067 0,7752

47,58

2,0212

1,00057

47,58 0,90852 5

3,8436

e para o ln(limites de confiana) da amostra T:


1,00057 0,00057 (1,00057 0,7756
5. Textos gerais

0,7752 0,77522 0,0689 2 3,8436)

Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos uma relao de actividade de 2,171 com um intervalo de confiana para 95 por cento de 2,027 a 2,327. Como todas as preparaes tm uma actividade assumida de 20 g de protena por mililitro, o clculo d para a mostra T uma actividade de 43,3 g de protena por mililitro com um intervalo de confiana para 95 por cento de 40,5 a 46,5 g de protena por mililitro. O mesmo procedimento usado para calcular a actividade das outras amostras e dos intervalos de confiana associados. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.1.4.-IV.

Resposta (mg / 100 ml)

FIGURA 5.1.5.-I.

TABELA 5.1.5.-II Resposta y: soma dos valores da glicmia (mg/100ml) aps 1 hora e 2,5 horas
grupo 1 S1 112 126 62 T2 104 112 58 63 53 113 91 68 82,8 grupo 2 S2 65 116 73 47 88 63 50 55 69,6 T1 72 160 72 93 113 71 65 100 93,3 grupo 3 T1 105 83 125 56 92 101 66 91 89,9 S2 91 67 67 45 84 56 55 68 66,6 grupo 4 T2 118 119 42 64 93 73 39 31 72,4 S1 144 149 51 107 117 128 87 71 106,8

TABELA 5.1.4.-IV Clculos finais da actividade das vacinas a examinar e limites de confiana para 95 por cento (em g de protena por mililitro)
Limite inferior Vacina T Vacina U Vacina V 40,5 32,9 36,8 Estimativa 43,4 35,2 39,4 Limite superior 46,5 37,6 42,2

86 52 110 116 101 mdia 95,6

5.1.5. DUPLO ENSAIO CRUZADO Titulao de insulina por injeco subcutnea em coelhos O padro administrado a 1 unidade e 2 unidades por mililitro. A amostra administrada em doses equivalentes determinadas com base na actividade assumida do produto que de 40 unidades por mililitro. Cada animal recebe por via subcutnea 0,5 ml das solues apropriadas, de acordo com o plano representado na tabela 5.1.5.-I. As respostas obtidas so apresentadas na tabela 5.1.5.-II. A grande varincia constatada reflecte a variabilidade dos resultados entre os animais e mostra a utilidade de aplicar um ensaio cruzado.

A anlise de varincia mais complicada neste ensaio do que nos outros porque, na soma dos quadrados, a componente devida ao paralelismo no independente da devida s diferenas entre animais. Para verificar o paralelismo das rectas de regresso, necessrio calcular um segundo termo de erro obtido subtraindo a componente do paralelismo e duas componentes de interaco componente devida s diferenas entre animais. A anlise de varincia usa 3 componentes de interaco resultantes da repetio dos tratamentos no interior de cada grupo: dias preparao; dias regresso; dias paralelismo. Estes termos reflectem a tendncia que tm os factores considerados (preparaes, regresso e paralelismo) para variar de dia para dia. Os rcio-F correspondentes permitem verificar a validade do ensaio neste aspecto. Se os valores de F so significativamente elevados, convm interpretar os resultados do ensaio com circunspeco e mesmo, se possvel, de o reiniciar. A anlise de varincia realizada aplicando as frmulas das tabelas 3.2.3.-I a 3.2.3.-III separadamente para cada um dos 2 dias e ao conjunto de todos os dados. As frmulas das tabelas 3.2.3.I e 3.2.3.-II do: FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

TABELA 5.1.5.-I Ordem dos tratamentos


Grupo de coelhos 1 dia 1 dia 2 S1 T2 2 S2 T1 3 T1 S2 4 T2 S1

560

5.3. Anlises estatsticas

Dia 1

PS PT HP

165,25 162,25 8 4 2 173,38 176,99 8 4 2 169,31 169,13 16 8 2

LS LT HL LS LT HL LS LT HL

13 8,75 96 16 6 20,06 5,25 96 16 6 16,53 7,00 192 6

As frmulas da seco 3.2.5. do: para o declive comum


b 32 ( 16,53 7) ln 2 16 2 33,95

Dia 2

PS PT HP

para ln(relao de actividade):


M T C 169,13 169,31 2 ( 33,95) 8859,5 137,3 0,00276

conjunto

PS PT HP

8859,5 V

2,0482

1,0695

32

8859,5 (-33,95)2 2

16

0,2402

e as frmulas da tabela 3.2.3.-III permitem calcular:


Dia 1 SSprep SSreg SSpar 18,000 3784,5 144,5 Dia 2 SSprep SSreg SSpar 13,781 5125,8 1755,2 Conjunto SSprep SSreg SSpar 0,141 8859,5 1453,5

e para o ln(limites de confiana):


1,0695 0,00276 0,0695 (1,0695 0,002762 2 0,2402)
5. Textos gerais

0,00295

0,18279

Os termos da interaco obtm-se pela operao: dia 1 dia 2 conjunto:


SSdias SSdias SSdias
prep reg par

31,64 50,77 446,27

Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos uma relao de actividade de 1,003 com um intervalo de confiana para 95 por cento de 0,835 a 1,204. Estes resultados multiplicados por AT = 40 do uma actividade de 40,1 unidades por mililitro com um intervalo de confiana para 95 por cento de 33,4 a 48,2 unidades por mililitro. 5.2. MODELO DE RELAO DE DECLIVES 5.2.1. DESENHO COMPLETAMENTE ALEATRIO (0,3,3) Ensaio do factor VIII Um laboratrio desenvolve um ensaio colorimtrico do factor VIII em solues concentradas. O laboratrio no tem experincia deste tipo de titulaes mas tenta torn-lo operacional. So preparadas 3 diluies equivalentes para o padro e para a amostra. igualmente preparado um branco embora no seja esperada uma relao dose-resposta linear para as doses mais baixas. Cada diluio observada com 8 rplicas, um nmero superior ao que ser utilizado nos ensaios de rotina. A representao grfica dos dados mostra claramente que a relao dose-resposta efectivamente no linear para as doses baixas. As respostas obtidas para o branco no so usadas nos clculos (so necessrios novos ensaios para justificar esta deciso). As frmulas das tabelas 3.3.3.2.-I e 3.3.3.1-II do:
PS = 0,6524 LS = 1,4693 aS = 0,318 bS = 0,329 GS = 0,1554 10-8 PT = 0,5651 LT = 1,2656 aT = 0,318 bT = 0,271 GT = 0,1156 JT = 2,84 10-6

Calcula-se tambm a soma dos quadrados devidos variabilidade diria:


SSdias 1 2 N (D1 2
2 D2 )

478,52

e a soma dos quadrados devidos aos blocos (variabilidade entre animais):


SSblocos 2 B i2 K 39794,7

onde Bi a resposta mdia por animal. A anlise de varincia pode ser completada conforme descrito na tabela 5.1.5.-III.
TABELA 5.1.5.-III Anlise de varincia
Origem da variao No paralelismo Dias Dias amostra reg. Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados 1 1 1 28 31 1 1 1 no para 1 28 63 1453,5 31,6 50,8 38258,8 39794,7 0,14 8859,5 478,5 446,3 3844,1 53423,2 1453,5 31,6 50,8 1366,4 1283,7 0,14 0,001 0,975 0,000 0,072 0,082 1,064 0,023 0,037

Probabilidade 0,311 0,880 0,849

Erro residual entre coelhos Coelhos Amostras Regresso Dias Dias

JS = 4,17

8859,5 64,532 478,5 446,3 137,3 3,485 3,251

e
HI = 0,09524 a= 0,05298 K = 1,9764

E a anlise de varincia realizada com a ajuda das frmulas das tabelas 3.3.3.1.-III e 3.3.3.1.-IV. A existncia de uma regresso muitssimo significativa e a ausncia de desvio da linearidade e interseco indicam que a actividade pode ser calculada. 561

Erro residual inter-coelhos Total

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

Declive da curva do padro:


b s 6 1,469 36 84 0,0530 0,0822
Origem da variao Regresso

TABELA 5.2.1.-II Anlise de varincia


Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados 2 1 2 5 42 47 0,1917 3.10 2.10
9 5

Probabilidade 0,000 0,978 0,061

Declive da curva da amostra


b r 6 1,266 36 84 0,0530 0,0677
Interseco No linear Tratamentos

0,0958 3.10 1.10


9 5

24850 7.10
4

A aplicao da frmula 3.3.5.1.-3 d:


R 0,0677 0,0822 0,823

2,984

0,1917 1,62.10 0,1919


4

Erro residual Total

3,86.10

0,08222 K

0,08222 3,86 10 6 2,1882 0,000083 0,75

0,0357 0,000062

1,000083

5.2.2. ENSAIO TOTALMENTE ALEATRIO (0,4,4,4) Ensaio in vitro de vacinas da gripe O teor em antigneo da hemaglutinina (AH) de 2 vacinas gripais determinado por imunodifuso radial simples. As 2 vacinas possuem uma actividade declarada de 15 g de AH por dose, equivalente a um teor em AH de 30 g/ml. O teor em AH atribudo ao padro de 39 g/ml. O padro e as vacinas a titular so examinadas em 4 concentraes, preparadas em duplicado com base nos respectivos teores (atribudo ou declarado). Quando obtido o equilbrio entre o reagente interno e o reagente externo, mede-se a superfcie da zona anular da preparao. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.2.2.-I. A representao grfica dos dados no apresenta nenhum aspecto fora do habitual. A aplicao das frmulas das tabelas 3.3.3.1.-I e 3.3.3.1-II do:
PS = 108,2 LS = 301,0 aS = 141,0 bS = 61,2 GS = 3114,3 JS = 0,223 PT = 103,85 LT = 292,1 aT = 116,7 bT = 64,95 GT = 2909,4 JT = 2,227 PU = 85,8 LU = 234,1 aU = 139,8 bU = 39,2 GU = 1917,3 JU = 0,083

e os limites de confiana para 95 por cento so:


0,823 0,000083 1,678 0,823 0,000062 0,006 ( 1,646)

Absorvncia

5. Textos gerais

A relao de actividade estimada de 0,823 com um intervalo de confiana para 95 por cento entre 0,817 e 0,829.

TABELA 5.2.1.-I Absorvncias


branco Conc. B padro S (em UI/ml) S1 0,01 0,022 0,024 0,024 0,026 0,023 0,022 0,022 0,023 mdia 0,0235 0,133 0,133 0,131 0,136 0,137 0,136 0,138 0,137 0,1351 S2 0,02 0,215 0,215 0,216 0,218 0,220 0,220 0,219 0,218 0,2176 S3 0,03 0,299 0,299 0,299 0,297 0,297 0,305 0,299 0,302 0,2996 amostra T (em UI/ml) T1 0,01 0,120 0,119 0,118 0,120 0,120 0,121 0,121 0,121 0,1200 T2 0,02 0,188 0,188 0,190 0,190 0,190 0,191 0,191 0,190 0,1898 T3 0,03 0,254 0,253 0,255 0,258 0,257 0,257 0,255 0,254 0,2554

e
HI = 0,0093 a = 11,04 K = 14785,8

E a anlise de varincia realizada com a ajuda das frmulas das tabelas 3.3.3.1.III e 3.3.3.1.-IV. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.2.2.-II. A existncia de uma regresso muitssimo significativa e a ausncia de desvio da linearidade e interseco indicam que a actividade pode ser calculada. Declive da curva do padro:
b s 6 301,1 60 180 11,04 6,356

Declive da curva da vacina T:


b r 6 292,1 60 180 11,04 6,056

Declive da curva da vacina U:


b U 6 234,1 60 180 11,04 4,123

FIGURA 5.2.1.-I.

562

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

A relao de actividade estimada de 6,056/6,356 = 0.953 para a vacina T e de 4,123/6,356 = 0,649 para a vacina U.
C 6,3562 K 6,3562 1,068 2,1792 0,0056 0,625 0,0444 0,0035 1,0056

TABELA 5.2.2.-III Estimativa da quantidade de AH (g/dose)


Limite inferior Vacina T Vacina U 13,4 8,9 Estimativa 14,3 9,7 Limite superior 15,3 10,6

Os limites de confiana so dados pela frmula 3.3.5.1.-4. Para a vacina T:


0,955 0,0056 1,913 0,0035 ( 1,913) 0,955 0,063

5.3. RESPOSTAS QUALITATIVAS 5.3.1. TITULAO DE UMA PREPARAO RELATIVAMENTE A UM PADRO PELO MTODO DA PROPABILIDADE ITERACTIVA (PROBIT) Ensaio in vivo de uma vacina diftrica Uma vacina diftrica, com a actividade assumida de 140 UI/ampola, titulada por comparao com um padro com a actividade atribuda de 132 UI/ampola. Com bases nestas actividades, preparam-se doses equivalentes destas preparaes, que so administradas de modo aleatrio a um grupo de cobaios. Aps determinado intervalo de tempo, os animais so submetidos a uma prova de virulncia atravs da toxina diftrica. Os resultados obtidos, expressos em nmero de animais sobreviventes, so apresentados na tabela 5.3.1.-I. Os valores so transpostos para a primeira tabela de trabalho, onde so calculadas as colunas seguintes como descrito na seco 4.2.1. A tabela 5.3.1.-II representa o primeiro ciclo de clculo.
TABELA 5.3.1.-I Dados brutos do ensaio em cobaios da vacina diftrica
Padro (S) actividade atribuda 132 UI/ampola dose (UI/ml) 1,0 1,6 2,5 4,0 submetidos protegidos a prova 12 12 12 11 0 3 6 10 Amostra (T) actividade assumida 140 UI/ampola dose (UI/ml) 1,0 1,6 2,5 4,0 submetidos protegidos a prova 11 12 11 11 0 4 8 10

Para a vacina U:
0,649 0,0056 1,423 0,0035 ( 1,301) 0,649 0,058

TABELA 5.2.2.-I Superfcie de precipitao (mm2)


Conc. (g/ml) 7,5 15,0 22,5 30,0 Padro S I 18,0 22,8 30,4 35,7 II 18,0 24,5 30,4 36,6 Amostra T I 15,1 23,1 28,9 34,4 II 16,8 24,2 27,4 37,8 Amostra T I 15,4 20,2 24,2 27,4 II 15,7 18,6 23,1 27,0

Superfcie da zona anelar

FIGURA 5.2.2.-I. TABELA 5.2.2.-II Anlise de varincia


Origem da variao Regresso Interseco No linear Tratamentos Erro residual Total Graus Soma Quadrado Rcio de dos mdio F liberdade quadrados 3 2 6 11 12 23 1087,7 3,474 5,066 1096,2 12,815 1109,0 1,068 362,6 1,737 0,844 339,5 1,626 0,791

Probabilidade 0,000 0,237 0,594

Probabilidade

FIGURA 5.3.1.-I.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

563

5. Textos gerais

O teor em AH, expresso em g/ml, calculado multiplicando as relaes de actividade e os limites de confiana pela actividade assumida (30 g/ml). Os resultados obtidos figuram na tabela 5.2.2.-III.

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.3.1.-II. Primeira tabela de trabalho no primeiro ciclo


Vacina Dose S 1,0 1,6 2,5 4,0 T 1,0 1,6 2,5 4,0 n 12 12 12 11 11 12 11 11 r 0 3 6 10 0 4 8 10 x 0,000 0,470 0,916 1,386 0,000 0,470 0,916 1,386 p 0,000 0,250 0,500 0,909 0,000 0,333 0,727 0,909 Y 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Z 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 y 1,253 0,627 0,000 1,025 1,253 0,418 0,570 1,025 w 7,64 7,64 7,64 7,00 7,00 7,64 7,00 7,00 wx 0,00 3,59 7,00 9,71 0,00 3,59 6,42 9,71 wy 9,57 4,79 0,00 7,18 8,78 3,19 3,99 7,18 wx2 0,00 1,69 6,41 13,46 0,00 1,69 5,88 13,46 wy2 12,00 3,00 0,00 7,36 11,0 1,33 2,27 7,36 wxy 0,00 2,25 0,00 9,95 0,00 1,50 3,66 9,95

TABELA 5.3.1.-III. Segunda tabela de trabalho no primeiro ciclo


5. Textos gerais vacina S T w 29,92 28,65 wx 20,30 19,72 wy 7,18 0,80 wx2 21,56 21,03 wy2 22,36 21,97 wxy2 7,70 12,11 Sxx 7,79 7,46 Sxy 12,58 12,66 Syy 20,64 21,95 x 0,68 0,69 y 0,24 0,03 a 1,36 1,17

TABELA 5.3.1.-IV. Primeira tabela de trabalho no segundo ciclo


Vacina Dose S 1,0 1,6 2,5 4,0 T 1,0 1,6 2,5 4,0 n 12 12 12 11 11 12 11 11 r 0 3 6 10 0 4 8 10 x 0,000 0,470 0,916 1,386 0,000 0,470 0,916 1,386 p 0,000 0,250 0,500 0,909 0,000 0,333 0,727 0,909 Y 1,36 0,58 0,15 0,93 1,17 0,39 0,35 1,13 0,086 0,279 0,561 0,824 0,122 0,349 0,637 0,870 Z 0,158 0,336 0,394 0,258 0,202 0,370 0,375 0,211 y 1,911 0,672 0,001 1,260 1,769 0,430 0,591 1,311 w 3,77 6,74 7,57 5,07 4,20 7,23 6,70 4,35 wx 0,00 3,17 6,94 7,03 0,00 3,40 6,14 6,03 wy 7,21 4,53 0,01 6,39 7,43 3,11 3,96 5,70 wx2 0,00 1,49 6,36 9,75 0,00 1,60 5,62 8,36 wy2 13,79 3,04 0,00 8,05 13,14 1,34 2,34 7,48 wxy 0,00 2,13 0,01 8,86 0,00 1,46 3,63 7,90

TABELA 5.3.1.-V. Segunda tabela de trabalho depois do ltimo ciclo


vacina S T w 18,37 17,96 wx 14,80 12,64 wy 2,14 0,55 wx2 14,85 11,86 wy2 17,81 18,35 wxy 5,28 6,76 Sxx 2,93 2,96 Sxy 7,00 7,15 Syy 17,56 18,34 x 0,81 0,70 y 0,12 0,03 a 2,05 1,72

A soma das 6 ltimas colunas desta tabela realizada de seguida para cada uma das preparaes, e os resultados so transportados para a segunda tabela de trabalho (ver tabela 5.3.1.-III), onde as outras colunas so calculadas com a ajuda das frmulas 4.2.1.-4 a 4.2.1.-10. O declive comum b resultante de 1,655. De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na primeira tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o segundo ciclo de clculo (tabela 5.3.1.-IV). Procede-se assim por ciclos de clculos iteractivos at obteno de uma diferena mnima entre 2 ciclos consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se ento sob a forma indicada na tabela 5.3.1.-V. O teste de linearidade feito conforme descrito na seco 4.2.2. O valor de 2 com 4 graus de liberdade de 0,851 1,070 1,921, ou seja, um valor de p de 0,750 o que no significativo.

Uma vez que no h desvio significativo da linearidade, o teste de paralelismo pode ser efectuado como descrito na mesma seco. O valor de 2 com 1 grau de liberdade de
(16,71 17,27) 14,152 5,89 0,001, ou seja um valor de p

de 0,974 o que no significativo. Procedendo como indicado na seco 4.2.3, obtemos as seguintes estimativas: para ln(relao de actividade):
M T 1,721 ( 2,050) 2,401 0,137

2,4012 V

2,4012 5,893 5,893 12 1,9602 1 18,37 1 17,96 0,110

1,127

564

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

e para ln(limites de confiana):


0,155 0,013 0,127 (0,649 0,142 0,288 1,127 0,0362)

5.3.3. DETERMINAO DA DE50 DE UMA SUBSTNCIA PELO MTODO DA PROBABILIDADE ITERACTIVA (PROBIT) Ensaio in vitro de uma vacina oral da poliomielite A titulao de uma vacina oral da poliomielite efectuada pela determinao de DE50 em placas ELISA com 10 diluies diferentes e 8 rplicas de 50 l. Os resultados obtidos so apresentados na tabela 5.3.3.-I.
TABELA 5.3.3.-I Diluies (10x l de vacina no diluda)
3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

A actividade e os limites de confiana podem agora ser obtidos multiplicando os antilogaritmos pela actividade assumida (149 UI/ampola). A estimativa assim obtida de 160,6 UI/ampola com um intervalo de confiana para 95 por cento entre 121,0 e 215,2 UI/ampola. 5.3.2. MTODO LOGIT E OUTROS MTODOS DE ANLISE DA TITULAO DE UMA AMOSTRA RELATIVAMENTE A UM PADRO Os resultados sero fornecidos para a situao onde o mtodo logit e outros mtodos clssicos desta famlia so aplicados para os dados da seco 5.3.1. Este exemplo deve ser considerado como um exerccio ilustrativo, e no como uma alternativa ao mtodo da probabilidade iteractiva (probit) no caso particular. S poder ser utilizada outra funo com base em justificaes experimentais ou tericas.

TABELA 5.3.2.-I Resultados obtidos com diferentes anlises de funes


Logit 1 1 e e (1 4,101 2,15 0,0066 162,9 121,1 221,1 e Gompit
Y Y Y )2

Z Declive b
2

1 eY

e
e
Y

ngulo(*) 1 1 sin Y 2 2 1 cos Y 2 1,717 1,50 0,0010 155,8 122,6 200,7

2,590 3,56 0,168 158,3 118,7 213,3 1 2 1 2 ento = 0 e Z = 0 ento = 1 e Z = 0

lin

2 par.

Actividade Limite inf. Limite sup.

(*)

se Y

se Y

Probabilidade

FIGURA 5.3.3.-I.

TABELA 5.3.3.-II. Primeira tabela de trabalho do primeiro ciclo


Vacina Dose T 10 3,5 10 4,0 10 4,5 10 5,0 10 5,5 10 6,0 10 6,5 10 7,0 10 7,5 10 8,0 n 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 r 0 0 1 2 6 7 7 8 8 8 x 8,06 9,21 10,36 11,51 12,66 13,82 14,97 16,12 17,27 18,42 p 0,000 0,000 0,125 0,250 0,750 0,875 0,875 1,000 1,000 1,000 Y 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Z 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 0,399 y 1,253 1,253 0,940 0,627 0,627 0,940 0,940 1,253 1,253 1,253 w 5,09 5,09 5,09 5,09 5,09 5,09 5,09 5,09 5,09 5,09 wx 41,04 46,91 52,77 58,63 64,50 70,36 76,23 82,09 87,95 93,82 wy 6,38 6,38 4,79 3,19 3,19 4,79 4,79 6,38 6,38 6,38 wx2 330,8 432,0 546,8 675,1 816,8 972,1 1140,8 1323,1 1518,9 1728,2 wy2 8,00 8,00 4,50 2,00 2,00 4,50 4,50 8,00 8,00 8,00 wxy 51,4 58,8 49,6 36,7 40,4 66,1 71,7 102,9 110,2 117,6

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

565

5. Textos gerais

5.3. Anlises estatsticas

Estes valores so transpostos para a primeira tabela de trabalho, onde so calculadas as colunas seguintes como descrito na seco 4.2.1. A tabela 5.3.3.-II representa o primeiro ciclo deste mtodo de clculo. A soma das 6 ltimas colunas desta tabela realizada de seguida e os resultados so transportados para a segunda tabela de trabalho (ver tabela 5.3.3.-III), onde as outras colunas so calculadas com a ajuda das frmulas 4.2.1.-4 a 4.2.1.-10. O declive comum b resultante de -0,295. De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na primeira tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o segundo ciclo de clculo. Procede-se assim por ciclos de clculos iteractivos at obteno de uma diferena mnima entre 2 ciclos consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se ento sob a forma indicada na tabela 5.3.3.-IV. O teste de linearidade feito conforme descrito na seco 4.2.2. O valor de 2 com 8 graus de liberdade de 2,711, ou seja, um valor de p de 0,951 o que no significativo. Procedendo como indicado na seco 4.5, obtemos as seguintes estimativas: para ln(relao de actividade):
M T 1,721 ( 2,050) 2,401 0,137

5.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS 5.4.1. ANLISE DE UMA CURVA LOGSTICA DE 4 PARMETROS Titulao serolgica de imunosoros tetnicos Como j foi previamente indicado na seco 3.4, este exemplo tem por objectivo ilustrar um modo possvel de anlise dos dados apresentados, mas no necessariamente reflectir o nico modo de anlise ou o mais apropriado. Muitas outras aproximaes esto descritas na literatura, mas elas no conduzem, na maior parte das situaes, a resultados muito diferentes. Encontramos na seco 7.5 uma breve discusso destas aproximaes alternativas bem como de outras consideraes estatsticas.
TABELA 5.4.1.-I Respostas observadas
Padro S Dil. 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 Obs. 1 2,912 2,579 2,130 1,651 1,073 0,585 0,463 0,266 0,228 0,176 Obs. 2 2,917 2,654 2,212 1,638 0,973 0,666 0,356 0,234 0,197 0,215 Dil. 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 Amostra T Obs. 1 3,017 2,801 2,401 1,918 1,364 0,861 0,497 0,340 0,242 0,178 Obs. 2 2,987 2,808 2,450 1,963 1,299 0,854 0,496 0,344 0,217 0,125

5. Textos gerais

( 0,646)2 55,883 ( 0,646)2 55,883 12 1,9602 V 1 19,39 0,052

1,197

1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120

e para ln(limites de confiana):


14,692 ( 2,420) 0,197 12,272 (2,882 0,754 1,197 0,0092)

Esta estimativa expressa em termos de ln(diluio). Para converter esta expresso em ln(DE50)/ml necessrio efectuar a transformao M T
ln 1000 . 50

Um imunosoro de cobaio doseado por comparao com um imunosoro de referncia (0,4 UI/ml) com uma tcnica de imunoadsoro por enzima conjugado (ELISA) Aplicam-se 10 diluies a ? de cada preparao numa placa ELISA com 96 pocilhos. Cada diluio aplicada 2 vezes. Os resultados observados so apresentados na tabela 5.4.1.-I. Para este exemplo assume-se que o laboratrio validou as condies 1 a 3 especificadas na seco 3.1.1, quando o ensaio foi desenvolvido em condies de rotina. Para alm disso, o laboratrio validou tambm as condies de igualdade do limite superior e do limite inferior das amostras. A representao grfica no demonstra aspectos anormais. Procede-se ao ajustamento dos parmetros da funo

Como a actividade deste tipo de vacina expresso em termos de log10(DE50)/ml, necessrio dividir os resultados por ln(10). A actividade estimada assim obtida igual a 6,63 log10(DE50)/ml, com um intervalo de confiana para 95 por cento entre 6,30 e 6,96 log10(DE50)/ml.

TABELA 5.3.3.-III. Segunda tabela de trabalho do segundo ciclo


vacina T w 50,93 wx 674,3 wy 11,17 wx2 9484,6 wy2 57,50 wxy 312,32 Sxx 556,92 Sxy 164,43 Syy 55,05 x 13,24 y 0,219 a 3,690

TABELA 5.3.3.-IV. Segunda tabela de trabalho do ltimo ciclo


vacina T w 19,39 wx 238,2 wy 0,11 wx2 2981,1 wy2 26,05 wxy2 37,35 Sxx 55,88 Sxy 36,11 Syy 26,05 x 12,28 y 0,006 a 7,931

566

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

logstica pelo mtodo dos mnimos quadrados, utilizando um programa informtico apropriado, supondo que os termos de erro residual so variveis aleatrias normais independentes e identicamente distribudas. Neste caso so necessrios 3 parmetros (, e ) para descrever o factor de declive comum e as assmptotas comuns inferior e superior, mais 2 parmetros complementares (S e T) para descrever a posio horizontal das 2 curvas. O programa fornece as estimativas para os diferentes parmetros:
= 3,196 = 1,112 = 0,145 S = T = 4,307 4684

uma actividade estimada de 1,459 0,4 0,584 UI/ml. A frmula 4.2.3.-2 d, para os limites de confiana para 95 por cento, os valores de 0,557 e 0,612 UI/ml.

6. COMBINAO DE RESULTADOS DE ENSAIOS


6.1. INTRODUO Para satisfazer as exigncias da Farmacopeia muitas vezes necessrio realizar vrios ensaios independentes e combinar os seus resultados. A questo coloca-se quanto admissibilidade da combinao dos resultados dos ensaios, e em caso afirmativo, de que modo. Dois ensaios podem ser considerados como independentes quando a execuo de um deles no afecta as probabilidades associadas aos resultados dos outros. Isto implica que o conjunto dos erros aleatrios ligados aos principais factores de influncia de um dos ensaios (por exemplo, diluies do padro e da amostra, sensibilidade do indicador biolgico) devem ser independentes dos erros aleatrios correspondentes ao outro ensaio. Os ensaios realizados em vrios dias consecutivos a partir de diluies do padro preparadas no mesmo momento no so considerados ensaios independentes. Existem vrios mtodos para combinar os resultados de ensaios independentes, sendo o mais aceitvel do ponto de vista terico o que apresenta maior dificuldade de aplicao. A seguir so descritos 3 mtodos de aproximao simplificada; outros podem ser usados desde que as condies necessrias sejam satisfeitas. Antes de combinar as actividades obtidas a partir dos ensaios baseados no modelo de linhas paralelas ou no modelo da probabilidade iteractiva (probit) devem ser transformados em logaritmos; pelo contrrio, as actividades obtidas a partir de ensaios baseados no modelo de relao de declives so utilizadas tal qual. Como os 2 primeiros modelos so de utilizao mais corrente que o da relao de declives, o smbolo M (representando o logaritmo da actividade) que usado nas frmulas desta seco. Lendo R (relao de declive) em vez de M, o experimentador pode aplicar as mesmas frmulas para calcular os resultados dos ensaios baseados no modelo de relao de declives. Antes de serem combinados, todas as estimativas de actividade devem ser corrigidas relativamente actividade atribuda para preparao. 6.2. COMBINAO PONDERADA DE RESULTADOS DE ENSAIOS Este mtodo pode ser utilizado se as seguintes condies forem satisfeitas: 1) As estimativas de actividade resultam de ensaios independentes, 2) para cada ensaio, C est perto de 1 (digamos inferior a 1,1), 3) o nmero de graus de liberdade dos erros residuais individuais superior ou igual a 6 e de preferncia superior a 15, 4) as estimativas individuais de actividade formam uma srie homognea (ver seco 6.2.2). Se as condies no forem satisfeitas, este mtodo no pode ser aplicado. O mtodo descrito na seco 6.3 pode ento ser 567
5. Textos gerais

Alm disso, fornece para a varincia residual s2 uma estimativa de 0,001429 com 20 graus de liberdade (variao intra-tratamentos). Para obter os limites de confiana, e verificar o paralelismo e a linearidade, linearisam-se as respostas u observadas, antes de as submeter a uma anlise de linhas paralelas ponderada atravs do programa. Este procedimento muito semelhante ao descrito na seco 4.2 pelo mtodo da probabilidade iteractiva (probit), introduzindo-se as seguintes modificaes:
u Y = (x 1 = 1 e Z= e (1 ) y w= Y Z2 ( s2 Z )2

Y Y

Y)2

Obtm-se assim, uma anlise de varincia ponderada das respostas transformadas y com as ponderaes w:
TABELA 5.4.1.-II. Anlise de varincia ponderada
Origem da variao Amostras Regresso No paralelismo No linearidade Tratamentos Erro residual Total graus de liberdade 1 1 1 16 19 20 39 Chi-quadrado 0,529653 6599,51 0,0458738 8,89337 6608,98 20,0000 6628,98 Probabilidade 0,467 0,000 0,830 0,918

No se observam desvios significativos de paralelismo e de linearidade; o mtodo de doseamento satisfatrio para os clculos da actividade. Se a condio de igualdade das assmptotas superior e inferior no for satisfeita, provvel que se observem desvios significativos de linearidade e/ou paralelismo, uma vez que os testes de paralelismo e de linearidade reflectem a justeza do ajustamento do modelo de 4 parmetros na sua totalidade. O erro residual na anlise de varincia sempre igual a 1 em resultado da transformao. , no entanto, possvel calcular um factor de heterogeneidade (anlogo ao utilizado no mtodo dos probits). A actividade relativa da amostra pode ser obtida pelo clculo do antilogaritmo de S T. Multiplicando este valor pela actividade atribuda da preparao de referncia, obtemos FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

utilizado para obter a melhor estimativa da actividade mdia, podendo ser adoptado para os ensaios ulteriores como actividade assumida. 6.2.1. CLCULO DOS FACTORES DE PONDERAO presumido que os resultados de cada um dos n ensaios foram analisados para dar origem a n valores de M com os limites de confiana associados. Para cada ensaio, o intervalo de confiana logartmico L obtido por subtraco ao limite superior o inferior. O factor de ponderao W calculado para cada valor de M com a ajuda da frmula 6.2.1.-1, onde t toma o mesmo valor que o utilizado no clculo dos limites de confiana.
W 4t2 L2 (6.2.1.-1.)

6.2.4. CLCULO DA MDIA PONDERADA E DOS LIMITES DE CONFIANA BASEADO NAS VARIAES INTRA- E INTER-ENSAIOS Quando os resultados de vrios ensaios repetidos so combinados, o valor de 2 pode ser significativo. Considera-se ento que a variabilidade observada tem duas componentes:
2 a variabilidade intra-ensaio sM = 1/W,

2 a variabilidade interensaios sM

M n n

M 1

onde M a mdia no ponderada. A primeira varia de um ensaio para outro, enquanto que a segunda comum a todos os valores M. Calculamos ento, para cada valor M, um factor de ponderao:
1
2 sM

6.2.2. HOMOGENEIDADE DAS ESTIMATIVAS DE ACTIVIDADE Elevando ao quadrado o desvio de cada valor de M relativamente mdia ponderada, e depois multiplicando cada um dos desvios pelo factor de ponderao apropriado e efectuando a sua soma no conjunto dos ensaios, obtemos uma varivel estatstica em que a distribuio segue aproximadamente uma lei de 2 (ver tabela 8.3) e que pode ser utilizado para verificar a homogeneidade de uma srie de estimativas do logaritmo da actividade:
2
n

2 sM

5. Textos gerais

que substitui W na seco 6.2.3, onde t toma aproximadamente o valor 2. 6.3. COMBINAO NO PONDERADA DE RESULTADOS DE ENSAIOS Para combinar da maneira mais simples as n estimativas de M obtidas a partir de n ensaios, determinamos a sua mdia seguida do clculo do desvio padro segundo a frmula:
2 SM

W (M

M )2

onde

WM W

(6.2.2.-1.) M n n M 1

Se o valor de 2 assim calculado inferior ao valor da tabela que corresponde a (n 1) graus de liberdade, as actividades so homogneas e os valores obtidos na seco 6.2.3 para a actividade mdia e os limites associados tero significado. Se o valor de 2 calculado superior ao valor da tabela, as actividades so heterogneas. Isto significa que as variaes entre as estimativas individuais de M so superiores ao que seria previsvel pelas estimativas dos limites de confiana, quer dizer que existe uma variabilidade significativa entre os ensaios. Nestas circunstncias, a condio 4 no satisfeita e as equaes da seco 6.2.3 no so aplicveis, mas elas podem ser substitudas pelas da seco 6.2.4. 6.2.3. CLCULO DA MDIA PONDERADA E DOS LIMITES DE CONFIANA Os produtos WM so formados para cada ensaio e a sua soma dividida pela soma dos factores de ponderao de todos os ensaios, para dar a mdia logartmica ponderada da actividade.
M WM W (6.2.3.-1.)

(6.3.-1.)

e os limites de confiana so dados por


M tsM (6.3.-2.)

onde t possui (n 1) graus de liberdade. O nmero n de estimativas de M normalmente pequeno, e em consequncia o valor de t relativamente grande. 6.4. EXEMPLO DE ACTIVIDADE MDIA PONDERADA E DOS SEUS LIMITES DE CONFIANA Na tabela 6.4.-I esto representadas 6 estimativas independentes da actividade da mesma preparao, com os limites de confiana para 95 por cento e os nmeros de graus de liberdade correspondentes. As condies 1, 2 e 3 da seco 6.2 so satisfeitas. Os valores ln(actividade) e os factores de ponderao so calculados como descrito na seco 6.2.
TABELA 6.4.-I. Anlise de varincia ponderada
actividade estimada (UI/amp.) 18367 18003 18064 17832 18635 18269 Limite inferior (UI/amp.) 17755 17415 17319 17253 17959 17722 Limite superior (UI/amp.) 19002 18610 18838 18429 19339 18834 Graus ln Ponderao de actividade W liberdade M 20 20 20 20 20 20 9,8183 9,7983 9,8017 9,7887 9,8328 9,8130 3777,7 3951,5 2462,5 4003,0 3175,6 4699,5

O erro tipo de ln(actividade mdia) a raiz quadrada do inverso da soma dos factores de ponderao:
SM 1 W (6.2.3.-2.)

e os limites de confiana aproximados so obtidos tomando o antilogaritmo do valor dado pela equao:
M t sM (6.2.3.-3.)

onde o nmero de graus de liberdade associado a t igual soma do nmero de graus de liberdade para os quadrados mdios do erro nos ensaios individuais. 568

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

A homogeneidade das estimativas de actividade avaliada por meio da frmula 6.2.2.-1, que d um valor de 2 de 4,42 com 5 graus de liberdade. Este resultado no significativo (p 0,49) e portanto todas as condies so satisfeitas. O clculo da actividade mdia ponderada para a frmula 6.2.3.-1 d um valor de 9,8085. A frmula 6.2.3.-2 d um desvio padro de 0,00673 e os limites de confiana para 95 por cento aproximados calculados pela frmula 6.2.3.-3, onde t possui 120 graus de liberdade, so de 9,7951 e 9,8218. Tomando o antilogaritmo destes valores, obtemos uma actividade de 18 187 UI/ampola com um intervalo de confiana para 95 por cento entre 17 946 e 18 431 UI/ampola.

Uma anlise de varincia completa implicando a partio de todas as componentes ligeiramente mais complexa porque ela implica uma redefinio de X, com mais colunas, para verificar as hipteses de paralelismo e de linearidade, depois do qual as hipteses lineares podem ser testadas. Para as titulaes baseadas em respostas qualitativas, os efeitos lineares (ordenadas na origem aS, aT, etc e declive comum b) so determinadas maximizando a soma dos tratamentos nln(ai bx) (n r)ln(1 (ai bx)), onde x ln(dose), representa a forma da distribuio e i {S, T, ...}. 7.2. HETEROGENEIDADE DA VARINCIA Nem sempre possvel resolver o problema da heterogeneidade da varincia pela simples transformao das respostas. Uma aproximao possvel consiste na utilizao de uma regresso linear ponderada. Para obter uma estimativa sem distoro (bias) aplica-se s observaes um factor de ponderao proporcional ao inverso do erro das varincias. Como o verdadeiro erro das varincias nem sempre conhecido, pode-se proceder atravs da determinao iteractiva das ponderaes. No entanto, o clculo do intervalo de confiana coloca ainda novos problemas. 7.3. VALORES ABERRANTES E ROBUSTEZ DOS MTODOS O mtodo dos mnimos quadrados descrito neste anexo apresenta o inconveniente de ser extremamente sensvel a resultados aberrantes. Um resultado nitidamente aberrante pode falsear totalmente os resultados. Resolve-se esse problema normalmente, rejeitando esses resultados dos dados do ensaio. Esta pratica pode conduzir rejeio arbitrria de dados, e no isenta de perigos. No fcil propor regras gerais sobre o modo de decidir se uma observao especfica constitui ou no um resultado aberrante, e por isso mtodos mais robustos foram desenvolvidos, que so menos sensveis presena de resultados aberrantes porque atribuem menor peso s observaes que se afastam muito do valor presumido. Estes mtodos colocam, no entanto, outros problemas ligados ao clculo dos intervalos de confiana ou definio de uma funo de ajustamento satisfatria. 7.4. ERROS CORRELACIONADOS A aleatoriedade absoluta nem sempre realizvel ou verdadeiramente sustentvel do ponto de vista prtico. , por isso, frequente que as doses sucessivas de uma srie de diluies apresentem erros correlacionados e que, em consequncia, os limites de confiana sejam demasiado aproximados. Foram desenvolvidos mtodos que permitem ter em ateno este efeito de autocorrelao. 7.5. CURVAS DOSE-RESPOSTA NO LINEARES PROLONGADAS A anlise das curvas dose-resposta no lineares prolongadas coloca um conjunto de problemas estatsticos que indispensvel ter em considerao, e por causa dos quais recomendada a consulta a um especialista. Alguns desses problemas so apresentados sucintamente a seguir. 1) Um exemplo utilizando a funo logstica de 4 parmetros descrito anteriormente. No entanto, igualmente possvel utilizar modelos baseados em funo que dem outras curvas sigmoides. Foi sugerido o emprego de modelos comportando parmetros suplementares de assimetria. 569

7. PARA ALM DESTA MONOGRAFIA


impossvel apresentar uma exposio completa de mtodos estatsticos num texto da Farmacopeia, mas os mtodos anteriormente descritos devem ser normalmente suficientes para a maior parte dos ensaios da farmacopeia. O objectivo desta seco a de tentar trazer uma viso mais global sobre os mtodos alternativos ou mais gerais que foram desenvolvidos. O leitor que estiver interessado convidado a aprofundar o assunto explorando a literatura existente. De qualquer modo, a aplicao de mtodos estatsticos mais especializados dever ser deixada ao cuidado de especialistas. 7.1 MODELOS LINEARES GERAIS Os mtodos descritos neste anexo podem, globalmente, ser descritos como modelos lineares gerais (ou generalistas para poder incluir os mtodos de probits e de logits). O princpio geral consiste na definio de uma matriz de estrutura linear X (ou matriz de planificao) em que cada linha representa uma observao e cada coluna um efeito linear (preparao, bloco, coluna, dose). Por exemplo, o ensaio de quadrado latino do exemplo 5.1.2 poder ser representado por uma matriz de 36 linhas e 13 colunas: 1 coluna para cada preparao, 1 coluna para as 5 doses, 5 colunas para os blocos com excepo do primeiro e 5 colunas para as linhas com excepo da primeira. Todas as colunas, com excepo daquela contendo as doses so preenchidas com o valor 0 ou 1 dependendo da observao corresponder ou no ao efeito considerado. Um vector Y construdo com as observaes (transformadas). As actividades so estimadas com auxlio da frmula (XtX)-1XtY, e fcil de deduzir a estimativa da actividade m atravs do rcio dos efeitos relevantes. O intervalo de confiana calculado pelo teorema de Fieller:
gv12 v22 ts b m2v22
2 v 12 v22

m mL, mU

v11

2mv12 (1 g)

g v11

onde g

t2s2v22 b2

e v11, v22, v12 representam respectivamente os multiplicadores da varincia para o numerador e denominador e o multiplicador da covarincia. Eles so obtidos directamente a partir de (XtX) 1 ou indirectamente fazendo:
Var(a1 a2) Var(a1) Var(a2) 2Cov(a1,a2)

e Cov(a1 a2,b)

Cov(a1,b) Cov(a2,b)

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

5.3. Anlises estatsticas

2) A heterogeneidade da varincia corrente quando as respostas se distribuem numa grande intervalo. Se a anlise ignora esta heterogeneidade, a interpretao dos resultados corre o risco de ser incorrecta e as estimativas distorcidas (biased). Perante um nmero de rplicas limitado o recurso a factores de ponderao proporcionais ao inverso das varincias de erro tem poucas oportunidades de ser fivel. Uma aproximao satisfatria pode ser o clculo de uma funo que exprima uma relao entre a varincia e a resposta mdia. 3) Os procedimentos estatsticos de ajustamento das curvas podem originar estimativas diferentes dependendo das hipteses colocadas quanto homogeneidade da varincia e ao intervalo das respostas utilizado. 4) Em princpio, a igualdade das respostas mxima e mnima, obtidas com as diferentes preparaes includas numa dosagem, pode ser directamente verificada em cada ensaio. No entanto, a interpretao dos resultados destes testes estatsticos pode no ser evidente. Os testes de linearidade e de paralelismo descritos no mtodo de anlise simplificada (exemplo 5.4.1) incluem indirectamente as verificaes de igualdade e de preciso dos limites inferior e superior. 5) Muitos doseamentos incluem os controlos que servem para identificar as respostas limite (inferior e/ou superior), mas estes valores podem no ser coincidir com os limites superior e inferior obtidos pelo ajustamento estatstico a partir da curva dose-resposta prolongada. 6) O mtodo de anlise simplificado descrito no exemplo 5.4.1 fornece intervalos de confiana aproximados.

Outros mtodos podem igualmente ser utilizados para o clculo, como por exemplo o mtodo baseado na ausncia de ajustamento do modelo completamente especificado. Para dados de doseamentos tpicos, com respostas cobrindo o conjunto do intervalo para cada preparao testada, todos os mtodos do resultados similares.

8. TABELAS E MTODOS DE CLCULO


As tabelas contidas nesta seco apresentam os valores crticos correspondentes aos nmeros de graus de liberdade mais usuais. Se determinado valor crtico no figurar, devem ser consultadas tabelas mais detalhadas. Numerosos programas informticos contm funes estatsticas, e o seu emprego prefervel ao uso das tabelas aqui apresentadas. Uma outra aproximao possvel consiste na utilizao dos mtodos de clculo descritos a seguir a cada tabela, para determinar a probabilidade correspondente a uma varivel estatstica e a um nmero de graus de liberdade dados. 8.1 DISTRIBUIO DE F Se o valor observado superior ao valor indicado na tabela, ele considerado como significativo (linhas superiores, p = 0,05) ou muito significativo (linhas inferiores, p = 0,01). df1 o nmero de graus de liberdade do numerador e df2 o nmero de graus de liberdade do denominador. Mtodo de clculo: seja F o rcio-F e df1 e df2 como descrito acima. Seja pi p 3,14159265358979... O mtodo seguinte permite o clculo do valor p.

5. Textos gerais

df1 df2 10

10

12

15

20

4,965 10,044

4,103 7,559 3,885 6,927 3,682 6,359 3,493 5,849 3,385 5,568 3,316 5,390 3,183 5,057 2,996 4,605

3,708 6,552 3,490 5,953 3,287 5,417 3,098 4,938 2,991 4,675 2,922 4,510 2,790 4,199 2,605 3,782

3,478 5,994 3,259 5,412 3,056 4,893 2,866 4,431 2,759 4,177 2,690 4,018 2,557 3,720 2,372 3,319

3,326 5,636 3,106 5,064 2,901 4,556 2,711 4,103 2,603 3,855 2,534 3,699 2,400 3,408 2,214 3,017

3,217 5,386 2,996 4,821 2,790 4,318 2,599 3,871 2,490 3,627 2,421 3,473 2,286 3,186 2,099 2,802

3,072 5,057 2,849 4,499 2,641 4,004 2,447 3,564 2,337 3,324 2,266 3,173 2,130 2,890 1,938 2,511

2,978 4,849 2,753 4,296 2,544 3,805 2,348 3,368 2,236 3,129 2,165 2,979 2,026 2,698 1,831 2,321

2,913 4,706 2,687 4,155 2,475 3,666 2,278 3,231 2,165 2,993 2,092 2,843 1,952 2,563 1,752 2,185

2,845 4,558 2,617 4,010 2,403 3,522 2,203 3,088 2,089 2,850 2,015 2,700 1,871 2,419 1,666 2,039

2,774 4,405 2,544 3,858 2,328 3,372 2,124 2,938 2,007 2,699 1,932 2,549 1,784 2,265 1,571 1,878

2,538 3,909 2,296 3,361 2,066 2,868 1,843 2,421 1,711 2,169 1,622 2,006 1,438 1,683 1,000 1,000

12

4,747 9,330

15

4,543 8,683

20

4,351 8,096

25

4,242 7,770

30

4,171 7,562

50

4,034 7,171

3,841 6,635

570

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

8.2. DISTRIBUIO DE T Se o valor observado superior ao valor indicado na tabela, ele considerado significativo (p 0,05) ou muito significativo (p 0,01).
df 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 18 20 p 0,05 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,179 2,145 2,120 2,101 2,086 p 0,01 63,656 9,925 5,841 4,604 4,032 3,707 3,499 3,355 3,250 3,169 3,055 2,977 2,921 2,878 2,845 df 22 24 26 28 30 35 40 45 50 60 70 80 90 100 p 0,05 2,074 2,064 2,056 2,048 2,042 2,030 2,021 2,014 2,009 2,000 1,994 1,990 1,987 1,984 1,960 p 0,01 2,819 2,797 2,779 2,763 2,750 2,724 2,704 2,690 2,678 2,660 2,648 2,639 2,632 2,626 2,576

O valor t (p = 0,05) para um dado nmero de graus de liberdade df obtido pelo mtodo seguinte, que exacto at 6 casas decimais.
t = 1.959964 1 2.37228 / df + 2.82202 / df ^ 2 + 2.56449 / df ^ 3 + 1.51956 / df ^ 4 + 1.02579 / df ^ 5 + 0.44210 / df ^ 7

8.3. DISTRIBUIO DE
df 1 2 3 4 5 6 7 8 p 0,05 3,841 5,991 7,815 9,488 11,070 12,592 14,067 15,507 16,919 18,307 p

2
df 11 12 13 14 15 16 20 25 30 40 p 0,05 19,675 21,026 22,362 23,685 24,996 26,296 31,410 37,652 43,773 55,758 p 0,01 24,725 26,217 27,688 29,141 30,578 32,000 37,566 44,314 50,892 63,691 5. Textos gerais

0,01 6,635 9,210 11,345 13,277 15,086 16,812 18,475 20,090 21,666 23,209

Mtodos de clculo: o valor p para determinado t com df graus de liberdade obtido pelos mtodos descritos na seco 8.1 com F = t2, df1 = 1 e df2 = df.

9 10

Se df1 for par

Se df1 for impar e df2 par

Se df1 e df2 forem mpares

x = df1 / (df1 + df2/F) s=1 t=1 for i = 2 to (df1 - 2) step 2 t = t*x* (df2 + i - 2) /i s=s+t next i p = s*(1 - x) ^ (df2 /2)

x = df2 / (df2 + df1 * F) s=1 t=1 for i = 2 to (df2 - 2) step 2 t = t*x* (df1 + i - 2) /i s=s+t next i p = 1 - s* (1 - x) ^ (df1 /2)

x = atn (sqr (df1 * F / df2)) cs = cos (x) sn = sin (x) x = x /2 s=0 t = sn * cs / 2 v=0 w=1 for i = 2 to (df2 - 1) step 2 s =s + t t = t * i /(i + 1) * cs * cs next i for i = 1 to (df1 - 2) step 2 v=v+w w = w*(df2 + i) / (i + 2) sn * sn next i p = 1 + (t * df2 * v-x-s) / pi * 4

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

571

5.3. Anlises estatsticas

Se um valor observado superior ao valor indicado na tabela, ele considerado significativo (p = 0,05) ou muito significativo (p = 0,01). Mtodo de clculo: seja x2 o valor da varivel 2 e df tal como descrito acima. O mtodo seguinte permite calcular o valor de p.
Se df for par s=0: 5. Textos gerais t = exp (-x2 / 2) for i = 2 to df step 2 s=s+t t = t* x2 / i next i p=1-s Se df mpar x = sqr (x2) : s=0 t = x* exp (- x2/2) / sqr (pi / 2) for i = 3 to df step 2 s=s+t t = t* x2 / i next i p = 1 - s - 2* phi (x)

x negativo, pode-se utilizar a frmula indicada acima. Este mtodo assume que o computador pode apresentar cerca de 15 casas decimais. Se o nmero de dgitos for inferior ou superior a 15, este mtodo necessita de alguns ajustamentos simples.
s=0 t=x i=1 repeat s=s+t i=i+2 t = t*x*x/i until t<1E-16 phi = 0.5+s*exp(-x*x/2)/sqr(2*pi)

8.5. PERMUTAES ALEATRIAS Neste mtodo phi a distribuio normal reduzida cumulativa (ver seco 8.4). 8.4. DISTRIBUIO DE ? (DISTRIBUIO NORMAL REDUZIDA CUMULATIVA)
x 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95

As permutaes aleatrias so indispensveis no caso de ensaios de blocos completos. O algoritmo representado a seguir mostra como obter uma permutao aleatria de N tratamentos por meio da funo de clculo de um sistema informtico. 1. inscrever na linha os N tratamentos possveis. 2. escolher aleatoriamente um nmero inteiro r tal que 1 r N. 3. permutar o r-simo tratamento e N-simo tratamento da linha. 4. fazer N N 1 e repetir os passos 2 a 4 at N 1.

0,500 0,520 0,540 0,560 0,579 0,599 0,618 0,637 0,655 0,674 0,691 0,709 0,726 0,742 0,758 0,773 0,788 0,802 0,816 0,829

x 1,00 1,05 1,10 1,15 1,20 1,25 1,30 1,35 1,40 1,45 1,50 1,55 1,60 1,65 1,70 1,75 1,80 1,85 1,90 1,95

0,841 0,853 0,864 0,875 0,885 0,894 0,903 0,911 0,919 0,926 0,933 0,939 0,945 0,951 0,955 0,960 0,964 0,968 0,971 0,974

x 2,00 2,05 2,10 2,15 2,20 2,25 2,30 2,35 2,40 2,45 2,50 2,55 2,60 2,65 2,70 2,75 2,80 2,85 2,90 2,95

0,977 0,980 0,982 0,984 0,986 0,988 0,989 0,991 0,992 0,993 0,994 0,995 0,995 0,996 0,997 0,997 0,997 0,998 0,998 0,998

O exemplo seguinte, de 6 tratamentos, ilustra este algoritmo.

1. 2. 3. 4. 2. 3. 4. 2. 3. 4. 2. 3. 4. 2. 3. 4.

N r

6 2

S1

S2

S3

T1

T2

T3

S1 N r 5 4 S1 N r 4 4 S1 N r 3 1 S3 N r 2 1 T3 N 1

T3

S3

T1

T2

S2

T3 S3 T2

T1 S2

T3 S3 T2 T1 S2

T3 S1 T2 T1 S2

Para os valores de x negativos, o valor de obtm-se a partir da tabela tomando 1-(-x). Mtodo de clculo: Seja x o valor da varivel x. O mtodo seguinte permite obter o valor de correspondente se 0 x 8,15. Se x 8,15 o valor de pode ser igualado a 1. Se 572

S3

S1

T2

T1

S2

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

8.6. QUADRADOS LATINOS O exemplo seguinte mostra como utilizar 3 permutaes independentes para obter um quadrado latino. 1). gerar uma permutao aleatria de N tratamentos possveis (ver seco 8.5):
T3 S3 S1 T2 T1 S2 2 3 6 1 4 5

3 T3 S2 T1 T2 S1 S3

4 S3 T3 S2 T1 T2 S1

6 S1 S3 T3 S2 T1 T2

2 T2 S1 S3 T3 S2 T1

5 T1 T2 S1 S3 T3 S2

1 S2 T1 T2 S1 S3 T3

T3 S2 T1 T2 S1 S3

S3 T3 S2 T1 T2 S1

S1 S3 T3 S2 T1 T2

T2 S1 S3 T3 S2 T1

T1 T2 S1 S3 T3 S2

S2
3

S2 T1 S3 T3 T2

T2 S1 S2 T1 S3

T3 S2 S1 S3 T1

S3 T3 T2 S1 S2

T1 T2 T3 S2 S1

S1 S3 T1 T2 T3

T1
4

T2
5

S1
6

S3 T3

3). gere de seguida 2 permutaes aleatrias independentes dos nmeros 1 a N: uma para as linhas:
2 3 6 1 4 5

9. GLOSSRIO DE SMBOLOS E TERMOS


9.1. GLOSSRIO DE SMBOLOS
Smbolo a Definio Interseco da regresso linear das respostas com a dose ou ln(dose) Declive da regresso linear da resposta em dose, ou logaritmo da dose Nmero de nveis de doses para cada preparao (excluindo o branco nos ensaios do modelo de relao de declives) Base de logaritmos naturais (= 2,71828182845905...) 1 C Nmero de preparaes num ensaio, incluindo a preparao padro Clculo usado no teorema de Fieller: g C Actividade estimada obtida como o rcio dos efeitos nos modelos lineares Nmero de rplicas de cada tratamento Probabilidade de que determinado clculo seja superior ao valor observado. Igualmente usado no rcio r/n na probabilidade iteractiva Nmero de unidades respondendo em cada grupo tratado em ensaios dependentes de respostas qualitativas Estimativa do desvio padro s2 Estimativa da varincia residual dada pelo erro mdio quadrtico na anlise de varincia Estatstica de Student (tabela 8.2) Resposta observada na anlise de quatro parmetros

e uma para as colunas:


b 3 4 6 2 5 1 d

4). O quadrado latino pode agora ser encontrado colocando por ordem as linhas e colunas do quadrado latino simples de acordo com as 2 permutaes para as linhas e colunas:

e g h m n p

s s2 t u

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

573

5. Textos gerais

2). pode construir-se um quadrado latino simples rodando para a direita os termos desta permutao. Inscreva na primeira linha a permutao obtida na etapa 1. A segunda linha constituda pela mesma permutao, mas em que os termos foram transpostos para a direita, o tratamento situado na extrema direita vem ocupar o espao livre na extrema esquerda. Repita esta operao em cada linha at que todos os tratamentos apaream uma vez em cada coluna:

1 1 S1

2 T3

3 T2

4 T1

5 S3

6 S2

5.3. Anlises estatsticas

Smbolo v11, v12, v22 w x y A B C

Definio Multiplicadores de (co)varincia para o numerador e denominador do rcio m no teorema de Fieller Coeficiente de ponderao O ln(dose) Resposta individual ou transformada Actividade assumida das amostras quando se preparam doses Resposta mdia dos brancos nos ensaios de de relao de declives Estatstica usada no clculo dos limites de confiana: 1 C 1 g Resposta mdia de cada coluna do desenho do quadrado latino Resposta total no tempo I, tempo II no ensaio de permutao duplo Rcio de 2 estimativas independente de varincia seguindo a distribuio-F (tabela 8.1.) Valores do tratamento usados na anlise de varincia dos ensaios de relao de declives. Multiplicadores usados na anlise de varincia dos ensaios de linhas paralelas. Multiplicadores usados na anlise de varincia dos ensaios de relao de declives. Nos ensaios de linhas paralelas, o ln do rcio entre doses adjacentes. Nos ensaios de relao de declives, o intervalo entre doses adjacentes. Valores lineares usados na anlise de varincia dos ensaios de relao de declives Termo de correco utilizado no clculo da soma de quadrados numa anlise de varincia Amplitude do intervalo de confiana em logaritmos Contrastes lineares de padres e amostras ln relao de da actividade de uma amostra especfica Nmero total de respostas num ensaio ( Soma do padro e das amostras Actividade estimada de uma amostra especfica Relao de da actividade de uma amostra especfica Resposta mdia em cada linha 1 a n do desenho do quadrado latino, ou em cada bloco num desenho de blocos aleatrio Padro Resposta mdia menor dose 1 at maior d de um padro S Soma dos quadrados de uma fonte especfica de variao Amostras em ensaio Resposta mdia menor dose 1 at maior d de um padro T Coeficiente de varincia no clculo dos limites de confiana Factor de ponderao usada na combinao de resultados de ensaios Estrutura linear ou desenho matricial usado para gerar modelos lineares Vector representativo das respostas (transformadas) nos modelos lineares gerais dh)

Smbolo Z

Definio A primeira derivada de Assmptota superior da curva ln(dose)-resposta na anlise de quatro parmetros Factor de declive da curva ln(dose)-resposta na anlise de quatro parmetros O ln(dose) correspondente a 50 por cento de resposta no modelo de quatro parmetros Assmptota inferior da curva ln(dose)-resposta na anlise de quatro parmetros 3,141592653589793238... Distribuio normal reduzida cumulativa (tabela 8.4) Estatstica chi-quadrado (tabela 8.3)

Cp,...,Cn D1, D2 F GS,GT,... HP, HL HB, HI I


5. Textos gerais

9.2. GLOSSRIO DE TERMOS Correspondncia utilizada entre a terminologia portuguesa e a inglesa (5).
Terminologia em lngua portuguesa actividade actividade atribuda actividade declarada actividade estimada actividade real actividade rotulada aleatoriedade amplitude distoro coeficiente de regresso conjunto curvatura oposta desenho de 5 ponto com zero comum desvio padro desvio padro da mdia ensaio ensaios qualitativos erro das varincias erro padro fluxograma limite de confiana mdia no ponderada mdia ponderada mdia(s) mtodo das semelhanas mximas modelo de linhas paralelas modelo de relao de declives no paralelismo ordenao permutao probabilidade iterativa probabilidade iterativa funcional relao de actividade soma dos quadrados para o erro termo de erro termo de erro mdio quadrtico termo de no-paralelismo teste transformao probabilstica iterativa Terminologia em lngua inglesa potency assigned potency stated potency estimated potency true potency labelled potency randomisation range bias pooled regression coeficient opposite curvature common-zero 5 point design standard deviation standard deviation of the mean assay quantal assays error variances standard error flowchart confidence interval unweighted mean weighted mean mean(s) maximum likehood method parallel-line model slope-ratio model non-parallelism array cross-over probit working probit potency ratio sum of squares for error error term error-mean square term non-parallelism term test probit transformation

JS, JT,... K L LS, LT,... M N PS,PT,.... R R R1 ... Rn

S S1,...,Sd SS T, U, V, ... T1,...,Td V W X Y

(5) Esta sub seco aqui introduzida para facilidade de consulta, pelo leitor, da bibliografia em ingls e compreenso da terminologia adoptada nesta rea pela Comisso da Farmacopeia Portuguesa, a partir da 6 edio. Em estatstica est muito consagrada a terminologia em ingls, e foi nossa inteno proceder adequao terminologia portuguesa, pelo que apresenta aqui um glossrio de termos com a correspondncia verso inglesa da Farmacopeia Europeia.

574

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.3. Anlises estatsticas

10. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA


Esta seco contm uma lista de referncias bibliogrficas de leitura recomendada para um estudo mais aprofundado do assunto. Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3a Ed. Cambridge University Press, Cambridge. Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series A 135, 370-384. DeLean, A., Munson, P. J. e Rodbard, D. (1978). Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: Application to bioassay, radioligand assay and physiological dose-response curves, Am J. Physiol. 235 (2): E97-E102.

Finney, D. J. (1978). Statistical method in biological assay, 3a Ed. Griffin, London. Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and Practice of Statistics in Biological Research, 2 Ed. W. H. Freeman & Co, New York. Peace, K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel. Bowerman, B. L. & OConnell (1990). Linear Statistical Models an Applied Approach, 2 Ed. PWS-KENT Publishing Company, Boston. Govindarajulu, Z. (2001). Statistical Techniques in Bioassay, 2 Ed, Karger, New York.

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5. Textos gerais

5.4. SOLVENTES RESIDUAIS


1. Introduo .................................................................. 2. mbito da presente nota explicativa .......................... 3. Princpios gerais.......................................................... 3.1. Classificao dos solventes residuais em funo da avaliao do risco .............................. 3.2. Mtodos que permitem estabelecer os limites de exposio ........................................................ 3.3. Opes que permitem descrever os limites dos solventes da classe 2 .......................................... 3.4. Procedimentos analticos .................................. 3.5. Declarao de conformidade dos limites em solventes residuais .............................................. 4. Limites de solventes residuais .................................... 4.1. Solventes a evitar................................................ 579 580 580 580 580 580 581 581 581 581 4.2. Solventes de utilizao limitada ........................ 4.3. Solventes com baixo potencial txico................ 4.4. Solventes para os quais no foram encontrados dados toxicolgicos adequados .......................... Glossrio Anexo 1: lista de solventes includos nesta nota explicativa .................................................... Anexo 2: informaes complementares...................... A2.1: regulamentao ambiental para os solventes orgnicos volteis .............. A2.2: solventes residuais nos produtos farmacuticos .................................... Anexo 3: mtodos relativos ao estabelecimento de limites de exposio ................................ 582 582 582

583 585 585 585 585


5. Textos gerais

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5.4. Solventes residuais

5.4. SOLVENTES RESIDUAIS


LIMITAO DOS TEORES DE SOLVENTES RESIDUAIS NAS SUBSTNCIAS ACTIVAS, NOS EXCIPIENTES E NOS MEDICAMENTOS
A Conferncia Internacional para a Harmonizao (ICH) (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) adoptou um documento intitulado Impurezas: Nota explicativa relativa aos solventes residuais, que prescreve os limites do teor de solventes que podem permanecer nas substncias activas, nos excipientes e nos medicamentos aps fabrico. Esta nota explicativa, cujo texto reproduzido a seguir, exclui os produtos j comercializados. Contudo, a Farmacopeia Portuguesa aplica s substncias activas, aos excipientes e aos medicamentos existentes os princpios enunciados na nota explicativa, tenham estes sido objecto, ou no, de uma monografia na Farmacopeia. conveniente pesquisar, no conjunto das substncias e produtos, eventuais vestgios de solventes que tenham subsistido aps fabrico. Quando os limites a aplicar esto conformes aos a seguir fornecidos, os ensaios de solventes residuais no so, regra geral, mencionados nas monografias especficas, uma vez que os solventes utilizados podem diferir de fabricante para fabricante e os requisitos deste captulo geral so postos em prtica pela aplicao da monografia geral Substncias para uso farmacutico. Por consequncia, a Autoridade competente deve estar informada dos solventes utilizados durante o processo de fabrico. Estas informaes devem figurar igualmente no processo apresentado para pedido de obteno de um certificado de conformidade s monografias da Farmacopeia Portuguesa e so mencionadas no certificado. Quando se utilizam solventes da classe 3, a substncia pode ser submetida a um ensaio de perda por secagem ou pode ser efectuada uma determinao especfica. Se um solvente da classe 3 apresenta um limite justificado e autorizado superior a 0,5 por cento, necessrio proceder determinao especfica desse solvente. Em caso de utilizao de solventes residuais das classes 1 e 2 (ou solventes da classe 3 cujo teor seja superior a 0,5 por cento), deve ser aplicada, sempre que possvel, a metodologia descrita no mtodo geral (2.4.24.). Nos restantes casos, deve recorrer-se a um mtodo validado apropriado. Quando efectuada a determinao quantitativa de um solvente residual, esta tida em conta para o clculo do teor da substncia, a no ser que tambm se efectue um ensaio de perda por secagem.

IMPUREZAS: NOTA EXPLICATIVA RELATIVA AOS SOLVENTES RESIDUAIS (CSP/ICH/283/95)


1. INTRODUO 2. MBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA 3. PRINCPIOS GERAIS 3.1. Classificao dos solventes residuais em funo da avaliao do risco 3.2. Mtodos que permitem estabelecer os limites de exposio 3.3. Opes que permitem descrever os limites dos solventes da classe 2 3.4. Procedimentos analticos 3.5. Declarao de conformidade dos limites em solventes residuais 4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS 4.1. Solventes a evitar 4.2. Solventes de utilizao limitada 4.3. Solventes com baixo potencial txico 4.4. Solventes para os quais no foram encontrados dados toxicolgicos adequados GLOSSRIO ANEXO 1. Lista dos solventes includos nesta nota explicativa ANEXO 2. Informaes complementares A2.1. Regulamentao ambiental para os solventes orgnicos volteis A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacuticos ANEXO 3. Mtodos relativos ao estabelecimento de limites de exposio

1. INTRODUO A presente nota explicativa tem por objectivo recomendar as quantidades de solventes residuais admissveis nos produtos de utilizao farmacutica por forma a excluir qualquer risco para a sade do paciente. Preconiza a utilizao de solventes de menor toxicidade e descreve, para alguns solventes, as taxas residuais consideradas aceitveis sob um ponto de vista toxicolgico. Os solventes residuais nos produtos de utilizao farmacutica so aqui definidos como produtos qumicos orgnicos volteis utilizados ou produzidos no fabrico de substncias activas e excipientes ou entrando na preparao de medicamentos. Os processos de fabrico correntes no permitem a eliminao completa dos solventes. A escolha apropriada do solvente para a sntese da substncia activa pode melhorar o rendimento ou determinar caractersticas como a forma cristalina, a pureza e a solubilidade. Assim, o solvente pode, por vezes, constituir um elemento crtico do processo de sntese. A presente nota explicativa no se refere aos solventes exclusivamente utilizados como excipientes nem aos solvatos. , contudo, conveniente avaliar e justificar o teor em solventes de tais produtos. Sabendo que os solventes residuais no apresentam qualquer vantagem teraputica, conveniente elimin-los, sempre que possvel, para satisfazer s exigncias da qualidade (especificaes, Boas Prticas de Fabrico de Medicamentos). Os medicamentos no devem apresentar teores de solventes residuais superiores aos previstos nos dados de segurana. Os solventes da classe 1 (quadro 1), pela elevada toxicidade que possuem, no devem ser utilizados na fabrico de substncias activas, de excipientes, ou de medicamentos, a no ser que se justifique claramente aps uma avaliao risco/benefcio. Os solventes da classe 2 (quadro 2), cuja toxicidade menor, devem ter utilizao limitada, tendo em vista a proteco dos pacientes de reaces adversas. Idealmente, devem ser utilizados sempre que possvel os solventes da classe 3 (quadro 3), menos txicos. A lista completa dos solventes figura no Anexo 1 da presente nota explicativa.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

579

5. Textos gerais

5.4. Solventes residuais

As listas apresentadas neste documento no so exaustivas, podendo outros solventes em uso actualmente vir a ser acrescentados s diferentes listas. Os limites recomendados para os solventes das classes 1 e 2, ou a classificao dos solventes, podem variar em funo do aparecimento de novos dados de segurana. Os dados de segurana que permitem suportar o pedido de colocao no mercado de um novo medicamento, contendo um novo solvente, podem-se inspirar nas informaes apresentadas neste documento ou nas Guideline ICH-Q3A (Impurezas nas novas substncias activas) Guideline ICH-Q3B (Impurezas nos novos medicamentos), ou, ainda, no conjunto dos trs documentos. 2. MBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA Esta nota faz o inventrio dos solventes residuais presentes nas substncias activas, nos excipientes e nos medicamentos. Por consequncia, deve ser realizado um ensaio dos Solventes residuais sempre que os processos de fabrico ou de purificao decorrem na presena de tais solventes. A pesquisa incidir apenas sobre os solventes utilizados ou produzidos durante o processo de fabrico ou na purificao das substncias activas, dos excipientes ou dos medicamentos. Mesmo que os fabricantes possam escolher efectuar a determinao sobre o medicamento, possvel utilizar um mtodo cumulativo que permite calcular os teores de solventes residuais no medicamento a partir dos teores existentes nos diferentes elementos constitutivos. Se este clculo der um resultado inferior ou igual ao nvel de solvente indicado nesta nota explicativa, a determinao dos solventes residuais no medicamento no exigida. Pelo contrrio, se o teor de solventes residuais for superior ao nvel recomendado, o ensaio deve ser efectuado no medicamento para assegurar que o teor de solventes residuais foi conduzido a valores admissveis durante a formulao. Os medicamentos devem igualmente ser submetidos a este ensaio sempre que um solvente for utilizado durante o fabrico. A presente nota explicativa no se aplica s novas substncias activas, excipientes ou medicamentos potenciais utilizados nos estdios de desenvolvimento de pesquisa clnica, nem aos medicamentos j comercializados. A presente nota explicativa aplica-se a todas as formas farmacuticas e a todas as vias de administrao. Teores elevados de solventes residuais so admissveis em certos casos, por exemplo em tratamentos de curta durao (30 dias ou menos) ou em aplicaes tpicas. Estes teores devem ser objecto de uma justificao caso a caso. Para complementar as informaes relativas aos solventes residuais ver o anexo 2. 3. PRINCPIOS GERAIS 3.1. CLASSIFICAO DOS SOLVENTES RESIDUAIS EM FUNO DA AVALIAO DO RISCO O International Program on Chemical Safety (IPCS) utiliza a expresso dose diria tolervel (DDT) (em ingls TDI = tolerable daily intake) para descrever os limites de exposio aos produtos qumicos txicos. Para este mesmo conceito, a OMS e outras autoridades ou institutos (nacionais ou internacionais) de sade pblica utilizam a expresso dose diria admissvel (DDA) (em ingls ADI = acceptable daily intake). A exposio diria admissvel (EDA) (em ingls PDE = Permitted daily intake) a nova expresso consagrada para o presente documento, a qual permite evitar qualquer confuso entre os diferentes valores de DDA para uma mesma substncia. 580

Os solventes residuais referidos neste documento esto listados no anexo 1 por nomes e estrutura, e foram avaliados em funo do risco que apresentam para a sade humana. Subdividem-se em trs classes: Classe 1: Solventes a evitar. Carcinognios humanos conhecidos ou fortemente suspeitos, perigosos para o ambiente. Classe 2: Solventes cuja utilizao est submetida a limitaes. Carcinognios animais no genotxicos ou eventuais agentes causadores de outros efeitos txicos irreversveis como a neurotoxicidade ou a teratogenicidade. Solventes suspeitos de estarem na origem de outros efeitos txicos importantes mas reversveis. Classe 3: Solventes com baixo potencial txico. Solventes com baixo potencial txico para o homem no sendo exigido qualquer limite em relao exposio. Os solventes da classe 3 apresentam valores de EDA iguais ou superiores a 50 mg. 3.2. MTODOS QUE PERMITEM ESTABELECER OS LIMITES DE EXPOSIO O mtodo utilizado para estabelecer os valores de EDA aos solventes residuais est apresentado no Anexo 3. Os resumos dos dados de toxicidade que serviram para estabelecer estes valores esto publicados em Pharmeuropa, Vol. 9, n 1, suplemento do ms de Abril de 1997. 3.3. OPES QUE PERMITEM DESCREVER OS LIMITES DOS SOLVENTES DA CLASSE 2 Duas opes permitem fixar os limites que se aplicam aos solventes da classe 2. Opo 1: Podem ser utilizados os limites de concentrao (em ppm) indicados no quadro 2. Estes limites foram determinados com ajuda da expresso (1) a seguir apresentada e tomam como referncia uma dose de 10 g administrada quotidianamente.
Concentrao (ppm) = 1000 EDA dose (1)

5. Textos gerais

Neste caso o valor da EDA indicado em mg/dia e a dose em g/dia. Estes limites so considerados aceitveis para todas as substncias, excipientes ou medicamentos. Em consequncia, esta opo pode ser aplicada quando a dose diria desconhecida ou varivel. Se o conjunto dos excipientes e das substncias activas de uma formulao satisfizerem aos limites da opo 1 estes componentes podem ser utilizados em quaisquer propores. No necessrio qualquer outro clculo desde que a dose diria no ultrapasse 10 g. Os medicamentos administrados em doses superiores a 10 g por dia devem ser considerados na opo 2. Opo 2: No se considera necessrio que cada componente do medicamento satisfaa aos limites indicados na opo 1. O valor da EDA, expresso em mg/dia, tal como se mostra no quadro 2, pode ser utilizado com a dose diria mxima conhecida e a equao (1), atrs apresentada, pode ser usada para determinar a concentrao de solvente residual autorizada num medicamento. Tais limites so considerados aceitveis se ficar demonstrado que a presena de solvente residual foi FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.4. Solventes residuais

reduzida ao mnimo possvel. Os limites devem ser realistas em relao preciso analtica, capabilidade no decurso do fabrico e a uma variao razovel no processo de fabrico. Em suma, os limites devem reflectir os padres de fabrico actuais. possvel utilizar a opo 2 adicionando as quantidades de solventes residuais presentes em cada um dos componentes do medicamento. A soma das quantidades de solventes admissveis por dia deve ser inferior indicada pelo valor de EDA. A ttulo de exemplo, consideremos a aplicao das opes 1 e 2 ao acetonitrilo contido num medicamento. A exposio diria admissvel ao acetonitrilo de 4,1 mg/dia, por consequncia o limite preconizado pela opo 1 de 410 ppm. A quantidade mxima de medicamento administrada por dia de 5,0 g e este medicamento contm dois excipientes. A composio do medicamento e o clculo do teor mximo em acetonitrilo residual esto apresentados no quadro seguinte:
Componente Substncia activa Excipiente 1 Excipiente 2 Medicamento Quantidade na Formulao 0,3 g 0,9 g 3,8 g 5,0 g Teor em acetonitrilo 800 ppm 400 ppm 800 ppm 728 ppm Exposio diria 0,24 mg 0,36 mg 3,04 mg 3,64 mg

3, pode utilizar-se um mtodo no especfico, como por exemplo a perda por secagem. A validao dos mtodos de determinao dos nveis de solventes residuais deve obedecer s normas ICH seguintes: Text of Analytical Procedures e Extension on Validation of Analytical Procedures. 3.5. DECLARAO DE CONFORMIDADE DOS LIMITES EM SOLVENTES RESIDUAIS A fim de respeitar os critrios descritos nesta nota explicativa, os fabricantes de produtos farmacuticos necessitam de informaes sobre os teores de solventes residuais contidos nos excipientes e substncias activas. As seguintes afirmaes so dadas como exemplos aceitveis da informao que deve ser facultada pelos fornecedores de excipientes ou de substncias activas aos fabricantes de produtos farmacuticos. Conforme o caso, o fornecedor deve escolher uma das seguintes:
5. Textos gerais

provavelmente s esto presentes solventes da classe 3. A perda por secagem inferior a 0,5 por cento, provavelmente s esto presentes os solventes X, Y, da classe 2. Todos se encontram abaixo dos limites preconizados na opo 1. (Neste caso o fornecedor deve indicar o nome dos solventes da classe 2 representados por X, Y, ), provavelmente s esto presentes os solventes X, Y, da classe 2 e solventes da classe 3. Os teores de solventes residuais da classe 2 encontram-se abaixo dos limites preconizados na opo 1 e os teores dos solventes residuais da classe 3 so inferiores a 0,5 por cento. Se solventes da classe 1 estiverem provavelmente presentes, devem ser identificados e quantificados. Provavelmente presente refere-se simultaneamente ao solvente utilizado no passo final do fabrico e aos solventes que so usados no decurso das etapas precedentes do fabrico e que no so removidos sistematicamente recorrendo a um processo validado. Se solventes da classe 2 ou classe 3 estiverem presentes em quantidade, respectivamente, superior ao limite da opo 1 ou superior a 0,5 por cento, devem ser identificados e quantificados. 4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS 4.1. SOLVENTES A EVITAR Os solventes da classe 1 no devem ser utilizados no fabrico de substncias activas, excipientes e medicamentos devido sua toxicidade inaceitvel ou ao seu efeito nocivo no ambiente. Contudo, se a utilizao destes solventes for incontornvel para a produo de um medicamento que corresponda a um avano teraputico importante, os seus teores no devem ultrapassar os valores apresentados no quadro 1, salvo excepo justificada. O 1,1,1-tricloroetano est includo no quadro 1 devido ao seu efeito nocivo sobre o ambiente. O limite assinalado de 1500 ppm est fundamentado na avaliao dos dados de segurana.
QUADRO 1 Solventes da classe 1 em produtos farmacuticos (solventes que devem ser evitados) Solvente Benzeno Tetracloreto de carbono 1,2-Dicloroetano 1,1-Dicloroetano 1,1,1-Tricloroetano Concentrao limite (ppm) 2 4 5 8 1500 Nocividade Carcinognico Txico e nocivo para o ambiente Txico Txico Nocivo para o ambiente

O excipiente 1 satisfaz ao limite imposto pela opo 1, mas a substncia activa, o excipiente 2 e o medicamento no correspondem s exigncias deste limite. No entanto, o medicamento satisfaz ao limite da opo 2 (4,1 mg por dia) e, consequentemente, s recomendaes desta nota explicativa. Consideremos um segundo exemplo de acetonitrilo residual. A quantidade mxima de um medicamento administrada diariamente de 5,0 g e este medicamento contm dois excipientes. A composio do medicamento e o clculo do teor de acetonitrilo residual esto indicadas no quadro seguinte:
Componente Substncia activa Excipiente 1 Excipiente 2 Medicamento Quantidade na Formulao 0,3 g 0,9 g 3,8 g 5,0 g Teor em acetonitrilo 800 ppm 2000 ppm 800 ppm 1016 ppm Exposio diria 0,24 mg 1,80 mg 3,04 mg 5,08 mg

Neste caso, acontece que pela soma dos teores de cada constituinte, o medicamento no respeita nem o limite da opo 1, nem o da opo 2. O fabricante pode ento analisar o medicamento com vista a saber se o processo de fabrico permitiu reduzir o teor de acetonitrilo. Se o teor de acetonitrilo no foi reduzido para o limite autorizado durante a formulao, o fabricante deve tomar outras medidas para reduzir a quantidade de acetonitrilo no medicamento. Se todos estes procedimentos no permitirem a reduo do teor de solvente residual, o fabricante pode, a ttulo excepcional, relatar as medidas tomadas para reduzir o teor de solvente para o limite preconizado e apresentar uma anlise avaliadora dos riscos e dos benefcios que justifiquem a utilizao do medicamento com um teor de solvente residual superior ao limite autorizado. 3.4. PROCEDIMENTOS ANALTICOS Os teores de solventes residuais so habitualmente determinados por tcnicas cromatogrficas, como, por exemplo, a cromatografia em fase gasosa. Para determinar os teores de solventes residuais conveniente aplicar, na medida do possvel, os procedimentos harmonizados descritos nas farmacopeias. Em caso de impossibilidade, os fabricantes podem escolher um procedimento analtico validado e apropriado a uma aplicao particular. Em presena de solventes exclusivamente da classe FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

581

5.4. Solventes residuais

4.2. SOLVENTES DE UTILIZAO LIMITADA Os solventes apresentados no quadro 2 devem estar limitados nos produtos farmacuticos, devido sua toxicidade intrnseca. Os valores das EDA so apresentados com a aproximao de 0,1 mg/dia e as concentraes so apresentadas com a aproximao de 10 ppm. Os valores apresentados no reflectem necessariamente a preciso analtica da determinao. A preciso deve ser calculada e fazer parte da validao do mtodo.
QUADRO 2 Solventes da classe 2 em produtos farmacuticos
Solvente Acetonitrilo Ciclo-hexano Clorobenzeno Clorofrmio 1,2-Dicloroeteno Diclorometano N,N-Dimetilacetamida N,N-Dimetilformamida 1,2-Dimetoxietano 1,4-Dioxano Etilenoglicol 2-Etoxietanol Formamida Hexano Metanol Metilbutilcetona Metilciclo-hexano N-Metilpirrolidona 2-Metoxietanol Nitrometano Piridina Sulfolano Tetra-hidrofurano Tetralina Tolueno 1,1,2-Tricloroetano Xileno* EDA (mg/dia) 4,1 38,8 3,6 0,6 18,7 6,0 10,9 8,8 1,0 3,8 6,2 1,6 2,2 2,9 30,0 0,5 11,8 5,3 0,5 0,5 2,0 1,6 7,2 1,0 8,9 0,8 21,7 Concentrao limite (ppm) 410 3880 360 60 1870 600 1090 880 100 380 620 160 220 290 3000 50 1180 530 50 50 200 160 720 100 890 80 2170

QUADRO 3 Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas BPF ou outros requisitos de qualidade (continuao)
Acetato de isopropilo Acetato de metilo Acetato de propilo Acetona cido actico cido frmico Anisol 1-Butanol 2-Butanol Cumeno Dimetilsulfxido Etilmetilcetona Formato de etilo Heptano Isobutilmetilcetona 3-Metil-l-butanol 2-Metil-l-propanol Pentano 1-Pentanol 1-Propanol 2-Propanol

4.4. SOLVENTES PARA OS QUAIS NO FORAM ENCONTRADOS DADOS TOXICOLGICOS ADEQUADOS Os solventes seguintes (quadro 4) podem tambm ter interesse para os fabricantes de excipientes, substncias activas ou de medicamentos. Contudo, no foram ainda encontrados dados toxicolgicos adequados que permitam determinar uma EDA. Os fabricantes devem fornecer uma justificao relativa aos nveis residuais destes solventes nos produtos farmacuticos.
QUADRO 4 Solventes para os quais no foram encontrados dados toxicolgicos adequados
cido tricloractico cido trifluoractico 1,1-Dietoxipropano 1,1-Dimetoxietano 2,2-Dimetoxipropano ter de petrleo ter isoproplico Isoctano Isopropilmetilcetona Metiltetra-hidrofurano

5. Textos gerais

GLOSSRIO Carcinognios genotxicos: Carcinognios que produzem cancro por afectarem genes ou cromossomas. LOEL: Abreviatura de lowest-observed effect level. Lowest-observed effect level: A menor dose de substncia que, num estudo ou grupo de estudos, produz aumentos biologicamente significativos na frequncia ou gravidade de qualquer efeito nos animais ou humanos expostos. Factor de modificao: Um factor determinado por um toxicologista profissional e aplicado aos resultados de um bioensaio para obter a relao com os dados humanos nas condies de segurana satisfatrias. Neurotoxicidade: A capacidade de uma substncia para provocar efeitos indesejveis sobre o sistema nervoso. NOEL: Abreviao de no-observed-effect level No-observed-effect level: A dose mais elevada de substncia para a qual no se verificam aumentos biologicamente significativos da frequncia ou da gravidade de qualquer efeito no homem ou nos animais expostos. EDA: Abreviatura de exposio diria admissvel (em ingls PDE = permitted daily exposure). Exposio diria admissvel: a dose mxima diria de solvente residual admitida num produto farmacutico. Toxicidade reversvel: Ocorrncia de efeitos nocivos causados por uma substncia e que desaparecem uma vez que cesse a exposio substncia. Carcinognio humano fortemente suspeito: Uma substncia FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

* Habitualmente 60 por cento de m-xileno, 14 por cento de p-xileno, 9 por cento de o-xileno com 17 por cento de etilbenzeno.

4.3. SOLVENTES COM BAIXO POTENCIAL TXICO Os solventes da classe 3 (apresentados no quadro 3) podem ser considerados como os de menor toxicidade e de menor risco para a sade humana. A classe 3 no inclui qualquer solvente que se saiba ser nocivo para a sade humana nos limites autorizados para os produtos farmacuticos. Contudo, no existem estudos de toxicidade a longo prazo nem estudos de carcinogenicidade para muitos dos solventes da classe 3. Os dados disponveis indicam que eles apresentam baixa toxicidade em estudos de toxicidade aguda ou de curta durao e resultados negativos nos estudos de genotoxicidade. O limite admissvel, sem justificao particular, para os solventes desta classe inferior ou igual a 50 mg/dia (correspondendo a 5000 ppm ou a 0,5 por cento de acordo com a opo 1). Quantidades superiores referida podem tambm ser aceites desde que sejam realistas em relao capabilidade de fabrico e s boas prticas de fabrico.
QUADRO 3 Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas BPF ou outros requisitos de qualidade
Acetato de butilo Acetato de etilo Acetato de isobutilo Etanol ter etlico terc-butilmetilter

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5.4. Solventes residuais

para a qual as provas epidemiolgicas de carcinognese no puderam ser estabelecidas, ainda que existam dados genotxicos positivos e provas evidentes de carcinognese em roedores.

Teratogenicidade: Aparecimento de malformaes estruturais no decurso do desenvolvimento fetal quando se administra uma substncia durante a gravidez.

ANEXO 1. LISTA DOS SOLVENTES INCLUDOS NESTA NOTA EXPLICATIVA


Solvente acetato de etilo acetona acetonitrilo cido actico cido frmico acetato de butilo acetato de isobutilo acetato de isopropilo acetato de metilo acetato de propilo Outras Designaes ster etlico do cido actico 2-propanona cido etanico ster butlico do cido actico ster isobutlico do cido actico ster isoproplico do cido actico ster metlico do cido actico ster proplico do cido actico Frmula Qumica CH3COOCH2 CH3 CH3COCH3 CH3CN CH3COOH HCOOH CH3COO(CH2)3 CH3 CH3COOCH2CH(CH3)2 CH3COOCH(CH3)2 CH3COOCH3 CH3COOCH2CH2CH3 Classe Classe 3 Classe 3 Classe 2 Classe 3 Classe 3 Classe 3 Classe 3 Classe 3 Classe 3 Classe 3

anisol

metoxibenzeno

Classe 3

benzeno

benzol

Classe 1

1-butanol 2-butanol terc-butilmetilter

lcool n-butlico ou butan-1-ol lcool sec-butlico ou butan-2-ol 2-metoxi-2-metilpropano

CH3(CH2)3OH CH3CH2CH(OH)CH3 (CH3)3COCH3

Classe 3 Classe 3 Classe 3

ciclo-hexano

hexametileno

Classe 2

clorobenzeno

Classe 2

clorofrmio

triclorometano

CHCI3

Classe 2

cumeno

isopropilbenzeno (1-metiletil)benzeno sim-dicloroetano, dicloreto de etileno, cloreto de etileno 1,1-dicloroetileno, cloreto de vinilideno 1,2-dicloroetileno, dicloreto de acetileno cloreto de metileno DMA DMF Metilsulfinilmetano, sulfxido de metilo DMSO ter dimetlico do etilenoglicol monoglima dimetilcelossolve CH2CICH2Cl H2C = CCl2 CIHC = CHCl CH2Cl2 CH3CON(CH3)2 HCON(CH3)2 (CH3)2SO

Classe 3 Classe 1 Classe 1 Classe 2 Classe 2 Classe 2 Classe 2 Classe 3

1,2-dicloroetano 1,1-dicloroeteno 1,2-dicloroeteno Diclorometano N,N-dimetilacetamida N,N-dimetilformamida dimetilsulfxido

1,2-dimetoxietano

H3COCH2CH2OCH3

Classe 2

1,4-dioxano

p-dioxano 1,4-dioxano

Classe 2

etanol

lcool etlico

CH3CH2OH

Classe 3

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

583

5. Textos gerais

5.4. Solventes residuais

ANEXO 1. LISTA DOS SOLVENTES INCLUDOS NESTA NOTA EXPLICATIVA (continuao)


Solvente ter etlico etilenoglicol 2-etoxietanol formamida formato de etilo heptano hexano metanol 3-metil-1-butanol Outras Designaes ter dietlico ou etoxietano ou 1,1-oxibisetano 1,2-di-hidroxietano ou 1,2-etanodiol celossolve metanamida ster etlico do cido frmico n-heptano n-hexano lcool metlico lcool isoamlico lcool isopentlico 3-metilbutan-1-ol 2-hexanona hexan-2-ona ciclo-bexilmetano Frmula Qumica CH3CH2OCH2CH3 HOCH2CH2OH CH3CH2OCH2CH2OH HCONH2 HCOOCH2CH3 CH3(CH2)5CH3 CH3(CH2)4CH3 CH3OH (CH3)2CHCH2CH2OH Classe Classe 3 Classe 2 Classe 2 Classe 2 Classe 3 Classe 3 Classe 3 Classe 2 Classe 3

metilbutilcetona metilciclo-hexano

CH3(CH2)3COCH3

Classe 2 Classe 2

5. Textos gerais

metiletilcetona

metilisobutilcetona

2-metil-1-propanol N-metilpirrolidona

2-butanona MEK butan-2-ona 4-metilpentan-2-ona 4-metil-2-pentanona MIBK lcool isobutlico 2-metilpropan-1-ol 1-metil-2-pirrolidona 1-metilpirrolidin-2-dona

CH3CH2COCH3

Classe 3

CH3COCH2CH(CH3)2

(CH3)2CHCH2OH

Classe 3 Classe 2

2-metoxietanol nitrometano pentano 1 -pentanol

metilcelossolve n-pentano lcool amlico pentan-1-ol lcool pentlico

CH3OCH2CH2OH CH3NO2 CH3(CH2)3CH3 CH3(CH2)3CH2OH

Classe 2 Classe 2 Classe 3 Classe 3

piridina 1-propanol 2-propanol lcool proplico propan-1-ol lcool isoproplico propan-2-ol CH3CH2CH2OH (CH3)2CHOH

Classe 2 Classe 3 Classe 3

sulfolano

1,1-dixido de tetra-hidrotiofeno

Classe 2

tetracloreto de carbono tetra-hidrofurano

tetraclorometano xido de tetrametileno oxaciclopentano 1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno

CCl4

Classe 1 Classe 2

tetralina

Classe 2

tolueno

metilbenzeno

Classe 2

1,1,1-tricloroetano 1,1,2-tricloroeteno

metilclorofrmio tricloroeteno

CH3CCl3 HClC = CCl2

Classe 1 Classe 2

xileno(*)

dimetilbenzeno xilol

Classe 2

(*)

Habitualmente 60% m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno com 17% de etilbenzeno.

584

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.4. Solventes residuais

ANEXO 2. INFORMAES COMPLEMENTARES A2.1. REGULAMENTAO AMBIENTAL PARA OS SOLVENTES ORGNICOS VOLTEIS Um certo nmero de solventes residuais, correntemente utilizados no fabrico de produtos farmacuticos, considerado como substncias txicas nas monografias EHC (Environmental Health Criteria) relativas aos critrios de sade e de ambiente e no sistema IRIS (Integrated Risk Information System). Faz parte dos objectivos dos organismos como o International Programme on Chemical Safety (IPCS), o United States Environmental Protection Agency (USEPA) e o United States Food and Drug Administration (USFDA), a determinao dos teores de exposio admissveis. O objectivo desta determinao proteger a sade pblica e preservar o ambiente contra os eventuais efeitos nocivos resultantes de uma exposio prolongada a estas substncias. Os mtodos utilizados para a avaliao dos limites mximos de exposio sem causar efeitos nocivos assentam geralmente em estudos conduzidos a longo prazo. Se no se dispuser de resultados de estudos a longo prazo, podem utilizar-se os resultados obtidos em estudos de curto prazo, com a condio de certos parmetros serem modificados (por exemplo, a utilizao de factores de segurana mais elevados). A contribuio aqui descrita baseia-se numa exposio a longo prazo ou exposio durante o tempo de vida da populao no seu meio ambiente, ou seja, ao ar ambiente, alimentao, gua potvel e a outros meios. A2.2. SOLVENTES RESIDUAIS NOS PRODUTOS FARMACUTICOS Os limites de exposio contidos nesta nota explicativa so definidos a partir de mtodos e dados de toxicidade apresentados nas monografias ECH e IRIS. Contudo, ao estabelecer estes limites, deve ter-se em conta alguns postulados relativos aos resduos dos solventes utilizados na sntese e no fabrico de produtos farmacuticos. Os postulados so os seguintes: 1) Apenas os pacientes (e no a populao em geral) utilizam produtos farmacuticos com o objectivo de se tratarem ou prevenir as infeces e doenas. 2) Para a maior parte dos produtos farmacuticos, o princpio de uma exposio durante toda a vida no necessria, mas pode servir de hiptese de trabalho com vista reduo de riscos para a sade. 3) Os solventes residuais entram inevitavelmente na fabricao dos produtos farmacuticos e fazem frequentemente parte integrante dos medicamentos. 4) Excepo feita para casos muito particulares, o teor em solventes residuais no deve ultrapassar os limites prescritos. 5) Os resultados dos estudos toxicolgicos utilizados para determinar os teores aceitveis de solventes residuais devem ter origem em protocolos experimentais apropriados, tais como os descritos pela OCDE e pelo Red Book da FDA. ANEXO 3. MTODOS RELATIVOS AO ESTABELECIMENTO DE LIMITES DE EXPOSIO O mtodo de Gaylor-Kodell, relativo avaliao do risco (Gaylor, D. W. and Kodell, R. L.: Linear Interpolation algorithm for low dose assessmerzt of toxic substance, J. Environ. Pathology, 4,305,1980), est apropriado para os solventes carcinognicos da classe 1. No estabelecimento de limites de exposio, apenas os dados de carcinogenicidade fiveis FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

podem justificar uma extrapolao por aplicao de modelos matemticos. Os limites de exposio dos solventes da classe 1 podem ser determinados combinando factores de segurana elevados (ex. 10 000 a 1000 000) e os dados de no-observed-effect level (NOEL). A deteco e quantificao destes solventes deve responder aos ltimos desenvolvimentos em matria de tcnicas analticas. Os teores de exposio aceitveis apresentados nesta nota explicativa para os solventes da classe 2 foram estabelecidos aps calcular os valores de EDA, de acordo com os procedimentos que permitem estabelecer os limites aplicveis aos produtos farmacuticos (Pharmacopeia Forum, Nov-Dez 1989) e o mtodo adoptado pela IPCS para avaliao do risco apresentado pelas substncias qumicas (Assessing Human Health Risk of Chemicals-Environmental Health Criteria 170, WHO, Geneve, 1994). Estes mtodos so semelhantes aos utilizados pela EPA (RIS), FDA (Red Book) e por outros organismos. O mtodo aqui apresentado para permitir uma melhor compreenso da origem dos valores de EDA. No necessrio efectuar estes clculos para utilizar os valores de EDA indicados no ponto 4 do presente documento. A EDA calculada a partir do no-observed-effect level (NOEL), ou ainda do lowest-observed-effect level (LOEL), obtidos no estudo mais relevante realizado com animais, com a ajuda da expresso:
EDA NOEL Ajuste ponderal F1 F2 F3 F4 F5 (1)

Preferencialmente a EDA deve ser derivada do NOEL. Se o NOEL no puder ser obtido, deve utilizar-se o LOEL. Os factores de modificao aqui propostas, que permitem aplicar aos seres humanos as dados obtidos, assemelham-se aos factores de incerteza utilizados nas EHC (Environmental Health Criteria 170, WHO, Geneve, 1994), e aos factores de modificao ao factores de segurana mencionados no Pharmacopeial Forum. A hiptese de uma exposio sistmica de 100% utilizada em todos as clculos, sem distino das diferentes vias de administrao. Os factores de modificao so as seguintes:
F1 = um factor que permite a extrapolao entre as espcies: F1 = 2 para extrapolar do co para o homem F1 = 2,5 para extrapolar do coelho para a homem F1 = 3 para extrapolar da macaco para a homem F1 = 5 para extrapolar da rato para a homem F1 = 10 para extrapolar dos outros animais para o homem F1 = 12 para extrapolar do ratinho para o homem.

F1 permite ter em conta as relaes comparativas superfcie/ /massa corporal para as espcies em questo e para o homem. A superfcie (S) calculada com ajuda da expresso seguinte:
S = k M0,67 (2)

em que M corresponde massa corporal e k uma constante cujo valor est fixado em 10. As massas corporais utilizadas na equao esto no quadro A3.1, apresentado mais frente.
F2 = 10 e representa o factor que tem em conta a variabilidade entre os indivduos. Em regra, um factor de 10 est indicado para o conjunto dos solventes orgnicos. Este valor aplicado sistematicamente na presente nota. F3 = um factor varivel que corresponde aos estudos de toxicidade relativos a uma exposio a curto prazo: F3 = 1, para os estudos cuja durao corresponde pelo menos a um tempo de semi-vida (1 ano para os roedores ou coelhos; 7 anos para os gatos, ces e macacos)

585

5. Textos gerais

5.4. Solventes residuais

F3 = 1, para os estudos relativos reproduo, no decurso dos quais est coberto todo o perodo da organognese F3 = 2, para um estudo de 6 meses com roedores ou de 3,5 anos com no roedores F3 = 5, para um estudo de 3 meses com roedores ou de 2 anos com no roedores F3 = 10, para os estudos de curta durao.

Neste exemplo,
F1 = 12, para ter em conta a extrapolao do rato para o homem F2 = 10, para ter em conta as diferenas entre os indivduos F3 = 5, uma vez que a durao do estudo est limitada a apenas 13 semanas F4 = 1, porque no se verifica qualquer toxicidade grave F5 = 1, porque foi determinada a dose no efectiva

Quando os estudos tm uma durao que se situa entre o incio e o fim de perodos acima determinados, utiliza-se o factor mais elevado, por exemplo, um factor de 2 para um estudo de 9 meses com roedores.
F4 = um factor que pode ser utilizado em todos os casos de toxicidade elevada, por exemplo carcinogenicidade no genotxica, neurotoxicidade ou teratogenicidade. Nos estudos de toxicidade ligada reproduo devem utilizar-se os factores indicados a seguir: F4 = 1, para a toxicidade associada ao feto ou me F4 = 5, para a toxicidade associada ao feto sem a me F4 = 5, para um efeito teratognico com efeito txico para a me F4 = 10, para um efeito teratognico sem efeito txico para a me. F5 = um factor varivel que pode ser utilizado se a dose no efectiva no foi estabelecida.

QUADRO A3.1 Valores utilizados para os clculos apresentados neste documento


Massa corporal do rato Massa corporal de uma rata em gestao Massa corporal do ratinho Massa corporal de uma ratinha em gestao Massa corporal do cobaio Massa corporal do macaco Rhesus Massa corporal do coelho (em gestao ou no) Massa corporal do co beagle Volume respiratrio do rato Volume respiratrio do ratinho Volume respiratrio do coelho Volume respiratrio do cobaia Volume respiratrio do homem Volume respiratrio do co Volume respiratrio do macaco Consumo de gua do ratinho Consumo de gua do rato Consumo alimentar do rato 425 g 330 g 28 g 30 g 500 g 2,5 kg 4 kg 11,5 kg 290 1/dia 43 1/dia 1440 1/dia 430 1/dia 28800 1/dia 9000 1/dia 1150 1/dia 5 ml/dia 30 ml/dia 30 g/dia

5. Textos gerais

Quando apenas se conhece o valor LOEL, pode utilizar-se um factor que pode ir at 10, em funo do grau de toxicidade. O ajustamento do peso efectuado assumindo o valor arbitrrio de 50 Kg para a massa corporal de um adulto do sexo masculino ou feminino. Este valor, relativamente baixo, oferece uma margem de segurana acrescida em relao ao peso padro, 60 ou 70 kg, frequentemente utilizado neste tipo de clculo. Para os adultos com menos de 50 kg, considera-se que esto protegidos pela acumulao dos factores de segurana utilizados na determinao da EDA. Se o solvente estiver presente num medicamento exclusivamente para uso peditrico, deve proceder-se correco do peso, ajustando-o para o valor inferior adequado. Para ilustrar a aplicao desta equao, tomemos, a ttulo de exemplo, um estudo de toxicidade do acetonitrilo no rato, que apresentado no suplemento de Abril de 1997 de Pharmeuropa, vol. 9, n 1, pgina S24 (verso inglesa). O valor de NOEL estimado 50,7 mg kg1 dia1. Neste caso concreto, o valor da EDA calculado como se segue:
EDA = 50,7 mg EDA = 4,22 mg dia1 kg1 dia1 50 kg/12 10 5 1 1

No que se refere s concentraes de gs utilizadas nos estudos de inalao, a equao dos gases perfeitos, PV = nRT, permite converter ppm em mg/l ou mg/m3. A ttulo de exemplo, o estudo de toxicidade reprodutiva do rato por inalao de tetracloreto de carbono (massa molecular 153,84) apresentado no Suplemento de Abril de 1997 de Pharmaeuropa, vol. 9, n 1, pgina S9.
n/V = P/RT = 300 106 atm 153840 mg mol1/0,082 atm K1 mol1 298K = 46,15 mg/24,45 1 = 1,89 mg/l

Foi utilizada a correspondncia 1 000 1 = 1 m3, para converter o resultado em mg/m3.

586

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.5. TABELAS ALCOOMTRICAS


5.5. Tabelas alcoomtricas ................................................ 589

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

587

5. Textos gerais

5.5. Tabelas alcoomtricas

5.5. TABELAS ALCOOMTRICAS


A frmula geral fixada pelo Conselho das Comunidades Europeias nas suas Directivas de 27 de Julho de 1976 sobre a alcoometria serviu de base para estabelecer as tabelas seguintes.
(kg/m3)

% V/V 5,3 5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 8,7 8,8 8,9 9,0 9,1 9,2 9,3 9,4 9,5 9,6 9,7 9,8 9,9 10,0 10,1 10,2 10,3 10,4 10,5 10,6 10,7 10,8 10,9 11,0 11,1 11,2

% m/m 4,22 4,30 4,38 4,46 4,54 4,62 4,70 4,78 4,86 4,95 5,03 5,11 5,19 5,27 5,35 5,43 5,51 5,59 5,67 5,75 5,83 5,91 5,99 6,07 6,15 6,23 6,32 6,40 6,48 6,56 6,64 6,72 6,80 6,88 6,96 7,04 7,12 7,20 7,29 7,37 7,45 7,53 7,61 7,69 7,77 7,85 7,93 8,01 8,10 8,18 8,26 8,34 8,42 8,50 8,58 8,66 8,75 8,83 8,91 8,99

20

(kg/m3)

% V/V 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 5,0 5,1 5,2

% m/m 0,0 0,08 0,16 0,24 0,32 0,40 0,47 0,55 0,63 0,71 0,79 0,87 0,95 1,03 1,11 1,19 1,27 1,35 1,43 1,51 1,59 1,67 1,75 1,82 1,90 1,98 2,06 2,14 2,22 2,30 2,38 2,46 2,54 2,62 2,70 2,78 2,86 2,94 3,02 3,10 3,18 3,26 3,34 3,42 3,50 3,58 3,66 3,74 3,82 3,90 3,98 4,06 4,14

990,65 990,52 990,39 990,26 990,12 989,99 989,86 989,73 989,60 989,47 989,34 989,21 989,08 988,95 988,82 988,69 988,56 988,43 988,30 988,18 988,05 987,92 987,79 987,67 987,54 987,42 987,29 987,16 987,04 986,91 986,79 986,66 986,54 986,42 986,29 986,17 986,05 985,92 985,80 985,68 985,56 985,44 985,31 985,19 985,07 984,95 984,83 984,71 984,59 984,47 984,35 984,23 984,11 983,99 983,88 983,76 983,64 983,52 983,40 983,29

20

996,70 996,55 996,40 996,25 996,11 995,96 995,81 995,67 995,52 995,38 995,23 995,09 994,94 994,80 994,66 994,51 994,37 994,23 994,09 993,95 993,81 993,66 993,52 993,38 993,24 993,11 992,97 992,83 992,69 992,55 992,41 992,28 992,14 992,00 991,87 991,73 991,59 991,46 991,32 991,19 991,06 990,92 990,79

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

589

5. Textos gerais

998,20 998,05 997,90 997,75 997,59 997,44 997,29 997,14 996,99 996,85

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8 11,9 12,0 12,1 12,2 12,3 12,4 12,5 12,6 12,7 12,8 12,9 13,0 13,1 13,2 13,3 13,4 13,5 13,6 13,7 13,8 13,9 14,0 14,1 14,2 14,3 14,4 14,5 14,6 14,7 14,8 14,9 15,0 15,1 15,2 15,3 15,4 15,5 15,6 15,7 15,8 15,9 16,0 16,1 16,2 16,3 16,4 16,5 16,6 16,7 16,8 16,9 17,0 17,1 17,2

% m/m 9,07 9,15 9,23 9,32 9,40 9,48 9,56 9,64 9,72 9,80 9,89 9,97 10,05 10,13 10,21 10,29 10,37 10,46 10,54 10,62 10,70 10,78 10,87 10,95 11,03 11,11 11,19 11,27 11,36 11,44 11,52 11,60 11,68 11,77 11,85 11,93 12,01 12,09 12,17 12,26 12,34 12,42 12,50 12,59 12,67 12,75 12,83 12,91 13,00 13,08 13,16 13,24 13,32 13,41 13,49 13,57 13,65 13,74 13,82 13,90

20

(kg/m3)

% V/V 17,3 17,4 17,5 17,6 17,7 17,8 17,9 18,0 18,1 18,2 18,3 18,4 18,5 18,6 18,7 18,8 18,9 19,0 19,1 19,2 19,3 19,4 19,5 19,6 19,7 19,8 19,9 20,0 20,1 20,2 20,3 20,4 20,5 20,6 20,7 20,8 20,9 21,0 21,1 21,2 21,3 21,4 21,5 21,6 21,7 21,8 21,9 22,0 22,1 22,2 22,3 22,4 22,5 22,6 22,7 22,8 22,9 23,0 23,1 23,2

% m/m 13,98 14,07 14,15 14,23 14,31 14,40 14,48 14,56 14,64 14,73 14,81 14,89 14,97 15,06 15,14 15,22 15,30 15,39 15,47 15,55 15,63 15,72 15,80 15,88 15,97 16,05 16,13 16,21 16,30 16,38 16,46 16,55 16,63 16,71 16,79 16,88 16,96 17,04 17,13 17,21 17,29 17,38 17,46 17,54 17,62 17,71 17,79 17,87 17,96 18,04 18,12 18,21 18,29 18,37 18,46 18,54 18,62 18,71 18,79 18,87

20

(kg/m3)

983,17 983,05 982,94 982,82 982,70 982,59 982,47 982,35 982,24 982,12 982,01 981,89 981,78 981,67 981,55 981,44 981,32 981,21 981,10 980,98 980,87 980,76 980,64 980,53 980,42 980,31 980,19 980,08 979,97 979,86 979,75 979,64 979,52 979,41 979,30 979,19 979,08 978,97 978,86 978,75 978,64 978,53 978,42 978,31 978,20 978,09 977,98 977,87 977,76 977,65 977,55 977,44 977,33 977,22 977,11 977,00 976,89 976,79 976,68 976,57

976,46 976,35 976,25 976,14 976,03 975,92 975,81 975,71 975,60 975,49 975,38 975,28 975,17 975,06 974,95 974,85 974,74 974,63 974,52 974,42 974,31 974,20 974,09 973,99 973,88 973,77 973,66 973,56 973,45 973,34 973,24 973,13 973,02 972,91 972,80 972,70 972,59 972,48 972,37 972,27 972,16 972,05 971,94 971,83 971,73 971,62 971,51 971,40 971,29 971,18 971,08 970,97 970,86 970,75 970,64 970,53 970,42 970,31 970,20 970,09

5. Textos gerais

590

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 23,3 23,4 23,5 23,6 23,7 23,8 23,9 24,0 24,1 24,2 24,3 24,4 24,5 24,6 24,7 24,8 24,9 25,0 25,1 25,2 25,3 25,4 25,5 25,6 25,7 25,8 25,9 26,0 26,1 26,2 26,3 26,4 26,5 26,6 26,7 26,8 26,9 27,0 27,1 27,2 27,3 27,4 27,5 27,6 27,7 27,8 27,9 28,0 28,1 28,2 28,3 28,4 28,5 28,6 28,7 28,8 28,9 29,0 29,1 29,2

% m/m 18,96 19,04 19,13 19,21 19,29 19,38 19,46 19,54 19,63 19,71 19,79 19,88 19,96 20,05 20,13 20,21 20,30 20,38 20,47 20,55 20,63 20,72 20,80 20,88 20,97 21,05 21,14 21,22 21,31 21,39 21,47 21,56 21,64 21,73 21,81 21,90 21,98 22,06 22,15 22,23 22,32 22,40 22,49 22,57 22,65 22,74 22,82 22,91 22,99 23,08 23,16 23,25 23,33 23,42 23,50 23,59 23,67 23,76 23,84 23,93

20

(kg/m3)

% V/V 29,3 29,4 29,5 29,6 29,7 29,8 29,9 30,0 30,l 30,2 30,3 30,4 30,5 30,6 30,7 30,8 30,9 31,0 31,1 31,2 31,3 31,4 31,5 31,6 31,7 31,8 31,9 32,0 32,1 32,2 32,3 32,4 32,5 32,6 32,7 32,8 32,9 33,0 33,1 33,2 33,3 33,4 33,5 33,6 33,7 33,8 33,9 34,0 34,1 34,2 34,3 34,4 34,5 34,6 34,7 34,8 34,9 35,0 35,1 35,2

% m/m 24,01 24,10 24,18 24,27 24,35 24,44 24,52 24,61 24,69 24,78 24,86 24,95 25,03 25,12 25,20 25,29 25,38 25,46 25,55 25,63 25,72 25,80 25,89 25,97 26,06 26,15 26,23 26,32 26,40 26,49 26,57 26,66 26,75 26,83 26,92 27,00 27,09 27,18 27,26 27,35 27,44 27,52 27,61 27,69 27,78 27,87 27,95 28,04 28,13 28,21 28,30 28,39 28,47 28,56 28,65 28,73 28,82 28,91 28,99 29,08

20

(kg/m3)

969,98 969,87 969,76 969,65 969,54 969,43 969,32 969,21 969,10 968,99 968,88 968,77 968,66 968,55 968,43 968,32 968,21 968,10 967,99 967,87 967,76 967,65 967,53 967,42 967,31 967,19 967,08 966,97 966,85 966,74 966,62 966,51 966,39 966,28 966,16 966,05 965,93 965,81 965,70 965,58 965,46 965,35 965,23 965,11 964,99 964,88 964,76 964,64 964,52 964,40 964,28 964,16 964,04 963,92 963,80 963,68 963,56 963,44 963,32 963,20

963,07 962,95 962,83 962,71 962,58 962,46 962,33 962,21 962,09 961,96 961,84 961,71 961,59 961,46 961,33 961,21 961,08 960,95 960,82 960,70 960,57 960,44 960,31 960,18 960,05 959,92 959,79 959,66 959,53 959,40 959,27 959,14 959,01 958,87 958,74 958,61 958,47 958,34 958,20 958,07 957,94 957,80 957,66 957,53 957,39 957,26 957,12 956,98 956,84 956,70 956,57 956,43 956,29 956,15 956,01 955,87 955,73 955,59 955,45 955,30

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

591

5. Textos gerais

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 35,3 35,4 35,5 35,6 35,7 35,8 35,9 36,0 36,1 36,2 36,3 36,4 36,5 36,6 36,7 36,8 36,9 37,0 37,1 37,2 37,3 37,4 37,5 37,6 37,7 37,8 37,9 38,0 38,1 38,2 38,3 38,4 38,5 38,6 38,7 38,8 38,9 39,0 39,1 39,2 39,3 39,4 39,5 39,6 39,7 39,8 39,9 40,0 40,1 40,2 40,3 40,4 40,5 40,6 40,7 40,8 40,9 41,0 41,1 41,2

% m/m 29,17 29,26 29,34 29,43 29,52 29,60 29,69 29,78 29,87 29,95 30,04 30,13 30,21 30,30 30,39 30,48 30,56 30,65 30,74 30,83 30,92 31,00 31,09 31,18 31,27 31,35 31,44 31,53 31,62 31,71 31,79 31,88 31,97 32,06 32,15 32,24 32,32 32,41 32,50 32,59 32,68 32,77 32,86 32,94 33,03 33,12 33,21 33,30 33,39 33,48 33,57 33,66 33,74 33,83 33,92 34,01 34,10 34,19 34,28 34,37

20

(kg/m3)

% V/V 41,3 41,4 41,5 41,6 41,7 41,8 41,9 42,0 42,1 42,2 42,3 42,4 42,5 42,6 42,7 42,8 42,9 43,0 43,1 43,2 43,3 43,4 43,5 43,6 43,7 43,8 43,9 44,0 44,1 44,2 44,3 44,4 44,5 44,6 44,7 44,8 44,9 45,0 45,1 45,2 45,3 45,4 45,5 45,6 45,7 45,8 45,9 46,0 46,1 46,2 46,3 46,4 46,5 46,6 46,7 46,8 46,9 47,0 47,1 47,2

% m/m 34,46 34,55 34,64 34,73 34,82 34,91 35,00 35,09 35,18 35,27 35,36 35,45 35,54 35,63 35,72 35,81 35,90 35,99 36,08 36,17 36,26 36,35 36,44 36,53 36,62 36,71 36,80 36,89 36,98 37,07 37,16 37,25 37,35 37,44 37,53 37,62 37,71 37,80 37,89 37,98 38,08 38,17 38,26 38,35 38,44 38,53 38,62 38,72 38,81 38,90 38,99 39,08 39,18 39,27 39,36 39,45 39,54 39,64 39,73 39,82

20

(kg/m3)

955,16 955,02 954,88 954,73 954,59 954,44 954,30 954,15 954,01 953,86 953,72 953,57 953,42 953,28 953,13 952,98 952,83 952,69 952,54 952,39 952,24 952,09 951,94 951,79 951,63 951,48 951,33 951,18 951,02 950,87 950,72 950,56 950,41 950,25 950,10 949,94 949,79 949,63 949,47 949,32 949,16 949,00 948,84 948,68 948,52 948,37 948,21 948,05 947,88 947,72 947,56 947,40 947,24 947,08 946,91 946,75 946,58 946,42 946,26 946,09

945,93 945,76 945,59 945,43 945,26 945,09 944,93 944,76 944,59 944,42 944,25 944,08 943,91 943,74 943,57 943,40 943,23 943,06 942,88 942,71 942,54 942,37 942,19 942,02 941,84 941,67 941,49 941,32 941,14 940,97 940,79 940,61 940,43 940,26 940,08 939,90 939,72 939,54 939,36 939,18 939,00 938,82 938,64 938,46 938,28 938,10 937,91 937,73 937,55 937,36 937,18 937,00 936,81 936,63 936,44 936,26 936,07 935,88 935,70 935,51

5. Textos gerais

592

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 47,3 47,4 47,5 47,6 47,7 47,8 47,9 48,0 48,1 48,2 48,3 48,4 48,5 48,6 48,7 48,8 48,9 49,0 49,1 49,2 49,3 49,4 49,5 49,6 49,7 49,8 49,9 50,0 50,1 50,2 50,3 50,4 50,5 50,6 50,7 50,8 50,9 51,0 51,1 51,2 51,3 51,4 51,5 51,6 51,7 51,8 51,9 52,0 52,1 52,2 52,3 52,4 52,5 52,6 52,7 52,8 52,9 53,0 53,1 53,2

% m/m 39,91 40,00 40,10 40,19 40,28 40,37 40,47 40,56 40,65 40,75 40,84 40,93 41,02 41,12 41,21 41,30 41,40 41,49 41,58 41,68 41,77 41,86 41,96 42,05 42,14 42,24 42,33 42,43 42,52 42,61 42,71 42,80 42,90 42,99 43,08 43,18 43,27 43,37 43,46 43,56 43,65 43,74 43,84 43,93 44,03 44,12 44,22 44,31 44,41 44,50 44,60 44,69 44,79 44,88 44,98 45,07 45,17 45,26 45,36 45,46

20

(kg/m3)

% V/V 53,3 53,4 53,5 53,6 53,7 53,8 53,9 54,0 54,1 54,2 54,3 54,4 54,5 54,6 54,7 54,8 54,9 55,0 55,1 55,2 55,3 55,4 55,5 55,6 55,7 55,8 55,9 56,0 56,1 56,2 56,3 56,4 56,5 56,6 56,7 56,8 56,9 57,0 57,1 57,2 57,3 57,4 57,5 57,6 57,7 57,8 57,9 58,0 58,1 58,2 58,3 58,4 58,5 58,6 58,7 58,8 58,9 59,0 59,1 59,2

% m/m 45,55 45,65 45,74 45,84 45,93 46,03 46,13 46,22 46,32 46,41 46,51 46,61 46,70 46,80 46,90 46,99 47,09 47,18 47,28 47,38 47,47 47,57 47,67 47,77 47,86 47,96 48,06 48,15 48,25 48,35 48,45 48,54 48,64 48,74 48,84 48,93 49,03 49,13 49,23 49,32 49,42 49,52 49,62 49,72 49,81 49,91 50,0] 50,11 50,21 50,31 50,40 50,50 50,60 50,70 50,80 50,90 51,00 51,10 51,19 51,29

20

(kg/m3)

935,32 935,14 934,95 934,76 934,57 934,38 934,19 934,00 933,81 933,62 933,43 933,24 933,05 932,86 932,67 932,47 932,28 932,09 931,90 931,70 931,51 931,31 931,12 930,92 930,73 930,53 930,34 930,14 929,95 929,75 929,55 929,35 929,16 928,96 928,76 928,56 928,36 928,16 927,96 927,77 927,57 927,36 927,16 926,96 926,76 926,56 926,36 926,16 925,95 925,75 925,55 925,35 925,14 924,94 924,73 924,53 924,32 924,12 923,91 923,71

923,50 923,30 923,09 922,88 922,68 922,47 922,26 922,06 921,85 921,64 921,43 921,22 921,01 920,80 920,59 920,38 920,17 919,96 919,75 919,54 919,33 919,12 918,91 918,69 918,48 918,27 918,06 917,84 917,63 917,42 917,20 916,99 916,77 916,56 916,35 916,13 915,91 915,70 915,48 915,27 915,05 914,83 914,62 914,40 914,18 913,97 913,75 913,53 913,31 913,09 912,87 912,65 912,43 912,22 912,00 911,78 911,55 911,33 911,11 910,89

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

593

5. Textos gerais

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 59,3 59,4 59,5 59,6 59,7 59,8 59,9 60,0 60,1 60,2 60,3 60,4 60,5 60,6 60,7 60,8 60,9 61,0 61,1 61,2 61,3 61,4 61,5 61,6 61,7 61,8 61,9 62,0 62,1 62,2 62,3 62,4 62,5 62,6 62,7 62,8 62,9 63,0 63,1 63,2 63,3 63,4 63,5 63,6 63,7 63,8 63,9 64,0 64,1 64,2 64,3 64,4 64,5 64,6 64,7 64,8 64,9 65,0 65,1 65,2

% m/m 51,39 51,49 51,59 51,69 51,79 51,89 51,99 52,09 52,19 52,29 52,39 52,49 52,59 52,69 52,79 52,89 52,99 53,09 53,19 53,29 53,39 53,49 53,59 53,69 53,79 53,89 53,99 54,09 54,19 54,30 54,40 54,50 54,60 54,70 54,80 54,90 55,00 55,11 55,21 55,31 55,41 55,51 55,61 55,72 55,82 55,92 56,02 56,12 56,23 56,33 56,43 56,53 56,64 56,74 56,84 56,94 57,05 57,15 57,25 57,36

20

(kg/m3)

% V/V 65,3 65,4 65,5 65,6 65,7 65,8 65,9 66,0 66,1 66,2 66,3 66,4 66,5 66,6 66,7 66,8 66,9 67,0 67,1 67,2 67,3 67,4 67,5 67,6 67,7 67,8 67,9 68,0 68,1 68,2 68,3 68,4 68,5 68,6 68,7 68,8 68,9 69,0 69,1 69,2 69,3 69,4 69,5 69,6 69,7 69,8 69,9 70,0 70,1 70,2 70,3 70,4 70,5 70,6 70,7 70,8 70,9 71,0 71,1 71,2

% m/m 57,46 57,56 57,67 57,77 57,87 57,98 58,08 58,18 58,29 58,39 58,49 58,60 58,70 58,81 58,91 59,01 59,12 59,22 59,33 59,43 59,54 59,64 59,74 59,85 59,95 60,06 60,16 60,27 60,37 60,48 60,58 60,69 60,80 60,90 61,01 61,11 61,22 61,32 61,43 61,54 61,64 61,75 61,85 61,96 62,07 62,17 62,28 62,39 62,49 62,60 62,71 62,81 62,92 63,03 63,13 63,24 63,35 63,46 63,56 63,67

20

(kg/m3)

910,67 910,45 910,23 910,01 909,78 909,56 909,34 909,11 908,89 908,67 908,44 908,22 908,00 907,77 907,55 907,32 907,10 906,87 906,64 906,42 906,19 905,97 905,74 905,51 905,29 905,06 904,83 904,60 904,37 904,15 903,92 903,69 903,46 903,23 903,00 902,77 902,54 902,31 902,08 901,85 901,62 901,39 901,15 900,92 900,69 900,46 900,23 899,99 899,76 899,53 899,29 899,06 898,83 898,59 898,36 898,12 897,89 897,65 897,42 897,18

896,94 896,71 896,47 896,23 896,00 895,76 895,52 895,28 895,05 894,81 894,57 894,33 894,09 893,85 893,61 893,37 893,13 892,89 892,65 892,41 892,17 891,93 891,69 891,45 891,20 890,96 890,72 890,48 890,23 889,99 889,75 889,50 889,26 889,01 888,77 888,52 888,28 888,03 887,79 887,54 887,29 887,05 886,80 886,55 886,31 886,06 885,81 885,56 885,31 885,06 884,82 884,57 884,32 884,07 883,82 883,57 883,32 883,06 882,81 882,56

5. Textos gerais

594

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 71,3 71,4 71,5 71,6 71,7 71,8 71,9 72,0 72,1 72,2 72,3 72,4 72,5 72,6 72,7 72,8 72,9 73,0 73,1 73,2 73,3 73,4 73,5 73,6 73,7 73,8 73,9 74,0 74,1 74,2 74,3 74,4 74,5 74,6 74,7 74,8 74,9 75,0 75,1 75,2 75,3 75,4 75,5 75,6 75,7 75,8 75,9 76,0 76,1 76,2 76,3 76,4 76,5 76,6 76,7 76,8 76,9 77,0 77,1 77,2

% m/m 63,78 63,89 63,99 64,10 64,21 64,32 64,43 64,53 64,64 64,75 64,86 64,97 65,08 65,19 65,29 65,40 65,51 65,62 65,73 65,84 65,95 66,06 66,17 66,28 66,39 66,50 66,61 66,72 66,83 66,94 67,05 67,16 67,27 67,38 67,49 67,60 67,71 67,82 67,93 68,04 68,15 68,26 68,38 68,49 68,60 68,71 68,82 68,93 69,04 69,16 69,27 69,38 69,49 69,61 69,72 69,83 69,94 70,06 70,17 70,28

20

(kg/m3)

% V/V 77,3 77,4 77,5 77,6 77,7 77,8 77,9 78,0 78,1 78,2 78,3 78,4 78,5 78,6 78,7 78,8 78,9 79,0 79,1 79,2 79,3 79,4 79,5 79,6 79,7 79,8 79,9 80,0 80,1 80,2 80,3 80,4 80,5 80,6 80,7 80,8 80,9 81,0 81,1 81,2 81,3 81,4 81,5 81,6 81,7 81,8 81,9 82,0 82,1 82,2 82,3 83,4 82,5 82,6 82,7 82,8 82,9 83,0 83,1 83,2

% m/m 70,39 70,51 70,62 70,73 70,85 70,96 71,07 71,19 71,30 71,41 71,53 71,64 71,76 71,87 71,98 72,10 72,21 72,33 72,44 72,56 72,67 72,79 72,90 73,02 73,13 73,25 73,36 73,48 73,60 73,71 73,83 73,94 74,06 74,18 74,29 74,41 74,53 74,64 74,76 74,88 74,99 75,11 75,23 75,34 75,46 75,58 75,70 75,82 75,93 76,05 76,17 76,29 76,41 76,52 76,64 76,76 76,88 77,00 77,12 77,24

20

(kg/m3)

882,31 882,06 881,81 881,55 881,30 881,05 880,79 880,54 880,29 880,03 879,78 879,52 879,27 879,01 878,75 878,50 878,24 877,99 877,73 877,47 877,21 876,96 876,70 876,44 876,18 875,92 875,66 875,40 875,14 874,88 874,62 874,36 874,10 873,84 873,58 873,32 873,06 872,79 872,53 872,27 872,00 871,74 871,48 871,21 870,95 870,68 870,42 870,15 869,89 869,62 869,35 869,09 868,82 868,55 868,28 868,02 867,75 867,48 867,21 866,94

866,67 866,40 866,13 865,86 865,59 865,32 865,05 864,78 864,50 864,23 863,96 863,69 863,41 863,14 862,86 862,59 862,31 862,04 861,76 861,49 861,21 860,94 860,66 860,38 860,10 859,83 859,55 859,27 858,99 858,71 858,43 858,15 857,87 857,59 857,31 857,03 856,75 856,46 856,18 855,90 855,62 855,33 855,05 854,76 854,48 854,19 853,91 853,62 853,34 853,05 852,76 852,48 852,19 851,90 851,61 851,32 851,03 850,74 850,45 850,16

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

595

5. Textos gerais

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 83,3 83,4 83,5 83,6 83,7 83,8 83,9 84,0 84,1 84,2 84,3 84,4 84,5 84,6 84,7 84,8 84,9 85,0 85,1 85,2 85,3 85,4 85,5 85,6 85,7 85,8 85,9 86,0 86,1 86,2 86,3 86,4 86,5 86,6 86,7 86,8 86,9 87,0 87,1 87,2 87,3 87,4 87,5 87,6 87,7 87,8 87,9 88,0 88,1 88,2 88,3 88,4 88,5 88,6 88,7 88,8 88,9 89,0 89,1 89,2

% m/m 77,36 77,48 77,60 77,72 77,84 77,96 78,08 78,20 78,32 78,44 78,56 78,68 78,80 78,92 79,04 79,16 79,28 79,40 79,53 79,65 79,77 79,89 80,01 80,14 80,26 80,38 80,50 80,63 80,75 80,87 81,00 81,12 81,24 81,37 81,49 81,61 81,74 81,86 81,99 82,11 82,24 82,36 82,49 82,61 82,74 82,86 82,99 83,11 83,24 83,37 83,49 83,62 83,74 83,87 84,00 84,13 84,25 84,38 84,51 84,64

20

(kg/m3)

% V/V 89,3 89,4 89,5 89,6 89,7 89,8 89,9 90,0 90,1 90,2 90,3 90,4 90,5 90,6 90,7 90,8 90,9 91,0 91,1 91,2 91,3 91,4 91,5 91,6 91,7 91,8 91,9 92,0 92,1 92,2 92,3 92,4 92,5 92,6 92,7 92,8 92,9 93,0 93,1 93,2 93,3 93,4 93,5 93,6 93,7 93,8 93,9 94,0 94,1 94,2 94,3 94,4 94,5 94,6 94,7 94,8 94,9 95,0 95,1 95,2

% m/m 84,76 84,89 85,02 85,15 85,28 85,41 85,54 85,66 85,79 85,92 86,05 86,18 86,31 86,44 86,57 86,71 86,84 86,97 87,10 87,23 87,36 87,49 87,63 87,76 87,89 88,02 88,16 88,29 88,42 88,56 88,69 88,83 88,96 89,10 89,23 89,37 89,50 89,64 89,77 89,91 90,05 90,18 90,32 90,46 90,59 90,73 90,87 91,01 91,15 91,29 91,43 91,56 91,70 91,84 91,98 92,13 92,27 92,41 92,55 92,69

20

(kg/m3)

849,87 849,58 849,29 848,99 848,70 848,41 848,11 847,82 847,53 847,23 846,93 846,64 846,34 846,05 845,75 845,45 845,15 844,85 844,55 844,25 843,95 843,65 843,35 843,05 842,75 842,44 842,14 841,84 841,53 841,23 840,92 840,62 840,31 840,00 839,70 839,39 839,08 838,77 838,46 838,15 837,84 837,52 837,21 836,90 836,59 836,27 835,96 835,64 835,32 835,01 834,69 834,37 834,05 833,73 833,41 833,09 832,77 832,45 832,12 831,80

831,48 831,15 830,82 830,50 830,17 829,84 829,51 829,18 828,85 828,52 828,19 827,85 827,52 827,18 826,85 826,51 826,17 825,83 825,49 825,15 824,81 824,47 824,13 823,78 823,44 823,09 822,74 822,39 822,04 821,69 821,34 820,99 820,63 820,28 819,92 819,57 819,21 818,85 818,49 818,12 817,76 817,40 817,03 816,66 816,30 815,93 815,55 815,18 814,81 814,43 814,06 813,68 813,30 812,92 812,54 812,15 811,77 811,38 810,99 810,60

5. Textos gerais

596

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V 95,3 95,4 95,5 95,6 95,7 95,8 95,9 96,0 96,1 96,2 96,3 96,4 96,5 96,6 96,7 96,8 96,9 97,0 97,1 97,2 97,3 97,4 97,5 97,6 97,7

% m/m 92,83 92,98 93,12 93,26 93,41 93,55 93,69 93,84 93,98 94,13 94,27 94,42 94,57 94,71 94,86 95,01 95,16 95,31 95,45 95,60 95,75 95,90 96,05 96,21 96,36

20

(kg/m3)

% V/V 97,8 97,9 98,0 98,1 98,2 98,3 98,4 98,5 98,6 98,7 98,8 98,9 99,0 99,1 99,2 99,3 99,4 99,5 99,6 99,7 99,8 99,9 100,0

% m/m 96,51 96,66 96,81 96,97 97,12 97,28 97,43 97,59 97,74 97,90 98,06 98,22 98,38 98,53 98,69 98,86 99,02 99,18 99,34 99,50 99,67 99,83 100,0

20

(kg/m3)

810,21 809,82 809,42 809,02 808,63 808,23 807,82 807,42 807,01 806,61 806,20 805,78 805,37 804,96 804,54 804,12 803,70 803,27 802,85 802,42 801,99 801,55 801,12 800,68 800,24

799,80 799,35 798,90 798,45 798,00 797,54 797,08 796,62 796,15 795,68 795,21 794,73 794,25 793,77 793,28 792,79 792,30 791,80 791,29 790,79 790,28 789,76 789,24

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

597

5. Textos gerais

5.6. AFERIO DOS INTERFERES


1. Introduo .................................................................. 2. Aferio da actividade antivrica (reduo do efeito citopatognico)............................................................ 3. Aferio de um interfero por meio de clulas Hep2c e do vrus da encefalomiocardite infecciosa .............. 3.1. Cultura e preparao das clulas Hep2c............ 3.2. Multiplicao do vrus EMC .............................. 3.3. Mtodo de aferio.............................................. 3.3.1. Determinao do intervalo de medida .... 601 601 601 601 601 602 602 3.3.2. Aferio .................................................... 3.3.3. Anlise dos resultados.............................. 4. Validao de outros mtodos ...................................... 4.1. Escolha da linha celular e do vrus.................... 4.2. Escolha da tcnica de colorao vital ................ 4.3. Validao estatstica............................................ 4.4. Validao do plano de ensaio.............................. 5. Reagentes e meios de cultura .................................... 602 602 602 602 603 603 603 603
5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

599

5.6. Aferio dos interferes

5.6. AFERIO DOS INTERFERES


Esta seco fornecida a ttulo de informao e conselho; no constitui parte obrigatria da Farmacopeia. 1. INTRODUO As monografias relativas aos interferes humanos incluem, geralmente, uma aferio biolgica fundamentada na aco inibidora, exercida pelos interferes, sobre o efeito citopatognico de um vrus sobre uma cultura celular. Entretanto, geralmente, no do especificaes pormenorizadas no que se refere ao vrus, linha celular e tcnica a utilizar, de modo a permitir uma certa flexibilidade, indispensvel nos casos em que a monografia inclui vrias subclasses de interferes. A presente monografia tem por finalidade fornecer ao analista indicaes gerais sobre a tcnica, a optimizao e a validao deste tipo de ensaios, uma vez escolhida uma combinao apropriada de linha celular e vrus citopatognico. Descreve em pormenor, a ttulo de exemplo de mtodo apropriado, um processo analtico aplicvel a uma aferio de actividade antivrica particular, fornecendo informaes sobre outras combinaes vrus-linha celular e indicaes sobre as modalidades de adaptao e de validao do processo para essas outras combinaes. 2. AFERIO DA ACTIVIDADE ANTIVRICA (REDUO DO EFEITO CITOPATOGNICO) A aferio da actividade antivrica dos interferes humanos baseia-se na avaliao da resposta induzida em clulas humanas pelos interferes que suprimem ou reduzem o efeito citopatognico produzido nessas clulas por um vrus infeccioso. A actividade do interfero avaliada por comparao da sua capacidade de proteger clulas da aco citopatognica de um vrus com a de uma preparao padro apropriada, calibrada em Unidades Internacionais. 3. AFERIO DE UM INTERFERO POR MEIO DE CLULAS Hep2c E DO VRUS DA ENCEFALOMIOCARDITE INFECCIOSA O mtodo de aferio que se descreve a ttulo de exemplo baseia-se na reduo do efeito citopatognico. Utiliza clulas humanas Hep2c que so infectadas com o vrus da encefalomiocardite infecciosa (EMC) com a finalidade de avaliar a actividade de diferentes preparaes de interfero humano. Este mtodo foi empregado desde que foram feitos estudos patrocinados pela Organizao Mundial de Sade (OMS) para estabelecimento de padres internacionais dos interferes humanos alfa, beta e gama e a sua sensibilidade, fiabilidade e reprodutibilidade para estimulao da actividade desses diferentes tipos de interferes humanos foram demonstrados por variadas vezes. Para as culturas de clulas de mamferos, todas as operaes so conduzidas segundo os mtodos padronizados estabelecidos para estas culturas celulares. Os volumes de reagentes a utilizar so aqui indicados para culturas efectuadas em frascos de 75 cm2; podem utilizar-se outros tipos de recipientes (frascos ou caixas de cultura) e, nesse caso os volumes devem ser, ento, consequentemente adaptados. 3.1. CULTURA E PREPARAO DAS CLULAS HEP2C As clulas Hep2c so mantidas e repicadas em meio de cultura A. FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

As clulas so conservadas na forma congelada seguindo mtodos padronizados. Podem ser mantidas em cultura at, no mximo, 30 passagens aps o que devem preparar-se novas culturas a partir dos lotes congelados. Para iniciar a aferio, proceda recolha das clulas quando os tapetes celulares apresentarem uma confluncia de 90 por cento, pelo mtodo de tratamento com tripsina que se descreve a seguir. Remova o meio de cultura dos frascos. Junte a cada frasco 5 ml de soluo de tripsina aquecida a 37C, preparada extemporaneamente por diluio a 1/50 com tampo salino de fosfato a partir de uma soluo-me concentrada contendo 4 mg/ml de tripsina R e 4 mg/ml de edetato de sdio R. Rolhe os frascos e agite com movimentos circulares para lavar o tapete celular. Elimine o excesso de soluo de tripsina. Coloque os frascos na incubadora a 37C durante 5-10 min. Proceda a um exame visual ou microscpico para observar os sinais de separao das clulas. Ao microscpio, estas aparecem ou aglutinadas ou separadas flutuando livremente. Agite energicamente os frascos para separar todas as clulas e, de seguida, junte cerca de 5 ml de meio de cultura A. Agite energicamente para obter uma suspenso de clulas separadas. Para preparar as suspenses celulares para a aferio, disperse as clulas com precauo aspirando e expirando com uma pipeta para desfazer os agregados celulares e conte as clulas ajustando a concentrao das suspenses em 6 105 clulas por mililitro. 3.2. MULTIPLICAO DO VRUS EMC O vrus EMC multiplicado em clulas L-929 de rato de modo a obter-se uma suspenso-me do vrus. A manuteno das clulas L-929 deve ser efectuada por tratamento com tripsina e repicagem como se descreve para as clulas Hep2c (NOTA: em caso de crescimento celular fraco, pode ser necessrio substituir o soro de vitela recm-nascida por soro fetal de vitela). Tome vrios frascos contendo culturas confluentes de clulas L-929. Retire o meio de cultura contido nos frascos. Introduza em cada frasco 2 ml de suspenso do vrus EMC, previamente diludo at uma concentrao de cerca de 2,5 108 UFP/ml com meio de cultura B. Em cada frasco contendo 4-6 l07 clulas L-929 a multiplicidade da infeco ser aproximadamente de 10 UFP/clula. Disperse com precauo a suspenso vrica na superfcie de um tapete celular, agitando com movimentos circulares, e coloque de novo na incubadora durante cerca de 1 h. Mantenha o pH do meio entre 7,4 e 7,8. Aps a adsoro do vrus EMC, junte a cada frasco cerca de 40 ml de meio de cultura B e volte a colocar na incubadora a 37C durante cerca de 30 h. Mantenha o pH do meio entre 7,4 e 7,8 para obter um rendimento mximo em vrus. Recolha o sobrenadante da cultura e conserve-o a cerca de 40C. Coloque os frascos a -20C para congelar os tapetes celulares e, de seguida, aquea at temperatura ambiente. Junte cerca de 5 ml de meio de cultura e agite para romper as membranas celulares. Passe o contedo de cada frasco para o recipiente que contm o sobrenadante da cultura e transfira esta mistura para tubos de centrfuga de plstico de 50 ml e centrifugue a cerca de 500 g durante, aproximadamente 10 min, para separar os resduos celulares. Reparta o sobrenadante lmpido em tubos de vidro de tampa roscada em fraces de 20, 10, 5, 1, 0,5 ou 601
5. Textos gerais

5.6. Aferio dos interferes

0,2 ml por tubo, segundo as necessidades. Conserve a -70C. Os volumes mais altos podem ser descongelados e divididos em quantidades mais pequenas e recongelados, se necessrio. Convm, entretanto, notar que esta suspenso-me do vrus EMC no conserva o seu ttulo inicial a no ser que seja conservada ininterruptamente a cerca de -70C; ciclos de congelao-descongelao repetidos ou a conservao a temperaturas mais elevadas (por exemplo, da ordem de -20C) conduzem a uma perda progressiva do ttulo. 3.3. MTODO DE AFERIO 3.3.1. Determinao do intervalo de medida Preparao das solues de interfero Dilua o padro de interfero apropriado (por exemplo, um padro OMS de um subtipo de interfero especfico) no meio de cultura A de modo a obter uma srie de diluies de razo 10 cobrindo o intervalo de doses de 1 000-0,001 UI/ml. Utilize placas de microtitulao de 96 cavidades. Introduza em cada cavidade 100 l de meio de cultura A. Junte a todas as cavidades, com excepo das que serviro de testemunhas vrus, cerca de 100 l de cada uma das diluies da preparao padro. Misture cuidadosamente o contedo das cavidades com uma pipeta multicanais regulada para 100 l. Distribuio da suspenso celular Verta numa placa de Petri estril a suspenso de clulas Hep2c ajustada de modo a conter cerca de 6 105 clulas por mililitro de meio de cultura A e reparta o contedo da placa de Petri nas cavidades da placa de microtitulao utilizando uma pipeta multicanais regulada para 100 l. Coloque as placas na incubadora a 37C em atmosfera com 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h. Infeco pelo vrus Nesta etapa, verifique ao microscprio que os tapetes de clulas Hep2c so confluentes, que apresentam uma distribuio celular relativamente uniforme, que a morfologia est correcta e que as clulas esto de boa sade. Esvazie, ento, a maior parte do meio de cultura contido nas cavidades, procedendo do seguinte modo: inverta a placa, sacuda-a e seque-a com papel absorvente (deve proceder-se sempre do mesmo modo para esvaziar o lquido contido nas cavidades). Dilua a suspenso-me do vrus EMC com meio de cultura A fresco de modo a obter um ttulo infeccioso de cerca de 3 x 107 UFP/ml (NOTA: so necessrios cerca de 20 ml de vrus diludo para cada placa, mais 5-10 por cento de volume suplementar). Coloque a suspenso diluda numa placa de Petri estril de 9 cm e, de seguida, com uma pipeta multicanais regulada para 200 l, reparta o contedo da placa por todas as cavidades (compreendendo as que servem de testemunhas vrus), com excepo das previstas como testemunhas clulas; nestas ltimas, junte cerca de 200 l de meio de cultura A que no contenha vrus. Volte a colocar as placas na incubadora a 37C, em atmosfera com 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h. Colorao Examine as placas ao microscpio para confirmar o efeito citopatognico produzido pelo vrus EMC sobre as testemunhas vrus. O tempo necessrio para obter um efeito citopatognico mximo pode variar de uma aferio para outra devido variabilidade intrnseca da reaco das clulas Hep2c prova vrica num determinado perodo da cultura em contnuo. Remova a maior parte do meio de cultura contido nas cavidades 602

para uma soluo descontaminante apropriada (por exemplo, hipoclorito de sdio). Junte nas cavidades soluo salina tamponada de pH 7,4 R e remova-a para uma soluo descontaminante. Introduza em cada cavidade 150 l de soluo de colorao e deixe a colorao das clulas efectuar-se durante cerca de 30 min temperatura ambiente; de seguida, remova a soluo de colorao para uma soluo descontaminante. Junte nas cavidades cerca de 150 l de soluo de fixao, deixe agir durante 10 min temperatura ambiente e remova a soluo de fixao para uma soluo descontaminante. Lave os tapetes celulares colocando as placas num recipiente de plstico em gua corrente. Seque superficialmente as placas com papel absorvente. Seque, de seguida, a uma temperatura compreendida entre 20 e 37C at evaporao total da humidade. Junte em cada cavidade 150 l de hidrxido de sdio 0,1 M. Elua o corante agitando suavemente as placas ou batendo com elas repetidas vezes na palma da mo. Assegure-se que a repartio da colorao uniforme no conjunto das cavidades antes de proceder s determinaes espectrofotomtricas. Determine a absorvncia em 610-620 nm usando um leitor de placas de microtitulao, utilizando como branco uma cavidade, ou uma linha de cavidades, que no contenham clulas mas 150 l de hidrxido de sdio 0,1 M. Calcule as concentraes do padro de interfero que corresponde, respectivamente, reduo mxima e reduo mnima do efeito citopatognico. Estas concentraes definem o intervalo de medida que ser utilizado para a aferio. 3.3.2. Aferio Efectue a aferio segundo o mtodo que antes se descreveu, utilizando: Como solues problema, uma srie de diluies a 1/2 da amostra em meio de cultura A, cujas concentraes nominais preencham o intervalo de medida da aferio, como solues padro, uma srie de diluies a 1/2 em meio de cultura A do padro apropriado (por exemplo, um padro OMS de um subtipo de interfero especfico), cujas concentraes nominais preencham o intervalo de medida da aferio. 3.3.3. Anlise dos resultados Os resultados das aferies da actividade antivrica ajustam-se geralmente a uma curva dose-resposta de tipo sigmide, quando se constri o grfico da concentrao em interfero (logaritmo do inverso da diluio) em funo da absorvncia. Construa a curva da concentrao em interfero (logaritmo do inverso da diluio) em funo da absorvncia determinada, para as solues padro e para as solues problema. Considerando s a zona linear da curva, calcule o teor em interfero da amostra por comparao das respostas obtidas com as solues problema e as solues padro, segundo os mtodos estatsticos habituais para os ensaios em linhas paralelas. 4. VALIDAO DE OUTROS MTODOS 4.1. ESCOLHA DA LINHA CELULAR E DO VRUS Para a aferio da actividade antivrica dos interferes podem ser utilizados um certo nmero de outras combinaes linha celular/vrus, por exemplo, o vrus EMC com clulas do epitelioma pulmonar A549, o vrus Forest Semliki (vrus SF) ou o vrus Sindbis com fibroblastos humanos, o vrus da estomatite vesicular com fibroblastos diplides humanos, a FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

5.6. Aferio dos interferes

linha celular amnitica humana WISH ou a linha de clulas renais bovinas de Madin-Darby. A combinao linha celular/vrus escolhida deve ser, geralmente, aquela cuja resposta preparao de interfero a titular apresentar a sensibilidade mxima e que permita obter respostas paralelas com preparaes da amostra e do padro do interfero. 4.2. ESCOLHA DA TCNICA DE COLORAO VITAL A tcnica de colorao atrs descrita permite determinar o nmero residual de clulas viveis. Podem ser igualmente utilizadas outras tcnicas, nomeadamente a colorao com violeta de metilo ou com violeta de cristal, ou o mtodo de converso do azul de tiazol (MTT). Em todos os casos, o critrio de escolha do mtodo deve ser a obteno, entre a colorao e o nmero de clulas viveis, de uma relao que apresente uma linearidade e uma sensibilidade satisfatrias. 4.3. VALIDAO ESTATSTICA Como todas as aferies biolgicas efectuadas segundo o modelo de linhas paralelas, a aferio da actividade antivrica deve satisfazer s condies estatsticas habituais de linearidade da resposta, de paralelismo e de varincia. 4.4. VALIDAO DO PLANO DE ENSAIO Como para todas as aferies em placas de microtitulao, necessria uma validao do plano do ensaio utilizado. importante, nomeadamente, despistar os erros resultantes de uma ordem de distribuio no aleatria nas cavidades ou o efeito de bordo da placa, e elimin-los efectuando um plano de aferio aleatria ou evitando utilizar cavidades com bordos.

5. REAGENTES E MEIOS DE CULTURA Meio de cultura A (soro de vitela recm-nascida: 10 por cento)
Meio de cultura RPMI 1640, se necessrio adicionado de antibiticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina 10 ng/ml) L-Glutamina, 200 mM, estril Soro de vitela recm-nascida

450 ml 5 ml 50 ml

Meio de cultura B (soro fetal de vitela: 2 por cento


Meio de cultura RPMI 1640, se necessrio adicionado de antibiticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina 10 ng/ml) L-Glutamina, 200 mM, estril Soro fetal de vitela

490 ral 5 ml 10 ml

Soluo de colorao
Negro de naftaleno cido actico glacial Acetato de sdio anidro gua q.b.p 0,5 g 90 ml 8,2 g 1 000 ml
5. Textos gerais

Soluo de fixao
Formaldedo (40 por cento) cido actico glacial Acetato de sdio anidro gua q.b.p. 100 ml 90 ml 8,2 g 1 000 ml

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

603

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa ........................ 607

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

605

5. Textos gerais

5.7. QUADRO DAS CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS CITADOS NA FARMACOPEIA PORTUGUESA

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos

5.7. QUADRO DAS CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS CITADOS NA FARMACOPEIA PORTUGUESA


O quadro seguinte publicado para completar a monografia geral Preparaes radiofarmacuticas. Os valores foram obtidos a partir da base de dados do National Nuclear Data Center (NNDC) situado no Brookhaven National Laboratory, Upton, NY., Estados Unidos da Amrica, directamente acessvel pela Internet: http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html. Se for preferida uma outra fonte de informaes (valores mais recentes), deve ser mencionada explicitamente. Outras fontes de dados: * DAMRI (Dpartement des Applications et de la Mtrologie des Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, Frana),

** PTB (Physikalisch-Technishe Bundesanstalt, Braunschweig, Alemanha), *** NPL (National Physical Laboratory, Teddington, Middlesex, Reino Unido). A incerteza da semi-vida dada entre parntesis. Em princpio, o nmero entre parntesis o valor numrico da incerteza-padro dos ltimos dgitos correspondentes ao valor indicado (Guide to the Expression of Uncertainty in measurement, International Organisation for Standardisation (ISO), 1993, ISBN 92-67-20188-3). So utilizadas as abreviaturas seguintes: eA = electres Auger, ec = electres de converso, = electres, + = positres, = raios gama, X = raios X

Emisso electrnica Radionuclido Semi-vida Tipo Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 99,8 99,8 0,8 X Tipo

Emisso fotnica Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 199,6 (II) 199,5 (II) 1 7

Azoto-13 (13N) Carbono-11 (11C)

9,965 (4) min 20,385 (20) min 30,04 (3) anos

+ +

0,492 (I) (mx: 1,198) 0,386 (I) (mx: 0,960) 0,026

0,511 0,511 0,005 0,032-0,036

eA ec

Csio-137 (137Cs) em equilbrio com Brio-137m (137mBa)

(137mBa: 2,552 (1) min)

0,624 0,656 0,174 (I) 0,416 (I)

8,0 1,4 94,4 5,6

0,662

85,1

9,33 (3) h

eA ec

0,055 0,246 0,276 0,316

3 8,5 2 2,3

0,070-0,073 0,083 0,331 0,361 0,406 0,585 0,692 0,767 0,826 0,908 0,946 1,099 1,277

69 19 79 9,9 2,0 3,6 4,3 3,2 2,4 5,7 7,9 1,8 1,6

Chumbo-201 (201Pb) (produz Tlio-201 radioactivo)

51,873 (9) h Chumbo-203 (203Pb)

eA ec

0,055 0,194

3,0 13,3

0,010 0,071-0,073 0,083 0,279 0,401

37,0 69,6 19,4 80,8 3,4

(I) Energia mdia do espectro . (II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

607

5. Textos gerais

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos

Emisso electrnica Radionuclido Semi-vida Tipo Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 47 0,9 18,1 Tipo

Emisso fotnica Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 25 38,0 (II) 100,0 14,1 2,2 66,1 4,3 15.5 3,0 7,8 17,0 3,1 7,6 57 9,2 85,6 10,7

77,27 (3) dias

eA
+

0,006 0,179 (I) 0,631 (I)

0,006-0,007 0,511 0,847 1,038 1,175 1,238 1,360 1,771 2,015 2,035 2,598 3,202 3,253

Cobalto-56 (56Co)

5. Textos gerais

271,79 (9) dias Cobalto-57 (57Co)

eA + ec ec

0,006-0,007 0,014 0,115 0,129

177,4 7,4 1,8 1,3 0,692 49,4 14,9

0,006-0,007 0,014 0,122 0,136

0,15 X 0,006-0,007 0,511 0,811 0,864 1,675 1,173 1,333 X 0,012-0,014 0,190 26,3 29,9 (II) 99,4 0,7 0,5 100,0 100,0 17,0 67,6 22,3 9,9

70,86 (7) dias Cobalto-58 (58Co)

eA
+

0,006 0,201 (I)

Cobalto-60 (60Co)

5,2714 (5) anos

0,096 (I) (mx. 0,318)

99,9

13,10 (3) s Crpton-81m (81mKr) 27,7025 (24) dias Crmio-51 (51Cr) Enxofre-35 (35S) Estrncio-89 (89Sr) em equilbrio com trio-89m (89mY) Estrncio-90 (90Sr) em equilbrio com trio-90 (90Y) Flor-18 (18F) Fsforo-32 (32P) Fsforo-33 (33P)

ec

0,176 0,189

26,4 4,6

eA

0,004

67

0,005 0,320

87,51 (12) dias 50,53 (7) dias (89mY: 16,06 (4) s) 28,74 (4) anos (90Y: 64,l0 (8) h) 109,77 (5) min 14,26 (4) dias 25,34 (12) dias

0,049 (I) (mx: 0,167) 0,583 (I) (mx: 1,492)

100 99,99 0,909 0,01

0,196 (I) (mx: 0,546)

100

0,250 (I) (mx: 0,633) 0,695 (I) (mx: 1,71) 0,076 (I) (mx: 0,249)

96,7 100 100

0,511

193,5(II)

(I) Energia mdia do espectro . (II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

608

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos

Emisso electrnica Radionuclido Semi-vida Tipo Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 21 1 0,7 3,8 0,3 50 Tipo

Emisso fotnica Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 19,1 112 (II) 5,9 37 1,2 2,1 5,6 1,9 23,4 1,5 1,5 1,1 1,3 4,1 1,8 57 42,4 21,2 2,4 16,8 4,7 0,15 4,7 178,3 3,0 44,1 178,3 3,0 70,5 25,9 98,3 92,9 68,4 10,5 27,8 123,4 (II) 97,8 2,1 6,9 82,3

9,49 (7) h

eA
+

0,008 0,157 (I) 0,331 (I) 0,397 (I) 0,782 (I) 1,90 (I)

0,009-0,010 0,511 0,834 1,039 1,333 1,919 2,190 2,423 2,752 3,229 3,381 3,792 4,086 4,295 4,807

Glio-66 (66Ga)

3,2612 (6) dias

eA ec

0,008 0,082-0,084 0,090-0,092 0,175

62 30,4 3,6 0,3

0,008-0,010 0,091-0,093 0,185 0,209 0,300 0,394 0,888

Glio-67

(67Ga)

67,629 (24) min Glio-68 (68Ga)

eA
+

0,008 0,353 (I) 0,836 (I) 0,008 0,353 (I) 0,836 (I) 0,019

5,1 1,2 88,0 42,4 1,2 88,0 13,4

0,009-0,010 0,511 1,077

Germnio-68 (68Ge) em equilbrio com Glio-68 (68Ga)

270,82 (27) dias (68Ga:

eA
+

0,009-0,010 0,511 1,077

67,629 (24) min) 4,9 (1) h eA

0,023-0,026 0,642 0,658 0,885 0,938 0,997

ndio-110 (110In)

69,1 (5) min ndio-110m (110m In)

eA
+

0,019 1,015 (I)

5,3 6,1

0,023-0,026 0,511 0,658 2,129

2,8047 (5) dias ndio-111 (111In)

eA ec

0,019

15,6

0,003 0,023-0,026

0,145 0,167-0,171 0,219 0,241-0,245 0,162 0,186-0,190 0,777 (I) (mx: 1,985)

7,8 1,3 4,9 1,0 40 40 X

0,171 0,245

90,2 94,0

49,51 (1) dia ndio-114m (114mIn) em equilbrio com ndio-114(114In) (114In: 71,9 (1) s)

eA

0,023-0,027

36,3

95

0,190 0,558 0,725

15,6 3,2 3,2

(I) Energia mdia do espectro . (II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

609

5. Textos gerais

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos

Emisso electrnica Radionuclido Semi-vida Tipo Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 12,3 13,6 1,8 0,4 Tipo

Emisso fotnica Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 9,3 86,6 83,3 0,1 0,4 0,3 1,4 0,4 15,5 114 26 6,7 42,2 34 2,9 2,3 (II) 33 4,2 0,8 0,3

13,27 (8) h

eA lc

0,023 0,127 0,154 0,158

0,004 0,027-0,031 0,159 0,346 0,440 0,505 0,529 0,538

Iodo-123 (123I)

59,402 (14) dias Iodo-125 (125I)


5. Textos gerais

eA + ec

0,004 0,023-0,035

80 33

0,004 0,027 0,031 0,035

13,11 (5) dias

eA ec

0,023 0,354 0,634 0,109 (I) 0,290 (I) 0,459 (I) 0,530 (I) 0,46 0,330

6 0,5 0,1 3,6 32,1 8,0 1 3,5 1,6

0,027-0,031 0,388 0,491 0,511 0,666 0,754 0,880 1,420

Iodo-126 (126I)

8,02070 (11) dias

ec

0,029-0,030

3,9

Iodo-131 (131I)

0,069 (I) 0,097 (I) 0,192 (I) 0,140 (I) 0,162 (I) 0,299 (I) 0,441 (I) 0,140 (I) 0,237 (I) 0,307 (I) 0,352 (I) 0,399 (I) 0,444 (I) 0,529 (I)

2,1 7,3 89,9 3,8 3,2 4,2 83 7,4 8 8,8 21,9 8 7,5 23,8

0,080 0,284 0,365 0,637 0,723 0,530 0,875 1,298


*0,527

2,6 6,1 81,7 7,2 1,8 87 4,5 2,4

Iodo-133 (133I) (produz Xnon-133 radioactivo)

20,8 (1) h

6,57 (2) h Iodo-135 (135I) (produz Xnon-135 radioactivo)

0,547 0,837 1,039 1,132 1,260 1,458 1,678 1,791

13,8 7,2 6,7 8,0 22,7 28,9 8,7 9,6 7,8

trio-90 (90Y)

64,10 (8) h 65,94 (1) h

0,934 (I) (mx: 2,280) 0,133 (I) 0,290 (I) 0,443 (I)

100 16,4 1,1 82,4 X 0,018-0,021 3,6

Molibdnio-99 (99Mo) em equilbrio com Tecncio-99m (99mTc) (99mTc: 6,01(1) h)

0,041 0,141 0,181 0,366 0,740 0,778

1,1 4,5 6 1,2 12,1 4,3

(I) Energia mdia do espectro . (II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

610

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos

Emisso electrnica Radionuclido Semi-vida Tipo Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 99,9 31,3 25,0 4,3 1,8 25,0 X Tipo

Emisso fotnica Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 199,8 (II) 57,2 64 23,2 3,0 5,3 54,2 2,2 9,0
5. Textos gerais

Oxignio-15 (15O)

122,24 (16)s 4,576 (5) h

0,735 (I) (mx: 1,732) 0,011 0,176 0,188 0,253 (I) 0,447 (I)

0,511 0,013-0,014 0,190 0,446 0,457 0,510 0,511 0,538 X 0,020-0,023 0,497 0,610

eA ec
+

Rubdio-81 (81Rb) em equilbrio com Cripton-81m (81mKr) (81mKr: 13,10 (3) s 39,26 (2) dias Rutnio-103 (103Ru) em equilbrio com Rdio-103m (103mRh)

eA + ec ec

0,017 0,030-0,039 0,031 (I) 0,064 (I)

12 88,3 6,6 92,9

91 5,8

(103mRh: 56,144 (20) min) 26,1 (1) h ec


+

0,285 0,353 0,495 (I)

3,4 1,4 0,3

0,010 0,069-0,071 0,08 0,368 0,579 0,828 1,206 1,226 1,274 1,363 1,515

32,0 63,3 17,5 87,2 13,8 10,8 29,9 3,4 3,3 3,4 4,0 46,0 73,7 20,4

Tlio-200 (200Tl)

72,912 (17) h Tlio-201 (201Tl)

ec

0,016-0,017 0,027-0,029 0,052 0,084 0,153

17,7 4,1 7,2 15,4 2,6

0,010 0,069-0,071 0,080

0,135 0,167 X 0,010 0,069-0,071 0,080 0,440

2,6 10,0 31,0 61,6 17,1 91,4

12,23 (2) dias Tlio-202 (202Tl)

eA ec

0,054 0,357

2,8 2,4

Tecncio-99 (99Tc)

2,11

105 anos

0,085 (I) (mx: 0,294) 0,002 0,015 0,120 0,137-0,140 0,022

100 74 2,1 9,4 1,3 11,6 X 0,026-0,030 0,470 0,508 75,6 1,4 17,7 X 0,018-0,021 0,141 7,3 89,1

6,01(1) h Tecncio-99m (99mTc)

ec eA ec

**19,16

(5) dias

eA

Telrio-121 (121Te)

(I) Energia mdia do espectro . (II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

611

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos

Emisso electrnica Radionuclido Semi-vida Tipo Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 88,0 7,4 Tipo

Emisso fotnica Energia (MeV) Probabilidade de emisso (por 100 desintegraes) 50,5

154,0 (7) dias Telrio-121m (121mTe) em equilbrio com Telrio-121 (121Te) (121Te: 19,16(5) dias Trtio (3H)
*12,33

eA

0,003 0,022-0,023

0,026-0,031

ec

0,050 0,077 0,180


*0,006 (I) (mx:

33,2 40,0 6,1 0,019)


*100

0,212 1,102

81,4 2,5

(6) anos

11,84 (7) dias Xnon-131m (131mXe)

eA ec

0,025 0,129 0,159 0,163

6,8 61 28,5 8,3 5,8

0,004 0,030 0,034

8,3 44,0 10,2

5. Textos gerais

0,164 X 0,004 0,031 0,035 0,080

2,0 6,3 40,3 9,4 38,3

5,243 (1) dias Xnon-133 (133Xe)

eA ec

0,026

0,045 0,075-0,080 0,101 (I) 0,025

55,1 9,9 99,0 7 X

2,19 (1) dias Xnon-133m (133Xe) (produz Xnon-133 radioactivo)

eA ec

0,004 0,030 0,034

7,8 45,9 10,6

0,199 0,228 0,232

64,0 20,7 46 5,5 3,1 96,0 X

0,233 0,031-0,035 0,250 0,608

10,0 5,0 90,2 2,9

9,14 (2) h Xnon-135 (135Xe)

ec

0,214 0,171 0,308

(I) Energia mdia do espectro . (II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

612

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5.8. HARMONIZAO DAS FARMACOPEIAS


5.8. Harmonizao das Farmacopeias.............................. 615

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

613

5. Textos gerais

5.8. Harmonizao das Farmacopeias

5.8. HARMONIZAO DAS FARMACOPEIAS


Este captulo geral serve somente como informao. Contm indicaes sobre o grau de harmonizao e, por consequncia, da possibilidade de intermutao dos diversos captulos gerais e monografias da Farmacopeia dos Estados Unidos da Amrica do Norte, da Farmacopeia Europeia e da Farmacopeia Japonesa. No modifica em nada o estatuto das monografias e captulos gerais que fazem f em caso de dvida ou litgio quando a conformidade com a Farmacopeia solicitada. A Comisso da Farmacopeia Europeia reconhece a utilidade de uma cooperao com outras farmacopeias para a elaborao de monografias e captulos gerais harmonizados. Esta harmonizao totalmente compatvel com os objectivos da Comisso e apresenta diversas vantagens, nomeadamente a simplificao e a racionalizao dos mtodos de controlo da qualidade e os processos de registo. Alis, esta harmonizao auxilia positivamente os trabalhos da Conferncia Internacional sobre a Harmonizao (ICH) e a Cooperao Internacional sobre a Harmonizao Veterinria (VICH) na medida em que certas notas explicativas dependem dos captulos gerais da Farmacopeia para a sua aplicao. Os trabalhos de harmonizao so realizados de uma forma bem definida, mas informal, no Grupo de Discusso das

Farmacopeias (PDG) que associa a Farmacopeia dos Estados Unidos, a Farmacopeia Europeia e a Farmacopeia Japonesa. Informaes sobre os pontos que sero tratados pelo PDG figuraro nas verses posteriores do presente captulo. A harmonizao dos captulos gerais tem como fim a obteno de mtodos ou normas intercambiveis; tal implica que a conformidade estabelecida com ajuda de uma das farmacopeias ser exactamente a mesma se o captulo correspondente de uma qualquer das outras farmacopeias tiver sido utilizado. Qualquer diferena residual entre os captulos gerais harmonizados das trs farmacopeias ser descrita nas sucessivas verses do presente captulo. A harmonizao das monografias tem como fim obter normas idnticas para todas as caractersticas de uma substncia. A harmonizao integral de certas monografias pode revelar-se difcil por causa, por exemplo, de diferenas de estatuto jurdico ou de interpretaes divergentes. Se tal acontecer, a PDG decidiu aprovar e publicar monografias em que o maior nmero possvel de elementos tero sido harmonizados. Os elementos divergentes que subsistem nas monografias harmonizadas sero descritos nas sucessivas verses do presente captulo. As trs farmacopeias decidiram no modificar unilateralmente as monografias e captulos gerais harmonizados; as revises sero efectuadas simultaneamente pelas trs farmacopeias segundo o processo mais conveniente.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

615

5. Textos gerais

5.9. POLIMORFISMO
5.9. Polimorfismo.............................................................. 619

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

617

5. Textos gerais

5.9. Polimorfismo

5.9. POLIMORFISMO
O polimorfismo (ou polimorfismo cristalino) a capacidade de um composto no estado slido se apresentar em vrias formas cristalinas diferentes enquanto que a sua composio qumica no varia. O estado slido de uma molcula pode apresentar-se igualmente numa forma no cristalina designada pelo termo amorfa. Quando o fenmeno observado para um corpo simples ou elemento (enxofre, por exemplo) o termo polimorfismo substitiu-se por alotropia. O termo pseudomorfismo utilizado para os solvatos (incluindo os hidratos) nos quais um solvente participa na malha cristalina em propores estequiomtricas; por vezes, por extenso, este termo empregado igualmente para os compostos de incluso nos quais o solvente est englobado na malha em propores variveis. Por isso, o termo pseudopolimorfismo ambguo dada a sua utilizao em situaes diferentes; , portanto, prefervel s reter os termos solvatos e hidratos. Quando uma monografia indica que a substncia apresenta polimorfismo, pode tratar-se de um polimorfismo cristalino verdadeiro, da existncia de um solvato, de alotropia ou da existncia de uma forma amorfa. A constncia da composio qumica implica que todas as formas cristalinas e a forma amorfa de uma dada espcie apresentam um comportamento qumico idntico em soluo ou fuso; pelo contrrio, as suas caractersticas fsico-qumicas e fsicas (solubilidade, dureza, compressibilidade, massa volmica, ponto de fuso, etc.) e, por consequncia, a sua reactividade e a sua biodisponibilidade podero ser diferentes no estado slido. Quando uma molcula apresenta polimorfismo, a forma mais estvel termodinamicamente aquela cuja entalpia livre mnima a uma dada temperatura e presso. As outras formas encontram-se num estado chamado metastvel. Nas condies normais de temperatura e presso, uma forma no estado metastvel pode manter-se imutvel ou pode representar uma transio para uma forma termodinamicamente mais estvel. Se existem vrias formas cristalinas, uma de entre elas termodinamicamente mais estvel a uma certa presso e temperatura. Uma dada forma cristalina pode constituir uma fase que susceptvel de se encontrar em equilbrio com outras fases slidas e tambm com as fases lquida e gasosa. Se cada uma das formas cristalinas a mais estvel a determinada temperatura, a passagem de uma para outra reversvel: neste caso, a transio chamada de

enanteotrpica. Ao contrrio, se s uma das formas estvel a qualquer temperatura, a transio irrreversvel ou monotrpica. A passagem de uma fase a outra um equilbrio de varincia 1 o que explica que a uma dada presso este estado caracterizado por uma temperatura chamada de temperatura de transio. As formas cristalinas diferentes ou solvatos podem ser geradas por variao das condies de cristalizao (temperatura, presso, solvente, concentrao, velocidade de cristalizao, induo do meio de cristalizao, presena e concentrao de impurezas, etc.). O estudo do polimorfismo pode ser realizado utilizando as seguintes tcnicas: difraco de raios-X dos ps, difraco de raios-X de um s cristal,
5. Textos gerais

anlise trmica (2.2.34) (calorimetria diferencial, termogravimetria, termomicroscopia), microcalorimetria, anlise de absoro da gua, microscopias ptica e electrnica, ressonncia magntica nuclear no estado slido, espectrofotometria de absoro no infravermelho (2.2.24), espectrometria de Raman (2.2.48), determinao da solubilidade e da velocidade intrnseca de dissoluo, determinao da massa volmica. Estas tcnicas so muitas vezes complementares e indispensvel utilizar vrias. Os diagramas presso/temperatura e energia/temperatura baseados nos dados analticos so ferramentas teis para conhecer as relaes energticas (enanteotropismo, monotropismo) e a estabilidade termodinmica de cada modificao de um composto polimrfico. No caso dos solvatos, a anlise calorimtrica diferencial e a termogravimetria devem ser privilegiadas, associadas a determinaes da solubilidade e da velocidade intrnseca de dissoluo e difraco de raios-X. No caso dos hidratos, o estabelecimento das isotrmicas de absoro/desabsoro da gua deve ser efectuado para conhecer as zonas de estabilidade relativa. Em geral, os hidratos so menos solveis na gua que as formas anidras e os solvatos so menos solveis no seu solvente que as formas no solvatadas.

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

619

5.10. CONTROLO DAS IMPUREZAS NAS SUBSTNCIAS PARA USO FARMACUTICO


5. Textos gerais

5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico ............................................................ 623

FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

621

5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico

5.10. CONTROLO DAS IMPUREZAS NAS SUBSTNCIAS PARA USO FARMACUTICO


Prembulo As monografias das substncias para uso farmacutico da Farmacopeia tm como objectivo assegurar uma qualidade destas substncias que seja aceite pelos utilizadores. Tendo em conta a misso que a Farmacopeia desempenha em matria de sade pblica, indispensvel que as suas monografias permitam um controlo adequado das impurezas. As exigncias de qualidade so estabelecidas na base de consideraes de ordem cientfica, tcnica e regulamentar. As exigncias relativas s impurezas figuram, por um lado, nas monografias especficas e, por outro, na monografia geral Substncias para uso farmacutico que so complementares: as monografias especficas fixam os critrios de aceitao das impurezas, enquanto que a monografia geral define as exigncias relativas qualificao, identificao e declarao das impurezas orgnicas eventualmente presentes nos princpios activos. Os limiares de declarao, de identificao e de qualificao especificados na monografia geral Substncias para uso farmacutico aplicam-se a todas as substncias aparentadas. Entretanto, se uma monografia no inclui ensaio das substncias aparentadas apoiado num mtodo quantitativo, a presena de impurezas novas de teor superior a um dos limites arrisca-se a passar desapercebida porque o ensaio no permite detect-la. As exigncias da rubrica Substncias aparentadas da monografia Substncias para uso farmacutico, nomeadamente no que respeita aos limiares, no se aplica aos excipientes, como tambm so excludos das disposies desta rubrica os produtos biolgicos, os peptidos, os oligoelementos, os produtos radiofarmacuticos, os produtos de fermentao e produtos semi-sintticos derivados, os produtos base de plantas e os produtos brutos de origem animal ou vegetal. Se os limiares indicados na monografia geral no se aplicam, os conceitos gerais de declarao, de identificao (na medida do possvel) e de qualificao das impurezas so em compensao vlidos para estas classes de substncias. Bases da elaborao das monografias da Farmacopeia A elaborao das monografias visa as substncias presentes nos medicamentos que foram autorizados pelas Autoridades competentes que aderiram Farmacopeia Europeia. Estas monografias no incluem, portanto, necessariamente todas as substncias para uso farmacutico presentes no mercado mundial. As impurezas orgnicas e inorgnicas presentes nas substncias objecto de avaliao pelas Autoridades competentes so, por este facto, qualificadas do ponto de vista da sua inocuidade no teor mximo autorizado (dose diria mxima), a menos que novos dados sobre a inocuidade, posteriores avaliao, justifiquem limites mais baixos. As monografias das substncias para uso farmacutico da Farmacopeia Europeia so elaboradas por grupos de peritos e grupos de trabalho que funcionam em colaborao com as Autoridades nacionais da Farmacopeia, as autoridades competentes em matria de autorizao de entrada no FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

mercado, os laboratrios nacionais de controlo e o laboratrio da Farmacopeia Europeia; eles so igualmente assistidos nas suas tarefas pelos produtores das substncias e/ou fabricantes da indstria farmacutica que as utilizam. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico A qualidade das substncias no que respeita s impurezas controlada por um conjunto de ensaios prescritos nas monografias. Estes ensaios tm como finalidade incluir as impurezas orgnicas e inorgnicas pertinentes em vista das origens donde provieram as substncias activas contidas nos medicamentos autorizados. O controlo dos solventes residuais objecto das disposies contidas na monografia geral Substncias para uso farmacutico e no captulo geral Solventes residuais. O certificado de conformidade para uma monografia da Farmacopeia Europeia indica, para uma substncia de uma dada origem, quais so os solventes residuais controlados assim como os critrios de aceitao especficos e o mtodo de controlo validado se for diferente dos mtodos descritos no captulo geral Identificao e controlo dos solventes residuais. As monografias das substncias qumicas orgnicas comportam geralmente um ensaio intitulado Substncias aparentadas que abarca as impurezas orgnicas pertinentes. Pode ser completado por outros ensaios, especficos, quando o ensaio de carcter geral no permite controlar uma dada impureza ou quando razes particulares (por exemplo, em relao com a inocuidade) justificam que seja prescrito um controlo especial. Quando a monografia cobre substncias que apresentam perfis de impurezas diferentes, pode conter um ensaio das substncias aparentadas nico que inclua todas as impurezas mencionadas na rubrica Impurezas ou incluir vrios ensaios que permitam o controlo de todos os perfis de impurezas. , ento, possvel verificar a conformidade da monografia aplicando somente os ensaios que so pertinentes com vista ao perfil de impurezas conhecido para a substncia e a origem consideradas. Podem, assim, figurar instrues relativas ao controlo das impurezas na rubrica Produo numa monografia, por exemplo, quando s um mtodo de controlo de uma impureza utilizado pelo fabricante porque tecnicamente demasiado complexo para ser de uso geral ou no pode ser aplicado substncia farmacutica final e/ou quando a validao do processo de produo (compreendendo a etapa de purificao) constitui uma garantia de controlo suficiente. Rubrica lmpurezas das monografias de princpios activos A rubrica Impurezas de uma monografia apresenta a lista das impurezas (com estrutura e denominao qumica, na medida do possvel), geralmente orgnicas, de que se sabe que so detectadas pelos ensaios prescritos na monografia. Esta informao baseada nos dados disponveis quando da elaborao ou da reviso da monografia e no necessariamente exaustiva. A rubrica compreende as impurezas especificadas e, se for caso disso, as outras impurezas detectveis. A todas as impurezas especificadas est associado um critrio de aceitao que no superior ao autorizado pelas Autoridades competentes. As outras impurezas detectveis so impurezas potenciais de estrutura definida que no so normalmente presentes para 623

5. Textos gerais

5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico

alm de um limiar de identificao nas substncias que entram na composio de medicamentos autorizados pelas Autoridades competentes. So citadas para informao na rubrica Impurezas. Se alm das impurezas especificadas e outras impurezas detectveis de um princpio activo aparecer qualquer outra impureza, incumbe ao utilizador da substncia verificar, em funo do teor e da natureza dessa impureza bem como da dose diria mxima e do limiar de identificao/qualificao apropriado se a sua identificao/qualificao ou no necessria em termos da monografia geral Substncias para uso farmacutico, rubrica Substncias aparentadas. importante notar que limiares especficos so aplicados s substncias para uso exclusivamente veterinrio. Interpretao do ensaio das substncias aparentadas nas monografias dos princpios activos
5. Textos gerais

nominal inferior ou igual ao limiar de identificao aplicvel para a substncia activa considerada, a soma das concentraes nominais das impurezas presentes num teor superior ao limite de excluso inferior ou igual a 1,0 por cento. Exemplo 2 A monografia de uma substncia para uso humano inclui uma rubrica Impurezas onde so includas 6 impurezas (A-F) com os critrios de aceitao seguintes: Se, no cromatograma obtido com a soluo problema, aparecerem outros picos, alm do pico principal, nenhum tem rea superior rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (b) (0,5 por cento) e a soma das suas reas no superior a 2 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (b) (1,0 por cento). No considere um pico devido ao branco nem picos de rea inferior a 0,1 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (b). Uma substncia satisfar ao ensaio se: as impurezas A, B, C, D, E e F esto cada uma presentes numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,5 por cento, qualquer outra impureza est presente numa concentrao nominal inferior ou igual ao limiar de identificao aplicvel para a substncia activa considerada, a soma das concentraes nominais das impurezas presentes num teor superior ao limite de excluso inferior ou igual a 1,0 por cento. Exemplo 3 A monografia, mais explcita, de uma substncia para uso humano cuja dose diria mxima no ultrapassa 2 g/dia inclui uma rubrica Impurezas onde esto includas 7 impurezas (A-F) definidas como Impurezas especificadas e 1 (G) mencionada como Outras impurezas detectveis. Limites: factor de correco: para o clculo do teor, multiplique a rea do pico da impureza A por 2,3, impureza B: no mximo, 3 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (a) (0,3 por cento), impureza E: no mximo, 4 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (a) (0,4 por cento), impurezas A, C, D e F: para cada impureza, no mximo, 2 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (a) (0,2 por cento), qualquer outra impureza: para cada impureza, no mximo, a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (a) (0,1 por cento), total: no mximo, a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (b) (1,0 por cento), limite de excluso: 0,5 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (a) (0,05 por cento). Uma substncia satisfar ao ensaio se: a impureza B est presente numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,3 por cento, a impureza E est presente numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,4 por cento, FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

Qualquer monografia especfica de uma substncia para uso farmacutico deve ser lida e interpretada conjuntamente com a monografia geral Substncias para uso farmacutico. Quando uma monografia estabelece, para as impurezas, um critrio de aceitao geral (qualquer outra impureza, outras impurezas, qualquer impureza) que equivale a um teor nominal superior ao limiar de identificao aplicvel para a substncia considerada (ver monografia geral Substncias para uso farmacutico) este limite aplica-se unicamente s impurezas especificadas citadas na rubrica Impurezas. Se so presentes outras impureza, convm determinar, luz das disposies da monografia geral, se necessrio identific-las (na medida do possvel), declar-las, especific-las e qualific-las. Incumbe ao utilizador da substncia determinar a validade dos critrios de aceitao para as impurezas no citadas na rubrica Impurezas ou citadas como outras impurezas detectveis. Os exemplos juntos so apresentados com a finalidade de ajudar interpretao dos critrios de aceitao das impurezas nas monografias especficas. Estes exemplos correspondem a diversas apresentaes redaccionais actualmente empregadas nas monografias na expectativa de uma harmonizao para uma futura edio. Exemplo 1 A monografia de uma substncia para uso humano inclui uma rubrica Impurezas onde esto includas 8 impurezas (A-H) das quais 2 (G,H) mencionadas como outras impurezas detectveis e especifica os critrios de aceitao seguintes: impureza A: no mximo, a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (b) (0,5 por cento), qualquer outra impureza: no mximo, a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (c) (0,2 por cento), total: no mximo, 2 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (b) (1,0 por cento), limite de excluso: 0,25 vezes a rea do pico principal do cromatograma obtido com a soluo padro (c) (1,0 por cento), Uma substncia satisfar ao ensaio se: a impureza A est presente numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,5 por cento, as impurezas B, C, D, E e F esto cada uma presentes numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,2 por cento, qualquer outra impureza est presente numa concentrao 624

5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico

as impurezas A, C, D e F esto cada uma presentes numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,2 por cento, sendo a rea do pico da impureza A multiplicada por 2,3 para o clculo do teor, qualquer outra impureza est presente numa concentrao nominal inferior ou igual a 0,10 por cento (limiar de identificao), a soma das concentraes nominais das impurezas presentes num teor superior ao limite de excluso inferior ou igual a 1,0 por cento. Recomendaes aos utilizadores de monografias de princpios activos As monografias fornecem especificaes que visam garantir que as substncias cujos perfis de impurezas correspondem aos tomados em conta quando da elaborao e/ou reviso da monografia so de qualidade apropriada. Incumbe ao utilizador da substncia verificar se a monografia permite um controlo adequado das impurezas para uma substncia de determinada origem, nomeadamente por meio do processo de certificao de conformidade das monografias da Farmacopeia. Uma monografia que inclui um ensaio de substncias aparentadas baseado num mtodo quantitativo (por exemplo, a cromatografia lquida, a cromatografia em fase gasosa e a electroforese capilar) assegura um controlo adequado das impurezas, para uma substncia de uma determinada origem, se as impurezas presentes num teor superior ao limiar de identificao aplicvel so impurezas especificadas mencionadas na rubrica Impurezas. Se a substncia contm outras impurezas alm das mencionadas na rubrica Impurezas, h que verificar se elas so detectveis pelo mtodo descrito na monografia. Se no for esse o caso, ser necessrio desenvolver um novo mtodo e solicitar a reviso da monografia. Segundo os teores detectados e os limites propostos, ser de encarar a identificao e/ou a qualificao destas impurezas. Quando um ensaio de substncias aparentadas nico cobre vrios perfis de impurezas, s so de mencionar no certificado de anlise as impurezas pertinentes para o perfil conhecido associado a uma origem particular, a menos que o detentor da autorizao de colocao no mercado no utilize substncias activas que apresentem perfis de impurezas diferentes. Identificao das impurezas (atribuio dos picos) Quando uma monografia especifica um limite individual para uma impureza, muitas vezes necessrio definir um meio de identificar essa impureza, por exemplo, com a ajuda de substncias de referncia, de um cromatograma representativo ou da reteno relativa. O utilizador pode julgar necessrio identificar impurezas para alm daquelas para as quais a monografia fornece um meio de identificao, por exemplo, com o objectivo de verificar a aplicabilidade da especificao de um determinado perfil de impurezas por comparao com a rubrica Impurezas. A Farmacopeia no fornece outras substncias de referncia, cromatogramas representativos ou informaes sobre as retenes relativas alm dos indicados na monografia. Cabe, pois, aos utilizadores escolher as tcnicas cientficas de identificao disponveis. Novas impurezas/impurezas especificadas presentes num teor superior ao limite indicado Quando a utilizao de um novo mtodo de produo ou a modificao de um processo j utilizado conduz ao FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

aparecimento de uma nova impureza, necessrio aplicar as prescries da monografia geral Substncias para uso farmacutico, no que respeita a identificao e qualificao, e verificar a capacidade da monografia de permitir o controlo dessa impureza. Os certificados de conformidade constituem um meio de confirmar, para uma substncia de determinada origem, que a nova impureza adequadamente controlada, ou fazer a proposta de um mtodo de controlo com um critrio de aceitao definido. Neste ltimo caso, ser determinada uma reviso da monografia. Quando a utilizao de um novo mtodo de produo ou a modificao de um processo j utilizado conduz presena de uma impureza especificada com um teor superior ao limite especificado, necessrio aplicar as disposies da monografia geral Substncias para uso farmacutico no que respeita qualificao.
5. Textos gerais

Mtodos cromatogrficos O captulo geral 2.2.46. Tcnicas de separao cromatogrfica trata de diferentes aspectos do controlo das impurezas. Para todos os fins teis, esto disponveis no site da DEQM (www.pheur.org) informaes sobre o nome comercial das colunas e outros reagentes e equipamentos que demonstraram serem convenientes quando da elaborao das monografias. GLOSSRIO Outras impurezas detectveis: impurezas potenciais de estrutura definida de que se sabe que so detectadas pelos ensaios da monografia mas que no so normalmente presentes acima do limiar de identificao nas substncias que entram na composio dos medicamentos autorizados pelas Autoriidades competentes. Fazem parte das impurezas no especificadas e so, portanto, limitadas por um critrio de aceitao global. Concentrao nominal: concentrao de uma impureza calculada a partir da concentrao da soluo padro prescrita e tendo em conta o factor de correco prescrito. Impureza: numa substncia para uso farmacutico, qualquer composto alm da entidade qumica definida como sendo essa substncia. Impureza identificada: impureza cuja caracterizao estrutural foi realizada. Impureza no identificada: impureza cuja caracterizao estrutural no foi realizada e que unicamente definida por propriedades analticas de ordem qualitativa (reteno relativa, por exemplo). Impureza no especificada: impureza limitada por um critrio de aceitao global e no individualmente citada com um critrio de aceitao especfico. Impureza potencial: impureza teoricamente susceptvel de aparecer quando da produo ou da conservao. Pode ou no estar efectivamente presente na substncia. Quando se sabe que uma impureza potencial detectada pelos ensaios da monografia mas no normalmente presente nas substncias que entram na composio dos medicamentos autorizados pelas Autoridades competentes, ela ser citada para informao na rubrica Impurezas nas Outras impurezas detectveis. 625

5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso farmacutico

Impureza especificada: impureza individualmente citada e limitada numa monografia por um critrio de aceitao especfico. Uma impureza especificada pode ser ou no ser identificada. Limite de excluso: nos ensaios cromatogrficos, teor nominal at ao dos picos/sinais no so considerados para o clculo da soma das impurezas. O limite de excluso e o limiar da declarao tm geralmente o mesmo valor numrico. Qualificao: processo de aquisio e de avaliao dos dados que estabelecem a inocuidade biolgica de uma impureza especificada ou de um determinado perfil de impurezas no teor ou teores especificados.

Limiar de declarao: limite a partir do qual uma impureza deve ser declarada. Limiar de qualificao: limite a partir do qual tem lugar a qualificao de uma impureza. Limiar de identificao: limite a partir do qual uma impureza deve ser identificada. Substncias aparentadas: nas monografias, ttulo dado aos ensaios de carcter geral para as impurezas orgnicas.

5. Textos gerais

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5.11. CARACTERSTICAS NAS MONOGRAFIAS


5.11. Caractersticas nas monografias.............................. 629

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5. Textos gerais

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5.11. Caractersticas nas monografias

5.11. CARACTERSTICAS NAS MONOGRAFIAS


Como se indica nas Prescries Gerais, as indicaes que figuram na rubrica Caractersticas no so para interpretar de modo rigoroso e no constituem exigncias. A ttulo de informao para os utilizadores, os mtodods recomendados pelos autores das monografias como base para as indicaes dizendo respeito higroscopicidade, cristalinidade e solubilidade so apresentadas a seguir. HIGROSCOPICIDADE Este mtodo para ser realizado nos produtos em cuja monografia se exige que satisfaam aos ensaios de perda por secagem ou de gua. D indicao da higroscopicidade da substncia sem ser uma verdadeira determinao desta. Utilize uma caixa de pesagem de vidro de 50 mm de dimetro externo e 15 mm de altura. Pese a caixa e a tampa (m1). Introduza a quantidade de substncia especificada no ensaio de perda por secagem ou gua e pese de novo (m2). Coloque a caixa no fechada num exsicador apropriado contendo uma soluo saturada de cloreto ou de sulfato de amnio, a 25C, ou numa estufa climtica regulada para 25C e 80 2 por cento de humidade relativa. Deixe em repouso durante 24 h. Coloque a tampa na caixa e pese (m3). Calcule o aumento de massa em percentagem usando a expresso:
m3 m2 m2 m1 100

Numa lmina de vidro limpa coloque algumas partculas da amostra em leo mineral. Examine ao microscpio polarizante. As partculas cristalinas apresentam uma birrefringncia e observam-se posies de extino quando da rotao do suporte da lmina. SOLUBILIDADE A quantidade mxima de substncia necessria para este ensaio de 111 mg (para cada solvente) e o volume mximo de solvente de 30 ml. Procedimento de dissoluo Agite energicamente durante 1 min e coloque numa manta termostatada temperatura de 25,0 0,5C durante 15 min. Se a dissoluo da amostra for incompleta, agite novamente durante 1 min e coloque na manta termostatada durante mais 15 min. Mtodo Pese para um tubo com rolha esmerilada (160 mm 160 mm) 100 mg da amostra finamente pulverizada (90). Junte 0,1 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa, a amostra muito solvel. Se a dissoluo for incompleta, junte 0,9 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a amostra facilmente solvel. Se a dissoluo for incompleta, junte 2,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a amostra solvel. Se a dissoluo for incompleta, junte 7,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a amostra ligeiramente solvel. Se a dissoluo for incompleta, pese 10 mg da amostra finamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte 10,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a amostra pouco solvel. Se a dissoluo for incompleta, pese 1 mg da amostra finamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte 10,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento de dissoluo. Se a dissoluo for completa a amostra muito pouco solvel.

O resultado expresso do seguinte modo: deliquescente: absoro de gua suficiente para que haja formao de uma soluo, muito higroscpico: aumento de massa superior ou igual a 15 por cento, higroscpico: aumento de massa inferior a 15 por cento e superior ou igual a 2 por cento, ligeiramente higroscpico: aumento de massa inferior a 2 por cento e superior ou igual a 0,2 por cento. CRISTALINIDADE Este mtodo empregado para estabelecer o carcter cristalino ou amorfo de uma substncia.

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5. Textos gerais