Deteco rpida de picornavrus respiratrios nas secrees nasofarngeas por ensaio de imunofluorescncia

Palavras-chave: Imunofluorescncia Picornavrus respiratrias Vrus respiratrios Enterovrus Rinovrus

RESUMO Experincia: Os picornavrus respiratrios (enterovrus e rinovrus) so comumente citados como causas da auto-limitada infeco do tracto respiratrio superior. Contudo, recentemente, tem sido sugerido que eles podem causar doenas respiratrias mais graves. Os ensaios de imunofluorescncia (IF) so rpidos e baratos; e so frequentemente utilizados para a deteco de vrus respiratrios. Objectivos: Procurou-se elaborar um procedimento de IF, utilizando reagentes comercialmente disponveis, para a deteco de picornavrus respiratrios directamente na secreo nasofarngea (NPA). Plano do estudo: De 01 de novembro de 2006 at 31 de outubro de 2007 todos os NPA dos pacientes com infeces respiratrias foram coradas com o reagente Light Diagnostic Pan Enterovirus - "Blend" por IF (IF-ENVPAN). Aquelas amostras cujo o teste foi positivo com a tal mancha, foram ainda testadas (sujeitas disponibilidade de espcimes congelados) com o mtodo do Painel respiratrio viral xTAG (xTAG respiratory viral panel), um mltiplo PCR direccionado contra picornavrus, adenovrus, (ADV), vrus sincicial respiratrio (VSR), vrus influenza do tipo A e B (IFA e IFB), vrus parainfluenza (PIV) 1-4, metapneumovrus humano (HMPV) e coronavrus. Resultados: 241 em 1122 NPA tiveram teste positivo pelo IF-ENVPAN. 143 NPA estavam disponveis para testes por Painel respiratrio viral xTAG. O mltiplo PCR detectou picornavrus respiratrios em 139 NPA, em 126 como sendo o nico vrus patognico. Concluses: Os nossos resultados indicam o potencial do IF-ENVPAN para deteco laboratorial de picornavrus respiratrios em espcimes clnicos. Como conhecido, esta primeira publicao de tal mtodo.

1. Experincia Estudos recentes que usam abordagens da biologia molecular sugerem, previamente, para um papel no perigoso por parte dos picornavrus (enterovrus e rhinovrus) na patognese de infeces graves do tacto respiratrio. Respirao ruidosa aguda (bronquiolite e asma aguda) e pneumonia viral em crianas e bebs, irritao de COPD (doena pulmonar obstructiva crnica), asma e fibrose cstica, infeces graves e crnicas em pacientes imunologicamente comprometidos e graves infeces no tracto respiratrio inferior em pessoas idosas tm sido associados com os picornavrus respiratrios. O diagnstico rpido de vrus respiratrios patognicos importante para ajudar a preveno da propagao de uma infeco hospitalar, para minimizar o uso desnecessrio de antibiticos e para discernir a necessidade de terapia antiviral. A imunofluorescncia um mtodo largamente usado para a deteco de muitos vrus respiratrios directamente a partir de amostras respiratrias. A imunofluorescncia um mtodo rpido, confivel e economicamente eficiente que fornece uma estimativa da qualidade dos espcimes e permite uma triagem de vrios vrus em simultneo. Contudo, a colorao IF de espcimes para deteco de pircornavrus respiratrios tem sido considerada impossvel devo ao grande nmero de sero-tipos envolvidos. Porm, o uso de anticorpos monoclonais especficos contra enterovrus tem sido descrito para fins de identificao tanto em Shell Vial como em cultura convencional. Ns conduzimos uma investigao preliminar da adequao do reagente Light Diagnostic Pan Enterovirus - "Blend" IF (IF-ENVPAN) para deteco por imunofluorescncia de picornavrus respiratrios directamente da secreo nasofarngeas (NPA). Embora no concebido para esta aplicao, ns frequentemente observmos um determinado padro citoplasmtico granular fluorescente, que esteve frequentemente associado com o NPA das crianas com respirao ruidosa. Como a reactividade cruzada com a hepatite A e os astrovrus era improvvel nas amostras respiratrias, as nossas observaes sugeriram uma associao possvel entra este padro fluorescente e a deteco de picornavrus respiratrios.

2. Objectivos Com o objectivo de avaliar a sustentabilidade do IF-ENVPAN para a deteco de picornavrus respiratrios directamente da NPA, ns, prospectivamente, testmos 1154 espcimes de NPA de pacientes com uma suspeita de infeco viral respiratria com o teste de IF-ENVPAN, testando, alm disso, os espcimes disponveis com resultado positivo de IF-ENVPAN com o Painel respiratrio viral xTAG, um mltiplo PCR comercial direccionado contra muitos vrus respiratrios, incluindo picornavrus.

3. Plano de estudo 3.1. Amostras Todas as 1154 secrees nasofarngeas (NPA) recolhidas durante o perodo de 1 ano (1 de Novembro de 2006at 31 de Outubro de 2007) de 986 crianas e 5 adultos com suspeita de infeco respiratria foram prospectivamente testados com o reagente Ligth Diagnostic Pan-Enterovirus Blend IF (IF-ENVPAN) e com o nosso habitual painel de triagem de IF para vrus respiratrios (ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-3 e HMPV). Quando disponvel, o excesso de material da amostra foi congelado a -80C. Todos os IF-ENVPAN com resultado positivo de NPA, possuindo suficiente material congelado, foram depois testados com o painel respiratrio viral xTAG, um mltiplo PCR direccionado contra picornavrus respiratrios, ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 14, HMPV e coronavrus. O nmero total de IF-ENVPAN com resultado positivo de NPA testados pelo mltiplo PCR foram 143. A cada 3 IF com resultado negativo de NPA (tanto pelo painel de triagem como pelo IF-ENVPAN) recolhidos entre 1 de Novembro de 2006 e 14 de Setembro de 2007, possuindo material congelado suficiente, foi tambm testado o xTAG mltiplo PCR. O nmero total de espcimes com resultado negativo de IF testados pelo mltiplo PCR foi 100. 3.2. Populao de pacientes Grande parte dos NPA foi recolhida de crianas admitidas ao bloco de emergncia do Departamento de Pediatria da Universidade de Berna, Sua. Algumas amostras vieram de crianas admitidas por outros hospitais ou enviadas por prticas de pediatras. Todos os 5 adultos foram admitidos pelo Hospital da Universidade de Berna, Sua; 3 deles estavam imunocomprometidos. As idades dos pacientes eram como se segue: 493<1 ano; 331: 1-3 anos; 115:49 anos; 47: 10-18 anos e 5 adultos. 3.3. Ensaios de imunofluorescncia As amostras de NPA foram vortexadas e centrifugadas a 700 x g durante 5 minutos. O sedimento celular foi ressuspendido em PBS e centrifugado outra vez a 700 x g durante 5 minutos e foi finalmente ressuspendido em PBS para formar uma suspenso ligeiramente turva. Uma gota desta suspenso celular foi colocada em cada poo da lmina de multi-poos. Depois de secar a lmina, foram fixados em acetona durante 10 minutos. Depois de colorir, todos os poos foram examinados com o microscpio de fluorescncia de 200-400x. As amostras que contm menos de 20 clulas epiteliais ciliadas foram consideradas inadeaquadas. 3.3.1.Painel de triagem de IF para ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-3 e HMPV Os poos foram coloridos com Light Diagnostics (Chemicon International, agora parte do Millipore, Temecula, CA) Rspiratoy Viral Screen DFA e a nica

fluorescena-conjugada de anticorpo monoclonal para a deteco de ADV, RSV, IFA, IFB e PIV 1-3 e com o Diagnostic Hybrid DFA Metapneumovirus Identification Kit para a deteco de HMPV de acordo com as instrues do fabricante. 3.3.2.IF-ENVPAN Todos os espcimes foram tambm testados com o reagente Light Diagnostics Pan-Enterovirus Blend Cat. Nmero 3360 que contm uma mistura de dois anticorpos monoclonais 2E11 e 9D5. Lminas separadas foram usadas para o IFENVPAN visto que este foi o nico ensaio de imunofluorescncia indirecta. Uma gota de anticorpo monoclonal foi colocada em cada poo. Depois da incubao numa cmara hmida a 37 1,5 C durante 30 minutos. As lminas foram lavadas em PBSTween e uma gota de Anti-Mouse IgG Conjugate (Light Diagnostics Cat. Nmero 5008) foi adicionada a cada poo. As lminas foram, depois, incubadas da mesma forma, lavadas, secas e examinadas. Um resultado positivo era indicado pela presena de duas ou mais clulas intactas, exibindo o padro especfico de fluorescncia: o citoplasma das clulas positivas aparecia envolvido superfcie com um manto de grnulos fluorescentes com uma cor verde-ma brilhante. As amostras com fluorescncia intra-nuclear ou extra-celular foram consideradas negativas. 3.3.3.Ensaio do painel respiratrio viral xTAG O RNA e o DNA foram extrados com o extractor EasyMAG (bioMrieux), usando o protocolo genrico 1.0.6.. Por cada 200 L de NPA, 20 L de uma diluio de 10 do fago MS2 da Escherichia Coli (ATCC strain 15597-B1) no Universal Transport Medium (Copan) foi adicionado como um controlo interno. O volume de elui foi estabelecido em 110 L. Os extractos foram guardados a -80C. O ensaio do painel respiratrio viral xTAG (Luminex Molecular Diagnostics) compromete os seguintes passos, todos os quais foram executados de acordo com as instrues do fabricante: dirigida a um alvo especfico, transcrio reversa PCR; tratamento por exonuclease/fosfatase; dirigida a um alvo especfico, extenso de um primer; direccionada a uma alvo especfico, a hibridizao dos amplicons (produto do PCR) para microesferas de fluorocromo marcadas; deteco dos amplicons no instumento Luminex IS 200. Para uma descrio detalhada do mtodo, ver Merante e al. A produo de ficheiros de arquivo, que consistem na mediana das intensidades das fluorescncias de todos os vrus, sendo que os subtipos foram interpretados usando o TDAS RVP-I 1.10 software (Luminex Molecular Diagnostics). Tabela 1

4. Resultados 4.1. Resultados da IF Uns totais de 1122 espcimes de NPA estavam disponveis para anlise; 32 amostras foram rejeitadas por no serem adequadas. Os resultados da IF esto na Tabela 1. 4.1.1. Painel de triagem de IF para ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-3 e HMPV 271 NPA foram positivos para RSV (24,1%), 36 para o ADV (3,2%), 32 para a IFA (2,8%), 28 para o PIV 1-3 (2,5%) e 10 para HMPV (0,9%). A co-infeco no foi observada. 4.1.2. IF-ENVPAN 241 (21,4%) de NPA de 220 pacientes tiveram resultado positivo. Uma dupla infeco com outro vrus respiratrio (9 RSV, 1 ADV, 2 PIV 1-3, e 1 HMPV) foi encontrado em 13 amostras. O resultado foi inconclusivo em 12 espcimes devido a um fundo manchado no especfico e a uma falta de aglomerado granular. 4.2. Resultados do painel respiratrio viral xTAG Um total de 243 NPA (143 IF-ENVPAN positivos e 100 negativos atravs das tcnicas de IF-ENVPAN e do painel de triagem de IF) foi testado pelo xTAG PCR mltiplo. O confronto entre os resultados IF-ENVPAN/xTAG PCR mltiplo est na Tabela 2.

4.2.1.IF-ENVPAN positiva em NPA O PCR mltiplo detectou picornavrus respiratrios em 139 (em 126 como o nico vrus patognico) dos 143 NPA positivos pelo IF-ENVPAN. Somente 4 NPA positivos pelo IF-ENVPAN foram negativos pelo mltiplo PCR. Devido falta de material congelado, ns fomos incapazes de clarificar estas discrepncias. 6 NPA com co-infeco (todos com RSV) tm suficiente material congelado e foram testados com xTAG PCR mltiplo. O PCR mltiplo confirmou o resultado de IF em todos os 6 NPA. O xTAG PCR mltiplo detectou uma dupla infeco em mais 7 espcimes (3 RSV, 2 PIV 4 e 2 PIV 3). 4.2.2.IF negativo em NPA O xTAG PCR mltiplo detectou 41 picornavrus respiratrios, 5 RSV, 5 IFA, 4 coronavrus, 2ADV, 2 PIV4, 2 PIV3 e 2 HMPV em 56 fora dos 100 IF negativos em NPA. Vrios vrus patognicos foram detectados em 6 espcimes (5 amostras com dois e uma com trs vrus respiratrios).

4.3. Anlises estatsticas O clculo da sensibilidade e da especificidade do IF-ENVPAN comparado com o xTAG PCR mltiplo no foi possvel por causa da diferenas nas amostragens entre IFENVPAN positivos e IF negativos em NPA, como descrito no plano de estudo. Comparado com o xTAG PCR mltiplo, o IF-ENVPAN mostrou um valor preditivo positivo de 97,2% e uma valor preditivo negativo de 59%. 5. Discusso O nosso estudo avaliou um procedimento de IF para a deteco de picornavrus respiratrios em NPA. Com esta finalidade o IF-ENVPAN foi comparado com o xTAG PCR mltiplo. O PCR mltiplo detectou picornavrus respiratrios e 139 dos 143 IF-ENVPAN positivos em NPA, em 126 como o nico vrus patognico. O reconhecimento do padro colorido positivo no apresentou qualquer dificuldade em particular para a equipa de laboratrio. Somente 4 IF-ENVPAN positivos em NPA eram negativos usando xTAG PCR mltiplo. Infelizmente, os 4 espcimes discrepantes no puderam ser retestados devo falta de material congelado. Alm disso, o xTAG PCR mltiplo confirmou o resultado do IF em todos os 6 testado em NPA com RSV co-infeco. Portanto uma reaco cruzada de IF-ENVPAN com outros vrus respiratrios pareceu ser a mais improvvel. Com base nos nossos resultados, ns consideramos o NPA que mostrava o padro especfico citoplasmtico granular fluorescente, seguindo a colorao de IF-ENVPAN por ser verdadeiramente positiva para picornavrus respiratrios. O valor predicativo positivo de IF-ENVPAN comparado com o xTAG PCR mltiplo foi 97,2%. Nem o IF-ENVPAN, nem o xTAG PCR podem distinguir entre enterovrus e rhinovrus. Testar com PCR especfico enterovrus e rhinovrus ou a realizao de estudos sequenciados seriam necessrios para resolver esta incerteza. Contudo, provvel que tanto rhinovrus como enterovrus so parte de um espectro contnuo de vrus relacionados, que causam doenas relacionadas. De um total de 1122 de NPA testados, 241 foram positivos pelo IF-ENVPAN para picornavrus respiratrios. Quando o IF usado, os picornavrus respiratrios foram a segunda patogenia viral mais frequentemente detectada em NPA; o primeiro se somente para sujeitos mais velhos do que 1 ano. Os nossos dados de IF apoiam a suspeita de uma grande fequncia de picornavrus respiratrios como patogenias virais como o descrito por outros autores. xTAG PCR mltiplo detectou pelo menos uma patogenia viral (41 picornavrus respiratrios) em 56 dos 100 IF negativos em NPA; e foi, portanto, quando comparado com o IF, mais sensvel para a deteco de vrus respiratrios, particularmente para os picornavrus respiratrios. Dada a grande variabilidade gentica dos picornavrus respiratrios, possvel que a mistura de anticorpo monoclonal no reaja com todos os serotipos presentes. Por outro lado, o aumento da sensibilidade dos mtodos moleculares comparada com o IF, para a deteco de vrus respiratrios no deve ser, somente, considerada como uma vantagem. Os picornavrus respiratrios tm sido detectados, tambm, por PCR em aproximadamente 20%

dos casos de falta de sintomas respiratrios. Alm disso, pelo menos dois relatrios documentaram a recuperao de picornavrus respiratrios por PCR, nas duas a trs semanas seguintes a uma doena respiratria aguda. Ser que a deteco de cidos nucleicos de picornavrus respiratrios representa a presena do vrus sem correlao com os sintomas clnicos actuais, a persistncia do genoma do vrus, seguindo a infeco anterior ou uma infeco activa? Uma maior vantagem dos mtodos de IF , paradoxalmente, a sua relativa insensibilidade tem que haver uma quantidade substancial de material viral presente para o resultado ser positivo. Um IF com resultado positivo correlaciona bem com uma infeco activa. Alm disso, o IF muito mais flexvel e muito menos caro que os procedimentos moleculares: os resultados esto disponveis durante muito tempo durante um dia (dentro de 2-4horas) e a preparao de novos espcimes pode comear enquanto os anteriores esto a ser completados. Por todas estas razes, o IF continua a possuir vantagens sobre o PCR, como o teste de primeira linha nos guias clnicos. Resumindo, os nossos dados apoiam a utilizao clnica da colorao atravs de IFENVPAN do NPA, para a deteco de picornavrus respiratrios, particularmente em bebs e crianas. A adio do IF-ENVPAN para triagem IF, segmentao de ADV, RSV, PIV, IFA, IFB e HMPV, proporcionar um diagnstico mais completo de infeces de vrus respiratrios.